xây dựng phương pháp định lượng fenofibrat và acid fenofibric trong huyết tương chó phục vụ việc xác định các thông số dược động học viên nang fenofbrat 160mg

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ HUYỀN CHANG

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG
FENOFIBRAT VÀ ACID FENOFIBRIC
TRONG HUYẾT TƢƠNG CHÓ PHỤC VỤ
VIỆC XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ DƢỢC
ĐỘNG HỌC VIÊN NANG FENOFBRAT
160MG
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ HUYỀN CHANG

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG
FENOFIBRAT VÀ ACID FENOFIBRIC
TRONG HUYẾT TƢƠNG CHÓ PHỤC VỤ
VIỆC XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ DƢỢC

ĐỘNG HỌC VIÊN NANG FENOFBRAT
160MG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Thuận

HÀ NỘI 2018


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị
Thuận – Bộ môn Hóa dược, Trường đại học Dược Hà Nội là người cô đã tận tình
hướng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết cho tôi hoàn thành luận văn tốt
nghiệp này.
Nhân dịp này tôi muốn gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến và
ThS. Trần Ngọc Bảo – Bộ môn Công Nghiệp Dược cùng các thầy cô giáo, cán bộ
kỹ thuật viên bộ môn Hóa dược và viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã quan
tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi có thể thực hiện đề tài của mình.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, phòng Quản lý
đào tạo sau đại học và các thầy cô giáo của Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo
điều kiện giúp đỡ tôi được trau dồi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong
suốt quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè là những
người đã dành cho tôi sự ủng hộ,chia sẻ và giúp đỡ tận tình.
Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2018
Học viên
Phạm Thị Huyền Chang

MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
Chƣơng 1.TỔNG QUAN ...................................................................................... 3
1.1. Fenofibrat và acid fenofibric ......................................................................... 3
1.1.1. Tính chất ................................................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm dược động học ........................................................................ 4
1.1.3. Tác dụng dược lý .................................................................................... 4
1.1.4. Chỉ định, chống chỉ định ........................................................................ 4
1.1.5. Liều lượng và cách dùng ........................................................................ 5
1.1.6. Một số phương pháp định lượng fenofibrat, acid fenofibric trong
huyết tương ....................................................................................................... 5
1.2. Sơ lƣợc phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................ 7
1.2.1. Khái niệm ............................................................................................... 7
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ............................................................. 8
1.2.3. Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký....................................................... 8
1.2.4. Cấu tạo hệ thống HPLC .......................................................................... 8
1.2.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký ............................... 11
1.3. Phƣơng pháp phân tích định lƣợng thuốc trong dịch sinh học ................ 12
1.3.1. Kỹ thuật xử lý mẫu ................................................................................ 13
1.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học .............. 15
1.4. Sinh khả dụng ................................................................................................ 19
Chƣơng 2.ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 20
2.1.Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tƣợng nghiên cứu ................................ 20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 20
2.1.2. Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất ................................................. 20
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................... 24
2.1.4. Động vật thí nghiệm .............................................................................. 21
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................... 21

2.2.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký ................................................................ 21


2.2.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương .......................................... 21
2.2.3. Thẩm định phương pháp ........................................................................ 21
2.2.4. Ứng dụng xác định các thông số DĐH viên nang fenofibrat 160mg .... 22
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 22
2.3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng FB và FA trong
huyết tương chó ............................................................................................... 22
2.3.2. Ứng dụng xác định các thông số dược động học .................................. 27
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ...................................................................... 27
Chƣơng 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................ 29
3.1. Khảo sát xây dựng phƣơng pháp .......................................................... 29
3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ...................................................... 32
3.2.1. Sự phù hợp hệ thống sắc ký ................................................................... 32
3.2.2. Độ chọn lọc - đặc hiệu ........................................................................... 33
3.2.3. Độ nhiễm chéo ....................................................................................... 33
3.2.4.Tỷ lệ thu hồi ............................................................................................ 33
3.2.5. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ....................................................... 34
3.2.6. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng dưới ....................................... 36
3.2.7. Độ đúng và độ lặp lại ............................................................................. 38
3.2.8. Độ ổn định ............................................................................................. 43
3.3. Xác định các thông số DĐH viên nang fenofibrat ............................... 46
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 49
4.1. Về phƣơng pháp định lƣợng .................................................................. 49
4.2. Về ứng dụng xác định các thông số DĐH ............................................. 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 53
Kết luận .......................................................................................................... 53
Kiến nghị ........................................................................................................ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Chú thích

AN

Chất phân tích

AUC

Diện tích dưới đường cong

ASEAN

Hiệp hội các nước Đông Nam Á

Autosampler

Hệ thống tiêm mẫu tự động

C18

Octadecylsilan

CV

Hệ số biến thiên

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam IV

EMA

Cơ quan quản lý dược phẩm Châu Âu

EtOAc

Ethyl acetat

FA

Acid fenofibric

FB

Fenofibrat

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC

Mẫu kiểm tra nồng độ cao

HT

Huyết tương

IS

Chuẩn nội

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng khối phổ

LLOQ

Giới hạn định lượng dưới

LOD

Giới hạn phát hiện

LQC

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

MeOH

Methanol

MF

Ảnh hưởng của nền mẫu

MQC

Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình

r

Hệ số tương quan

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Độ lệch chuẩn


SKD

Sinh khả dụng

SPE

Chiết pha rắn

Spic

Diện tích pic

TB

Trung bình

TĐSH

Tương đương sinh học

Tltk

Tài liệu tham khảo

tR

Thời gian lưu giữ

ULOQ

Giới hạn định lượng trên

UHPLC

Sắc ký siêu hiệu năng cao

WHO

Tổ chức y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Các phương pháp định lượng acid fenofibric trong huyết tương ........... 5
Bảng 2.1. Danh mục chất chuẩn............................................................................. 20
Bảng 2.2. Danh mục thuốc thử............................................................................... 20
Bảng 2.3. Bảng nồng độ các mẫu QC .................................................................... 23
Bảng 3.1. Chương trình gradient ............................................................................ 31
Bảng 3.2. Kết quả sự phù hợp hệ thống ................................................................. 32
Bảng 3.3. Kết quả tỷ lệ thu hồi IS sau khi chiết ..................................................... 34
Bảng 3.4. Các giá trị sử dụng trọng số ................................................................... 34
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát đường chuẩn FA......................................................... 35
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuẩn FB ......................................................... 36
Bảng 3.7. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới FA ..................................... 37
Bảng 3.8. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới FB ..................................... 38
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của FA ....................... 39
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của FB ..................... 40
Bảng 3.11. Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của FA ..................... 40
Bảng 3.12. Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của FB ..................... 42
Bảng 3.13. Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng.............................. 43
Bảng 3.14. Độ ổn định của mẫu sau xử lý ............................................................. 44
Bảng 3.15. Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kì đông – rã .................... 45
Bảng 3.16. Độ ổn định trong 30 ngày của mẫu huyết tương ................................. 46
Bảng 3.17. Nồng độ FA trong huyết tương chó sau khi uống thuốc ..................... 47
Bảng 3.18. Thông số dược động học của FA theo từng cá thể .............................. 47


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acid fenofibric (FA) và fenofibrat (FB) ............. 3

Hình 1.2. Sơ đồ máy HPLC .................................................................................... 7
Hình 3.1. Phổ xác định bước sóng hấp thụ của FA và FB ..................................... 29
Hình 3.2. Sắc ký đồ thu được khi chạy MeCN: đệm phosphat pH3 ...................... 30
Hình 3.3. Sắc ký đồ thu được khi chạy MeOH: đệm phosphat pH3...................... 30
Hình 3.4. Sắc ký đồ thu được khi chạy hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 80: 20 ... 30
Hình 3.5. Sắc ký đồ thu được khi chạy hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 90: 10 ... 31
Hình 3.6. Sắc ký đồ chương trình gradient ............................................................ 31
Hình 3.7. Sắc ký đồ kiểm tra sự phù hợp hệ thống ................................................ 32
Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu LLOQ ............................................................................ 33
Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu trắng ............................................................................... 33
Hình 3.10. Sắc ký đồ phát hiện giới hạn phát hiện của FA.................................... 37
Hình 3.11. Sắc ký đồ phát hiện giới hạn phát hiện của FB .................................... 28
Hình 3.12. Nồng độ trung bình FA trong huyết tương chó theo thời gian ............ 48


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, lối sống hiện đại đã làm cho bệnh lý tăng mỡ máu ngày càng trở
nên phổ biến và là nguy cơ gây ra các biến chứng nguy hiểm như bệnh lý tim mạch
hay chứng gan nhiễm mỡ. Sử dụng kết hợp thuốc với lối sống lành mạnh giúp duy
trì các chỉ số mỡ máu và ngăn chặn các nguy cơ. Các thuốc đang được sử dụng phổ
biến để điều trị bệnh là nhóm dẫn xuất acid fibric và nhóm statin.
Fenofibrat là một thuốc trong nhóm fibrat có hiệu lực điều trị cao, có thể dùng
trong thời gian dài và an toàn khi kết hợp với các thuốc hạ lipid máu khác nên được
các bác sĩ sử dụng phổ biến để điều trị cho bệnh nhân. Tuy nhiên, thuốc có độ tan
kém trong nước dẫn tới sinh khả dụng thấp và không ổn định. Các tác dụng phụ hay
gặp tuy không nghiêm trọng nhưng xuất hiện với tần suất khá cao và gây khó chịu
cho bệnh nhân.
Gần đây, rất nhiều nghiên cứu áp dụng các kỹ thuật bào chế hiện đại với mục
đích tăng sinh khả dụng, giảm liều dùng và hạn chế tác dụng không mong muốn của
thuốc. Điều này đặt ra yêu cầu trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc cần có

một phương pháp định lượng thuốc trên động vật giúp bước đầu thử tác dụng của
thuốc thông qua việc xác định các thông số dược động học. Từ đó đưa ra hướng bào
chế tiếp theo cũng như tiến đến nghiên cứu tác dụng và đánh giá tương đương sinh
học trên người tình nguyện.
Theo một số tài liệu tham khảo khi hấp thu vào cơ thể fenofibrat chuyển hóa
thành acid fenofibric có hoạt tính, tuy nhiên do các mục đích bào chế khác nhau như

giải phóng chậm, giải phóng có kiểm soát, tăng tốc độ hấp thu… nên có thể trong
những trường hợp này fenofibrat vẫn còn trong huyết tương chưa chuyển hóa. Như
vậy nhằm phục vụ nhu cầu nghiên cứu các dạng bào chế mới chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài :
‘‘Xây dựng phương pháp định lượng fenofibrat và acid fenofibric trong huyết
tương chó phục vụ việc xác định các thông số DĐH viên nang fenofibrat 160
miligam’’

1


Với 2 mục tiêu :
1. Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng fenofibrat, acid
fenofibric trong huyết tương chó.
2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để bước đầu xác định các thông số
dược động học nang fenofibrat 160 mg do viện Công nghệ dược phẩm Quốc
Gia sản xuất.

2


Chƣơng 1 :TỔNG QUAN
1.1.FENOFIBRAT VÀ ACID FENOFIBRIC

1.1.1. Tính chất
O

O
H3C

Cl

CH3
OH

O

O

O

Cl

O

O

FA

FB

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acid fenofibric (FA)và fenofibrat(FB)
Acid fenofibric:
-

Tên khoa học: 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy] – 2-methylpropanoic acid

-

Công thức phân tử: C17H15ClO4

-

Khối lượng phân tử: 318,8

-

Tính chất hóa lý: là dạng chuyển hóa có hoạt tính trong huyết tương của FB
bằng cách cắt liên kết ester trong phân tử FB nhờ enzyme esterase.

+ Dạng bột tinh thể màu trắng hoặc hơi trắng, không tan trong nước, độ tan tăng
trong các hệ đệm, tan tốt trong MeOH. Nóng chảy ở 179-183 0C.
+ Có khả năng hấp thụ UV ở 288nm, nên có thể định lượng bằng HPLC [2], [21].
Fenofibrat :
-

Tên khoa học: 1-methylethyl 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy] –
2-methylpropanoat.

-

Công thức phân tử: C20H21ClO4

-

Khối lượng phân tử: 360,8

-

Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan
trong nước (<0,5mg/ml), rất dễ tan trong methylen clorid, khó tan trong
ethanol 96%. Fenofibrat thân dầu, trung tính, hệ số phân bố D/N logP = 5,24.
Nóng chảy ở 79-820C[20], [21].

-

Tính chất hóa học:có cấu trúc ester nên dễ bị thủy phân cho acid fenofibric
(FA) và isopropanol. Hấp thụ tia UV ở bước sóng 286nm nên có thể định
lượng bằng HPLC detector UV-VIS tại bước sóng này[2], [17].

3


1.1.2. Đặc điểm dƣợc động học
Fenofibrat được hấp thu ngay ở đường tiêu hóa cùng với thức ăn. Hấp thu
thuốc bị giảm nhiều nếu uống sau khi nhịn ăn qua đêm. Thuốc nhanh chóng thủy
phân thành acid fenofibric có hoạt tính, chất này gắn nhiều vào albumin huyết
tương và có thể đẩy các thuốc kháng vitamin K ra khỏi vị trí gắn. Nồng độ đỉnh
trong huyết tương xuất hiện khoảng 5 giờ sau khi uống thuốc. Ở người có chức
năng thận bình thường, nửa đời trong huyết tương vào khoảng 20 giờ nhưng thời
gian này tăng lên rất nhiều ở người mắc bệnh thận và acid fenofibric tích lũy đáng
kể ở người bệnh suy thận uống fenofibrat hằng ngày. Acid fenofibric đào thải chủ
yếu theo nước tiểu (70% trong vòng 24 giờ, 88% trong vòng 6 ngày), chủ yếu dưới
dạng liên hợp glucuronic, ngoài ra còn có acid fenofibric dưới dạng khử và chất liên

hợp glucuronic của nó.
Không thấy xảy ra điều gì nghiêm trọng khi ngừng dùng fibrat, thậm chí sau
khi đã điều trị lâu ngày và cắt thuốc đột ngột [2].
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý
Fenofibrat được dùng để điều trị tăng lipoprotein - huyết typ IIa, typ IIb, typ
III, typ IV và typ V cùng với một chế độ ăn rất hạn chế về lipid. Fenofibtrat có thể
làm giảm 20 - 25% cholesterol toàn phần và 40 -50% triglycerid trong máu. Ðiều trị
bằng fenofibrat cần phải liên tục [3].
Sau khi vào cơ thể FB chuyển hóa thành FA, chất này hoạt hóa PPARII
(Peroxisome Proliferator Activated Receptor type II) làm tăng phân hủy lipid và
loại trừ các tiểu phân giàu triglicerid khỏi huyết tương nhờ hoạt hóa lipoprotein
lipase và giảm sản xuất apoprotein CIII, tăng tổng hợp AI và AII. Qua đó, fenofibrat
làm giảm được các thành phần gây xơ vữa động mạch như lipoprotein tỷ trọng rất
thấp (VLDL) và lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) làm tăng sản xuất lipoprotein tỷ
trọng cao (HDL), và còn làm giảm triglycerid máu. Do đó, thuốc cải thiện đáng kể
sự phân bố cholesterol trong huyết tương.
1.1.4. Chỉ định, chống chỉ định
Chỉ định: Fenofibrat được sử dụng trong điều trị rối loạn lipoprotein huyết các
tuýp IIa, IIb, III, IV và V, phối hợp với chế độ ăn.

4


Chống chỉ định:
Suy thận nặng, rối loạn chức năng gan nặng,trẻ dưới 10 tuổi.
Bệnh lý túi mật, dị ứng với FB.
Có thai và cho con bú
1.1.5. Liều lƣợng và cách dùng.
Ðiều trị fenofibrat nhất thiết phải phối hợp với chế độ ăn hạn chế lipid. Phải
uống thuốc cùng với bữa ăn.

Người lớn: 300 mg/ngày (1 viên 300 mg, uống vào một bữa ăn chính hoặc
uống 3 lần, mỗi lần 1 viên 100 mg cùng với các bữa ăn). Liều ban đầu thường là
200 mg một ngày (uống một lần hoặc chia làm 2 lần). Nếu cholesterol toàn phần
trong máu vẫn còn cao hơn 4 g/l thì có thể tăng liều lên 300 mg/ngày. Cần duy trì
liều ban đầu cho đến khi cholesterol máu trở lại bình thường; sau đó có thể giảm
nhẹ liều hàng ngày xuống. Phải kiểm tra cholesterol máu 3 tháng một lần. Nếu các
thông số lipid máu lại tăng lên thì phải tăng liều lên 300 mg/ngày.
Trẻ > 10 tuổi: Cần nghiên cứu kỹ để xác định căn nguyên chính xác của tăng
lipid máu ở trẻ. Có thể điều trị thử kết hợp với một chế độ ăn được kiểm soát chặt
chẽ trong vòng 3 tháng. Liều tối đa khuyên dùng là 5 mg/kg/ngày. Trong một số
trường hợp đặc biệt (tăng lipid máu rất cao kèm theo dấu hiệu lâm sàng của vữa xơ
động mạch, cha mẹ có biểu hiện tim mạch do xơ vữa trước 40 tuổi, có đám đọng
xanthom...) thì có thể dùng liều cao hơn nhưng phải do thầy thuốc chuyên khoa chỉ
định.
Nếu nồng độ lipid trong máu không giảm nhiều sau 3 đến 6 tháng điều trị bằng
fenofibrat thì cần thay đổi trị liệu (trị liệu bổ sung hoặc trị liệu khác).
1.1.6. Một số phƣơng pháp định lƣợng fenofibrat, acid fenofibric trong huyết
tƣơng
Bảng 1.1. Các phương pháp định lượng fenofibrat, acid fenofibric trong HT
Phƣơng pháp

Đối

phân tích

tƣợng

Điều kiện sắc ký

5

Xử lý mẫu

Tltk


HPLC-UV

FA

-Cột: Germini C18

Tủa protein

(250 × 4,6mm; 5µm)

bằng MeCN

[8]

-Pha động: MeOH – đệm
phosphat pH3 (75: 25)
-Bước sóng phân tích 288nm
-Chất nội chuẩn: atorvastatin
-LLOQ: 0,25 µg/ml
HPLC-UV

FA

-Cột: Symmetry Shield TMRP 18 Chiết lỏng(150 × 4,60mm; 5µm)

lỏng bằng

-Pha động: MeCN– acid

EtOAc

[27]

phosphoric 0,02M (50: 50)
-Bước sóng phân tích: 287nm
-Chất chuẩn nội: 4’-chloro-5fluro-2-hydroxybenzophenone
(CFHB)
-LLOQ: 0,05 µg/ml
HPLC-UV

FB

-Cột: C18 (4,6x 250mmx 5µm)

Chiết lỏng-

-Pha động: MeCN: đệm acetat

lỏng bằng

20mM = 40:60

EtOAc

[21]

-Bước sóng phân tích: 295nm
-Chất chuẩn nội: Nevidipin
-LLOQ: 0,15 µg/ml
HPLC-UV

-Cột: Lithosphere 60 RP-Select

Chiết lỏng-

B (250x 4mm; 5µm)

lỏng bằng

-Pha động: MeCN: đệm

EtOAc

[34]

phosphate pH 6,0 = 30: 70
-Chất chuẩn nội: Diazepam
-LLOQ: 0,095 µg/ml
LC-MS/MS

FA

-Cột: C18 pha đảo (2,1 × 50mm, Chiết lỏng-

6

[33]


5µm)

lỏng với hỗn

-Pha động: methanol: water:

hợp N-

formic = 75: 25: 0,25

hexane:

- Chất chuẩn nội: acid

dicloromethan

diclofenac

: isopropanol

-LLOQ: 0,005 μg / mL
UHPLCMS/MS

FB, FA -Cột: Acquity® BEH C18 (50 × Chiết lỏng 2,1 mm, 1,7 μm)

lỏng bằng hỗn

-Pha động: methanol:nước

hợp

=65:35

diethylether-

-Bước sóng phát hiện : 284nm

EtOAc

[26]

-Chất chuẩn nội: Fluvastatin
-LLOQ:FB: 30-90 ng/ml
FA: 40-100 ng/ml
CE

FA, FB -Mao quản 25cm x 50µm ( ID)
-Dòng điện 5,5kV

Tủa protein

[28]

bằng MeCN

-Áp suất tiêm mẫu 3447Pa
-Bước sóng phát hiện 280nm
-Hệ đệm là acid boric, sodium
carbonat, polyethylen glycol
6000
Từ các nghiên cứu tham khảo được ở trên, chúng tôi lựa chọn định lượng
fenofibrat và acid fenofibric trong huyết tương bằng HPLC với detector UV, sử
dụng hệ sắc ký pha đảo với cột C18 và xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏnglỏng với dung môi ethylacetat.
1.2 Sơ lƣợc phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.2.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography HPLC) là phương pháp phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để định tính và định

7


lượng trong phân tích kiểm nghiệm. Ra đời từ năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát
triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng hiệu năng cao là
một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong
cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ
lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học
với các nhóm hữu cơ, dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại
theo kích cỡ[2], [4].
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu tố
quyết định bản chất của quá trình sắc ký:
- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo.
- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố.
- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion.
1.2.3. Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký
Quá trình phân tách trong HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố chất

tan giữa hai pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy
chất tan bị pha tĩnh lưu giữ trong cột ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha động và pha
tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải tách được các chất ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột
mỗi chất sẽ được phát hiện và ghi lại dưới dạng pic. Tín hiệu của cả quá trình sắc ký
cho ta sắc ký đồ. Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một
hay nhiều thành phần.
1.2.4. Cấu tạo hệ thống HPLC
Máy HPLC gồm các bộ phận cơ bản [12], [21]được tóm tắt trên sơ đồ hình
1.2.

8


1. Bình chứa dung
môi pha động
2. Bơm cao áp
3. Bộ phận tiêm mẫu
4. Cột HPLC (pha
tĩnh)
5. Detector
6. Máy ghi tín hiệu
Hình 1.2.Sơ đồ máy HPLC
1.2.4.1. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ. Dung
môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm) và đuổi khí
hòa tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí). Trong phương pháp
thông thường chỉ cần một bình dung môi, trong phương pháp gradient cần phải có
nhiều bình dung môi.
1.2.4.2. Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải
tạo được áp suất cao khoảng 3000- 6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at (1at =0,98
Bar) và bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút (hiện
nay đã có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar)
1.2.4.3. Bộ phận tiêm mẫu ( injection):
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với
dung tích của cột là 5 - 100l . Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột: Bằng tiêm mẫu
thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosampler).
1.2.4.4. Cột HPLC (pha tĩnh):
Cột thường được làm bằng thép không gỉ, có chiều dài và đường kính trong
() khác nhau. Phần lớn quá trình phân tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng,

9


nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên, nhiệt
độ cột cũng không được phép vượt quá 60oC vì khả năng phân huỷ của pha tĩnh
hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra.
Sau đây là một số pha tĩnh điển hình:
- Silcagel trung tính: Dùng để tách các chất không phân cực và ít phân cực.
Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước. Ví dụ:
Lichrosorb Si 40, Si 60, Si 100; Hypersil; M- partisil; Micropack - Si . . .
Pha động dùng cho loại này là những chất không phân cực hay ít phân cực,
thường là các dung môi hữu cơ đơn hay hỗn hợp của vài dung môi hữu cơ không
tan trong nước như: benzen, toluen, cloroform, hexan, ethyl acetat . . .
-Silicagel đã alkyl hoá: Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các
chất phân cực có khả năng tạo cặp ion. Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị
alkyl hoá tức là đã được gắn với mạch carbon thẳng (C8, C18) hay các carbon vòng
(phenyl) vì thế nó không còn phân cực hay rất ít phân cực.
Ví dụ: Hypersil ODS, lichrosorb RP18, -RP8, C8 corasil, phenyl - corasil . .

.Pha động dùng cho loại này là các chất hữu cơ phân cực như methanol, acetonitril,
nước hoặc hỗn hợp của chúng.
- Silicagel đã được sulfonic, nitro hoá hay amin hoá: Dùng để tách các chất có
cấu tạo ion như các kim loại và hợp chất của kim loại hay các chất khi tan trong pha
động thì phân ly thành ion như các acid hay base. Ví dụ: Lichrosorb - NH2;
Lichrosorb - CN; Nucleosil - 5NH2; Partisil - SAX; Micropack; Hyperasil APS.
1.2.4.5. Detector :
Là bộ phận phát hiện các chất khi có chất ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi
trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng .Tùy theo tính chất của các chất cần
phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện
trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.
A=k.C Trong đó :A là tín hiệu đo được
C là nồng độ chất phân tích
k là hằng số thực nghiệm của detector

10


Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai detector sau :
+ Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm.
+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát
hiện các chất hấp thụ quang.
+Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự
nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang.
+Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array,ELSD (Detector tán xạ bay
hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp
thu cực đại của các chất .
Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là :
+ Detector phổ khối phân tử (MMS): là một detector rất ưu việt cho sắc ký
hiện nay, nó có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao.

+ Detector chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo các
chất đường )
+ Detector đo độ dẫn nhiệt ,hiệu ứng nhiệt ..
1.2.4.6. Bộ phận ghi tín hiệu
Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang. Trong các máy thế hệ cũ thì
sử dụng máy ghi đơn giản có thể đưa ra sắc ký đồ,thời gian lưu,diện tích của pic,
chiều cao… Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể
lưu tất cả các thông số,phổ đồ và các thông số của pic như tính đối xứng,hệ số phân
giải.... Trong quá trình phân tích đồng thời xử lý,tính toán các thông số theo yêu cầu
của người sử dụng như: nồng độ,đường chuẩn, RSD,...
1.2.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.2.5.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh)
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều
thành phần. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ và đường
kính cỡ hạt từ 3 – 10 µm. Quá trình sắc ký có thể được thực hiện bởi nhiều kỹ thuật
khác nhau như: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion,…

11


Yêu cầu của pha tĩnh: phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký, có khả
năng tách trong điều kiện nhất định, tính chất bề mặt ổn định, cân bằng động học
của sự tách xảy ra nhanh và lặp lại tốt, cỡ hạt phải đồng nhất.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3),
nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên nền mạch cacbon. Pha tĩnh trên nền
silica có nhiều ưu điểm và thường được sử dụng nhiều nhất.
1.2.5.2. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất cần phân tích ra khỏi cột tách
để thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất
tách sắc ký của một hỗn hợp. Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn

hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.
Yêu cầu: phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ổn định theo
thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân
cực như: n-hexan, n-hepta, benzen,…
Trong sắc ký pha đảo thì dung môi pha động thường là hệ dung môi phân cực
như: nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng.
1.2.5.3. Chọn hệ đệm
Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất phân tích
có tính acid hay base thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho
quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách. Thông thường với
các chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid nhưng cũng có những trường
hợp ngoại lệ, còn sắc ký tạo cặp ion thì pH tùy từng trường hợp.
1.2.5.4. Tốc độ dòng
Sau khi có pha động, pha tĩnh, pH thích hợp thì cần phải lựa chọn tốc độ dòng
cho pha động để quá trình tách tốt hơn.
1.3. Phƣơng pháp phân tích định lƣợng thuốc trong dịch sinh học
Phương pháp phân tích định lượng hoạt chất trong dịch sinh học là điểm quyết
định đến khả năng thành công của các nghiên cứu SKD, TĐSH,... Đặc thù của mẫu
dịch sinh học là nồng độ hoạt chất thấp, nền mẫu phức tạp (thường chứa muối, lipid,

12


protein,...), lượng mẫu ít nên không thể tiến hành định lượng lặp lại nhiều lần và số
lượng mẫu phân tích nhiều.
Do đó, điều quan trọng để có một phương pháp định lượng thuốc trong dịch
sinh học có độ nhạy, độ chọn lọc cao, giới hạn định lượng dưới thấp, độ tái lặp tốt
và thời gian phân tích cho một mẫu đủ ngắn là cầnmột kỹ thuật xử lý mẫu tối ưu và
một quy trình thẩm định phương pháp chặt chẽ theo những quy định riêng nhằm

đảm bảo độ tin cậy của phương pháp [11], [12].
1.3.1. Kỹ thuật xử lý mẫu
Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu,..) thường có nồng độ
dược chất thấp và chứa một tỷ lệ lớn các protein, các chất nội sinh làm cản trở khả
năng phát hiện và định lượng dược chất. Vì vậy mẫu cần được tách chiết, xử lý để
loại bỏ các tạp chất và có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích để tăng độ
nhạy của thiết bị phát hiện. Ba kỹ thuật thường được áp dụng là: chiết pha rắn, tủa
protein, chiết lỏng – lỏng.
1.3.1.1. Kỹ thuật tủa protein
Nguyên tắc: sử dụng tác nhân gây tủa protein để loại đi phần lớn lượng protein
có trong mẫu huyết tương trước khi phân tích. Một số tác nhân gây tủa là:
-

Thêm dung môi hữu cơ có thể trộn lẫn được với nước như MeCN, MeOH là
giảm hằng số điện môi của dung dịch.

-

Thêm acid mạnh như acid percloric, tricloroacetic để làm thay đổi pH của
dung dịch.

-

Thêm muối như amoni sulfat, natriclorid hoặc các ion kim loại như Cu, Zn,
Fe, để làm thay đổi lực ion.

-

Đun nóng mẫu làm biến tính protein.

-

Lọc hoặc siêu lọc
Trên thực tế thực tế để xử lý mẫu huyết tương dùng cho phân tích định lượng

người ta hay dùng kỹ thuật tủa protein bằng dung môi hữu cơ hay acid. Sau khi lắc
để kết tủa protein, tiến hành ly tâm với tốc độ cao, lấy dịch trong và tiêm sắc ký.
Phương pháp này có ưu điểm tiến hành đơn giản, sử dụng lượng dung môi ít
và kinh tế. Tuy nhiên nhược điểm của kỹ thuật này là mẫu bị pha loãng khi tủa bằng

13


dung môi hữu cơ hoặc hoạt chất bị biến đổi khi thêm acid vào trong mẫu. Ngoài ra
dung dịch thu được đem tiêm sắc ký thường không sạch nên làm giảm tuổi thọ của
cột.
Như vậy tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích và điều kiện phân tích cụ
thể có thể sử dụng kỹ thuật tủa protein.
1.3.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
Nguyên tắc: chuyển chất phân tích từ nền mẫu huyết tương (pha nước) sang
dung môi hữu cơ không hòa tan với nước, đồng thời tách được chất phân tích ra
khỏi các tạp có trong nền mẫu.
Để chiết được mẫu phân tích trong huyết tương và loại được tạp trong nền
mẫu, cần phải chọn được dung môi chiết có khả năng hòa tan chất phân tích nhưng
hòa tan ít tạp chất và dễ bay hơi khi đem cô. Còn mẫu phân tích trong huyết tương
(pha nước) cần chuyển sang dạng trung tính (các chất có bản chất base sẽ được
kiềm hóa, các chất có bản chất là acid sẽ được acid hóa) trước khi chiết để tăng khả
năng hòa tan chất phân tích trong dung môi chiết.
Trên thực tế các dung môi hay được lựa chọn để chiết chất phân tích trong
mẫu huyết tương là diethylether, chloroform, diclomethan,… Các dung môi bay hơi

có thể dùng riêng rẽ hay trộn lẫn vào nhau theo các tỷ lệ thích hợp tùy từng chất
phân tích. Sau khi chọn được dung môi chiết, chiết chất phân tích trong huyết tương
bằng cách: lắc, ly tâm, hút lớp dung môi có thể tích xác định, đem cô, thu được cắn
và hòa tan cắn trong pha động để tiêm sắc ký.
So với kỹ thuật tủa protein thì kỹ thuật chiết lỏng – lỏng phức tạp hơn, trải qua
nhiều bước tiến hành và có thể cho độ thu hồi thấp hơn. Nhưng phương pháp này lại
cho mẫu thu được sạch hơn và có thể làm giàu mẫu. Vì vậy có thể kết hợp đồng thời
2 kỹ thuật trên để có thể làm cho nền mẫu sạch hơn và khả năng thu hồi chất phân
tích tốt hơn.
Hiện nay, chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật xử lý mẫu được dùng phổ biến để chiết
chất phân tích trong nền mẫu huyết tương.
1.3.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn [30]

14


Nguyên tắc: dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật tách sắc ký có sự khác nhau về
ái lực của chất phân tích và các tạp chất với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất
lỏng.
Quy trình này gồm bốn bước chính:
-

Hoạt hóa cột bằng các dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm thích hợp.

-

Nạp mẫu: mẫu được hòa tan trong dung môi và cho qua cột.

-

Rửa: dùng dung môi hoặc dung dịch đệm cho qua cột để loại tạp.

-

Rửa giải: dùng dung môi thích hợp để đẩy chất phân tích ra khỏi cột.
Lấy dung dịch rửa giải, tiến hành bay hơi dung môi để thu được cắn. Hòa tan

cắn trong pha động và tiêm sắc ký.
Ngoài ra, người ta cũng có thể chiết tách mẫu theo kiểu lưu giữ tạp chất trên
cột và cho hoạt chất đi qua.
Để xây dựng 4 bước qui trình chiết trên cần xác định: hiệu quả của dung môi
rửa giải chất phân tích và hiệu lực tách chất phân tích của pha rắn. Tùy thuộc vào
bản chất của từng chất phân tích mà người ta sử dụng các loại cột có bản chất khác
nhau và các hệ thống dung môi khác nhau để chiết tách.
So với hai kỹ thuật trên, kỹ thuật SPE phức tạp và chi phí tốn kém hơn, nhưng
nền mẫu thu được sạch hơn và có thể làm giàu mẫu. Tuy nhiên do chi phí tương đối
cao nên hiện nay kỹ thuật này ở Việt Nam chưa được sử dụng nhiều để chiết mẫu
huyết tương.
Sau khi khảo sát căn cứ vào hiệu suất chiết hoạt chất, độ lặp lại giữa các lần
chiết, thời gian chiết, tính kinh tế,… để lựa chọn quy trình xử lý mẫu huyết tương
tối ưu nhất.
1.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học
Thẩm định phương pháp là một nội dung bắt buộc đối với các phương pháp
phân tích nói chung và phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học nói
riêng. Mục đích của thẩm định là chứng minh phương pháp đủ độ nhạy, độ tin cậy
và lặp lại tốt.
Hiện nay, có khá nhiều hướng dẫn về việc thẩm định phương pháp phân tích
trong dịch sinh học [11], [12], [17], như của tổ chức FDA (2013), EMA (2011)

15

ASEAN hoặc trong dược điển các nước, quy định về cách tiến hành và phương
pháp đánh giá không khác nhau nhiều. Theo hướng dẫn của FDA và EMA thẩm
định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học gồm các chỉ tiêu sau:
1.3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống
Nguyên tắc: Phân tích sắc ký lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng
độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu,
diện tích pic trung bình và các thông số khác của pic (độ phân giải, hệ số đối xứng,
số đĩa lý thuyết,...) của các lần sắc ký.
Yêu cầu: Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 2,0% và diện tích pic phải ≤ 5,0%
nếu không có quy định khác. Trường hợp giá trị RSD>5%, phải có sự giải thích phù
hợp.
1.3.2.2. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với các
thành phần khác có trong mẫu. Một phương pháp được coi là chọn lọc với chất
phân tích (AN) và chuẩn nội (IS) khi trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (có nồng độ AN
tương ứng với nồng độ thấp nhất của đường chuẩn), các pic của AN và IS phải được
nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn với các pic tạp, tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng
trên ít nhất 6 nguồn gốc khác nhau so với mẫu chuẩn tại thời gian lưu AN phải
không vượt quá 20%, tại thời gian lưu IS phải không vượt quá 5%.
1.3.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà phương pháp
phân tích sinh học có thể phát hiện từ nhiễu nền một cách đáng tin cậy (S/N=3).
Giới hạn định lượng dưới là nồng độ thấp nhất của chất cần thử có thể định
lượng được với độ đúng và độ lặp lại thích hợp. LLOQ được chấp nhận nếu đáp ứng
của chất phân tích phải gấp 5 lần đáp ứng của mẫu trắng.
Phân tích các mẫu chứa chất phân tích ở nồng độ LLOQ và LOD đã chuẩn bị ở
trên.
Yêu cầu: Với LOD tỷ số S/N=3, với LLOQ đáp ứng pic của chất phân tích

trên mẫu LLOQ ít nhất bằng 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng. Độ đúng phải đạt từ
80-120%, RSD độ lặp lại phải ≤20%.

16