Khoá luận tốt nghiệp xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất nitidine trong cây xuyên tiêu ( zanthoxylum nitidum)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
===£T)CũlG 8 = = =

NGUYỄN THỊ VÂN ANH

XÂY DƯNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT NITIDINE
TRONG CÂY XUYÊN TIÊU
(ZANTHOXYLUM NITIDUM)
BẰNG HỆ SẮC KÝ LỎNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: H óa học hữu cơ

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Khốã luận với đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất
Nitidine trong cây Xuyên Tiêu ( Zanthoxylum nitidum) bằng hệ sắc ký lỏng
HPLC” được thực hiện tại Phòng Hóa sinh Nông nghiệp và Tinh dầu - Viện Hóa
học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, người đã
giao đề tài, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực hiện và hoàn thành khóa luận

này.
Em xin trân trọng cảm ơn GS. TS Phạm Quốc Long - Viện Trưởng Viện Hóa
học các Hợp chất thiên nhiên, đã cho phép và tạo điều kiện để em được thực tập tại
Phòng Hóa sinh Nông nghiệp và Tinh dầu - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm

Hà Nội 2, ban Chủ nhiệm khoa cùng toàn thể các Thầy Cô trong Khoa Hóa học đã
hét lòng quan tâm, dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trường và
hoàn thiện khóa luận này.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn
luôn bên cạnh động viên, ủng hộ và là chỗ dựa vững chắc cho em trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Vân Anh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN................................................................................................3

1.1. Một vài nét về thực vật cây Xuyên tiêu Zanthoxylum nitidum....................... 3
1.2. Tình hình nghiên cứu về cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) và hoạt chất
nitidine...................................................................................................................... 3
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới............................................................ 3
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt N am ............................................................. 8
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ........................... 9

2.1. Đối tuợng nghiên cứu........................................................................................9
2.2. Hóa chất, dụng cụ và các thiết bị dùng trong nghiên cứu............................... 9
2.2.1. Hóa chất và dụng c ụ ..................................................................................9
2.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu...............................................................10
2.3. Phuơng pháp xử lý mẫu:.................................................................................10
2.4. Phuơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất: ...11

2.4.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)............................................................................11
2.4.2. sẳckýcột (CC)......................................................................................... 11
2.5. Phuơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đuợc........................ 12
2.5.1. Phổ hồng ngoại I R ...................................................................................12
2.5.2. Phổ khối lượng (MS)................................................................................12
2.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).......................................................12
2.6. Điểm nóng chảy (Mp)...................................................................................... 13
2.7. Phuơng pháp thử hoạt tính gây độc té bào.....................................................14
2.7.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào ỉn vitro..................................................... 14
2.7.2. Phép thử sinh học xác định tinh độc tể bào (cytotoxic assay)................14
2.8. Phuơng pháp HPLC xác định hàm luợng hoạt chất nitidine trong các bộ phận
của cây Xuyên tiêu [8] ........................................................................................... 16
CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM.................................................................................17


3.1. Xử lý mẫu thực vật và điều chế các cặn chiết từ mẫu thực vật...................... 17
3.2. Phân lập hợp chất nitidine từ cặn chiết...........................................................18
3.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất ZN1.................................... 19
3.4. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất ZN1...............................20
3.5. Xác định hàm lượng hoạt chất nitidine trong các bộ phận của cây Xuyên tiêu
bằng phương pháp HPLC [8] ................................................................................ 20
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................ 24
4.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất ZN1............................................................... 24
4.2. Két quả thử hoạt tính gây độc té bào của hợp chất nitidine...........................29
4.3. Hàm lượng của hoạt chất nitidine trong các bộ phận lá, quả, cành, thân và rễ
cây Xuyên tiêu........................................................................................................29
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN.........................................................................................32
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐẾN KHÓA LUẬN ..33
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................34

DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT

IR: Infrared Spectroscopy
El - MS: Electron Impact Mass Spectroscopy
3H NMR: 3H -Nuclear Magnetic Resonance
13c NMR: 13c - Nuclear Magnetic Resonance
HSQC: Heteronuclear Singlet - Quantum Coherence
HMBC: Heteronuclear Multiple - Bond Correlation
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
TLC: Thin layer chromatography
EtOAc: Ethyl acetate
UV-Vis: Ultraviolet-Visible: phổ tử ngoại và khả kiến
ô(ppm): Độ dịch chuyển hóa học (parts per million)
J(Hz): Hằng số tương tác (Hertz)
br: broad singlet
s: singlet
d: doublet
dd: double doublet
t: triplet
MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu.
IC50 (The half maximal Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50% .
MBC (Minimum Bactericidal Concentration): Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu.
HPLC (High Performance Liquid Chromatography): sắc ký lỏng hiệu năng cao.


DANH MỤC HÌNH VÀ s ơ ĐỒ

Hình 1: Ảnh mẫu cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum)......................................... 9
Hình 2: Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ cây Xuyên tiêu...........................................17

Hình 3: Sơ đồ phân lập chất ZN 1 từ phần cặn chiết nước của thân và cành cây
Xuyên tiêu.................................................................................................................. 19
Hình 4. a) Phổ UV-Vis của nitidine; b) sắc ký đồ HPLC của nitidine.....................21
Hình 5. Đường chuẩn định lượng nitidine................................................................. 21
Hình 6 : Phổ 'H-NMR của hợp chất ZN1.................................................................. 24
Hình 7: Phổ 13C-NMR của hợp chất ZN1................................................................. 25
Hình 8 : Phổ DEPT của hợp chất ZN1....................................................................... 25
Hình 9: Phổ HSQC của hợp chất ZN1...................................................................... 26
Hình 10: Phổ HMBC của hợp chất ZN-1.................................................................. 26
Hình 11: Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất ZN1.............................................. 27
Hình 12: cấu trúc hóa học của hợp chất nitidine..................................................... 28
Hình 13. Sắc kí đồ HPLC của các cặn chiết metanol tổng từ lá .............................. 30

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1. Độ lệch chuẩn của nitidine.......................................................................... 22
Bảng 2: Độ chính xác của phương pháp phân tích nitidine......................................23
Bảng 3. Số liệu phổ *H, 13C-NMR của hợp chất ZN1 và số liệu tham khảo của hợp
chất nitidine................................................................................................................ 27
Bảng 4. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nitidine....................... 29
Bảng 5. Hàm lượng nitidine có trong các bộ phận lá, quả, cành, thân và rễ cây
Xuyên tiêu.................................................................................................................. 31


ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước ta có diện tích khoảng 330.000 km2 nằm trong vùng nhiệt đới gió
mùa cận xích đạo nên nhiệt độ hàng năm khá cao (khoảng từ 22 - 34°C). Lượng
mưa hàng năm lớn tạo cho nước ta một hệ thực vật đa dạng và phong phú. Theo số
liệu thống kê gần đây hệ thực vật Việt Nam có khoảng 12.000 loài, trong đó cây

làm thuốc chiếm khoảng 26-30 % [6,7]. Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên rất quý
báu của đất nước.
Trong những thập kỷ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc
có nguồn gốc từ thiên nhiên để phòng và điều trị bệnh trở nên phổ biến. Trước sự phát
triển vượt bậc của sinh học phân tử, ngày nay việc nghiên cứu và tìm kiếm, khai thác
các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong y học, nông nghiệp và
các mục đích khác trong đời sống con người là một trong những hướng nghiên cứu đã
và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm.
Cây Xuyên tiêu (hay còn được gọi là Hoàng lực, Sưng, Trưng) có tên khoa
học Zanthoxylum nitỉdum (Roxb.) DC., thuộc họ Cam (Rutaceae). Các nghiên cứu
trên thế giới cho thấy cây này có thành phần chủ yếu là các hợp chất alkaloid và
lignan; ngoài ra còn có một số hợp chất khác có khung coumarin, terpenoid và
steroid. Nhiều hợp chất thu được từ cây này đã cho thấy có những hoạt tính sinh học
đáng chú ý như kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng viêm giảm đau, chống
co thắt, chống sốt rét..., trong đó nổi bật nhất là khả năng gây độc té bào, chống ung
thư của hoạt chất chính nitidine. Hợp chất này đã được chứng minh có khả năng ức
ché nhiều dòng té bào ung thư rất tốt và có khả năng trở thành chất chống ung thư
có nguồn gốc thiên nhiên.
Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như
hoạt tính sinh học của cây Xuyên tiêu mới chỉ có rất ít. Việc nghiên cứu chiết tách,
phân lập và xây dựng phương pháp xác định nhanh hàm lượng hoạt chất nitidine
trong cây Xuyên tiêu ở Việt Nam để từ đó định hướng cho việc khai thác nguồn
nguyên liệu này một cách có hiệu quả là rất cần thiết. Đe thực hiện mục tiêu trên,

1


chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất
nitidine trong cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) bằng hệ sắc ký lỏng
HPLC”.

Nội dung nghiên cứu:
1. Xử lý mẫu, tạo các cặn chiết.
2. Phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất nitidine.
3. Xây dựng phương pháp định lượng xác định hàm lượng của hoạt chất
nitidine trong các cặn chiết bằng HPLC.
Đổi tượng nghiên cứu:
Cây Xuyên tiêu (Zanthoxyỉum nitỉdum) thuộc họ Cam (Rutaceae) ở Việt
Nam.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Một vài nét về thực vật cây Xuyên tiêu Zanthoxylum nitidum
Cây Xuyên tiêu (hay còn gọi là cây hạt sẻn, sưng, hoàng lực) có tên khoa
học là Zanthoxylum nitỉdum (Roxb.) DC. thuộc họ Cam (Rutaceae). Đây là loại cây
nhỏ leo, ưa sáng và chịu hạn tốt, thường mọc trong các quần hệ cây bụi ở đồi,
nương rẫy bỏ hoang hoặc ven rừng thứ sinh, có nhiều cành, dài 1-2 m, có thể dài tới
15m. Đường kính thân có thể tới 15cm, có gai quặp. Cành hình trụ, nhẵn, màu nâu
đen, có gai ngắn rải rác, dẹt, quay về phía dưới. Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, dài
18-20 cm, gồm 5-7 lá chét mọc đối, hình trái xoan, dài 6-11 cm, rộng 3,5-5,5 cm,
gốc tròn, đầu có mũi nhọn, 2 mặt đều có gai ở gân, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới
nhạt, gân lá hằn rõ, cuống lá dài có gai. Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chùm, hay
chùm xim đơn riêng lẻ, hoa đơn tính, màu trắng, thơm; hoa đực có nhị dài hơn cánh
hoa, chỉ nhị mảnh; hoa cái có bầu hình cầu gồm 4-5 lá noãn, hơi ngắn hơn cánh hoa.
Quả có 1-5 mảnh vỏ,thường là 3 tụ lại ở quanh trục, mặt ngoài nhăn nheo, mặt trong
nhẵn. Khi chín mầu đỏ nhạt, mỗi mảnh vỏ đựng 1 hạt rắn, mầu đen bóng [1, 2, 7].
Ở nước ta, cây mọc hoang ở khắp các nơi, nhiều nhất tại các tỉnh miền núi
như Phú Thọ, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà
Tĩnh, Nghệ An, Hòa Bình, Hà Tây [2,7],

1.2. Tình hình nghiền cứu về cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) và hoạt
chất nitidine
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.2.1.1. Cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nỉtỉdum)
Các nghiên cứu về thành phần hóa học cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum
nỉtỉdum) trên thế giới cho thấy cây này có thành phần chủ yếu là các hợp chất
alkaloid và lignan; ngoài ra còn có một số hợp chất khác có khung coumarin,
terpenoid và steroid. Nhiều hợp chất thu được từ cây này đã cho thấy có những hoạt
tính sinh học đáng chú ý như kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng viêm
giảm đau, chống co thắt, chống sốt rét..., trong đó nổi bật nhất là khả năng gây độc
té bào, chống ung thư.

3


Lớp hoạt chất chính có trong cây Zanthoxyỉum nitỉdum là các alkãloid, bao
gồm 5 loại khung là benzophenanthridine alkaloid, quinolon, íuroquinoline,
aporphine và pyrimidine; trong đó các benzophenanthridine alkaloid chiếm hàm
lượng chính. Bằng các phương pháp tách chiết hoặc sử dụng HPLC, 21 hợp chất
benzophenanthridine alkaloỉd đã được tìm thấy có trong cây Zanthoxylum nitỉdum,
gồm

có

nitidine

(1),

chelerythrine

(2),

8-methoxynorchelerythrine

(3),

norchelerythrine (4), decarine (5), oxynitidine (6), oxychelerythrine (7), oxyavicine
(8), sanguinarine (9), dihydrochelerythrine (10), 6-acetonyldihydrochelerythrine
(11),

5,6-dihydro-6-methoxynitidine

hydroxyethyl]dihydrochelerythrine

(13),

(12),

(R)-8-[(R)-l-

8-methoxychelerythrin

(14),

8-

hydroxydihydrochelerythrine (15), epizanthocadinanine A (16), zanthocadinanines
A (17), zanthocadinanines B (18), epi-zanthocadinanine B (19), zanthomuurolanine
(20) và epi-zanthomuurolanine (21) [21, 22, 31, 58, 50].

1: R’=OMe; R2=OMe; R3=H; R4=H
2: r '=H; R2=OMe; R3=OMe; R4=H

6: R*=OMe; R2=OMe; R3=H
7: R*=H; R —OMe; R3=OM e

3: R*=OMe; R2=OMe; R3=H; R4=OMe
4: R'-H; R2-OMe; R3-OMe; R4-H
5: R*=H, R2=OH; R3=OMe; R4=H

4


10 : R '-O M e; R 2-O M e; R 3-H ; R4- H
11 : R '-O M e; R 2-O M e; R 3-O M e; R 4-C H 2COMe
12 : R'=O M c; R 2=OM c; R 3=OMe; R4=H
13 : R'=OM c; R 2=OM c, R 3=Me(OH)CH; R4=H
14 : R '-O M e; R 2-O M e; R 3-O M e; R4—H
15 : R 1—OMe, R 2-O M e, R 3-O H ; R4-H

5


Hầu hết các hợp chất benzophenanthridine alkaloid này đều có hoạt tính
gây độc tế bào, chống ung thư rất tốt, điển hình như các hợp chất nitidine,
chelerythrine, sanguinarine ....
1.2.1.2. Hợp chất nitidine
Ngay từ năm 1976, hợp chất nitidine (1) (hay nitidine chloride) đã được công
bố trên tạp chí Cancer Research về khả năng ức chế sự sao chép ngược của RNA
virut gây ung thư và hoạt tính chống bạch cầu, gợi ý về khả năng chống ung thư của

hợp chất này [43]. Sau đó, nhiều nghiên cứu khác đã cho thấy nitidine có khả năng
chống bệnh bạch cầu [54], gây độc đối với tế bào ung thư cổ tử cung HeLa S3, tế
bào bạch cầu chuột L1210, tế bào ung thư phổi người A549, tế bào u xương ác tính
ở người MG-63 [36, 39, 56], ngăn chặn quá trình di căn và xâm lấn in vivo của ung
thư vú, ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư thận [11, 17, 18, 32, 38]. Nghiên cứu
gần đây nhất (2014) đã cho thấy nitidine có khả năng chống di căn ung thư hầu,
thực quản [26, 37]. Điều đáng quý ở đây là nitidine đã được chứng minh không gây
đột biến gen và có tác dụng gây độc chọn lọc đối với các tế bào ung thư so với tế
bào lảnh tính. Năm 1977, ngay sau công bố về khả năng ức chế hoạt tính sao chép
ngược của RNA virut gây ung thư và hoạt tính chống bệnh bạch cầu, gợi ý về khả
năng chống ung thư của nitidine (vào năm 1976), nhà nghiên cứu Sethi v.s. đã
ngay lập tức tiến hành đánh giá về khả năng gây đột biến gen của hợp chất
benzophenanthridine alkaloid này do có sự khá tương đồng về cấu ưúc hóa học với
chất gây ung thư 5-methylchrysene. Thật may mắn, kết quả cho thấy nitidine không
gây đột biến gen. Nghiên cứu sâu hơn về mối liên quan hoạt tính - cấu ữúc của các
hợp chất này, tác giả đã đưa ra nhận định: chính sự có mặt của nguyên tử nitơ bậc 4
và của các nhóm methoxy trong cấu trúc của nitidine đã khiến cho hợp chất này có
hoạt tính gây độc tế bào mà không gây đột biến gen như chất gây ung thư 5methylchrysene [44],

6


5-methylchrysene
Mặt khác, trong một chương trình nghiên cứu nhằm tìm kiếm các chất chống
ung thư ít gây tác dụng phụ, các nhà nghiên cứu Nhật Bản nhận thấy nitidine có tác
dụng gây độc ỉn vitro chọn lọc đối với các tế bào ung thư so với các tế bào lành
tính, đối với cả các dòng tế bào ở người và ở chuột. Khi nghiên cứu ỉn vỉvo trên mô
hình khối u ghép ngoại lai dưới da, nitidine có khả năng ức chế rất tốt sự sinh
trưởng của khối u phổi ác tính ở chuột và ở người mà không gây tác dụng phụ
(không ảnh hưởng đối với các chỉ số huyết thanh và không gây độc đối với gan).

Khi nghiên cứu về mối liên hệ hoạt tính - cấu trúc, các tác giả nhận thấy rằng hợp
chất dihydronitidine cũng có tác dụng gây độc chọn lọc đối với các té bào ung thư
giống như hợp chất nitidine trong khi demethylnitidine thì không. Từ đó, các tác giả
đưa ra nhận định: chính sự có mặt của nhóm thé methoxy ở vị trí C -8 của khung
benzophenanthridine quyết định đặc tính này. Nghiên cứu này đã đưa ra bằng chứng
in vivo đầu tiên về khả năng chống ung thư ít gây tác dụng phụ của hợp chất
alkaloid tự nhiên nitidine [23].

Ngoài ra, hợp chất nitidine còn được chứng minh có hoạt tính chống sốt rét
rất tốt. Theo nghiên cứu của Jerome Bouquet và D. M. N. Gakunju nitidine có khả
năng ức chế sự hình thành P-haematin với cơ chế hoạt động tương tự như

7


chloroquine. Do đó hoạt tính chống sốt rét của nitidine do đó có thể được cải thiện
bằng cách biến đổi cấu trúc của phân tử này để tăng sự thâm nhập của không bào
tiêu hóa trong ký sinh trùng, nơi hemoglobin chuyển hoá diễn ra [60,61].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, mặc dù cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) được sử dụng
từ lâu trong dân gian để chữa bệnh và ở một số nơi được sử dụng làm gia vị (quả)
hoặc rau ăn (lá non) nhưng các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt
tính sinh học của cây thuốc này còn rất ít. Cho đến nay mới chỉ thấy có công bố về
thành phần hóa học tinh dầu quả xuyên tiêu của nhóm tác giả Nguyễn Xuân Dũng
[3] và việc phân lập một số hợp chất stigmasterol, dihydrokeampíerit, nitidine và
epi-sesamin từ vỏ xuyên tiêu Thanh Hóa của nhóm tác giả Ngô Xuân Lương [4, 5].
Nhìn chung, đây mới chỉ là các nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học mà chưa có
các nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng như việc định lượng hàm lượng hoạt chất
nitidine trong dược liệu Xuyên tiêu ở Việt Nam để định hướng khai thác hoạt chất
này một cách có hiệu quả và bền vững.

8


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là thân và cảnh cây Xuyên tiêu được thu hái tại Na
Hang, Tuyên Quang vào tháng 2 năm 2015. Tên cây được xác định bởi nhà thực vật
học TS. Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mau tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hóa học các
Hợp chất thiên nhiên.

Hình 1: Ảnh mẫu cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum)
2.2. Hóa chất, dụng cụ và các thiết bị dùng trong nghiên cứu
2.2.1. Hỏa chất và dụng cụ
a) Dụng cụ thí nghiệm:
- Bình tam giác (500 ml, 1000 ml, 2000 ml)
- Bình cầu (250 ml, 500 ml, lOOOml, 2000ml)
- Ổng nghiệm
- Bình thủy tinh 25 ml, 50 ml, 100 ml.
- Ống đong (50 ml,100 ml, 500 ml, lOOOml)
- Các loại pipet, ống hút chia độ v.v...
b) Hóa chất:
- Dung môi, metanol, cồn, n-hexan, etylacetat, cloroíorm, aceton.
- Silicagel cỡ hạt 40-60pm và 23-40 pm (Merk)
- Silicagel pha đảo (YMC Cig)
- Thuốc thử H2SƠ4 10%, dragendorít.

9

2.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Hệ thống chiết nóng.
- Máy cô quay chân không: Biichi Rotavapor R- 114.
- Cột sắc ký.
- Máy siêu âm: Elma, S60H
- Bản mỏng: TLC Silicagel 60 F254, Merck.
- Bơm hút chân không.
- Phễu chiết 2000ml.
- Cân kỹ thuật Precisa XT 620M.
- Cân phân tích Precisa XT 220A.
- Đèn tử ngoại.
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker Avance AM500FT-NRM (Viện
Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam)
- Máy đo phổ khối: ESI-MS: AGILENT 1100LC-MSD (Viện Hóa học- Viện
Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam)
- Máy đo phổ hồng ngoại: 670-FTIR NICOLET-NEXUS (Viện Hóa học- Viện
Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam)
- Máy đo điểm nóng chảy: Stuart SMP3
2.3. Phương pháp xử lý mẫu:
Mẩu thân và cành cây sau khi thu hái về được chặt nhỏ, sấy đến khô ở nhiệt
độ 60°c rồi được xay thành bột. Bột dược liệu (5 kg) được ngâm chiết với dung môi
metanol trong bình chiết siêu âm ở nhiệt độ 50°c, lặp lại 3 lần (2 ngày/lần). Gộp
dịch chiết lại và cô quay dưới áp suất giảm để thu hồi dung môi, thu được cao tổng
metanol (màu nâu vàng, 180g). Hòa tan cao tổng metanol này trong 1000 ml nước
cất rồi chiết phân bố lại lần lượt trong các dung môi n-hexan và etyl axetat, sau khi
cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexan (cặn A)
và etyl axetat (cặn B) tương ứng. Phần dịch nước còn lại được lọc và sau đó sắc ký
trên cột dianion với hệ dung môi metanoknước thu được các cặn c và D tương ứng.

10


2.4. Phương pháp phân tích, phân tách các hẫn hợp và phân lập các hợp chất:
Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các
hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC,
dùng để khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột pha đảo.
2.4.1. Sắc kỷ lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC): sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích trong
đó chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ
theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển mỗi thành phần chuyển dịch
với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị
trí khác nhau, sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng toáng sẵn DCAlufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RPis F254s (Merck). Dung môi triển khai sắc ký
là hỗn hợp của một số trong số các dung môi thường dùng nhu n-hexan, cloroform,
etyl axetat, axeton, metanol và nước. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước
sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2S 0 4 10 % trong cồn
hoặc thuốc thử dragendorft; thuốc thử được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ
nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
2.4.2. Sắc ký cột (CC)
Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố định được
nhồi toong các ống hình trụ được gọi là cột. Nhờ vậy mà có thể triển khai dung môi
liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.
Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà sự tách toong cột sẽ
xảy ra theo cơ ché hấp phụ (cột hấp phụ), hoặc theo cơ ché phân bố (cột phân bố).
Kích thước cột và cỡ hạt silicagel phụ thuộc vào bản chất của hỗn hợp cần tách.
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường, silicagel
pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) và
0,015-0,040 mm. Silicagel pha đảo YMC (30-50 pm, Fujisilisa Chemical Ltd.).
Nhựa trao đổi ion Dianion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).

11


2.5. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết
hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại.
2.5.1. Phổ hồng ngoại IR
Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng
10.000 -T 100.000 cm' 1 và biến thành năng lượng của dao động phân tử. Phổ hồng
ngoại được xây dựng dựa trên sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân
tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Như vậy phổ hồng ngoại là phổ
hấp thụ của 2 dạng năng lượng là năng lượng dao động và năng lượng quay.
Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng
tương đối của nguyên tử, liên kết và cấu trúc hình học của chúng. Mỗi kiểu liên kết
được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại,
có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ, dao động hóa
trị của nhóm OH tự do trong nhóm hydroxyl là 3300, 3450 cm'1, của nhóm
cacbonyl trong khoảng 1700, 1750 cm'1.
2.5.2. Phổ khối lượng (MS)
Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lượng rất bé chất
thử, phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dương. Các mảnh ion này nhờ bộ
phận phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác nhau tương ứng với lượng khối
của mỗi ion.
Phổ khối lượng được ghi trên máy Agilent 1200 HPLC-MSD (Electrospray
ionization source-ESI hoặc Atmospheric pressure chemical ionization-APCI) của
Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
2.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu
nhất hiện nay. Với việc sử dụng két hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai

chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất kể cả cấu
trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ

12


proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (*H và 13C)
dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn
bằng độ dịch chuyển hóa học.
Phổ ’H-NMR: Trong phổ ’H-NMR độ dịch chuyển hoá học của các proton
được xác định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá
học của phân tử. Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy
chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hoá học khác nhau. Dựa vào độ
dịch chuyển hoá học, diện tích pic cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với
nhau mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất.
Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu phổ vạch cacbon. Mỗi nguyên tử
cacbon ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho
phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm với dải thang đo rộng hơn so với phổ
proton (từ 0 ppm đến 240 ppm).
Phổ DEPT: Phổ này cho các tín hiệu phổ phân loại các bậc cacbon khác
nhau. Trên phổ DEPT 135 không cho tín hiệu của cacbon bậc 4, tín hiệu của CH và
CH3 nằm về một phía, còn tín hiệu của CH2 nằm về phía đối diện. Trên phổ DEPT
90 chỉ có duy nhất tín hiệu phổ của CH. Kết hợp phổ 13C-NMR và phổ DEPT sẽ
cho ta biết chính xác số cacbon bậc 1, 2, 3, 4.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR
Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan).
2.6. Điểm nóng chảy (Mp)
Đối với chất rắn két tinh thì điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan
trọng, nó là tiêu chuẩn để đo mức độ tinh khiết của hợp chất. Neu điểm chảy của hai

loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chênh lệch không quá 0,5°c thì sản phẩm
kết tinh có thể đã tinh khiết. Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp rất xa
so với điểm chảy lý thuyết thì chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết và phải
tinh chế, kết tinh lại.

13


Điểm nóng chảy được đo trên máy Kotier micro-hotstage của Viện Hoá học
các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.7. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào
2.7.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
- Các dòng tế bào ung thư: bao gồm 5 dòng tế bào ung thư (tế bào ung thư
biểu mô thực quản (KB), tế bào ung thư vú (MCF-7), tế bào ung thư phổi LU-1, tế
bào ung thư gan Hep-G2, té bào ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP)) do GS. TS. J. M.
Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan,
Italia cung cấp.
- Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường
nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM
HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum FBS (GIBCO).
- Te bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm C 0 2
ở điều kiện 37°c, 5% C 0 2.

2.7.2. Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa
Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc té bào chuẩn
nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát ữiển hoặc diệt
TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của
Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa
vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của

tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ
thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng
protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện
cụ thể như sau:
- Chất thử (10 p.1) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96
giếng để có nồng độ nồng độ 100pg/ml, 20 pg/ml; 4 pg/ml; 0.8 pg/ml; 0.16 pg/ml.

14


- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để
điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 pl môi
trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 2 ngày.
- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180pl) sẽ được
sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế
bào bằng Trichloracetic acid - TCA.
- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm C 02, tế bào được cố định vào đáy giếng
bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 °c. Đổ bỏ SRB
và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bang acetic acid rồi để khô ưong không khí
ở nhiệt độ phòng.

- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã
bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử
dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc két quả về hàm lượng màu của
chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của té
bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
[OD(chất thử) - OD(ngày 0)]
% sống sót =

X

100

--------------------------------------------OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)

% ức chế = 100% - % sống sót
- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine
(Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các
nồng độ 10 pg/ml; 2 pg/ml; 0,4 pg/ml; 0,08 pg/ml.
DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức
chế 50% sự phát triển của tế bào) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính
TableCurve. Chất thử nào có IC50 < 20 pg/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân
đoạn hóa học) hoặc IC50 < 4 pg/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt
tính gây độc té bào và có khả năng ức ché sự phát triển hoặc diệt TBUT.

15


2.8. Phương pháp HPLC xác định hàm lượng hoạt chất nỉtidine trong các bộ
phận của cây Xuyên tiêu [8]
Máy sắc ký lỏng LC Agilent 1200 Series (USA). Sử dụng hoá chất dùng
cho phân tích HPLC (Merck, Đức). Cột sắc ký Zorbax Eclipse X-C18 (4,6
xl50mm, 5pm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent. Lượng mẫu bơm 5 pl, sử dụng
hệ thống bơm mẫu tự động có điều nhiệt, bơm và rửa kim sau khi nạp mẫu vào cột.
Detector DAD hấp thụ cực đại ở bước sóng 273 nm. Nhiệt độ cột 35 °c. Tốc độ
dòng 0,3 ml/phút. Hệ dung môi gradient acetonitrile (kênh A)/H20 (kênh B): chạy
gradient kênh A từ 50%-80%, kênh B từ 50%-20%.

16

CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM
3.1. Xử lý mẫu thực vật và điều chế các cặn chiết từ mẫu thực vật
Thân và cành cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitỉdum) sau khi thu hái về
được rửa sạch và chặt nhỏ, sau đó sấy đến khô ở nhiệt độ 60°c rồi nghiền thành bột.
Bột mẫu khô sau đó được ngâm chiết để điều chế các cặn chiết theo sơ đồ trong
Hình 2.

Hình 2: Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ cây Xuyên tiêu

17


3.2. Phân lập hợp chất nitidine từ cặn chiết
Cặn D (7 g) được sau khi tiến hành rửa giải qua cột Dianion HP-20 với hệ
dung môi MeOH-nước (0, 25, 50, 75, 100% MeOH), thu được 5 phân đoạn kí hiệu
từ ZN/D/1 đến ZN/D/5. Phân đoạn ZN/D/5 được sắc ký trên cột silica gel pha
thường với hệ dung môi CHCl3:MeOH (7:1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu
từ ZN/D/5-1 đến ZN/D/5-5. Phân đoạn ZN/D/5-3 được sắc ký trên cột silica gel pha
đảo YMC C-18 với hệ dung môi rửa giải Me0H:H20 (3:1, v/v) thu được chất ZN1
(chất rắn màu ngà vàng, 100 mg).
Sơ đồ chiết tách và phân lập các chất từ thân và cành cây Xuyên tiêu được
trình bày trong Hình 3.

18


Hình 3: Sơ đồ phân lập chất ZN1 từ phần cặn chiết nước của thân và cành cây
Xuyên tiêu

3.3. Hằng số yật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất ZN1
Chất rắn màu ngà vàng.
ESI-MS: m/z 347 [M-H]\ C2iH 18N 0 4
1H-NMR (500 MHz, DMSO) 5 (ppm): 9,84 (2H, s, H-6), 8,89 (1H, d, J = 9,0

Hz, H -ll), 8,36 (1H, s, H-10), 8,30 (1H, s, H-4), 8,28 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-12),
7,89 (1H, s, H-7), 7,77 (1H, s, H-l), 6,34 (2H, s, 0-CH 2-0), 4,89 (3H, s, N-CH3),
4,23 (3H, s, 8-OCH3), 4,049 (3H, s, 9 -OCH3).
19