XÁC ĐỊNH hàm LƯỢNG BISPHENOL a TRONG GIẤY IN NHIỆT THEO QTTNKT3 9 2018

Khóa luận tốt nghiệp

1

KHÓA LUẬN/ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Thẩm định phương pháp:

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BISPHENOL A
TRONG GIẤY IN NHIỆT THEO
QTTN/KT3 9:2018


Khóa luận tốt nghiệp

2

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BPA
CV
ECG
EFSA

Bisphenol A
Coefficient of variation
Electrocardiogram
European Food Safety

Hệ số biến thiên
Điện tâm đồ
Cơ quan An toàn Thực

FCM

Association
Food Contact Materials

phẩm Châu Âu
Vật liệu tiếp xúc thực

HPLC

High peformance liquid

phẩm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ISO

chromatography
International Standard

Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

LC - MS

Organization
Liquid Chromatography –

Sắc ký lỏng khối phổ

LOD

LOQ
MS
QC
RSD
SD

Mass Spectrometry
Limit of Detection
Limit of Quantification
Mass Spectrometry
Quality Control
Relative standard deviation
Standard deviation

Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Khối phổ
Kiểm soát chất lượng
Độ lệch chuẩn tương đối
Độ lệch chuẩn


Khóa luận tốt nghiệp

3

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. So sánh độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ tái lặp...................................16
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát thời gian lắc mẫu...............................................................29
Bảng 3.2 Kết quả sau khi tính toán..............................................................................29

Bảng 3.3 Đường chuẩn ngày 29/09/2018.....................................................................30
Bảng 3.4 Đường chuẩn ngày 25/10/2018.....................................................................31
Bảng 3.5 Đường chuẩn ngày 30/10/2018.....................................................................32
Bảng 3.6 Khảo sát độ tuyến tính..................................................................................33
Bảng 3.7 Độ lặp lại của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 0,5 µg/mL..................................34
Bảng 3.8 Độ lặp lại của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 1,0 µg/mL..................................35
Bảng 3.9 Độ lặp lại của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 0,5 µg/mL..................................36
Bảng 3.10 Độ lặp lại của mẫu blank, QC và CC..........................................................36
Bảng 3.11 Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp.......38


Khóa luận tốt nghiệp

4

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1Tổng hợp Bisphenol A từ acetone và phenol..................................................1
Hình 1.2. Cấu trúc không gian của Bisphenol A..........................................................1
Hình 1.3 Cơ chế in giấy nhiệt......................................................................................5
Hình 1.4 Mô hình hệ thống HPLC...............................................................................8
Biểu đồ 3.1 Kết quả khảo sát thời gian lắc mẫu...........................................................29
Biểu đồ 3.2 Mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak của ngày 29/09. .30
Biểu đồ 3.3 Mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak của ngày 25/10 . 31
Biểu đồ 3.4 Mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak của ngày 30/10. .32


Khóa luận tốt nghiệp

1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu đối tượng:
1.1.1Giới thiệu về Bisphenol A (BPA):
1.1.1.1. Sự ra đời và cấu tạo của bisphenol A:
Bisphenol A lần đầu tiên được tổng hợp bởi nhà hóa học người Nga Alexander
Dianin vào năm 1891.[1] Tuy nhiên tài liệu tổng hợp BPA đầu tiên được công bố chính
thức là của Thomas Zincke, đại học Marburd, Đức vào năm 1905. Hợp chất này được
tổng hợp bởi sự ngưng tụ của acetone (do đó hậu tố A trong tên) với hai phân tử
phenol. Phản ứng được xúc tác bởi một acid mạnh, chẳng hạn như acid chlohydric
(HCl) hoặc nhựa polystyrene sulfonate hóa.

Hình 1.1Tổng hợp Bisphenol A từ acetone và phenol


Khóa luận tốt nghiệp

2

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của Bisphenol A
1.1.1.2. Tính chất hóa lý:
BPA tinh khiết ở dạng tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 158-159oC, nhiệt
độ sôi 220oC, áp suất bốc hơi 0,2 mmHg (ở 170oC). BPA tan trong dung môi hữu cơ
kém phân cực như acetone, benzene, chloroform, methanol, toluene, xylene... nhưng
không tan trong nước và các dung môi phân cực như acid acetic, C 2H5OH,
formaldehyde và một số chất khác.
1.1.1.3. Ứng dụng:
Bisphenol A xuất hiện ở dạng tinh khiết như những phiến màu trắng có mùi như
phenol nhạt. BPA là một trong những vật liệu tiếp xúc thực phẩm FCM (Food Contact
Materials), là một monomer trong tổng hợp polycarbonate và một chất làm dẻo được
sử dụng trong sản xuất nhựa epoxy được sử dụng để ngăn chặn sự tiếp xúc của thực

phẩm và các ion kim loại, đảm bảo độ ổn định nhiệt và độ bền cơ học của chúng. BPA
không chỉ được sử dụng trong sản xuất bao bì thực phẩm, mà còn cho vật liệu nha
khoa, thiết bị chăm sóc sức khỏe, đồ chơi bằng nhựa và các sản phẩm dành cho trẻ em
và trẻ sơ sinh. BPA cũng được biết đến là sử dụng trong quá trình phát triển các chất
nhuộm được sử dụng với giấy nhiệt (thường được thấy trong biên nhận thu ngân). [2]
1.1.1.4. Độc tính:
BPA được sử dụng trong việc chuẩn bị nhựa để sản xuất vật liệu, bao bì nhựa,
đồ dùng nhà bếp, lớp phủ nắp bình có tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm. Do đó, BPA có
thể di chuyển vào thức ăn tùy thuộc vào nhiệt độ thực phẩm, thời gian gia nhiệt và đặc
tính hóa lý.
Vào năm 2017, Cơ quan Hóa chất châu Âu đã kết luận rằng BPA nên được liệt
kê là một mối quan ngại lớn do tính chất gây rối loạn nội tiết, liên quan đến những


Khóa luận tốt nghiệp

3

nguy cơ có thể bao gồm thay đổi chuyển hóa, bệnh tim mạch, tác động đến hệ sinh sản
và các nguy cơ khác.[3]
Trong một nghiên cứu thí nghiệm sử dụng mô mỡ ở người, nhóm nghiên cứu
của đại học Cincinnati phát hiện rằng BPA ức chế một hormone thiết yếu, adiponectin,
chịu trách nhiệm điều chỉnh độ nhạy cảm insulin trong cơ thể đồng thời gây ra nguy cơ
mắc hội chứng chuyển hóa cao hơn cho con người. Phát hiện của họ được công bố trên
tạp chí Environmental Health Perspectives, số trực tuyến ngày 14 tháng 8, 2008.
Trong một nghiên cứu của Patrica Hunt và các cộng sự ở phía bắc Carolina cho
biết khi chuột cái tiếp xúc với BPA đã cho thấy nó có khả năng làm gián đoạn quá trình
phân li nhiễm sắc thể trong tế bào trứng của động vật có vú và tạo ra một kiểu phân li
khác ở kỳ giữa của quá trình giảm phân. Các nghiên cứu thực nghiệm này chỉ ra rằng
việc tiếp xúc với BPA kể cả trong thời gian ngắn và liều lượng thấp cũng đủ để gây ra

những bất thường trong quá trình phân li nhiễm sắc thể. Quan trọng hơn, nghiên cứu
cũng cho thấy có mối liên quan rõ ràng với biến dị lệch bội ở người. [4] Trẻ nhỏ sớm
tiếp xúc với Bisphenol A sẽ bị tổn thương vĩnh viễn, Liên minh châu Âu (EU) đã cấm
sử dụng chai sữa cho trẻ em làm từ polycarbonate từ tháng 6 năm 2011.
Trong những năm qua, do tỷ lệ sản xuất ngày càng cao làm cho BPA hiện diện ồ
ạt trong môi trường. Việc tiếp xúc với BPA diễn ra không chỉ từ chuỗi thức ăn, nó cũng
có thể đi vào cơ thể thông qua đường hô hấp (bụi sàn, sơn). Ngoài ra, BPA đặc biệt có
trong giấy nhiệt, một thứ mà người hiện đại vẫn đang sử dụng hằng ngày. Một nghiên
cứu được tiến hành bởi Shelley Ehrlich và cộng sự vào năm 2015, Đại học Havard,
khoa Y tế cộng đồng năm 2015, phát hiện thấy sự gia tăng nồng độ BPA trong nước
tiểu sau khi tiếp xúc với hóa đơn trong 2 giờ liên tục mà không có găng tay.[5]


Khóa luận tốt nghiệp

4

1.1.2 Bisphenol A trong giấy nhiệt:
Việc sử dụng giấy nhiệt cho các hóa đơn bán vé, vé số, biên nhận ngân hàng, vé
xe bus, biên nhận tiền mặt, vé xem phim, thẻ hành lý, máy rút tiền ATM và giấy fax là
nguyên nhân làm tăng khả năng tiếp xúc của BPA với con người.
Năm 2015, Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) đã chỉ ra rằng giấy
nhiệt là nguồn tiếp xúc BPA thứ hai sau các vật liệu tiếp xúc thực phẩm.[6]
BPA có thể có mặt trong giấy nhiệt như monome tự do, hoạt động như một chất
kết dính màu hoặc đồng tác nhân kích hoạt hình thành màu trong khi tiếp xúc với nhiệt.
1.1.2.1 Giấy nhiệt và cơ chế in:[5]
Giấy nhiệt được sử dụng rộng rãi bởi các nhà bán lẻ để in hóa đơn bán hàng
trong các lĩnh vực khác nhau như cửa hàng tạp hóa, máy ATM ngân hàng để đảm bảo
dịch vụ nhanh chóng và chính xác. Giấy nhiệt cũng được sử dụng bởi các đại lý bán vé,
hệ thống xổ số và các doanh nghiệp khác, yêu cầu bản in có độ chính xác cao và số

lượng lớn. Các lĩnh vực y tế chuyên ngành như ngành y tế sử dụng hình ảnh chất lượng
cao được tạo ra bằng in nhiệt cho các bản in quan trọng và kỹ thuật cao, cần có độ
chính xác như điện tâm đồ (ECG), bản in siêu âm và toa thuốc.
Lớp phản ứng nhiệt của giấy nhiệt chứa BPA có vai trò như một chất tráng phim
và một loại thuốc nhuộm leuco, cũng như chất ổn định và chất kết dính.
Cơ chế in giấy nhiệt:


Khóa luận tốt nghiệp

5

Bề mặt giấy được phủ hỗn hợp trạng thái rắn của
thuốc nhuộm và một chất kết dính phù hợp, ví dụ:
thuốc nhuộm fluoran leuco

Gia nhiệt trên nhiệt
độ nóng chảy

Thuốc nhuộm Fluoran leuco phản ứng với acid (thường BPA)

Dạng thay đổi sau đó được bảo toàn trong trạng
thái siêu bền khi chất kết dính rắn lại đủ nhanh
Hình 1.3 Cơ chế in giấy nhiệt
1.1.2.2 Ưu điểm của in giấy nhiệt:
Máy in giấy nhiệt nhanh hơn nhiều so với các loại máy in khác khiến thời gian
chờ đợi ít hơn tại quầy thanh toán. Các hình ảnh được tạo ra có chất lượng cao và rõ
ràng hơn so với các loại in ấn khác, do đó làm cho chúng trở thành một thành phần
không thể thiếu được sử dụng ở khắp mọi nơi. Chúng được sử dụng ở tất cả các nơi
khác nhau, từ bệnh viện, nơi độ chính xác của bản in là rất quan trọng cho tới cửa hàng

địa phương, nơi các hóa đơn được ghi lại thông qua in nhiệt giúp người tiêu dùng chú ý
hơn đến chi tiêu của họ.


Khóa luận tốt nghiệp

6

Các máy in này cũng có khả năng in mã vạch chất lượng cao trực tiếp trên biên
nhận làm cho các giao dịch phức tạp như trả hàng và trao đổi trở nên dễ dàng hơn cho
khách hàng, nhà bán lẻ ngăn chặn việc trộm cắp và làm hóa đơn giả. Nói chung, giấy
nhiệt được phủ bằng BPA làm nó cực kỳ ổn định và chịu nhiệt. BPA được sử dụng để
làm lớp phủ cho giấy nhiệt đem lại cho nó những đặc tính vượt trội trong việc in không
sử dụng mực.
1.2 Các nghiên cứu về BPA trong giấy in nhiệt:
1.2.1 Khối phổ (MS):
Khối phổ (mass spectrometry) là thiết bị phân tích dựa trên xác định khối lượng phân
tử của các hợp chất bằng cách phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và
diện tích (m/z) của chúng.
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và bộ
phận phát hiện.
Đầu tiên mẫu được ion hóa trong nguồn ion rồi đưa vào bộ phận phân tích để tách các
ion theo tỉ số m/z. Các ion này sau đó đi vào bội phận phát hiện và được khuếch đại rồi
chuyển thành tín hiệu.
Một số kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng như ion hóa đầu phun điện tử (ESI –
electrospray ionization), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI – atmospheric
pressure chemical ionization) ….
Tác giả Russo và cộng sự thực hiện xác định BPA bằng ESI-MS được thực hiện
ở chế độ ion âm.
Quá trình ESI bao gồm các quá trình:

- Tạo thành các giọt mang điện tích
- Làm giảm kích thước của các hạt và phân nhỏ chúng


Khóa luận tốt nghiệp

7

- Quá trình hình thành pha hơi các ion.
Vì đây là kỹ thuật ion hóa mềm có độ nhạy cao nên được ứng dụng nhiều trong
phân tích các hợp chất không phân cực, trong trường hợp này là BPA..
1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) [7]
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ về cơ bản là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ
phận phát hiện là dectector khối phổ. Phương pháp này có nhiều ưu điểm như độ chọn
lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời
các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc ký thông thường không làm
được.
1.2.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV (HPLC) [8] [9]
1.2.3.1 Nguyên tắc cơ bản:
HPCL là một kỹ thuật tách các chất phân tích ra khỏi nhau khi chúng di chuyển theo
pha động qua cột chứa các hạt pha tĩnh.
Nói cụ thể hơn, kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất
cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ
bằng vật liệu hấp phụ rắn. Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau
với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn
tới sự phân tách các thành phần khì mà chúng chảy ra khỏi cột.


Khóa luận tốt nghiệp

8

1.2.3.2 Hệ thống HPLC gồm các thành phần cơ bản:

Hình 1.4 Mô hình hệ thống HPLC
 Hệ thống cấp pha động:
Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh, thường là hai dung môi hòa vào
nhau, trước khi sử dụng cần lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Khí hòa tan thường xuất hiện trong pha động, để đuổi khí thường sử dụng siêu âm hay
sục khí trơ như heli…
Có hai pha động thường được sử dụng là đã pha trộn sẵn và máy HPLC có bộ phận pha
trộn.
 Hệ thống bơm:
Bơm cao áp là bộ phận để đẩy pha động từ bình chứa dung môi đi qua cột bằng áp suất
cao (250-500at). Bơm được làm từ chất liệu có thể chịu được áp suất cao và không bị
dung môi ăn mòn.
 Hệ thống tiêm mẫu:


Khóa luận tốt nghiệp

9

Dung dịch mẫu phân tích được tiêm thẳng vào pha động bằng một xi lanh qua van tiêm
có vòng chứa mẫu.
Autosampler chứa nhiều mẫu và tiêm lần lượt các mẫu vào hệ thống sắc ký theo
chương trình đã chọn. Hiện nay đa số các máy đều được hỗ trợ hệ thống này.
 Cột và pha tĩnh:
Cột được chế tạo bằng thép không gỉ trơ với hóa chất và chịu được áp suất cao. Ngoài
cột chính còn có cột bảo vệ, cột này ngắn hơn cột sắc ký, nhồi hạt cùng loại và kích

thước hạt lớn hơn. Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các tạp chất có mặt
trong pha động.
Trong sắc ký lỏng vận hành thiết bị thường ở nhiệt độ phòng không cần điều nhiệt cột.
Tuy nhiên các máy sắc ký lỏng hiện đại thường được trang bị thêm hệ thống điều nhiệt
cột có thể đến 150oC.
 Bộ phận phát hiện (Detector):
Đầu dò UV – VIS là một loại đầu dò được sử dụng rộng rãi trong sắc ký lỏng, không
phá hủy mẫu và có độ tuyến tính cao 105 .Đầu dò UV – VIS được sử dụng với các hợp
chất có hấp thu trong vùng bước sóng UV – VIS. Sự hấp thu bức xạ của chất tan là một
hàm phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nó theo định luật Lambert-Beer:

-

-

 Bộ phận ghi và xử lý số liệu:
Máy ghi (Recorder)
Máy tích phân (Intergrator)
Máy tính với phần mềm điều khiển (Computer)
1.2.3.3 Các điểm cần lưu ý:
 Nguyên tắc chọn pha tĩnh và pha động:
Nếu có hỗn hợp chất phân tích:
Dự đoán độ phân cực của từng chất trong hỗn hợp dựa vào cấu trúc hóa học.


Khóa luận tốt nghiệp

-

10

Chọn pha tĩnh có độ phân cực gần với độ phân cực của các chất phân tích.
Chọn pha động có độ phân cực khác xa với độ phân cực pha tĩnh.
 Chất phân tích không phân cực thì chọn pha tĩnh không phân cực: C2, C4,
C8, C18, phenyl…. Pha động thì phân cực: acetonenitrile, methanol,
nước…


Khóa luận tốt nghiệp

11

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của đề tài là xác định Bisphenol A trong giấy in nhiệt bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV.
2.1.2 Nội dung nghiên cứu
Trên cơ sở mục tiêu đề ra, nội dung đề tài bao gồm:
- Tổng hợp các tài liệu liên quan đến bisphenol A và các phương pháp phân tích.
- Nghiên cứu khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc khảo sát xác định bisphenol
trong giấy nhiệt với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV.
- Thẩm định phương pháp:
o Đường chuẩn và độ tuyến tính
o Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
o Độ chính xác của phương pháp
o Độ không đảm bảo đo của phương pháp
2.2 Phương pháp nghiên cứu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao:
2.2.1 Nguyên lý:

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép bisphenol A được tách trên cột
thích hợp của sắc ký và được dò bằng đầu dò UV.
BPA được đo bằng đầu dò UV với bước sóng hấp thu sau khi tách cột pha đảo
(C18) trên thiết bị. [10]


Khóa luận tốt nghiệp

12

2.2.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp:
2.2.2.1 Ưu điểm:
- Loại được ảnh hưởng của nền và có độ tin cậy cao.
- Chọn lọc và có độ nhạy cao.
- Xác đinh được bisphenol A ở dạng vết.
2.2.2.2 Nhược điểm
Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành cao và đầu tư lớn.
2.2.3 Sơ lược về phương pháp xác định bisphenol A trong giấy in nhiệt bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hiện nay chưa có phương pháp tiêu chuẩn để xác định bisphenol A trong giấy in
nhiệt. Một số nghiên cứu xác định bisphenol A trong giấy nhiệt dựa theo trên mức độ
thôi nhiễm của bisphenol A trong nước rồi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao với đầu dò UV để xác định BPA.
2.3 Thực nghiệm
2.3.1 Quy trình:
Mười mẫu giấy nhiệt được sử dụng trong phương pháp này được cắt thành
những mảnh nhỏ. 20 mg được cho vào 50 mL nước cất và lắc trong 60 phút với vận tốc
60v/p. Mẫu sau lắc được lọc qua màng lọc 0,45 mm. [13]
2.3.2 Hóa chất:
BPA (độ tinh khiết tối thiểu ≥99%). Nước cất.

Khóa luận tốt nghiệp

13

2.3.3 Chuẩn bị mẫu:
Mẫu được lấy từ hóa đơn siêu thị, hóa đơn ngân hàng, ATM, vé số, vé xe bus,
hóa đơn nhà hàng, cửa hàng tiện lợi, biên lai thu tiền điện nước.
Ít nhất 10 biên lai thu được từ mỗi điểm lấy mẫu được bọc trong giấy nhôm, đặt
riêng biệt vào phong bì giấy không có BPA và được chuyển đến phòng thí nghiệm để
chuẩn bị mẫu.
2.3.4 Thiết bị:
2.3.4.1 Sắc ký
Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV.
Các điều kiện chạy máy:
 Cột: C18, 100, 5μm, (Nucleosil 100-5 C1810, hoặc tương đương), 250nm
x 4 mm
 Nhiệt độ cột: 20oC
 Hệ pha động: Methanol : nước = 65:35
 Kiểu rửa giải: đẳng môi/đẳng dòng (isocratic)
 Tốc độ dòng: 18 mL/min
 Thể tích tiêm mẫu: 40 μL
 Đầu dò huỳnh quang: bước sóng hấp thu: 275 nm.
2.3.4.2 Máy lắc
Máy lắc có khả năng giữ và xoay các chai chiết trong một chuyển động đầu cuối
ở tốc độ không đổi. Khoảng cách từ tâm trục quay đến tâm bình phải xấp xỉ 150 mm.
2.3.5 Dụng cụ:
- Bình trung tính 50 mL
- Pipette 10 mL

- Đầu lọc 0,45 μm


Khóa luận tốt nghiệp

14

- Vial loại 2,0 mL
- Pipette 5 mL
2.4 Các nội dung khảo sát [11][12]
2.4.1 Khảo sát thời gian lắc mẫu:
Mục đích của khảo sát thời gian lắc mẫu là để tìm ra thời gian thích hợp để chiết mẫu.
Để khảo sát thời gian chiết mẫu, thực hiện theo các bước sau đây:
1. Chuẩn bị mẫu: chuẩn bị 6 mẫu cùng khối lượng
2. Thực hiện xử lý mẫu theo quy trình
3. Lắc mẫu liên tục từ một đến 6 giờ, khoảng thời gian cách nhau 1 giờ. Sau khi
thu mẫu đã lắc trong máy lắc, lập tức tiến hành lọc mẫu và cho vào vial.
4. Phân tích mẫu và vẽ đồ thị biến thiên của nồng độ chất phân tích theo thời
gian.
2.4.2 Độ tuyến tính và đường chuẩn
Trong thực tế có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn trùm lên vùng nồng độ
trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ
trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn
và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn.
Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và kỹ
thuật khác nhau. Các loại đường chuẩn chủ yếu là:
-

Đường chuẩn với chuẩn tinh khiết
Đường chuẩn trên mẫu trắng

Đường chuẩn trên mẫu thực
Đường chuẩn có sử dụng nội chuẩn

Dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết sẽ được áp dụng trong phương pháp
thử nghiệm này:


Khóa luận tốt nghiệp

15

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn. Xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x (lặp
lại 3 lần và lấy giá trị trung bình).
Nếu sự phụ thuộc tuyến tính ta có khoảng khảo sát với đường biểu diễn là một
phương trình có dạng:
y = ax + b
Trong đó:

a: giá trị hệ số góc có giá trị là

b: giá trị hệ số chặn có giá trị là

và hệ số tương quan:

Nếu 0,995 < R ≤ 1: Có tương quan tuyến tính rõ rệt
Quy trình thực hiện:
1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
 Dung dịch chuẩn gốc bisphenol A (1000 mg/L): cân 10 mg (độ chính xác
0.01mg) chuẩn bis phenol A dạng tinh khiết vào bình định mức 10 ml và
định mức đến vạch bằng methanol. Dung dịch được bảo quản ở (4 ± 4 ºC),

giữ trong 3 tháng.
 Dung dịch chuẩn trung gian bisphenol A (100 mg/L): rút chính xác 1.0mL
dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L vào bình định mức 10 ml, định mức đến
vạch bằng MeOH. Dung dịch bảo quản (4 ± 4 )ºC, giữ trong 3 tháng.


Khóa luận tốt nghiệp

16

 Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc với nước cất theo bảng sau. Bảo quản (4
± 4)ºC và sử dụng trong 3 tháng.
Bảng 2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Thể tích dung dich

Thể tích bình định

Nồng độ cuối,

1

chuẩn 100 mg/L, mL
0.05

mức, mL
10

µg/mL
0.5

2

0.1

10

1.0

3

0.2

10

2.0

4

0.5

10

5.0

5

1.0

10

10.0

STT

2. Thực hiện 3 ngày khác nhau
3. Xác định nồng độ chất phân tích
4. Tìm phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn
2.4.3 Giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện của một phương pháp (LOD) là nồng độ chất phân tích thấp
nhất trong một mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng giá trị chính xác.
LOD có 2 loại là LOD của thiết bị và LOD của phương pháp.
Cách xác định:

 Phương pháp định tính:
Để xác định LOD của phương pháp định tính đầu tiên là phải dự đoán sơ bộ
nồng độ mà chắc chắn có mặt của chất cần phân tích.


Khóa luận tốt nghiệp

17

Ta thực hiện phân tích mẫu trắng có thêm chuẩn ở khoảng 6 đến 8 nồng độ khác
nhau, lặp lại từ 5 đến 10 lần để tăng độ tin cậy. Lập bảng thống kê tỷ lệ phần trăm phát
hiện và không phát hiện (dương tính/âm tính).
Xác định nồng độ thấp nhất mà tại đó tỷ lệ phần trăm vẫn còn đạt 100% thì đó
chính là giới hạn phát hiện của phương pháp.

 Phương pháp định lượng:
Cách 1: Xác định LOD của thiết bị dựa vào đường chuẩn, với công thức

Trong đó: SD là độ lệch chuẩn
b là hệ số góc của đường chuẩn
Cách 2: Xác định LOD dựa trên tỷ lệ giữa tí hiệu và nhiễu (Signal/Noise)
Giá trị của LOD được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu gấp 2 -3 lần đường nhiễu
nền, đường nền này được tính về hai phía, tốt nhất là hai bên lân cận của peak. LOD
thông thường được lấy bằng 3 lần S/N. (với S là chiều cao peak của chất phân tích).
Cách 3: Xác định LOD dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng:
Công thức tính:

Với

Trong đó:

: trung bình của mẫu trắng


Khóa luận tốt nghiệp

18

SDo: độ lệch chuẩn của mẫu trắng
Điều kiện: độ lệch chuẩn phải khác 0.
Trong phương pháp này ta sẽ xác định LOD thông qua xác định MDL (giới hạn phát
hiện của phương pháp).
Ta có MDL là nồng độ tối thiểu của một chất mà có thể đo được với độ tin cậy lên đến
99%, được xác định từ nồng độ chất phân tích trong một nền mẫu nhất định. [15]
Quy trình thực hiện:
1. Chuẩn bị mẫu: chuẩn bị 3 mẫu mỗi ngày, thực hiện 3 ngày khác nhau.
2. Thêm chuẩn vào mẫu: thêm 0,2 mL dung dịch chuẩn trung gian 100 ppm vào

nền mẫu.
3. Xử lý mẫu theo quy trình.
4. Phân tích 9 mẫu và tính độ lệch chuẩn của 9 mẫu. Nếu có bất cứ mẫu nào trong
số 9 mẫu đó không cho một giá trị cụ thể thì phải lặp lại quá trình thêm chuẩn
với một nồng độ cao hơn.
5. Tính kết quả MDL dựa trên mẫu thêm chuẩn, theo công thức dưới đây:
Trong đó: MDLS là giới hạn phát hiện của phương pháp dựa trên mẫu thêm
chuẩn.
là giá trị của hệ số Student với độ tin cậy 99% và bậc tự do n-1.
Ss là độ lệch chuẩn đối với mẫu thêm chuẩn.
Các điều kiện cần thiết để xác định MDL
 Chọn nồng độ chuẩn thêm vào mẫu gấp 2- 10 lần MDL
 Độ thu hồi đạt trong trong khoảng từ 80%-120%


Khóa luận tốt nghiệp

19

2.4.4 Giới hạn định lượng
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu có
thể định lượng được bằng phương pháp khảo sát với độ chụm và độ đúng chấp nhận
được trong điều kiện tiến hành phân tích.
Cách xác định:
Trong thực tế người ta thương kết hợp xác định LOQ và LOD. Các cách xác
định cũng tương tự như xác định LOD.
Cách 1: Xác định LOQ của thiết bị dựa vào đường chuẩn, với công thức:

Cách 2: Xác định LOD dựa trên tỷ lệ giữa tí hiệu và nhiễu (Signal/Noise)
Giá trị của LOD được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu gấp 10-20 lần đường

nhiễu nền, đường nền này được tính về hai phía, tốt nhất là hai bên lân cận của peak.
LOD thông thường được lấy bằng 10 lần S/N. (với S là chiều cao peak của chất phân
tích).
Cách 3: Xác định dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng:
Công thức tính LOQ:

Với và SDo tương tự như LOD.
2.4.5 Độ chính xác
Để diễn tả độ chính xác của một phương pháp dựa trên hai khái niệm độ đúng
và độ chụm. Nó thể hiện một dấu hiệu bất kỳ của lỗi hệ thống hoặc sai lệch trong
phương pháp.


Khóa luận tốt nghiệp

20

2.4.5.1 Độ chụm
Độ chụm thể hiện mức độ gần nhau (hay mức độ dao động) của các kết quả thử
nghiệm độc lập thu được quanh giá trị trung bình trong cùng điều kiện quy định.
Ta dùng khái niệm độ chụm để kiểm soát được những sai số ngẫu nhiên, vì
trong các trường hợp thử nghiệm trên mẫu khác nhau và điều kiện thí nghiệm khác
nhau thường cho kết quả không giống nhau.
Độ chụm có ba khái niệm cụ thể hơn là: độ lặp lại (repeatability), độ chụm trung
gian (intermediate precision) và độ tái lặp (reproducibility).
 Độ lặp lại: là phép đo sự biến đổi của các kết quả đo trong thời gian
ngắn.
 Độ chụm trung gian: là phép đo sự biến đổi của các kết quả đo
trong thời gian dài trong một phòng thí nghiệm.
 Độ tái lặp: là phép đo sự biến đổi của các kết quả đo trong thời gian

dài.
Sự khác biệt của các khái niệm trên được khái quát trong bảng sau:
2.4.5.2 Độ đúng
Độ đúng là mức độ sai lệch giữa giá trị trung bình của kết quả và giá trị thực
hoặc giá trị được chấp nhận. Độ đúng được đặc trưng bằng độ chệch (bias).
Độ chệch được tính theo công thức:

Với:

∆ là độ chệch, %

Xtb là giá trị trung bình của các kết quả thử nghiệm
μ là giá trị thực hay giá trị đúng (giá trị được chấp nhận là đúng)


Khóa luận tốt nghiệp

21

Độ chệch được xem như là sai số tổng thể của hệ thống, sai khác càng lớn thì độ
chệch càng lớn.
Những nguyên nhân dẫn đến sai số thường là do mẫu phân tích, phương pháp
thử ngiệm, phòng thí nghiệm, người phân tích, thiết bị đo,…
2.4.5.3 Cách xác định độ lặp lại:
Dựa trên các giá trị của độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối, độ lệch chuẩn
trung bình.

- Độ lệch chuẩn:

Trong đó:

SD là độ lệch chuẩn
là giá trị thu được của lần thử nghiệm thứ “i”
là giá trị trung bình của các kết quả thử nghiệm
n là số lần thử nghiệm

- Độ lệch chuẩn tương đối:

Trong đó:
RSD là độ lệch chuẩn tương đối, %
CV là hệ số biến thiên, %
- Độ lệch chuẩn trung bình: