NGHIÊN cứu TPHH tạo mùi HƯƠNG đặc TRƯNG TRONG TINH dầu TRẦM HƯƠNG AQUILARIA CRASSNA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TPHH TẠO
MÙI HƯƠNG ĐẶC TRƯNG TRONG
TINH DẦU TRẦM HƯƠNG
AQUILARIA CRASSNA


LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, tinh dầu đóng một vai trò vô cùng quan trọng, chúng được sử dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau như dùng làm dược phẩm trong y học giúp bảo vệ và
nâng cao sức khỏe, tạo hương thơm góp thêm phần hấp dẫn cho các loại thực phẩm, sử
dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất nước hoa, hương liệu và mỹ phẩm. Vì vậy, tinh
dầu luôn được quan tâm và trở thành đối tượng của nhiều công trình nghiên cứu khoa
học.
Cây Dó Bầu (Aquilaria crassna) là loài cây phân bố chủ yếu ở khu vực Đông
Nam Á, chúng có khả năng hình thành một loại sản phẩm đặc biệt gọi là trầm hương.
Trong đó, tinh dầu trầm hương (Agarwood oil) là loại tinh dầu mang lại giá trị kinh tế
rất cao và có nhiều ứng dụng thực tiễn phục vụ cho nhu cầu y học, hương liệu và mỹ
phẩm [19].
Đã có nhiều nghiên cứu về tinh dầu trầm hương được công bố tuy nhiên ở Việt
Nam cho đến hiện nay vẫn còn rất ít. Đặc biệt công trình nghiên cứu xác định các
thành phần tạo mùi hương đặc trưng trong tinh dầu trầm hương Aquilaria crassna, loài
có khả năng tạo ra tinh dầu trầm hương chất lượng tốt vẫn chưa phổ biến [15]. Mặc dù
tinh dầu trầm hương có rất nhiều thành phần khác nhau nhưng thường chỉ có một vài
thành phần chính có giá trị và tạo nên mùi hương đặc trưng cho nó. Trong khi đó nhu
cầu về thông tin, dữ liệu các thành phần tạo mùi đặc trưng trong tinh dầu trầm hương
để sử dụng cho mục đích hương liệu, thực phẩm và mỹ phẩm ngày càng cao. Xuất phát
từ những yêu cầu đặt ra như vậy chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
thành phần hóa học tạo mùi hương đặc trưng trong tinh dầu trầm hương Aquilaria
crassna” với mục đích xác định được các hợp chất tạo mùi hương đặc trưng của tinh

dầu trầm hương từ đó làm tiền đề cho việc tổng hợp nên hương liệu nhân tạo.


Trong đề tài này, chúng tôi cung cấp một số thông tin tổng quan về cây dó bầu
và tinh dầu trầm hương, tiến hành khảo sát thành phần hóa học trong tinh dầu trầm
hương của cây dó bầu A. crassna có nguồn gốc tại Việt Nam bằng phương pháp GCMS, tách phân đoạn và đánh giá cảm quan các thành phần tạo mùi hương, xác định
nhóm hợp chất tạo mùi hương đặc trưng trong tinh dầu trầm hương.


1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DÓ BẦU
1.1.1 Tên gọi
Tên khoa học: Aquilaria crassna Pierre.
Tên thường gọi: cây dó bầu, trầm hương.
Tên thương mại: Agarwood.
Bộ (Order): Malvales.
Họ (Family): Thymelaeaceae.
Chi (Genus): Aquilaria.
1.1.2 Đặc điểm thực vật

Hình 1.1 Cây dó bầu.

Cây dó bầu là loại cây thân gỗ sống lâu năm, cao từ 15-20 m, có cây cao đến 30
m. Thân thẳng, đường kính khoảng 40-60 cm, vỏ ngoài mỏng màu nâu xám. Cành
cong, mọc hơi chếch.
Tán lá thưa, lá mọc so le, hình bầu dục hay hình trứng, nhọn ở gốc, thon hẹp ở
đầu. Phiến lá dài 8-10 cm, rộng 3.5-5.5 cm, có mép phồng lên thành vòng. Mặt trên có
màu xanh, sáng bóng, nhẵn, mặt dưới màu nhạt hơn, có lông mịn, cuống lá dài 4-6 mm.

Hoa nhỏ, có cuống, đài hoa hình chuông, màu vàng nhạt hay vàng lục, có lông
mềm ở hai mặt. Hoa mọc thành cụm hay thành tán ở nách lá.
Quả khô, loại quả nang, hình quả lê, có lông mịn, thông thường dài 4 cm, rộng 3
cm, dày 2 cm. Mỗi quả thường có từ 1- 2 hạt.


2

Hạt có hai phần, phần chính ở phía trên dạng hình nón và phần kéo dài ở phía
dưới. Hạt khi chín có màu nâu, phần vỏ ngoài cùng hóa gỗ cứng, bên trong mềm có
chứa nhiều dầu.

a) Lá

b) Hoa

c) Quả
d) Hạt
Hình 1.2 Các bộ phận chính của cây dó bầu.
Cây dó bầu sau khi trồng khoảng 4-5 năm tuổi thì bắt đầu ra hoa kết trái. Tùy
vào điều kiện thời tiết ở mỗi vùng mà thời gian này có sự khác nhau. Cây thường ra
hoa và kết trái từ tháng 4 đến tháng 7 [1].


3

1.1.3 Phân bố
Trong tự nhiên cây dó bầu phân bố khắp các nước Châu Á từ Trung Đông, Nam
Á, Trung Quốc cho đến các nước Đông Nam Á.
Ở Việt Nam, cây dó bầu phân bố rải rác khắp các tỉnh vùng núi từ Hà Giang,

Quảng Ninh, Hoà Bình, Tuyên Quang, Thanh Hóa, Nghệ An đến Tây Ninh, An Giang
và Kiên Giang (đảo Phú Quốc). Tập trung nhiều nhất là ở các tỉnh mền trung và tây
nguyên như Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Gia Lai, Kon Tum, Bình Ðịnh, Phú
Yên, Khánh Hòa [1].
1.1.4 Phân loại
Trên thế giới có tổng cộng khoảng 25 loài dó bầu. Ở nước ta, hiện đã phát hiện
tất cả 6 loài: Aquilaria crassna, Aquilaria baillonii, Aquilaria banaense, Aquilaria
malaccensis, Aquilaria sinensis và Aquilaria rugosa [2], [9], [19]. Trong đó, loài
Aquilaria rugosa được phát hiện vào năm 2005 bởi GS.TS Lê Công Kiệt (Việt Nam)
và TS. Paul Kessler (Hà Lan), đây được xem là loài thứ 6 ở Việt Nam và thứ 25 trên
thế giới [16].
1.1.5 Đặc tính sinh học
Cây dó bầu có khả năng hình thành một loại sản phẩm đặc biệt gọi là trầm
hương. Tuy nhiên, không phải bất kỳ cây dó bầu nào cũng có trầm hương. Chỉ có một
số cây nhiễm bệnh mới chứa trầm ở phần lõi của thân cây và quá trình này chỉ xảy ra
đối với cây dó bầu còn sống. Thường tìm thấy ở những cây dó bầu bị bệnh sau thời
gian từ 10 ÷ 20 năm.
Sự tạo thành trầm hương là kết quả của sự biến đổi các phần tử gỗ do quá trình
chuyển hóa các bệnh lý ở những nơi cây bị bệnh, bị thương hoặc bị tác động bởi những
yếu tố bên ngoài tạo nên vết thương xảy ra một cách tự nhiên từ năm này sang năm


4

khác. Ngày nay, người ta còn sử dụng các loài vi sinh để tạo nên các vết thương cho
cây nhằm tăng khả năng hình thành trầm hương.

Hình 1.3 Sự tạo thành trầm hương của loài Aquilaria crassna bị nhiễm bệnh.
Tùy thuộc vào sự biến đổi các phần tử gỗ mà có thể thu được những sản phẩm
khác nhau như:

Tóc: do sự biến đổi một phần chất gỗ bên ngoài hình thành những đường đen
như sợi tóc nhưng lượng tinh dầu rất ít nên thường được dùng làm nhang đốt.
Trầm hương: do sự biến đổi không hoàn toàn của phần tử gỗ. Gỗ trầm hương
nhẹ, có vị cay, hơi đắng, mùi thơm nhẹ, có màu nâu hay sọc đen, ngấm tinh dầu trầm
hương nhiều hơn tóc. Trầm hương càng tốt khi nó càng dễ chìm trong nước. Khi đốt
cháy trầm hương bốc khói lên hình vòng rồi tan biến nhanh trong không khí. Dùng để
chưng cất tinh dầu.
Kỳ nam: là loại tốt nhất do có sự biến đổi hoàn toàn của phần tử gỗ, thấm
nhiều tinh dầu trầm hương, sản phẩm này có các màu nâu đậm, đen hoặc xanh. Kỳ nam
nặng và chìm trong nước, có đủ vị đắng, cay, chua, ngọt thơm, thường hình thành ở
phần lõi của cây. Kỳ nam chứa nhiều tinh dầu trầm hương nên khi cháy tạo ngọn lửa
màu xanh, khói lên thẳng và cao, bay lơ lửng trong không khí rất lâu [2].


5

1.2 TINH DẦU TRẦM HƯƠNG (AGARWOOD OIL)
1.2.1 Một số công trình nghiên cứu về tinh dầu trầm hương Aquilaria
crassna
1.2.1.1) Nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu trầm hương
Thành phần hóa học của tinh dầu trầm hương đã được nhóm các nhà khoa học
như nhóm M. Ishihara, nhóm N. Thavanapong, nhóm Regula Naef, nhóm Nurlaila
Ismail ... quan tâm và có nhiều công trình nghiên cứu. Hầu hết họ đồng ý rằng các
thành phần sesquiterpens và dẫn xuất chromone là các hợp chất chính trong tinh dầu
trầm hương [5], [14], [15], [21], [22].
Năm 2009, N. Thavanapong và đồng nghiệp đã nghiên cứu thành phần hóa học
của tinh dầu trầm hương Aquilaria crassna từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước và chiết xuất CO2 siêu tới hạn. Thành phần hóa học thu được từ hai phương pháp
là tương đối giống nhau nhưng thành phần định lượng của chúng thì khác nhau. Tinh
dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước gồm 8 thành phần chính:

γ-selinene, γ-10-epi-eudesmol, selina-3,11-dien-9-one, tetradecanal, γ-eudesmol,
epoxybulnesene, valerianol và selina-3,11-dien-14-al .Trong khi đó tinh dầu thu được
từ chiết xuất CO2 siêu tới hạn gồm 8 thành phần chính là selina-4,11- dien-14-al, axit
octadecanoic, campesterol, oxo-agarospirol, γ-sitosterol, hexadecanol, valerianol,
selina-3,11-dien-9-one và selina-3,11-dien-14-al [22].
Năm 2010, Nhóm các nhà khoa học dẫn đầu bởi Regula Naef đã phân tích các
thành phần dễ bay hơi của gỗ trầm hương ở một số loài Aquilaria, trong đó có A.
crassna. Chỉ ra một số nhóm hợp chất phổ biến bao gồm: agarofurans, cadinanes,
eudesmanes, valencanes và eremophilanes, guaianes, prezizanes, vetispiranes, 2-(2phenylethyl)-chromones, tetrahydro-2-(2-phenylethyl)-chomones, diepoxytetrahydro2-(2-phenylethyl)-chromones [19].


6

Năm 2011, P. Pripdeevech, W. Khummueng, and Seung-Kook Park đã nghiên
cứu xác định các thành phần dễ bay hơi từ ba loại tinh dầu trầm hương (A. malaccensis
, A. subintegra và A. crassna) đánh giá theo phương pháp sắc ký khí khối phổ (GCMS) và sắc độ khí-phép đo độ nhạy khứu giác (GC-O). Họ đã tìm thấy tổng cộng có 31
thành phần. Một tập hợp gồm 18 trong số 31 thành phần được xác định từ tinh dầu của
A. malaccensis với thành phần chính là isoamyl dodecanoate, guaia-1(10), 11-dien-15ol, karanone, cyclocolorenone và jinkoh-eremol. Tinh dầu A.subintegra mang lại 28
hợp chất được xác định với các thành phần phong phú nhất là isoamyl dodecanoate,
kusunol, jinkoh-eremol, epoxybulnesene và agarofuran, Trong khi 30 hợp chất dễ bay
hơi từ A. crassna đã được xác định với isoamyl dodecanoate, agarofuran, kusunol,
dehydrojinkoh-eremol và 9,11-eremophiladien-8-one là các thành phần chính. Thành
phần mùi đặc trưng được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật GC-O. Các thành phần
chính chịu trách nhiệm cho hương thơm bao gồm -agarofuran, 4-phenyl-2-butanone,
furfural và benzaldehyde. Đặc tính hương thơm của các chất bay hơi cũng được liệt kê:
-agarofuran đặc trưng mùi gỗ, là thành phần hoạt động hương thơm mãnh liệt nhất
của tinh dầu trầm hương. 4-phenyl-2-butanone có khả năng chịu trách nhiệm về các
mùi hương chính của hoa nhài, thảo dược và trái cây. Trong khi furfural và
benzaldehyde chịu trách nhiệm về các mùi hạnh nhân, trái cây [21].
Năm 2011, Jutarut Pornpunyapat, Pakamas Chetpattananondh, Chakrit và các

đồng nghiệp đã phân tích thành phần hóa học của tinh dầu trầm hương A. crassna
chưng cất lần lượt ở nhiệt độ 80 0C, 1000C, 1200C bằng phương pháp GC-MS đã thu
được số lượng các hợp chất chính tương ứng 8, 13, 21 chất. Điều này chỉ ra rằng nhiệt
độ chưng cất ảnh hưởng đến các hợp chất hóa học của chiết xuất tinh dầu. Ở nhiệt độ
chưng cất cao hơn, các thành phần có điểm sôi cao hơn của tinh dầu có thể được chiết
xuất qua đó thu được số lượng hợp chất hóa học nhiều hơn. Tinh dầu trầm hương thu
được ở nhiệt độ cao có tính chất tốt hơn, màu đậm hơn, nặng hơn, độ bền của tinh dầu


7

cao hơn, hương thơm và độ bám dính lâu hơn với da người. Tinh dầu chưng cất ở 80 0C
có agarospirol, alloaromadendrene, valencene và valerenol là các hợp chất chính.
Aristolene, 1,5-diphenyl-3-pentanone và agarospirol được tìm thấy là các hợp chất
chính của tinh dầu chưng cất ở 100 0C. Aromadendrenepoxide, agarospirol, alphaGurjunene và 2-naphthaleneethanol là các hợp chất chính của tinh dầu được chưng cất
ở 1200C [20].
Năm 2014, Y. Hashim và N.I. Ismail và P. Abbas, đã chỉ ra rằng các
sesquiterpenes là thành phần hoạt động chính đóng vai trò quan trọng trong việc tạo
mùi thơm và mùi dễ chịu cho tinh dầu trầm hương [12].
Một nghiên cứu của Nor Azah Ma, Ismail N, Mailina J và cộng sự được công bố
vào năm 2014. Trong nghiên cứu này, các thành phần hóa học của một số mẫu tinh dầu
trầm hương được lấy từ nhiều nguồn khác nhau đã được phân tích bằng bằng phương
pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), sáu hợp chất có ý nghĩa đã thu được trong
hầu hết các mẫu tức là 4-phenyl-2-butanone, α-guaiene, ar-curcumene, 10-epi-γeudesmol, dihydroagarofuran và valencene [18].
Năm 2014, nhóm các nhà khoa học được dẫn đầu bởi Nurlaila Ismail đã tiến
hành phân tích thành phần hóa học tinh dầu trầm hương và phân loại chất lượng của
nó. Thông thường, tinh dầu trầm hương được phân loại theo màu sắc, mùi thơm và dựa
trên cảm giác con người. Tuy nhiên, đánh giá này cho thấy tinh dầu trầm hương có thể
được phân loại theo tính chất hóa học. Nhiều nhà nghiên cứu đã nghiên cứu sự khác
biệt của thành phần hóa học trong tinh dầu trầm hương, hầu hết trong số họ đồng ý

rằng các thành phần sesquiterpens và dẫn xuất chromone là các hợp chất chính trong
tinh dầu trầm hương. Ba hợp chất sesquiterpenes chỉ được phát hiện ở tinh dầu chất
lượng cao nhất đó là: (-)-guaia-1(10), 11-dien-15-al, (-)-selina-3,11-dien, 9-one và (+)selina-3,11-dien, 9-ol. Các thành phần: 9-11-eremophiladien-8-one và oxo-agarospirol
đã được tìm thấy trong tinh dầu trầm hương chất lượng thấp. β-agarofuran, α-


8

agarofuran và 10-epi-eudesmol là những hợp chất chính trong chất lượng cao. Trong số
đó, agarofuran là hợp chất quan trọng nhất với tinh dầu chất lượng cao và nó đóng góp
vào mùi thơm của tinh dầu trầm hương [15].
Năm 2017, J Majid, AH Hazandy và các đồng nghiệp đã phân tích thành phần
hóa học của trầm hương từ các loài Aquilaria khác nhau (A.crassna, A.sinensis và A.
subintegra) đã được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp GC-MS. Nhìn chung,
tổng cộng có 20 hợp chất được xác định trong tất cả các loại gỗ trong đó có 13 hợp
chất từ A.crassna, 17 hợp chất từ A. sinensis và 17 các hợp chất từ A. subintegra. Một
số hợp chất dễ bay hơi phổ biến trong cả ba loài cụ thể là 4-phenyl-2-butanone,
agarofuran, dihydroagarofuran, α-bulnesene, α-agarofuran, aromadendrene, 10-epi-eudesmol, agarospirol, valencene, valerianol và α-eudesmol. Dihydroagarofuran là một
trong những hợp chất chính trong tất cả ba loài. Agarospirol là hợp chất phong phú
nhất đối với A. crassna, trong khi đó α- eudesmol là các hợp chất cao nhất trong A.
sinensis và A. subintegra [17].
Năm 2018, Đinh Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố nghiên cứu thành phần dễ
bay hơi của tinh dầu trầm hương từ Aquilaria crassna trồng ở tỉnh Khánh Hòa được
thực hiện bằng các phương pháp khác nhau bao gồm thủy phân, hỗ trợ enzyme, chưng
cất hơi nước hỗ trợ vi sóng, chiết bằng dung môi và carbon dioxide siêu tới hạn. Các
hợp chất dễ bay hơi của sản phẩm được phân tích bởi GC-MS. Hầu như tất cả các mẫu
có chứa một số thành phần đặc trưng phổ biến, chẳng hạn như benzylacetone, 10-epi-γeudesmol,

agarospirol,

valerianol,

eudesmol,

α-eudesmol,

neopetasane

và

dihydrokaranone. Tuy nhiên, có sự khác biệt về sản lượng, thành phần và số lượng các
thành phần được xác định [9].
Một nghiên cứu của Daoud Tajeldeinn Ahmaed and Ajaykumar D. Kulkarni
được công bố năm 2018. Nghiên cứu này mô tả các thành phần hóa học của các loài
Aquilaria, chủ yếu là Aqularia malaccensis, Aqularia sinensis và Aqularia crassna.


9

Có sự khác nhau giữa các nhóm hợp chất đã được xác định trong này các loài, chủ yếu
là Sesquiterpenoids, chromone và các hợp chất thơm dễ bay hơi. Một loạt kỹ thuật
phân tích khác nhau đã được sử dụng để phân lập các hợp chất từ gỗ trầm hương và
dung môi là phương pháp phổ biến nhất trong số đó. Các dung môi phân cực được sử
dụng để thu được các hợp chất phân cực và chromone, trong khi hầu hết các
sesquiterpenes là thu được từ dung môi không phân cực. Thành phần sesquiterpenes
trong trầm hương có thể được chia chủ yếu thành: Agarofurans, Agarospiranes,
Guaianes, Eudesmanes, Eremophilanes và Prezizananes. Từ các tài liệu đã tìm kiếm, có
thể kết luận rằng 6-methoxy-2-[2-(4-methoxypheny1)-ethyl]-chromone và 2-(2
(4methoxyphenyl)-ethyl)-chromone là hai chất chiếm ưu thế nhất tìm thấy ở tất cả các
loài [5].

1.2.1.2) Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của tinh dầu trầm hương
Kết quả nghiên cứu của Y.H. Hashim, A. Phirdaous, A. Azura và các đồng
nghiệp thực hiện vào năm 2014 đã chứng minh tiềm năng chống ung thư của tinh dầu
trầm hương thu được từ quá trình chưng cất gỗ trầm hương đối với các tế bào ung thư
vú. Trong nghiên cứu này, dựa trên các sàng lọc đơn giản (xét nghiệm khả năng sống
của tế bào và xét nghiệm khả năng gắn kết tế bào) cũng như xét nghiệm độc tế bào,
tinh dầu trầm hương đã được kiểm tra hoạt động chống ung thư của nó đối với các tế
bào ung thư vú. Tinh dầu trầm hương gây giảm số lượng tế bào trong cả khả năng sống
và tiêu diệt tế bào, ức chế sự gắn kết tế bào và làm cho các tế bào tách ra [13].
Năm 2015, S. Dahham, M. Tabana và các cộng sự đã công bố đặc tính chống
ung thư, chống oxy hóa và kháng khuẩn của Caryophyllene từ tinh dầu Aquilaria
crassna. Nghiên cứu đã chứng minh Caryophyllene có hoạt động kháng khuẩn rõ rệt và
tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ. Nghiên cứu kết luận rằng Caryophyllene có đặc tính
gây độc tế bào có chọn lọc một cách mạnh mẽ chống lại các tế bào ung thư đại trực
tràng của con người. Các nghiên cứu sâu hơn chỉ ra rằng Caryophyllene có khả năng


10

ức chế mạnh mẽ chống lại sự nhân bản, ngăn chặn sự vận động và tập hợp của khối u.
Những kết quả này giúp khẳng định rằng, Caryophyllene có tiềm năng lớn để được
phát triển hơn nữa như là một tác nhân hóa trị liệu đầy hứa hẹn chống lại các khối u ác
tính đại trực tràng [6], [7].
Cũng trong năm 2015, S. Dahham và đồng nghiệp lần đầu tiên làm sáng tỏ đặc
tính chống ung thư tuyến tụy của tinh dầu A. crassna, có thể kết luận rằng tác dụng
chống ung thư từ chiết xuất tinh dầu là do ảnh hưởng kết hợp của các thành phần hóa
học có hoạt tính sinh học có trong tinh dầu [8].
1.2.2 Công dụng của tinh dầu trầm hương
Tinh dầu trầm hương là chất lỏng sánh nhớt, có màu vàng, vàng nâu hay màu đỏ
hổ phách và mùi thơm đặc biệt, rất dai. Có rất nhiều công dụng trong y học, hương liệu

và mỹ phẩm.
1.2.2.1) Y học
Tinh dầu trầm hương đã được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc và các
quốc gia Đông Nam Á để điều trị các bệnh truyền nhiễm, viêm khớp và tim mạch. Nó
đã được sử dụng rộng rãi bởi người Ả Rập và Nhật Bản để điều trị rối loạn tiêu hóa,
giảm đau và an thần. Chiết xuất A. crassna được biết đến là thảo dược truyền thống của
Thái Lan để điều trị các chứng rối loạn khác nhau bao gồm viêm, lão hóa, ung thư và
rối loạn tim mạch. Một số nghiên cứu khoa học đã tiết lộ rằng các chiết xuất tinh dầu
của A. crassna có chứa các hợp chất chống oxy hóa, kháng khuẩn, gây độc tế bào, hạ
sốt, giảm đau, chống thiếu máu cục bộ, nhuận tràng và tiêu hóa [6], [13].
1.2.2.2) Hương liệu – Mỹ phẩm
Tinh dầu trầm hương là chất định hương có giá trị đặc biệt trong công nghệ chế
biến các loại hương liệu, nguyên liệu không thể thiếu trong ngành công nghiệp nước
hoa tạo ra các dòng nước hoa cao cấp cho mùi hương độc đáo. Tinh dầu trầm hương có


11

tác dụng làm đẹp da, chống lão hóa giúp da mịn và lành sẹo được điều chế thành nhiều
loại mỹ phẩm. Các loại mỹ phẩm chứa tinh dầu trầm hương rất được ưa chuộng đặc
biệt ở các quốc gia Châu Á.
Ngoài ra, tinh dầu trầm hương được dùng để xông tinh dầu cho không gian sinh
hoạt giúp giảm căng thẳng thần kinh, thanh lọc không khí nhờ tác dụng khử trùng
mạnh mẽ, sử dụng làm một loại hương tạo mùi thơm đặc trưng trong các dịp lễ tôn
giáo quan trọng [15], [20].


12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Tinh dầu trầm hương sử dụng làm nguyên liệu
cho nghiên cứu này được cung cấp bởi Công ty
Agarvina Việt Nam thu được bằng phương pháp
chưng cất lôi cuốn hơi nước.
Gỗ trầm hương sản xuất tinh dầu được xác định
là Aquilaria crassna Pierre (họ Thymelaeaceae).

Hình 2.4 Tinh dầu trầm hương.
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp sắc ký cột trung áp (MPLC)
Sắc ký cột là một phương pháp dùng để tách một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất
ra thành từng loại đơn chất dựa vào độ phân cực khác nhau của những loại hợp chất đó
đối với một hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh.
Pha tĩnh thường là các hạt silicagel được nạp nén trong cột thủy tinh, mẫu chất
cần phân tích đặt ở phía trên đầu cột pha tĩnh. Pha động là dung môi giải ly, đặt ở phía
trên mẫu cần phân tách. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phía dưới cột, được hứng bằng
những hủ bi thủy tinh đặt phía dưới trước ống dẫn cột.


13

Sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel pha thường thì hợp chất không (kém) phân
cực được giải ly ra khỏi cột trước, còn hợp chất phân cực giải ly ra sau. Với hai chất
không phân cực, chất có trọng lượng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn bị giữ
lại trong cột lâu hơn chất còn lại.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký cột trung áp. Sử
dụng máy bơm hút dung môi từ bình chứa đẩy vào đầu cột, từ đó đẩy chất ra khỏi cột
nhờ áp lực của bơm trung áp. Có thể điều chỉnh tốc độ dòng chảy của dung môi nhờ

van điều chỉnh của máy bơm [3], [10].
2.2.2 Phương pháp đánh giá cảm quan thành phần tạo mùi hương
Đánh giá cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để
nhận biết, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan của một sản phẩm như màu sắc,
hình thái, mùi vị và cấu trúc.
Để đánh giá cảm quan các thành phần tạo mùi hương chúng tôi sử dụng phép
thử cho điểm. Phép thử này thường dùng để xác định xem mức độ khác nhau về một
tích chất cảm quan nào đó giữa nhiều mẫu là bao nhiêu. Trong nghiên cứu này, phép
thử được dùng để xác định xem nhóm thành phần tạo hương có mùi thơm giống mùi
của tinh dầu trầm hương hay không.
Trước tiên người thử sẽ được làm quen để xác định mùi hương của mẫu. Giai
đoạn tiếp theo người thử sẽ nhận được đồng thời tất cả các mẫu cần đánh giá. Những
người này thường là các chuyên gia cảm quan, đã có thời gian dài được huấn luyện và
làm việc trong lĩnh vực này. Sau khi ngửi thử, người thử sẽ đánh giá cường độ của tính
chất cảm quan của mỗi mẫu thông qua một điểm số tương ứng với một thuật ngữ mô tả
cường độ của tính chất ấy đã được quy định sẵn. Thang điểm thường dùng trong phép
thử này là thang 6 điểm. Thang điểm hay thuật ngữ mô tả là do người điều hành thí
nghiệm lựa chọn, tuy nhiên cần tránh những thuật ngữ không rõ nghĩa [4].


14

2.2.3 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) là sự kết hợp hai kỹ thuật để tạo thành một
phương pháp duy nhất trong phân tích hỗn hợp các chất. Hai thiết bị này có khả năng
bổ sung và hỗ trợ cho nhau trong quá trình phân tích, sắc ký khí tách các thành phần
của một hỗn hợp và khối phổ phân tích đặc tính của từng thành phần riêng lẻ đó. Như
vậy, khi tiêm mẫu vào hệ thống sẽ tách ra các thành phần riêng biệt từ hỗn hợp các chất
và xác định từng thành phần trong chúng. Hơn nữa, nó còn có khả năng xác định được
hàm lượng của từng thành phần.

Thiết bị GC-MS được cấu tạo gồm hai phần: phần sắc ký khí (GC) và phần khối
phổ (MS):
- Sắc ký khí (GC) dùng để chia tách hỗn hợp chất ra các thành phần riêng lẻ,
mỗi thành phần có một giá trị riêng biệt. Trong sắc ký khí sự chia tách xuất hiện khi
mẫu được bơm vào pha động. Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, mỗi hợp
chất trong hỗn hợp mẫu tương tác với pha tĩnh một lực tương tác khác nhau, hợp chất
tương tác yếu sẽ thoát ra khỏi cột trước. Hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi
sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hay áp suất của pha động. Pha động là một khí trơ
như heli, pha tĩnh được sử dụng là hóa chất và được chứa trong cột. Cột GC được làm
bằng thủy tinh, inox hay thép không gỉ có kích thước rất đa dạng. Chiều dài thường lớn
hơn 25m và đường kính rất nhỏ như một ống mao dẫn. Một chất chia tách, rửa giải
phóng đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò. Đầu dò có khả năng tạo ra một tín hiệu khi phát
hiện ra chất cần phân tích. Tín hiệu này phát ra từ máy tính, thời gian từ khi bơm mẫu
đến khi rửa giải gọi là thời gian lưu (tR). Nếu trong cùng điều kiện sắc ký như nhiệt độ,
loại cột…giống nhau thì cùng một chất luôn có cùng thời gian lưu. Trong quá trình
chạy sắc ký, máy tính sẽ tạo ra một đồ thị từ các tín hiệu gọi là sắc ký đồ. Mỗi peak
trong sắc ký đồ đại diện cho một tín hiệu được tạo ra khi một chất rửa giải từ cột sắc ký
đi vào đầu dò detector. Trục hoành biểu thị thời gian lưu (tR), trục tung biểu thị cường


15

độ của tín hiệu. Mỗi đỉnh peak biễu diễn một chất riêng lẻ và có thời gian lưu tương
ứng.
- Khối phổ (MS) dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó.
Khi giải hấp các chất riêng lẻ ở pha khí từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện
ion hóa (mass spectrometry) và bị vỡ thành những mãnh vụn là các vật mang điện (ion)
rồi đi vào đầu dò detector. Máy tính sẽ ghi lại biểu đồ sau mỗi lần quét. Trục hoành
biễu diễn tỉ lệ m/z (tương ứng với khối lượng phân tử mỗi mãnh) còn trục tung biễu
diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn được quét bởi đầu dò detector. Biểu đồ này

gọi là khối phổ. Khối phổ MS này được đem so sánh với các khối phổ MS chuẩn có
trong thư viện khối phổ đã được xác định trước. Việc này giúp ta có thể định danh
được chất đó [11].


16

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
3.1.1 Hóa chất
Dung môi dùng để chạy cột: n-hexane, ethyl acetate.
Dung môi dùng để phân tích GC-MS: n-hexane, acetone.
Silicagel cỡ hạt 40 – 60 µm được sử dụng cho pha thường.
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ
3.1.2.1) Thiết bị
Thiết bị GC-MS GC-MS Scion 456-GC/Scion SQ.

Hình 3.5 Thiết bị GC-MS Scion 456-GC/Scion SQ.
Máy bơm và máy phân đoạn hứng tự động.
Máy cô quay chân không Buchi.
Cân phân tích.
Máy đánh siêu âm Sonicator.


17

Máy thổi khí nitơ N2 LCMS.
3.1.2.2) Dụng cụ
Cột sắc ký đường kính 1,7 cm.
Dụng cụ dùng để hứng phân đoạn: hủ bi 20mL.

Dụng cụ chứa mẫu phân tích: Vial 1,5 mL.
Bình cầu cô quay.
Một số dụng cụ khác: bình chứa dung môi, pipet định mức, pipet paster, phễu
thủy tinh, ống đong, erlen...
3.2 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TINH DẦU TRẦM HƯƠNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS
3.2.1 Công đoạn chuẩn bị mẫu
Mẫu được chuẩn bị bằng cách hòa tan 10µL tinh dầu Trầm hương trong 990µL
n- hexane và 200 µL acetone cho vào một vial.

Hình 3.6 Mẫu tinh dầu Trầm hương phân tích GC-MS.


18

3.2.2 Công đoạn phân tích GC-MS
Thành phần hóa học của tinh dầu trầm hương xác định bằng phương pháp phân
tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) được thực hiện tại Viện hàn lâm khoa học và
công nghệ Việt Nam (Số 1, Mạc Đĩnh Chi, P. Bến Nghé, Q.1, Tp.HCM).
Phân tích GC-MS được tiến hành trên máy Scion 456-GC/Scion SQ (Scion
Instrument, Hoa Kỳ) với cột sắc ký khí RESTEK (dài 30m; đường kính 0,25mm; phim
dày 0,25m) cùng phần mềm điều khiển MS Workstation 8. Các điều kiện phân tích
cho GC-MS là được liệt kê trong bảng 2.1.
Bảng 3.2.2.1.a.1 Các điều kiện để phân tích cho GC-MS
Chương trình
Điều kiện
Nhiệt độ ban đầu: giữ ở 100oC trong vòng 1 phút.
Giai đoạn 1: tăng 15oC/phút cho đến 140oC thì giữ 20
Chương trình nhiệt

phút.
Giai đoạn 2: tăng 10oC/phút tới 230oC.
Giai đoạn 3: tăng 25oC/phút tới 280oC.

Khí mang
Tốc độ dòng
Thể tích mẫu tiêm
Nhiệt độ buồng tiêm
Năng lượng ion hóa
Ghi nhận khối phổ m/z

Heli
1 mL/phút
1µL
250oC
70 eV
Trong khoảng 50-500 amu

Việc định danh các thành phần trong tinh dầu được thực hiện bằng cách so sánh
phổ của từng cấu tử tách ra trên sắc ký đồ với các phổ chuẩn có trong thư viện phổ
NIST MS Search 2.2.


19

Mức độ phù hợp giữa các chất có trong mẫu nghiên cứu và chất đề nghị được
xác định bằng đại lượng độ tương hợp khối phổ (Match). Độ tương hợp càng cao thì
kết quả định danh càng chính xác. Khi phổ khối của một chất phân tích hoàn toàn
giống với phổ khối của một chất chuẩn trong thư viện thì độ tương hợp khối phổ được
biểu thị là 1000. Độ tương hợp đạt trên 800 được xem là cho kết quả có độ tin cậy cao.

Đồng thời dựa trên tỉ lệ diện tích peak của các cấu tử xác định được % hàm lượng các
chất có trong mẫu phân tích.
3.3 TÁCH PHÂN ĐOẠN TINH DẦU TRẦM HƯƠNG BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ CỘT TRUNG ÁP
3.3.1 Mô tả hệ thống

Hình 3.7 Hệ thống sắc ký cột
Hệ thống gồm cột sắc ký bằng thủy tinh, đầu cột được ráp nối với một hệ thống
bơm nén, áp lực bơm có thể điều chỉnh. Máy bơm hút dung môi từ bình chứa đẩy vào
đầu cột, từ đó giúp đẩy chất đi qua lớp hấp thu nhanh hơn. Đầu dưới cột được gắn vào
máy phân đoạn.


20

3.3.2 Tiến hành lên cột sắc ký
Sử dụng cột có kích thước:
- Đường kính cột: d = 1,7cm.
- Chiều cao cột: h = 90cm.

Hình 3.8 Cột sắc ký
Chất hấp thu sử dụng là silicagel đối với pha thường có cỡ hạt từ 40-60 µm.
Lượng silicagel đã dùng: m = 120g.
Lựa chọn dung môi chạy cột thích hợp: n- hexane và ethyl acetate (từ dung môi
không phân cực đến phân cực)
- Dung môi n- hexane dùng để tách các chất không (kém) phân cực.
- Ethyl acetate dùng để tách các chất có độ phân cực trung bình.
Nạp chất hấp thu vào cột (nhồi cột): sử dụng phương pháp nhồi khô. Cố định cột
thẳng đứng, dùng phễu rót silicagel vào cột và nén chặt (chừa một khoảng phía trên để
nạp mẫu) sau khi nạp xong tiến hành bơm dung môi để ổn định cột.

21

Sau khi ổn định cột, ta tiến hành nạp mẫu, lúc này mặt thoáng của silicagel
trong cột phải bằng phẳng. Mẫu là tinh dầu nên ta tiến hành nạp dung dịch mẫu lỏng
với thể tích mẫu: V= 3mL. Dùng pipet để hút dung dịch mẫu, đặt đầu của pipet gần sát
với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành
trong của cột cho dung dịch chất chảy dọc theo thành trong của cột chạm xuống bề mặt
chất hấp thu.
Kỹ thuật dùng để giải ly ra khỏi cột: sử dụng lực đẩy. Dùng máy bơm hút dung
môi từ bình chứa đẩy vào đầu cột, từ đó đẩy chất ra khỏi cột. Có thể điều chỉnh tốc độ
dòng chảy của dung môi nhờ van điều chỉnh của máy bơm, tốc độ bơm: 3mL/phút, áp
suất: 3 bar.
- Quy trình chạy cột với dung môi n- hexane và ethyl acetate:

a)

c)
d)
b)
Hình 3.9 Quy trình sắc ký cột tinh dầu Trầm hương.

a) Đầu tiên, tiến hành chạy cột với dung môi n- hexane. Lớp màu vàng bắt đầu
tách ra sau đó chuyển sang giai đoạn trong suốt không màu.
b) Tiếp theo, thay đổi tỉ lệ dung môi n- hexane : ethyl acetate lên 9:1 thì tách được
lớp có màu vàng nhạt.


22

c) Khi tăng tỉ lệ dung môi n- hexane : ethyl acetate đến 8:2 thì xuất hiện lớp màu
vàng đậm tách ra.
d) Bắt đầu xả cột bằng dung môi ethyl acetate 100% thì tách ra được lớp màu nâu
đậm.
Khi dung môi ra khỏi cột, ta thu chúng vào các phân đoạn khác nhau nhờ vào
máy phân đoạn theo thời gian hay theo thể tích. Hứng bằng hủ bi dung tích 20mL, mỗi
chu trình sẽ được hứng với 36 hủ bi.

Hình 3.10 Một chu trình của máy phân đoạn hứng tự động.
Tổng số phân đoạn tách được là 525 phân đoạn. Sau đó, đem vào máy thổi khí
nitơ đuổi dung môi.