cơ chế kháng kháng sinh

Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Phụ lục

MỞ ĐẦU
Kháng kháng sinh là hiện tượng vi sinh vật đề kháng lại một kháng sinh mà trước đây vi
sinh vật đã nhạy cảm, dẫn đến giảm hiệu quả của kháng sinh, thất bại trong điều trị nhiễm
khuẩn và thậm chí là lây lan sang các bệnh nhân khác. Kháng kháng sinh là một hậu quả của
sử dụng kháng sinh, đặc biệt trong trường hợp lạm dụng kháng sinh và phát triển khi có sự đột
biến trong hệ gen của vi sinh vật hoặc vi sinh vật được tiếp nhận gen kháng thuốc.
Kháng kháng sinh đã và đang trở thành một vấn đề mang tính toàn cầu. Hiện tượng kháng
thuốc kháng sinh xuất hiện vào những năm 1950, chỉ sau một thời gian ngắn sau khi thuốc
kháng sinh bắt đầu được đưa vào sử dụng.Mặc dù vào đầu những năm 1980, nhiều loại kháng
sinh mới được phát hiện nhưng trong 30 năm trở lại đây, không có loại kháng sinh nào được
tìm thấy. Điều này có nghĩa là tốc độ phát minh kháng sinh mới có dấu hiệu tụt lùi so với sự
phát triển bất thường của vi sinh vật, kéo theo đó là sự gia tăng tất yếu của hiện tượng kháng
kháng sinh và nguy cơ không còn kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trong tương
lai. Vì vậy, việc phát hiện vi sinh vật kháng kháng sinh và gen đột biến gây nên hiện tượng
kháng kháng sinh là rất cần thiết trong việc khắc phục hiện tượng kháng thuốc và phát triển
các loại kháng sinh mới.
Có nhiều phương pháp để phát hiện kiểu hình và kiểu gen của vi sinh vật kháng thuốc như
phát hiện vi sinh vật kháng thuốc bằng phương pháp D-test hoặc pha loãng thạch…. Tuy
nhiên, trong bài này, chúng tôi sẽ giới thiệu về phương pháp xác định gen mã hóa cho sự
kháng hai loại kháng sinh Erythromycin và Vancomycin dựa trên nguyên tắc của phương pháp
PCR. Đây là phương pháp tương đối phổ biến hiện nay trong việc phát hiện kiểu gen kháng
thuốc vì độ tin cậy cao.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH VÀ SỰ KHÁNG KHÁNG SINH Ơ
VI KHUẨN

1

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

1.

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Kháng sinh

Kháng sinh (antibiotics) là tất cả những chất hóa học được chiết xuất từ môi trường nuôi
cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp, chúng có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu
diệt vi sinh vật bằng cách tác động chuyên biệt trên một giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi
sinh vật. Ngày nay, số lượng và chủng loại kháng sinh rất nhiều và đa dạng. Tùy thuộc vào đặc
điểm cấu tạo hóa học và hiệu quả tác động, mà có thể có nhiều cơ chế tác động của kháng sinh
lên vi sinh vật và thậm chí có những cơ chế còn chưa được hiểu biết đầy đủ. Tuy nhiên, kháng
sinh tác động lên vi khuẩn theo một số cơ chế chính sau:
1.1.

Ức chế sự sinh tổng hợp của màng tế bào

Các kháng sinh điển hình cho cơ chế tác dụng này bao gồm nhóm β- lactam,
nhóm Glycopeptide (Vancomycin), và nhóm polymycine (baxitracin). Nhìn chung, những
kháng sinh này có khả năng tác động vào nhiều giai đoạn của quá trình tổng hợp màng tế bào
vi sinh vật, cụ thể như: ngăn cản quá trình vận chuyển thành phần tạo màng ra ngoài màng,
ức chế các men tổng hợp các yếu tố của tế bào vi khuẩn… Bên cạnh đó, những kháng sinh này
có thể làm rối loạn quá trình nhân lên của vi khuẩn; đó là vi khuẩn vẫn có thể nhân lên nhưng

không có vách hoặc vách không hoàn chỉnh. Khi đó, vi khuẩn rất mỏng manh, kích thước dài
ra, dễ bị tiêu diệt bởi môi trường xung quanh hoặc bị đại thực bào bắt và tiêu diệt.
1.1.2 Gây

rối loạn chức năng màng nguyên sinh chất
Kháng sinh gây rối loạn tính thấm của màng nguyên sinh chất, các chất được tổng hợp
bị thoát ra khỏi tế bào. Vì vậy, kháng sinh ức chế các quá trình chuyển hoá năng lượng,
ảnh hưởng đến sự hô hấp của vi khuẩn và ức chế quá trình phân chia tế bào, ví dụ:
kháng sinh Polymycin có cơ chế tác dụng kiểu này.
1.1.3
Ức chế sinh tổng hợp protein và acid nucleic
- Tác dụng lên ribosom của vi khuẩn:
1.1.4
+ Kháng sinh gắn lên tiểu phần 30S của ribosom và ngăn cản ARN vận chuyển
(tRNA) mang acid amin đối mã với phân tử ARN thông tin (mRNA), dẫn đến các
protein không được tổng hợp. Vì vậy, vi khuẩn sẽ bị ức chế và tiêu diệt. Kháng
sinh có tác dụng theo cơ chế này phải kể đến: tetracyclin.

+ Kháng sinh tác động lên tiểu phần 50S của ribosom làm rối loạn các tổng hợp protein do
ngăn cản quá trình hình thành liên kết peptid giữa các acid amin nên không hình thành được
chuỗi polypeptide, ví dục Macrolide (Erythromycin), Lincosamid và Phenicol.

2

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

- Kháng sinh tác động lên acid folic: acid folic là cơ sở cho sự tổng hợp methionin, purin và
pyrimdin, từ đó tổng hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn. Sulfamid và
trimethoprim có cấu trúc hoá học tương tự acid folic và acid paraaminobenzoic, khi sử dụng
sulfamid và trimethoprim để điều trị, các phân tử này cạnh tranh enzym và chiếm chỗ trong
quá trình tổng hợp protein và acid nucleic làm cho sự hoạt động của tế bào bị rối loạn.
-Kháng sinh gắn vào enzym gyrase làm cho enzym này không cắt được phân tử ADN hình
vòng của vi khuẩn thành dạng sợi thẳng. Vì vậy, ADN không thể nhân lên được, đồng thời
cũng ngăn cản quá trình sao chép mã di truyền thành ARN thông tin. Kết quả làm cho vi
khuẩn không nhân lên được và cũng không tổng hợp được protein. Kháng sinh tác dụng theo
cơ chế này là nhóm Quinolon.
2.

Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn
2.1. Các loại đề kháng kháng sinh
2.1.1. Đề kháng giả:

Vi khuẩn có biểu hiện đề kháng nhưng không có liên quan về gen nên không di truyền được.
Trên thực tế, một số hiện tượng đề kháng của vi khuẩn khi nằm trong các ổ ápxe lớn hoặc có
tổ chức hoại tử bao bọc dẫn đến kháng sinh không thấm vào được ổ viêm nên không tác động
được đối với vi khuẩn gây bệnh.
Tương tự, khi vi khuẩn ở trạng thái nghỉ (không phát triển, không chuyển hoá) thì không chịu
tác dụng của thuốc ức chế quá trình sinh tổng hợp chất như vi khuẩn lao nằm trong hang lao.
Ngoài ra, có thể gặp hiện tượng kháng thuốc giả khi hệ thống miễn dịch của cơ thể bị suy
giảm hoặc chức năng của đại thực bào hạn chế thì cơ thể không đủ khả năng loại trừ những vi
khuẩn đã bị kháng sinh ức chế, khi hết kháng sinh, chúng hồi phục và phát triển trở lại.
2.1.2.

Đề kháng thật:

Đây là hình thức đề kháng do gen quy định và có tính di truyền.
- Đề kháng tự nhiên: Một số vi khuẩn không chịu tác động của một số kháng sinh nhất định
như Pseudomonas không chịu tác dụng của Penicillin, tụ cầu không chịu tác dụng của colistin.
Đó là sự dung nạp thuốc hoặc các vi khuẩn không có vách như Mycoplasma sẽ không chịu tác
dụng của kháng sinh ức chế sinh tổng hợp vách như nhóm β-lactam
- Đề kháng thu được: Do một biến cố di truyền là đột biến hoặc nhận được gen đề kháng làm
cho vi khuẩn đang từ không có gen đề kháng trở thành có gen đề kháng. Trên thực tế, kháng
sinh là một nhân tố chọn lọc của vi khuẩn.

3

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

2.2.

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Cơ chế đề kháng kháng sinh
Gen đề kháng tạo ra sự đề kháng bằng cách:

- Làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất: vi khuẩn đề kháng có khả năng tạo ra một
protein đưa ra màng ngăn cản kháng sinh thấm vào tế bào vi khuẩn hoặc làm mất khả năng
vận chuyển qua màng do cản trở protein vận chuyển. Vì vậy, kháng sinh không vào được trong
tế bào.
- Sinh ra các isoenzyme, dẫn đến vi khuẩn không còn chịu sự tác động của kháng sinh nữa
(không thu hút được kháng sinh) nên không chịu tác động của kháng sinh. Ví dụ: sulfamid và
trimethoprim.

- Làm thay đổi đích tác động: Đột biến gen làm thay đổi cấu trúc của các phân tử protein,
những receptor tiếp nhận kháng sinh bám vào. Kết quả kháng sinh không gắn được vào điểm
đó được nữa nên không có tác dụng. Ví dụ: một protein cấu trúc hoặc do một nucleotid trên
tiểu phần 30S hoặc 50S của ribosom bị thay đổi sẽ giúp vi khuẩn kháng Streptomycin,
Erythromycin.
- Sinh ra enzyme làm biến đổi cấu trúc hoá học của phân tử kháng sinh làm mất tác dụng của
kháng sinh hoặc phá huỷ cấu trúc hoá học của phân tử kháng sinh, ví dụ β-lactamase làm cho
kháng sinh nhóm β-lactam mất tác dụng.
-Cơ chế bơm thuốc ra (efflux pumps): hệ thống bơm thoát dòng có tác dụng chuyển kháng
sinh ra ngoài, làm giảm nồng độ kháng sinh trong tế bào của vi khuẩn.
- Những vi khuẩn kháng kháng sinh thường do phối hợp các cơ chế đề kháng kháng sinh với
nhau. Ví dụ: một số vi khuẩn Gram (-) kháng β-lactam là do có men β-lactamase kết hợp với
giảm khả năng gắn với kháng sinh và giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất.
2.3.

Cơ chế lan truyền đề kháng

Vi khuẩn mang gen đề kháng kháng sinh sẽ được truyền dọc từ thế hệ này sang thế hệ khác
qua sự nhân lên của tế bào hoặc có thể được truyền ngang từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác.
Cơ chế lan truyền gen đề kháng là:
- Trong tế bào: Gen đề kháng có thể truyền từ phân tử ADN này sang phân tử ADN khác ngay
trong một tế bào nhờ cơ chế transposon.
- Giữa các tế bào: Thông qua các hình thức vận chuyển di truyền như tiếp hợp, biến nạp, tải
nạp, gen đề kháng chuyển từ tế bào này sang tế bào khác trong cùng một loài hoặc khác loài.

4

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH

Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

- Trong quần thể vi sinh vật: Thông qua sự chọn lọc dưới tác dụng của kháng sinh, những vi
khuẩn đề kháng được chọn lọc và phát triển sẽ thay thế những vi khuẩn nhạy cảm.
- Trong quần thể đại sinh vật: Những vi khuẩn đề kháng sẽ được lây lan từ người này sang
người khác qua con đường trực tiếp hoặc gián tiếp.
2.4.

Macrolide và cơ chế kháng của vi khuẩn

1.1.1

MACROLIDE
2.4.2.1.

Cấu tạo và phổ
hoạt động

2.4.1. Cấu tạo và phổ hoạt động của macrolide
Macrolide là một trong những kháng sinh quan trọng nhất được sử dụng để điều trị nhiễm
trùng do vi khuẩn Gram dương gây ra như Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae
và Streptococcus pyogenes và tác dụng hiệu quả trên các chủng vi sinh vật đã kháng Penicilin
và Tetracyclin, đặc biệt là Staphylococus và ở những người có biểu hiện dị ứng với penicillin.
Erythromycin, được chiết từ vi nấm Streptomyceserythreus, là kháng sinh đầu tiên thuộc
nhóm macrolide được dùng rộng rãi nhất, bắt đầu sử dụng trên lâm sàng từ nǎm 1950.[1]
Macrolide được đặc trưng bởi một vòng lacton có 14, 15 hoặc 16 cạnh mang một hoặc
nhiều các gốc đường(cladinose, desosamine…) (bằng liên kết glycosit) và các gốc thay thế
phụ liên kết với các nguyên tử khác nhau của vòng lacton.

-Loại thuốc vòng 14 cạnh, chẳng hạn như: Erythromycin, Clarithromycin, Roxithromycin,
Dirithromycin…
-Loại thuốc vòng 15 cạnh như: azithromycin…
-Loại thuốc vòng 16 cạnh như: tylosin, carbomycin A, josamycin, midecamycin,
miocamycin, rokitamyin, và spiramycin …
Thế hệ mới nhất của họ Macrolide là ketolide-được đặc trưng bởi sự thay thế đường
cladinose ở vị trí C3 với 1 nhóm keto.
2.4.2.2.

Cơ chế tác động
của thuốc:

2.4.2. Cơ chế tác động của macrolide
Macrolide thuộc nhóm tác động đến quá trình tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn
( tranh giành vị trí gắn ở ribosom và ngăn cản vị trí chuyển dịch của axit amin):
Macrolide liên kết với các tiểu đơn vị ribosome lớn (50S) trong vùng lân cận trung tâm

5

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

peptidyl transferase và gây ra kiềm hãm tăng trưởng tế bào vi khuẩn do ức chế tổng hợp
protein. Do đó, nó là kháng sinh kìm khuẩn hay tĩnh khuẩn, tức không có tác dụng hủy diệt
mầm bệnh mà chỉ có tác dụng ức chế sự nhân lên của chúng.
Cơ chế chính xác phụ thuộc vào cấu trúc hóa học cụ thể của thuốc, có 4 kiểu ức chế tổng

hợp protein của Macrolide:
-

Ức chế tiến triển của các chuỗi peptit mới tạo thành;
Xúc tiến phân li tRNA peptidyl khỏi các ribosom;
Ức chế hình thành liên kết peptit;
Can thiệp vào sự lắp ráp tiểu đơn vị ribosom 50S.
2.4.2.3.

Vị trí gắn kết của
Macrolide trên
ribosom:

Vị trí chung của các nơi liên kết macrolid là trên tiểu đơn vị ribosome lớn (50S).
Cụ thể:
-

RNA tạo nên thành phần cơ bản của vị trí gắn Macrolide (một số dư lượng nucleotide trong
miền V của 23S rRNA tương tác với các phân tử nhóm macrolid).
Mối liên kết đó góp phần đáng kể cho sức mạnh của sự tương tác của các phân tử macrolid với
ribosome, được hình thành giữa chuỗi mono hoặc disaccharide C5 của Macrolide vòng 14 - 15
- và 16 cạnh và rRNA.
2.4.2.4. Cơ chế
khángMacrolide
của vi khuẩn:
2.4.32. Cơ chế kháng macrolide của vi khuẩn
Vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh macrolide, lincosamide-streptogramin B trong 3 cách:
(1) thông qua chỉnh sửa mục tiêu bằng cách methyl hóa hoặc đột biến có thể ngăn chặn
sự gắn kết của kháng sinh để ribosome của nó mục tiêu.
(2) thông qua cơ chế bơm thuốc ra (efflux pumps).

(3) Cơ chế enzyme khử hoạt tính thuốc.
1.3.1.4.12.4.32.1. Cơ chế thay đổi vị trí mục tiêu của thuốc:
Mỗi chất kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác nhau ở vi khuẩn. Các đích cho
kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự gắn kết của một protein, do đó thuốc
không thể gắn vào và tác động đến vi khuẩn. Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu hết kháng
sinh. Với các loại vi khuẩn kháng Macrolide thì việc sửa đổi vị trí mục tiêu thông qua việc
methyl hóa ribosome mục tiêu, đột biến ribosome mục tiêu hay thông qua trung gian peptide.
6

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

a.

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Methyl hóa ribosome
Năm 1956, ngay sau khi Erythromycin được đưa vào điều trị, sự kháng thuốc đã xuất hiện
ở các chủng thuộc Staphylococci. Nghiên cứu sinh hóa cho thấy sức đề kháng là do sự methyl
hóa mục tiêu ribosome của thuốc kháng sinh, dẫn đến sự đề kháng chéo với Macrolide,
Lincosamide, và Streptogramin B, gọi là MLSB kiểu hình. Sau đó, các kiểu hình MLS B mã hóa
bởi một loạt các gen erm (Erythromycinribosome methylase) đã được báo cáo trong một số
lượng lớn các vi sinh vật. Các chủng kháng thuốc Erythromycin đầu tiên của liên cầu khuẩn
(Streptococci) đã được báo cáo tại Vương quốc Anh vào năm 1959 và Bắc Mỹ vào năm
1967[1]. Cho đến nay, methyl hóa ribosome vẫn là cơ chế phổ biến nhất của quá trình kháng
MLSB.
Trong vi khuẩn gây bệnh, các protein được tổng hợp từ gen erm là một đơn adenine trong
23S, một phần của tiểu đơn vị lớn (50S) của ribosome. Như một hệ quả của sự methyl hóa,

liên kết của Erythromycin với mục tiêu của nó bị suy yếu. Sự chồng chéo các liên kết của
Macrolide, Lincosamide, và Streptogramin B trong 23S rRNA dẫn đến sự kháng chéo giữa 3
loại thuốc. Một loạt các vi sinh vật kháng macrolid bao gồm cả vi khuẩn gram dương, xoắn
khuẩn, và vi khuẩn yếm khí, đều biểu hiện gen Erm methylases.
Gần 40 gen erm đã được báo cáo cho đến nay. Trong vi khuẩn gây bệnh, các yếu tố
quyết định chủ yếu được sinh ra bởi plasmid và transposon được tự transferable. Có thể phân
biệt 21 loại gen erm và protein Erm tương ứng dựa vào sự tương đồng về kiểu gen (<80%).
Bốn lớp chính được phát hiện trong vi sinh vật gây bệnh: erm (A), erm (B), erm (C), và erm
(F). erm (A) và erm (C) thường là lớp gen có trong tụ cầu (Staphylococc). Lớp generm(B) chủ
yếu trong liên cầu khuẩn (streptococci) và vi khuẩn đường ruột (enterococci), và lớp gen
erm(F) trong loài Bacteroides và vi khuẩn kỵ khí khác. Ngoài các gen erm (B), các gen
ermTR, được coi là một tập hợp con của lớp gen erm(A) trên cơ sở trình tự tương đồng, có
thể được phát hiện trong β-hemolyticStreptococci.
Biểu hiện của sự kháng MLSB có thể là cấu thành hoặc cảm ứng. Trong kháng cảm ứng, vi
khuẩn tạo ra mRNA không hoạt động, không thể mã hóa methyl hóa. Lúc này, mRNA sẽ được
kích hoạt chỉ có sự hiện diện của một chất cảm ứng macrolid. Ngược lại, trong biểu hiện cấu
thành, hoạt động methyl hóa mRNA được sản xuất trong trường hợp không có cảm ứng.

b.

Đột biến ribosome mục tiêu

7

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Trong lựa chọn in vitro của Escherichia coli đột biến ribosome được đánh giá cao trong
việc đề kháng với Erythromycin. Dimethyl hóa một nucleotide của rRNA 23S bởi methyl
transferase loại erm. Cơ chế này chịu trách nhiệm phần lớn trong việc kháng Clarithromycin ở
các chủng vi khuẩn Mycobacterium avium và Helicobacter pylori. Đột biến tương tự cũng đã
được báo cáo trong Treponema pallidum và các loài Propionibacterium.
Đột biến trong protein ribosome L4 và L22 tạo ra sự kháng Erythromycin đã được ghi
nhận trong phòng thí nghiệm và phân lập lâm sàng của S.pneumoniae. Những thay đổi tạo
thành nhóm trong một chuỗi bảo tồn cao của L4 và tạo tính kháng Macrolide nhưng không
kháng Clindamycin. Mặc dù các loại đề kháng được coi là không thể chuyển nhượng, nhưng
phế cầu (S.pneumococci) có thể có được gen kháng kháng sinh bằng gen bên ngoài chuyển
vào bằng cách chuyển đổi sau đó tái tổ hợp tương đồng, do đógen kháng kháng sinh có thể lây
lan.
Qua trung gian peptit: Có thể đuổi thuốc ra khỏi vị trí liên kết với ribosom, từ đó sự tách
ra của peptidyl-tRNA bị ức chế do tương tác của chuỗi peptit đặc hiệu mới tạo thành với thuốc
kháng sinh, và quá trình tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn vẫn tiếp tục.
1.3.1.4.2

Cơ chế bơm thuốc ra (efflux pumps)

2.4.32.2.Cơ chế bơm thuốc ra (efflux)
Các vi khuẩn có khả năng bơm các phân tử của thuốc kháng sinh ra khỏi tế bào khi thuốc
xâm nhập vào nguyên sinh chất qua các kênh porin trên thành tế bào trước khi thuốc đến được
chỗ ribosome.
Trong vi khuẩn gram âm, các bơm được mã hóa trong nhiễm sắc thể góp phần vào sự
kháng nội tại với các hợp chất kỵ nước, chẳng hạn như các Macrolide. Trong vi khuẩn gram
dương, kháng Macrolide bằng cơ chế bơm thuốc ra ngoài này là do 2 loại máy bơm ATPbinding-cassette (ABC)và Major-facilitator-superfamily (MFS).
Cho đến nay, các protein tham gia quá trình đẩy thuốc ra ngoài tạo khả năng đề kháng
Macrolide đặc trưng cho loài Staphylococccus là vận chuyển ABC được mã hóa bởi gen
plasmidborne msr(A). Gen msr(A) ban đầu được phát hiện trong Staphylococcus epidermidis,

và kể từ đó, nó đã được tìm thấy trong một loạt các loài tụ cầu (Staphylococcal), bao gồm
S.aureus. Vận chuyển ABC yêu cầu ATP để hoạt động và thường được hình thành bởi một
kênh bao gồm 2 kênh xuyên màng và 2 ATP-binding nằm ở bề mặt của cytosolic màng.
Gen msr(A) mã hóa một protein với 2 ATP-binding đặc trưng cho vận chuyển ABC. Bản
chất thành phần màng của bơm msr(A) vẫn chưa được biết. Hệ thống này có thể có nhiều
thành phần, liên quan đến gen msr(A) và nhiễm sắc thể để tạo thành một máy bơm hoạt động

8

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

đầy đủ đặc trưng cho Macrolide14 - và 15-cạnh và B Streptogramin (MSB).Erythromycin và
macrolid 14 - và 15-cạnh khác là chất gây cảm ứng, trong khi Streptogramin B thì không. Do
đó, chủng đề kháng với Streptogramin B chỉ sau khi cảm ứng với Erythromycin.
Gen msr(A) không được tìm thấy trong liên cầu khuẩn (Streptococci). Trong chi
Streptococcus, gen mef(A) mã hóa một máy bơm, mà có thể được tìm thấy trong phân lập lâm
sàng của S. pneumoniae và S. pyogenes, trong các loài khác của liên cầu khuẩn (liên cầu
khuẩn miệng, liên cầu khuẩn nhóm C và G, và Streptococcus agalactiae), và trong vi khuẩn
ruột. Các gen mef(A) ban đầu đã được báo cáo trong S.pyogenes. Một gen tương tự, từng được
gọi là mef(E), nhưng bây giờphân loại lại như mef(A), đã được báo cáo sau trong S.
pneumoniae. proteinmef(A) thuộc về MFS. Các protein này được thúc đẩy bởi động cơ proton
và chỉ ảnh hưởng đến Macrolide vòng 14 - và 15-cạnh (kiểu hình M).
Các gen mef(A) có thể có được bằng cách kết hợp S. pyogenes và S. pneumoniae và được
sinh ra bởi transposon trong S. pneumoniae. Sự kết hợp củaerm(B) và mef(A) gen có thể được
tìm thấy trong S. pneumoniae, S. pyogenes, hoặc S. Aga- lactiae. Các chủng này có một kiểu

hình MLSB.
2.4.32.3. Sự ngưng hoạt động của thuốc:
Gắn liền với cơ chế này của kháng kháng sinh, và không giống như sửa đổi mục tiêu, làm
bất hoạt kháng sinh đề kháng đối với thuốc kháng sinh chỉ có liên quan về mặt cấu trúc.
Esterases và transferases phospho được báo cáo trong enterobacteria kháng Erythromycin và
Macrolide 14- và 15-cạnh khác. Các enzyme này được vi khuẩn tổng hợp để phân cắt kháng
sinh hoặc tác dụng lên một phần trong cấu trúc của kháng sinh làm bất hoạt chúng.
2.5.

Vancomycin-Glycopeptit:
2.5.1. Tổng quan[2, 3]:

Kháng sinh glycopeptide rất quan trọng để điều trị các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do
vi khuẩn gram dương gây ra bao gồm Staphylococci, Streptococci , Enterococci , và
Clostridia.
Trong nhóm glycopeptides, vancomycin là kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất, ngoài
ra còn có teicoplanin. Vancomycin được phát hiện vào đầu những năm 1950, như một sản
phẩm trao đổi thứ cấp được sản xuất bởi các vi khuẩn đất Streptomyces orientalis (nay đổi tên
thành Amycolatopsis orientalis ) , vancomycin nhanh chóng được đưa vào sử dụng lâm sàng

9

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

cho điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gram dương mà không có đáp ứng với các tác

nhân kháng khuẩn có sẵn .
Vancomycin có tác dụng tốt trên các vi khuẩn gram dương hiếu khí và kỵ khí, bao gồm :
tụ cầu (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis) (kể cả các chủng kháng
methicilin không đồng nhất), liên cầu khuẩn (gồm có Streptococcus pneumoniae (kể cả chủng
đã kháng penicilin), Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus bovis),
cầu tràng khuẩn (ví dụ Enterococcus faecalis) và Clostridiae. Vancomycin có tác dụng in vitro
trên các vi khuẩn: Listeria monocytogenes, Lactobacillus spp., Actinomyces spp., Clostridium
spp. và Bacillus spp.
2.5.2.

Cấu trúc và cơ chế tác động:

Cấu trúc:

Vancomycin là một thành viên của họ kháng sinh glycopeptide có vài chục thành viên.
Các kháng sinh này bao gồm một trong hai cấu trúc heptapeptide mạch thẳng cốt lõi mà lần
lượt được sửa đổi bởi glycosyl hóa chọn lọc và sự sửa đổi acid amin tạo ra các hợp chất khác
nhau.

10

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Bên cạnh các axit amin thường được tìm thấy trong các protein như Asn và Leu, các
glycopeptide cũng kết hợp axit amin bất thường bao gồm 3,5-dihydroxyphenylglycine

(DHPG), beta-hydroxytyrosine (beta-OHTyr), và p-hydroxyphenylglycine (HPG). Ngoài việc
liên kết thông qua các liên kết peptide, các axit amin thơm cũng có thể được tham gia vào qua
các liên kết chéo thông qua carboncarbon thơm hoặc liên kết ether giữa axit amin 2 và 4, 4 và
6, và 5 và 7. Hai thuốc kháng sinh glycopeptide được sử dụng lâm sàng, vancomycin và
Teicoplanin, cũng đáp ứng như nguyên mẫu với các cấu trúc lõi heptapeptide.
Cả hai sự bảo toàn tetrapeptide đầu cuối-C bao gồm (HOOC)-DHPG-(beta-OHTyr) HPG-HPG-(NH2). Các cấu trúc lõi sau đó phân ra trong tripeptide đầu cuối-N với lớp
vancomycin bao gồm (HOOC)-Asn-beta-OHTyr-Leu-(NH2), và lớp teicoplanin là (HOOC)HPG-beta-OHTyr-HPG-(NH2).
Sự đa dạng trong các cấu trúc lõi này đạt được thông qua biến đổi hóa học của các axit
amin, ví dụ, sự xử lí bằng clo của beta-OHTyr, N-methyl hóa của Lue, sunfuric hóa của HPG,
và thông qua glycosyl hóa có chọn lọc, phổ biến nhất tại trung tâm HPG và beta-OHTyr áp
chót, mà còn ở DHPG C- đầu cuối và HPG N- đầu cuối của các kháng sinh với lõi teicoplanin.
Glycosyl hóa thêm vào của các dư lượng carbohydrate có thể xảy ra, như có thể thay thế các
đường bằng các nhóm acyl béo như trong teicoplanin (Hình 1). Lớp Teicoplanin của
glycopeptide cũng có thể được chia thành các hợp chất mà axit amin 1 (HPG) và 3 (DHPG) là
liên kết ngang, ví dụ như, teicoplanin, và có nơi không có, ví dụ như, avoparcin.
-

Cơ chế tác động của thuốc:
•

Thông qua sự ức chế các bước ngoại bào trong sinh tổng hợp peptidoglycan.

Trong cấu trúc màng vi khuẩn gram dương, hệ thống Peptidoglycan với các đơn vị cấu tạo
là N-acetylmuramic acid (NAM) và N -acetylglucosamine (NAG) peptide đóng vai trò kiến
tạo quan trọng. Vancomycin ức chế quá trình liên kết của các thành phần này vào cấu trúc
màng do đó ức chế quá trình hình thành màng tế bào vi khuẩn. Đây chính là cơ chế tác động
chính của kháng sinh Vancomycin.
Sự ức chế enzyme transglycosylase dẫn đến ngăn cản một cách hiệu quả sự phát triển
và lắp ráp của các chuỗi peptidoglycan.
•

11

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Ngoài ra Vancomycin còn làm thay đổi tính thấm màng tế bào và sự sinh tổng hợp ARN
của vi khuẩn.

2.5.3.

Kháng Glycopeptit:

Kháng glycopeptide trong Enterococci thể hiện trong ít nhất là sáu kiểu hình riêng biệt
phân loại dựa trên sự nhạy cảm, bề rộng của sự kháng với các hợp chất riêng lẽ, và mức độ
kháng. Sáu kiểu hình đó bao gồm: VanA, VanB, VanC, VanD, VanF, VanG. Mỗi cụm gen Van
cho thấy gen liên kết với kiểu hình đề kháng cụ thể :

12

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Hình 5: Cụm gen van kháng kháng sinh Glycopeptide
Mỗi kiểu hình tương ứng với các kiểu gen nhất định, nồng độ kháng tương ứng và đặc
trưng cho các chủng Enterococci khác nhau. Sau đây là bảng nồng độ ức chế tối thiểu các kiểu
gen của 2 loại Glycopeptide là Vancomycin và Teicoplanin [2]
Bảng nồng độ ức chế tối thiểu các kiểu gen của Vancomycin [2]
Kiểu hình

VanA (thường
trong commonly in
E. faecalis và and
E. faecium)
VanB

Kiểu gen

Kháng

Kháng

Vancomycin

Teicoplanin

High-level
Cụm gene
vanA gene
cluster
Cụm gene

resistanceKháng mức caoHigh-level
cao
resistance MICMIC-64 μg/mL16–512 μ/mL
≥1000 μg/mL
Kháng mức

(commonly

vanB gene

caoHigh-level

inthường ở E.

cluster

resistance MIC-4–512

faecalis và and E.

Kháng mức

μg/mL

Sensitive
Nhạy cảm
MIC≤
0.5μg/mL

Loại kháng

High level
inducible
resistanceKháng
cảm ứng mức cao
Kháng cảm
ứng mức caoHigh
level inducible
resistance

faecium)
VanC (E.

Các cụm

gallinarum, E.

gen vanC1,

casseliflavus , E.

vanC2, vanC3

flavescens)

gene clusters

Low level

Sensitiv Nhạy

resistance Kháng mức cảme
MIC≤
thấp
MIC-2μg/mL-32 0.5μg/mL

Low level
constitutive
resistanceKháng
cấu mức thấp

μg/mL
Kháng mức caoCụm gene
VanD

vanD gene
cluster

Low-level
Inducible

trung bìnhModerate-

resistance Kháng

High level resistance
MIC-64–256

mức thấp MIC-4–

resistanc Kháng

32 μg/mL

cảm ứnge

μg/mL
VanE

Cụm gene
vanE gene
cluster

Kháng mức
thấpLow-level

SensitiveNhạy
cảm

resistance MIC-16

Kháng cảm
ứngInducible

MIC-≤0.5

resistance

13

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

μg/mL
VanG

gene vanG
gene

VanL

Cụm gene
vanL gene
cluster

μg/mL

Low level

Sensitiv Nhạy

resistanceKháng mức cảme
MIC≤
thấp
MIC ≤ 16μg/mL 0.5μg/mL
Kháng mức thấp

Low level

Sensitiv Nhạe

Kháng cảm
ứngInducible
resistance
Kháng cảm
ứngInducible

resistance MIC-8

resistance

μ/mL
Kháng mức
VanM

vanM

caoHigh-level
resistance
MIC>256μg/mL

High level
resistance Kháng

ứngInducible

mức cao

resistance

Kháng mức thấp
Low-level
VanN

vanN

Kháng cảm

resistance MIC-16

Sensitive
MIC
0.5μg/mL

Constitutive
resistanceKháng

cấu
μg/mL
Cơ chế cơ bản của kháng Vancomycin trong Enterococci là sự hình thành của các thụ
thể Peptidoglycan với giảm ái lực glycopeptide. Điều này dẫn đến giảm liên kết của
Vancomycin và giảm ức chế tổng hợp thành tế bào. Tiền chất Peptidoglycan với giảm ràng
buộc với Vancomycin chịu trách nhiệm cho việc này. Thay vì các Peptidoglycan tiền thân
thường xảy ra D- alanine - Dalanine , tiền thân như D- ala -D- lactate hoặc D- ala -D- serine
được tìm thấy trên các vách tế bào của chủng kháng Vancomycin của vi khuẩn ruột. D- ala -Dlactate đã được tìm thấy có một mối quan hệ ít hơn D- ala -D- ala 1000 lần đối với
Vancomycin trong khi D- ala -D- serine có một mối quan hệ về ít hơn tiền thân tế bào bình
thường 6 lần . Điều đó đã được chỉ ra rằng việc thay thế các đầu cuối D- alanine của thành tế

bào di động với kết quả D- lactate trong lực đẩy trong chuỗi liên kết của các phân tử
Vancomycin dẫn đến làm giảm 1000 lần trong mối quan hệ với các kháng sinh. Thay thế D- ala
- Dserine kết quả giảm 6 lần trong mối liên hệ với Vancomycin vì nhóm hydroxymethyl của
serine là cồng kềnh hơn so với nhóm methyl của alanine.

14

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Chương 2: Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh
2.1. Kỹ

thuật PCR:

2.1.1. Giới thiệu chung:
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh
năm 1985.
Kĩ thuật PCR ( polymerase chain reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme
polymerase ) lLà phương pháp in vitro để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó, có độ nhạy
rất cao mà chỉ cần một lượng mẫu ban đầu hạn chế, được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt
( máy PCR ).
Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: trong y học, vi sinh vật học,
công nghệ sinh học… Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ
gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN…
2.1.2. Phản ứng PCR:

a. Nguyên lý:
PCR là phương pháp tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn trên cơ
sở hoạt động invitro của enzyme DNA polymerase để tổng hợp các sợi mới bổ
sung cho các sợi DNA khuôn. Đây là một phản ứng dây chuyền nhân bản DNA
diễn ra trong điều kiện invitro
Phản ứng PCR xảy ra bên ngoài tế bào. Kỹ thuật tổng hợp ADN ngoài cơ thể cũng tuân thủ
theo những nguyên tắc cơ bản của quá trình sao chép ADN trong cơ thể như: cần sự mở xoắn
thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi ( mồi xuôi, mồi ngược ), cần nguyên liệu và môi trường
thích hợp, và cần có sự tham gia của enzyme ADN polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có
khác là dùng nhiệt cao (940C) tháo xoắn thay cho helicase keeta hợp cho từng giai đoạn phản

15

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế. Nhờ kỹ thuật PCR mà với một lượng nhỏ
ADN ban đầu chúng ta có thể thu được lượng AND đủ lớn cần thiết để tiến hành các thí
nghiệm về AND.

•

Các thành phần của một phản ứng PCR:
Muốn tiến hành phản ứng PCR cần phải có các thành phần sau:
- AND khuôn
- Mồi

- ADN polymerase (thường dùng Taq polymerase)
- Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
- Dung dịch đệm (buffer: nồng độ Mg2+)
c. Chu kỳ nhiệt:
Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:
Biến tính (denaturation): Trong giai đoạn biến tính, phân tử ADN khuôn mẫu ở dạng xoắn kép

•

được tách thành 2 sợi đơn. Quá trình biến tính thường được thực hiện ở khoảng 94 0C trong
vòng 30 giây – 1 phút.
Bắt cặp mồi(annealing): Trong giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi)

•

cho phép các mồi bắt cặp với khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Nhiệt độ này dao động trong
khoảng 40-650C, tùy thuộc vào Tm của mồi sử dụng.
Kéo dài (extension): Giai đoạn này nhiệt độ được tăng lên đến 70-72 0C. Đây là khoảng nhiệt

b.

độ tối thích cho Taq polymerase hoạt động, tiến hành tổng hợp ADN bắt đầu từ vị trí có mồi
theo chiều 5’-3’. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần nhân bản.
• Phản ứng PCR sẽ quay vòng 3 bước kể trên nhiều lần.

16

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH

Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng PCR
Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR điển hình thường là:
* Gây biến tính ADN: 94-950C, 30s-1phút
* Gắn mồi: khoảng 600C, 30s
* Kéo dài: 720C, 1 phút

17

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Hình 2.2: Chu kỳ nhiệt
2.1.3. Các loại phản ứng PCR:
Có 3 loại phản ứng PCR như sau: Standard PCR là phản ứn PCR có một mồi.
Phản ứng multiplex PCR : là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, ở đó hai
hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng (tương ứng có hai mồi
trở lên).
Standard PCR: có một mồi
PCR kết hợp enzyme cắt hạn chế :( AFLP) sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen
thành, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể
dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen.
2.2.

Thiết lập một phản ứng phát hiện gen kháng kháng sinh:

Các phản ứng PCR khác nhau ở DNA khuôn, mồi và chu kỳ nhiệt. Vì vậy để thiết lập
được một phản ứng PCR cho kết quả mong đợi ta cần khảo sát các điều kiện tối ưu cho phản
ứng
•

Xác định DNA nguồn: cần xác định việc biểu hiện kiểu hình của vi sinh vật
mang gen cần xác định có thể bằng phương pháp D test, ta sẽ có thể phát

18

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

hiện được vi sinh vật đó đã mang gen kháng thuốc chưa trước khi xác định
gen kháng thuốc.
•

Chọn mồi: mỗi loại mồi chỉ thích hợp cho một hoặc vài locus nhất định.
Việc chưa phát hiện được gen kháng thuốc đó như thế nào sẽ gây khó khăn
cho việc lựa chọn mồi. Vì vậy có thể lựa chọn phương pháp multiplex PCR,
chồng chéo các mồi trong một phản ứng để đạt hiệu quả cao hơn. Sau khi đã
định hình được đoạn gen kháng thuốc thì ta sẽ lựa chọn đoạn mồi phù hợp
để đạt hiệu quả cao hơn.

•

Kết hợp enzyme cắt hạn chế: với những DNA có kích thước lớn thì sẽ kết
hợp enzyme cắt hạn chế để hiệu quả tháo xoắn cao hơn.

•

Chu kỳ nhiệt: với mỗi phản ứng có một chu kỳ nhiệt tối thích, quyết định kết
quả phản ứng. Nhiệt độ gắn mồi thường phụ thuộc vào %GC, chiều dài mồi,
độ phù hợp của mồi…

Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm) được ước lượng qua một số công thức sau:
+ Nếu chiều dài DNA < 14 base và nồng độ ion M + ở điều kiện tiêu
chuẩn (50mM) thì:
Tm (0C) = 4 × (G + C) + 2 × (A + T)
+ Nếu chiều dài sợi DNA lớn hơn và cũng điều kiện ion tiêu chuẩn
trên thì: Tm (0C) = 64.90C + 410C ×(G + C – 16.4) / N. Với N là chiều dài sợi DNA tương
hợp.
+Nếu nồng độ muối thay đổi so với điều kiện trên , ta dùng công
thức:
Tm (0C) = 81.50C +16.60C × log10([Na+] +[K+]) + 0.410C × (%GC) – 675/N


Multiplex PCR đối với gen kháng kháng sinh:

19

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH

Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, ở đó
hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng. Từ các mô
tả đầu tiên về nó thì phương pháp này đã từng được áp dụng thành công trong rất
nhiều lĩnh vực thí nghiệm ADN gồm có phân tích mất đoạn, đột biến, đa hình hoặc
trong các phương pháp định lượng
Thí nghiệm tiến hành trên loài Streptogramin
PCR được thực hiện trong tổng khối lượng 25 µl có chứa 4 µl dung dịch mẫu,
0.4 mM (mỗi) mồi, và 1.25U GoTaq DNA polymerase (Promega, Madison, WI). Tất cả
các phản ứng được thực hiện trong một Perkin-Elmer GeneAmp Hệ thống PCR 2400
(Perkin-Elmer, MA) theo các điều kiện sau: ban đầu biến tính (94o C, 5 phút), 30 chu
kỳ (94o C, 30s), ủ (nhiệt độ thích hợp, 1 phút), và kéo dài (72o C, 1 phút) tiếp theo là
một phần mở rộng cuối cùng (72o C, 7 phút). Điện di 10 µl sản phẩm PCR thực hiện
trên agarose gel 1,5% chứa 0,5 µl ethidium bromide và theo dõi bằng tia cực tím. Các
chủng sau đây đã được phát hiện trong phản ứng PCR: E. faecium ATCC 51.559
(VanA và Soda), E. faecalis ATCC 51.299 (vanB, sodA, agg, CPD, và Gele), và E.
faecium CVM 3001 và 3002 cho vatE và vatD.



Multiplex PCR đối với gen kháng kháng sinh macrolide:
-

Quy trình làm tương tự như Vancomycin

20

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

-

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Mồi được sử dụng đố với các chủng khác nhau:

1.Chủng MANNHEIMIA HAEMOLYTICA và PASTEURELLA MULTOCIDA [9]

2.Cho chủng Streptococcus [6]

3.cho các chủng Streptococcus, Enterococcus, Corynebacterium, and Pseudomonas [8]

21

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

2.3.

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Kỹ thuật PCR xác định gen kháng kháng sinh đối với loài Streptococcus pneumoniea:

Sơ đồ xác định loại kháng sinh kháng Streptococcus pneumoniea:

22

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Lấy mẫu

Nuôi cấy và phân lập

Nuôi tăng sinh trong môi trường chứa kháng sinh

Chọn lọc ra các loại kháng sinh kháng Streptococcus pneumoniea

Xác định kiểu gen kháng kháng sinh
Xác định kiểu hình kháng kháng sinh

23

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

Tùy theo mỗi loại bệnh phẩm mà ta sử dụng các thủ thuật lấy mẫu, cách nuôi cấy và phân lập
vi khuẩn khác nhau. Ở đây ta xét với loại bệnh phẩm là máu. Vi khuẩn được phân lập từ máu
của bệnh nhân viêm màng não, viêm phổi cấp
2.2.1

Lấy mẫu:

Trong tường hợp bệnh nhân có sốt cao, nghi viêm màng não, viêm phổi cấp, dùng bơm
kim tiêm vô khuẩn lấy ít nhất 3ml máu tĩnh mạch cho ngay vào bình canh thang não-tim
(brainheart infusion) hay thioglycolate theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang, hoặc sử
dụng chai cấy máu do các hãng thương mại pha chế sẵn.
Chú ý: Động tác và quá trình lấy máu, cấy máu phải đảm bảo thật vô khuẩn trong một quy
trình kín. Tốt nhất kim lấy máu được nối trực tiếp vào bình môi trường qua một ống cao su
hay plastic vô khuẩn. sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn iot.
2.2.2

Nuôi cấy và phân lập [4, 5]:

+ Phế cầu khuẩn cũng là một vi khuẩn rất nhạy cảm và dễ chết, vì vậy tốt nhất các
bệnh phẩm nên được chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2h, hoặc không quá 6h, và có
thể giữ ở nhiệt độ 4-80C trong vòng 24h. nếu quá trình luân chuyển bệnh phẩm từ 2-4h thì
bệnh phẩm có thể được cấy ngay hoặc tăng sinh trước trong canh thang (tryptocasein soya
24

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH


Đồ án công nghệ 1

GVHD:Ths. PhạmTrần Vĩnh Phú

hoặc canh thang não-tim) 2h ở 370C. Nếu thời gian chuyển bệnh phẩm từ 4-8h, bệnh phẩm nên
được ủ trong canh thang ít nhất là 2h rồi mới sang thạch máu 5%.
+ Một số môi trường nuôi cấy phát hiện phế cầu khuẩn:


Thạch máu 5% có Gentamycin [5µg/ml]: môi trường này chỉ cho phế
cầu khuẩn phát triển.



Thạch máu 5% % không có Gentamycin: tìm phế cầu, liên cầu, tụ cầu
và một số trực khuẩn gram âm.



Thạch máu thỏ 7% phát hiện cả phế cầu và H.influenzae.

 Môi trường đặc hiệu để phát hiện Streptococcus pneumoniea đó là: môi trường
thạch máu 5% Gentamycin [5µg/ml]
Ủ trong điều kiện môi trường 37 0C, có 5%CO2 từ 18-24h. Nếu không có tủ ấm CO2,
đặt các hộp lồng vào chuông thủy tinh kín và đốt 1 ngọn nến, khi nến tắt cũng tạo được khí
trường có CO2, sau đó đặt chuông vào tủ ấm 370C  Sau 18-24h, quan sát trên môi trường
thạch máu thấy các khuẩn lạc của phế cầu khuẩn nhỏ 0.5-1.5 mm, có vỏ nhày ướt, có xu
hướng lõm giữa, có quầng tan huyết màu xanh (kiểu tan huyết α)  cấy thuần lại trên một đĩa
thạch máu khác, ủ ấm ở 370C/ 5% CO2 trong 18h. Ngày tiếp theo, làm thêm các thử nghiệm
sau để khẳng định (nếu chỉ thấy một loại khuẩn lạc thì không cần cấy thuần mà có thể làm
luôn các bước khẳng định).

Các thử nghiệm xác định:

-



Thử nghiệm Optochin (nhạy cảm với optochin)



Thử nghiệm tan trong muối mật (Bile solubility)



Thử nghiệm ngưng kết trên phiến kính

Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định vi khuẩn Streptococcus pneumoniae [6]:
+ Hình thể khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 5% (có hay không có gentamycin):trò

n,

25

SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH