Kĩ Thuật Khảo Sát Trực Tiếp Vi Khuẩn

KỸ THUẬT
KHẢO SÁT TRỰC TIẾP

Phạm Thái Bình

KỸ THUẬT SOI TƯƠI

1


Soi tươi không nền

Mục đích
ð Quan sát di động của vi khuẩn.
ð Phát hiện phẩy khuẩn tả.

Phương pháp

Huyền dòch
(vi khuẩn,
bệnh phẩm)

Hạ tụ quang,
quan sát ở ×40

Soi tươi có nền
Mục đích
ð Phát hiện vi khuẩn, vi nấm, ký
sinh trùng, hồng cầu bạch cầu
trong dòch não tủy, phân...

Phương pháp

C. neoformans
(nigrosin)

C. meningitidis
(nigrosin)

Huyền dòch
(vi khuẩn,
bệnh phẩm)

Nigrosin (2%)

Hạ tụ quang,
quan sát ở ×40

Methylen blue
(0.001%)

2


KỸ THUẬT
CHUẨN BỊ PHẾT NHUỘM

Chuẩn bò phết nhuộm khi thực hiện:
ð Nhuộm Gram (Gram stain).
ð Nhuộm kháng acid (Acid fast stain).
ð Nhuộm đơn (simple stain).

Khi làm phết nhuộm cần lưu ý:
ð Phải dàn đều phết nhuộm trên lame
ð Phải để phết nhuộm khô tự nhiên.
ð Phải cố đònh phết nhuộm bằng
cách hơ nhẹ qua ngọn lửa đèn cồn.
ð Không được nướng phết nhuộm

3


KỸ THUẬT
NHUỘM GRAM

Hans Christian Gram

Nguyên tắc

Vách của tế bào vi khuẩn Gram (+) giữ được màu của phức hợp
Crystal violet-Iodine khi bò tẩy bằng alcohol

4


Thuốc nhuộm

Dung dòch Crystal violet
ð Hòa tan amonium oxalate (0.8g)
trong nước cất (80ml).
ð Nghiền crystal violet (2g) trong cối

và cho từ từ ethanol 95% (20ml) vào
để làm tan hoàn toàn crystal violet.
ð Trộn đều hai dung dòch với nhau.
ð Bảo quản tránh ánh sáng.

Dung dòch Lugol
ð Nghiền iodine (1g) và potassium
iodine (3g) trong cối với nước cất
(100ml) cho tan hoàn toàn.
ð Bảo quản tránh ánh sáng.

Dung dòch Alcohol
ð Dùng alcohol 96%

Dung dòch Safranine
ð Nghiền safranine O (0.25g) với
ethanol 95% (10ml) trong cối cho
tan hoàn toàn.
ð Thêm vào 90ml nước cất, trộn đều.
ð Bảo quản tránh ánh sáng.

Phương pháp thực hiện
Phết nhuộm được
cố đònh trên lame

Phủ Crystal violet
lên phết nhuộm
trong 1 phút

Quan sát ở

vật kính dầu

Rửa bằng nước
cho sạch thuốc
nhuộm

Thấm khô phết
nhuộm

Phủ
Lugol
lên
phết nhuộm trong
1 phút

Rửa bằng nước
cho sạch thuốc
nhuộm

Rửa bằng nước
cho sạch thuốc
nhuộm

Phủ Safranine lên
phết nhuộm trong
1 phút

Tẩy màu bằng
alcohol

Rửa bằng nước

5


Hệ thống nhuộm Gram tự động

Wescor Model 7320 Aerospray®

Quick Slide AGS-1000

Biện luận kết quả
Tính chất Gram
ð Vi khuẩn Gram (-): bắt màu hồng
ð Vi khuẩn Gram (+): bắt màu tím

Hình dạng
ð Cầu khuẩn: vi khuẩn hình cầu
ð Trực khuẩn: vi khuẩn hình que

Cách sắp xếp

Các tính chất khác
ð Số lượng.

ð Xếp chùm

ð Tạo bào tử.

ð Xếp chuỗi

ð Hình dạng hoặc cách sắp
xếp đặc biệt (phẩy khuẩn,
xoắn khuẩn, xếp hình chữ
nho, dạng cầu trực khuẩn...)

ð Xếp đôi
ð Xếp rời rạc

6


Biện luận kết quả

Song cầu Gram (-)

Trực khuẩn Gram (-)

Trực khuẩn Gram (-), nhỏ

Phẩy khuẩn Gram (-)

Biện luận kết quả

Tụ cầu Gram (+)

Liên cầu Gram (+)

Trực khuẩn Gram (+)

Song cầu Gram (+)

Trực khuẩn Gram (+),
xếp chuỗi có tạo bào tử

Trực khuẩn Gram (+),
xếp chuỗi

7


Các sai lầm thường gặp
Mầm cấy
vi khuẩn
≥24h

Dung dòch
lugol không
đạt
chất lượng

Tẩy màu
quá lâu

Alcohol
acid

Tẩy màu
bằng
alcohol

acid

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu hồng

Các sai lầm thường gặp

Phết nhuộm
quá dày

Tẩy màu
quá ngắn

Alcohol tẩy
màu bò pha
loãng
Alcohol
70o

Vi khuẩn Gram (-) bắt màu tím

8


Các sai lầm thường gặp

Sau khi phủ crystal violet, không
rửa sạc h màu thừa trên lame.
Khi phủ lugol trên phết nhuộm
thì màu crystal violet thừa sẽ bò
tủa lại bám trên bề mặt phết

nhuộm. Kết quả có thể lầm
tưởng hình ảnh vi nấm.

Phủ safranine quá ngắn nên
không thấy rõ màu của Gram (-).

KỸ THUẬT
NHUỘM KHÁNG ACID

9


Nguyên tắc

Vi khuẩn kháng acid (Mycobacteria,
Nocardia…) có lớp vỏ sáp bao bọc nên
khi nhuộm với carbofuchsin thì phức hợp
màu không bò tẩy màu bởi dung dòch
có tính tẩy mạnh (alcohol acid, acid…)
Các phương pháp nhuộm kháng acid:
ð Phương pháp Ziehl Neelsen (Franz Ziehl
và Friedrich Neelsen, 1882)

ð Phương pháp Kinyoun (Joseph Kinyoun,
1887)

Dung dòch Carbon fuchsin

Thuốc nhuộm

ð Hòa tan phenol (5ml) trong nước cất (85ml).
ð Nghiền carbon fuchsin (0.3g đối với phương pháp
nhuộm nóng hoặc 1g đối với phương pháp
nhuộm lạnh) trong cối và cho từ từ ethanol 95%
(10ml) vào để làm tan hoàn toàn .
ð Trộn đều hai dung dòch với nhau.
ð Bảo quản tránh ánh sáng.

Dung dòch Alcohol acid
ð Hòa tan 97ml alcohol 96% trong 3ml HCl đậm đặc

Dung dòch Methylen blue
ð Nghiền methylen blue (0.3g) với ethanol 95%
(30ml) trong cối cho tan hoàn toàn.
ð Thêm vào nước cất (70ml) và trộn đều
ð Bảo quản tránh ánh sáng.

10


Phương pháp nhuộm nóng
(Ziehl Neelsen)

Phết nhuôm được
cố đònh trên lame
Hơ nóng trong 5 phút
bằng cách đốt nhẹ dưới
lame (không được để
sôi) hoặc đun cách thủy
nhưng không để khô

thuốc nhuộm.
Phủ Carbon fuchsin
lên phết nhuộm

Quan sát ở
vật kính dầu

Thấm khô phết
nhuộm

Rửa bằng nước
cho sạch thuốc
nhuộm

Rửa bằng nước
cho sạch thuốc
nhuộm

Phủ Methylen blue
lên
phết
nhuộm
trong 1 phút

Tẩy
màu
bằng alcohol
acid

Rửa bằng nước

Phương pháp nhuộm lạnh
(Kinyoun)
Phết nhuộm được
cố đònh trên lame

Phủ Carbon fuchsin
lên
phết
nhuộm
trong 30 phút

Rửa bằng nước
cho sạch thuốc
nhuộm

Quan sát ở
vật kính dầu

Thấm khô phết
nhuộm

Tẩy màu bằng
alcohol acid

Rửa bằng nước
cho sạch thuốc
nhuộm

Rửa bằng nước

Phủ Methylen blue
lên
phết
nhuộm
trong 1 phút

11


Hệ thống nhuộm kháng acid tự động

AFB-0010 (GG&B Company)

Biện luận kết quả
Đọc kết quả
ð Vi khuẩn kháng acid bắt màu hồng.
ð Vi khuẩn khác bắt màu xanh

Lưu ý
ð Nếu kết quả nhuộm kháng acid (+)
thì không được kết luận là dương
tính với M. tuberculosis mà phải đọc
kết quả là AFB (+) hoặc BK (+)

AFB: acid fast bacilli
BK: Bacilli de Koch

12

Biện luận kết quả
Đối với bệnh phẩm là đàm cần phải
đánh giá kết quả theo số lượng AFB
ð

(+/-): có 1→ 2 vi khuẩn trong 300 quang trường.

ð

(1+): có 1→ 9 vi khuẩn trong 100 quang trường.

ð

(2+): có 1→ 9 vi khuẩn trong 10 quang trường.

ð

(3+): có 1→ 9 vi khuẩn trong 1 quang trường.

ð

(4+): có > 9 vi khuẩn trong 1 quang trường.

Đối với các bệnh phẩm khác thì trả
kết quả AFB (+) hoặc AFB (-)

Các sai lầm thường gặp

Thời gian phủ

Carbofuchsin
ngắn

Phết nhuộm quá dày

Sai lầm trong
nhuộm kháng acid

Carbofuchsin bò cặn

Dùng Carbofuchsin
của phương pháp
nhuộm nóng để
nhuộm lạnh

13


CÁC KỸ THUẬT NHUỘM KHÁC

Kỹ thuật nhuộm hạt biến sắc

Phương pháp
Phết nhuôm được
cố đònh trên lame
Phủ thuốc nhuộm
lên phết nhuộm
trong 30’’ đến 1’

(Alkaline Methylen Blue)

Mục đích
ð Nhuộm hạt biến sắc để phát hiện vi khuẩn
bạch hầu (C. diphtheriae).

Thuốc nhuộm
–

Rửa bằng nước
cho sạch thuốc
nhuộm

Thấm khô phết
nhuộm

Quan sát ở
vật kính dầu

–
–

Nghiền methylen blue (0.3g) với ethanol 95% (30ml)
trong cối cho tan hoàn toàn.
Thêm nước cất (70ml) và 02 giọt KOH 10%, trộn đều
Bảo quản tránh ánh sáng.

Hạt biến sắc
bắt màu xanh
đậm, phần còn
lại của vi khuẩn

bắt màu xanh
nhạt

14


Kỹ thuật nhuộm lưỡng cực

Phương pháp
Phết nhuôm được
cố đònh trên lame
Phủ thuốc nhuộm
lên phết nhuộm
trong 20’’ đến 30’’

Rửa bằng nước
cho sạch thuốc
nhuộm

(Wayson)

Mục đích

ð Nhuộm lưỡng cực dùng để phát hiện vi
khuẩn dòch hạch (Y. pestis).

Thuốc nhuộm
–

–

–

Nghiền carbon fuchsin (0.2g) và methylen blue
(0.75g) với ethanol 95% (20ml) trong cối cho tan
hoàn toàn.
Thêm dung dòch phenol 5% (200ml) và trộn đều.
Bảo quản tránh ánh sáng.
− Y. pestis bắt màu xanh
đậm ở hai đầu và xanh
nhạt ở giữa.

Thấm khô phết
nhuộm

− Vi khuẩn khác bắt màu
xanh.
− Tế bào khác bắt màu
xanh đậm- tím.

Quan sát ở
vật kính dầu

− Mô bắt màu hồng – đỏ.

KHẢO SÁT TRỰC TIẾP
TRÊN CÁC BỆNH PHẨM
XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG

15

Có thể cho kết quả rất sớm,
gần như chung cuộc, từ đó:
ð

Giúp lâm sà ng và phò ng xét
nghiệm nghó ngay đến tác nhâ n
nhiễm trùng với độ chính xác đế n
99%.

ð

Giúp lâm sà ng lựa chọn kháng
sinh điều trò ban đầu.

ð

Giúp phò ng xét nghiệm đònh
hướng trong tiến trình xét nghiệp.

Đánh giá chất lượng bệnh
phẩm và gợi ý tác nhân
nhiễm trùng, từ đó:
ð

Giúp lâm sàng đònh hướng điều
trò ban đầu.

ð

Giúp phò ng xét nghiệm đònh
hướng trong tiến trình xét nghiệp.

Không có ý nghóa trong
khảo sát trực tiếp:
Có thể gợi ý sớm tác
nhân nhiễm trùng, từ đó:
ð

Giúp lâm sà ng đònh hướng
điều trò ban đầu.

ð

Giúp phò ng xét nghiệm
đònh hướng trong tiến trình
xét nghiệp.

ð

Quệt họ ng (nếu không có yê u
cầu tìm bạch hầu).

ð

Phân (nếu không có yêu cầ u
tìm tả hoặc Campylobacter)

Vai trò của khảo sát trực tiếp trong
xét nghiệm vi sinh lâm sàng

Khảo sát trực tiếp: máu

Nhuộm Gram từ pha
lỏng của môi trường
cấy máu sau khi ủ
35oC/12-16h

Trực khuẩn Gram (-)

Staphlococcus

H. influenzae

S. pneumoniae

16


Khảo sát trực tiếp: dòch não tủy

Tìm sự hiện diện:
ð Bạch cầu (trung tính
nhân, lympho bào).

đa

ð Hồng cầu.
Soi tươi (× 400)
với nigrosin

Lympho bào

ð Vi khuẩn.
ð Vi nấm.
ð Đơn bào (Naegleria fowleri).

Trung tính
đa nhân

Hồng cầu

C. meningitidis

Khảo sát trực tiếp:
dòch não tủy (tt)

S. pneumoniae

Nhuộm Gram để tìm
vi khuẩn hiện diện
trong dòch não tủy

L. monocytogenes

N. meningitidis

H. influenzae

Trực khuẩn Gram (-)

S. agalactidae

17


Khảo sát trực tiếp: nước tiểu

Nhuộm Gram để tìm
vi khuẩn , bạch cầu
trong nước tiểu

ð Nghi ngờ nhiễm trùng tiểu:
trên 1 quang trường có hiện
diện hiện diện 1 tế bào vi
khuẩn và/hoặc 1 bạch cầu.

E. coli (Nước tiểu, Gram)

ð Không có nhiễm trùng tiểu:
trên toàn phết nhuộm không
có hoặc rất ít tế bào vi khuẩn
hoặc bạch cầu.
S. saprophyticus (Nước tiểu, Gram)

Khảo sát trực tiếp: phân

ð Không có yêu cầu cụ thể
của lâm sàng: không thực
hiện khảo sát trực tiếp.

V. cholerae (Phân, Gram)

ð Yêu cầu tìm tả: soi tươi,
nhuộm Gram.
ð Yêu cầu tìm Campylobacter:
nhuộm Gram.
C. jejuni (Phân, Gram)

18


Khảo sát trực tiếp:
đường hô hấp trên

C. diphtheria (alkaline methylen blue và nhuộm Gram)

ð Quệt họng: nhuộm Gram

hoặc Alkaline Methylen blue
khi có yêu cầu tìm bạch hầu.

ð Các bệnh phẩm khác:
nhuộm Gram tìm sự hiện diện
vi khuẩn trong bệnh phẩm.

Viêm tai giữa (Gram)

Khảo sát trực tiếp:
đường hô hấp dưới

Nhuộm Gram (×100):
đánh giá độ tin cậy
của mẫu

Đàm không tin cậy (Gram, ×100)

Đàm tin cậy (Gram, ×100)

19


Khảo sát trực tiếp:
đường hô hấp dưới (tt)

Nhuộm Gram (×1000):
tiên đoán tác nhân
nhiễm trùng

S. pneumoniae (Đàm, Gram, ×1000)

K. pneumoniae (Đàm, Gram, ×1000)

Khảo sát trực tiếp:
đường hô hấp dưới (tt)

Nhuộm kháng acid
nếu có yêu cầu

20

Khảo sát trực tiếp:
mủ và tiết dòch

S. aureus (mủ, Gram, ×1000)

ð Nhuộm Gram: nếu kết quả chỉ có một
loại vi khuẩn thuần khiết có thể làm
kháng sinh đồ trực tiếp từ bệnh phẩm.

ð Nhuộm kháng acid: nếu có yêu cầu.

S. agalactidae (mủ, Gram, ×1000)

Khảo sát trực tiếp:
đường sinh dục
Niệu đạo bình thường
(Gram)

Quệt sinh dục nam:
ð Viêm niệu đạo không do lậu:

Viêm niệu đạo không
do lậu (Gram)

≤ 4-10 bạch cầu và không có
song cầu Gram (-) nội tế bào
trong 1 quang trường.

ð Viêm niệu đạo do lậu (98%):

≥ 10 bạch cầu và / hoặc phát
hiện song cầu Gram (-) nội tế
bào trong 1 quang trường.

Viêm niệu đạo do lậu
(Gram)

21


Khảo sát trực tiếp:
đường sinh dục (tt)
Quệt âm đạo:
ð Quệt âm đạo bình thường:

≤5 bạch cầu/quang trường và
có trực khuẩn Gram (+).

ð Có khả năng viêm âm đạo
do Gardnerella vaginalis:
≤5 bạch cầu/quang trường,
không có trự c khuẩn Gram (+)
nhưng có nhiều trực khuẩn Gram
(-) nhỏ.

Âm đạo bình thường
(Gram)

Viêm âm đạo do
G. vaginalis (Gram)

Viêm âm đạo do
C. trachomatis (Gram)

Viêm âm đạo do
N. gonorrhoeae (Gram)

ð Có khả năng viêm âm đạo
do Chlamydia trachomatis:
≥ 10 bạch cầu/quang trường.

ð Có khả năng viêm âm đạo
do N. gonorrhoeae: ≥10 bạch
cầu/quang trườ ng và có song
cầu Gram (-) nội tế bào.

Khảo sát trực tiếp:
đường sinh dục (tt)

Các bệnh phẩm khác:
ð Quệt cổ tử cung: nếu có song

cầu Gram (-) nội tế bào không
thể chắc chắn là lậu (vì độ nhạy
50-70%, độ đặc hiệu 50-90%).

Quệt cổ tử cung (Gram)

ð Nước tiểu: đầu dòng hoặc cuối

dòng, ly tâm lấy cặn lắng và
nhuộm Gram. Nếu cặn lắng
nước tiểu của nam có song cầu
Gram (-) nội tế bào có thề nghi
ngờ bò lậu.

Cặn lắng nước tiểu (Gram)

22