Thử Nghiệm Huyết Thanh Học Và Hóa Miễn Dịch Trong Chuẩn Đoán Nhiễm Trùng

THỬ NGHIỆM HUYẾT THANH HỌC
& HÓA MIỄN DỊCH
ÁP DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN
TÁC NHÂN NHIỄM TRÙNG

Phạm Thái Bình

THỬ NGHIỆM
HUYẾT THANH HỌC

1


Mục đích của thử nghiệm huyết thanh học

Tìm kháng thể đặc hiệu với một loại kháng
nguyên của tác nhân nhiễm trùng có trong
huyết thanh của bệnh nhân.
Chẩn đoán gián tiếp tác nhân nhiễm trùng.

Biện luận kết quả thử nghiệm huyết thanh học

ð Biện luận thử nghiệm huyết thanh
học phải dựa trên giá trò đònh lượng
của kết quả thử nghiệm.
ð Kết quả đònh lượng thường được
hiển thò bằng hiệu giá kháng thể.
ð Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng
cao nhất của huyết thanh bệnh
nhân mà thử nghiệm vẫn còn
dương tính.

Biện luận kết quả huyết
thanh học dựa vào:
−

Giá trò huyết thanh kép.

−

Hiệu giá kháng thể đặc
hiệu IgM.

−

Hiệu giá kháng thể đặc
hiệu so với giá trò cắt.

2


Biện luận kết quả dựa vào giá trò huyết thanh kép

(+):

Hiệu giá lần 2
Hiệu giá lần 1

≥4

Huyết thanh

lần 1
7-14
ngày

ð Đối với các kết quả đònh lượng hiển thò
bằng giá trò OD thì các nhà sản xuất thường
đưa ra một công thức để xác đònh như thế
nào là có sự gia tăng có ý nghóa đònh lượng
của huyết thanh lần 2 so với lần 1.

Huyết thanh
lần 2

ð Hữu dụng cho lâm sàng: thấp
ð Ý nghóa để chẩn đoán xác đònh: cao

Biện luận kết quả dựa vào hiệu giá kháng thể đặc hiệu IgM

Hiệu giá kháng thể
(+): thử nghiệm
(giá trò OD)

≥

Hiệu giá kháng thể
trung
bình
của
người bình thường
(giá trò OD)

ð Huyết thanh được lấy 1 lần và xác đònh
kháng thể đặc hiệu IgM.
ð Hữu dụng cho lâm sàng: cao
ð Ý nghóa để chẩn đoán xác đònh: cao

3


Biện luận kết quả dựa vào hiệu giá kháng thể so với giá trò cắt

(+):

Hiệu giá thử nghiệm
≥4
Hiệu giá cắt

hoặc
(+): ODhuyết

≥ k × ODgiá trò cắt

thanh

ð Xác đònh hiệu giá (giá trò OD) của huyết
thanh thử nghiệm và so sanh với hiệu giá
(giá trò OD) cắt của quần thể.
ð Hiệu giá (giá trò OD) cắt của quần thể được
xác đònh bằng điều tra dòch tễ học.
ð Hữu dụng cho lâm sàng: cao

ð Ý nghóa để chẩn đoán xác đònh: trung bình.

Một số thử nghiệm huyết thanh học thông dụng

ð

Tụ trực tiếp (direct agglutination)

ð

Tụ hồng cầu thụ động
(passive haemagglutination)

ð

Kết hợp bổ thể (complement fixation)

ð

ELISA phát hiện kháng thể
(antibody detection ELISA)

4


Tụ trực tiếp (Direct agglutination)
Nguyên tắc

Kháng nguyên
dạng hạt

Kháng thể đặc hiệu
với kháng nguyên
cần tìm

Tụ trực tiếp (Direct agglutination)
Hiện tượng tiền vùng (prozone)

Thừa kháng nguyên
KHÔNG TỤ

Kháng nguyên/kháng thể
tương xứng TỤ

Thừa kháng thể
KHÔNG TỤ

5


Tụ trực tiếp (Direct agglutination)
Thử nghiệm Widal phát hiện sự ngưng kết
của kháng thể đối với kháng nguyên O
và H của Salmonella.

Ứng dụng

ð Widal (+):
−

Nhiễm trùng do Salmonella.

−

Đã chủng ngừa thương hàn trước đó.

−

Có phản ứng chéo với nhiễm trùng không
phải Salmonella.

−

Nhiễm trùng do các tác nhân khác như sốt
rét, sốt xuất huyết, Enterobacteriaceae.

ð Widal (-):
−

Không có nhiễm trùng do Salmonella.

−

Đang trong tình trạng mang mầm bệnh.

−

Sự hạn chế về kỹ thuật hoặc sai sót trong
thực hiện thử nghiệm.

−

Ảnh hưởng do điều trò kháng sinh.

Tụ hồng cầu thụ động (Passive Haemagglutination)
Nguyên tắc

Kháng thể đặc hiệu
với kháng nguyên
cần tìm

Kháng nguyên hoà
tan gắn lên bề mặt
hồng cầu

6


Tụ hồng cầu thụ động (Passive Haemagglutination)
Ứng dụng

Thử nghiệm TPHA (Treponema pallidum Haemagglutination)
chẩn đoán giang mai.

Kết hợp bổ thể (Complement Fixation)
Nguyên tắc

Huyết thanh

(có kháng thể đặc

hiệu muốn tìm)

Phức hợp KN-KT
tiêu thụ hết bổ thể

Kháng nguyên

HCC-αHCC

(đặc hiệu với kháng
thể muốn tìm)

Hồng cầu còn
nguyên vẹn

Bổ thể
Huyết thanh

(không có kháng thể
đặc hiệu muốn tìm)

Kháng nguyên

(đặc hiệu với kháng
thể muốn tìm)

Bổ thể

Hồng cầu bò ly giải

Bổ thể không
bò tiêu thụ

(do bổ thể tấn công)

HCC-αHCC

7


Kết hợp bổ thể (Complement Fixation)
Ứng dụng
Thử nghiệm CFT (Complement
Fixation test) chẩn đoán:
− Brucella
− Campylobacter
− Chlamydia
− Leptospira
− Legionella pneumophila
− Mycoplasma pneumoniae
− Influenza A virus
− Rotavirus
− …

ELISA phát hiện kháng thể
(Antibody detection ELISA)
ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay)
Mẫu thử chứa
KT muốn tìm

Cộng hợp là kháng
thể gắn men và đặc
hiệu loài KT muốn tìm

Nguyên tắc

Cơ chất sinh màu
(TMB, OPD…)

Xuất hiện màu, nhờ
vậy có thế phát hiện
và đònh lượng được
KN dựa vào trò số OD

Giếng ELISA
gắn KN đặc hiệu
KT muốn tìm

KT gắn vào KN và bò
tóm bắt trên giếng

Cộng hợp gắn vào KT
nhờ vậy đánh dấu
men phức hợp KN-KT

8


ELISA phát hiện kháng thể
(Antibody detection ELISA)

Ứng dụng

ELISA phát hiện kháng thể
chẩn đoán:
− S. typhi
− Chlamydia
− Leptospira
− …

THỬ NGHIỆM HÓA MIỄN DỊCH

9


Mục đích của thử nghiệm hóa miễn dòch

Phát hiện kháng nguyên của vi
sinh vật, nhờ đó xác đònh tương đối
trực tiếp tác nhân nhiễm trùng.

Biện luận kết quả hóa miễn dòch

ð

Kết quả hóa miễn dòch chỉ cần giá trò đònh tính.

ð

Xác đònh có (dương tính) hoặc không có (âm tính)
kháng nguyên vi sinh vật gây bệnh, không cần giá trò

đònh lượng.

Một số thử nghiệm hoá miễn dòch (ELISA…) kết quả có thể biểu hiện giá trò
OD, nhưng giá trò OD này giúp người làm xét nghiệm so với OD nền để
xác đònh kết quả (+) hoặc (-).
Khi trả lời cho lâm sàng không cần đưa kết quả giá trò OD vì như vậy có
thể làm rối trí lâm sàng do lâm sàng hiểu nhầm trò số OD càng lớn thì
nhiễm trùng càng nặng.

10


Một số thử nghiệm hoá miễn dòch thông dụng
ð

Tụ latex (latex agglutination)

ð

Tủa trong thạch (ouchterlony)

ð

Điện di miễn dòch đối lưu (counter current immuno-electrophoresis)

ð

Ngăn tụ hồng cầu (Haemagglutination Inhibitor)

ð

Miễn dòch huỳnh quang trực tiếp (direct immuno-fluorescent)

ð

Miễn dòch huỳnh quang gián tiếp (indirect immuno-fluorescent)

ð

ELISA tóm bắt kháng nguyên (antigen capture ELISA)

ð

Sắc ký miễn dòch phát hiện kháng nguyên (antigen detection Immunochromatography)

ð

Sắc ký miễn dòch phát hiện kháng thể (antibody detection Immunochromatography)

Tụ latex (latex agglutination)
Nguyên tắc

Hạt latex (polystyrene
0.81µm) gắn kháng thể đặc
hiệu kháng nguyên

Kháng nguyên
hoà tan có trong mẫu thử

Hạt latex tụ lại

11


Tụ latex (latex agglutination)
Ứng dụng

Phát hiện kháng nguyên hòa
tan của vi khuẩn.

Tủa trong thạch (ouchterlony)

Kháng nguyên

Kháng thể

Ủ nhiệt độ
phòng, hộp ẩm

Phát hiện kháng nguyên
hòa tan của vi khuẩn

12


Điện di miễn dòch đối lưu
(Counter current immuno-electrophoresis)

-

+

Kháng
nguyên

Trên bản thạch điện di agarose, khoan 2
giếng, 1 giếng cho kháng nguyên (gần cực
âm), một giếng kháng thể (gần cực dương)

Kháng
thể

-

+

Trong thời gian điện di (22.5V/cm chiều dài, hay 78mA/cm chiều rộng), kháng nguyên di chuyển về
cực (+), kháng thể di chuyển về cực (-)

Sự kết hợp kháng nguyên và kháng thể sẽ hình thành
vạch kết tủa thấy được giữa hai giếng trong thạch

Phát hiện kháng nguyên hòa tan của vi khuẩn

Ngăn tụ hồng cầu (Haemagglutination Inhibitor)

Mẫu thử có
kháng nguyên
muốn tìm

KT đặc hiệu
KN muốn tìm

Mẫu thử không
có kháng nguyên KT đặc hiệu
muốn tìm KN muốn tìm

Phức hợp
KN-KT
HC đã gắn KN

KT còn tự do

HC đã gắn KN

Hồng cầu
không tụ

Hồng cầu
tụ lại

13


Ngăn tụ hồng cầu (Haemagglutination Inhibitor)

Miễn dòch huỳnh quang trực tiếp
(Direct immuno-fluorescent)

Kháng nguyên dạng hạt

(vi khuẩn, virus…) muốn
tìm hay muốn đònh type

Kháng thể đặc hiệu
đánh dấu huỳnh quang

Kháng thể bám vào
kháng nguyên, làm
kháng nguyên bò đánh
dấu huỳnh quang

Thấy được kháng
nguyên phát HQ khi xem
qua kính hiển vi HQ

14


Miễn dòch huỳnh quang gián tiếp
(Indirect immuno-fluorescent)

Kháng nguyên dạng hạt
(vi khuẩn, virus, …) đã biết
đặc hiệu KT muốn tìm

Mẫu thử có KT đặc
hiệu muốn tìm

Kháng thể bám vào
kháng nguyên

Cộng hợp : Kháng
thể gắn HQ đặc
hiệu loà i khá ng thể
muốn tìm

Cộng hợp gắn và o
kháng thể đặ c hiệ u
làm phứ c hợp KN-KT
bò đánh dầu HQ

Quệt cổ tử cung nhuộm kháng thể
huỳnh quang đặc hiệu C. trachomatis

Thấy được kháng
nguyên phát HQ khi xem
qua kính hiển vi HQ

ELISA tóm bắt kháng nguyên
(Antigen capture ELISA)

Mẫu thử chứa
KN muốn tìm

Cộng hợp là kháng
thể gắn men và đặc
hiệu KN muốn tìm

Cơ chất sinh màu
(TMB, OPD…)

Xuất hiện màu, có
thể phát hiện và
đònh lượng được KN
dựa vào trò số OD

Giếng
ELISA
gắn KT đặ c hiệ u
KN muốn tìm

KN bò KT đặc hiệu
tóm bắt trên giếng

Cộng hợp gắn vào
KN nhờ vậ y đá nh
dấu men phức hợp
KN-KT

15


Sắc ký miễn dòch phát hiện kháng nguyên
(Antigen detection Immuno-chromatography)

Kháng thể đặc hiệu
kháng thể chuột
Kháng thể đơn dòng
được gắn hạt vàng thể
keo và đặc hiệu kháng

nguyên Carbohydrate C
của S. pyogenes

Kháng thể đặc hiệu kháng
nguyên Carbohydrate C
của S. pyogenes

Sắc ký miễn dòch phát hiện kháng nguyên
(Antigen detection Immuno-chromatography)

16


Sắc ký miễn dòch phát hiện kháng thể
(Antibody detection Immuno-chromatography)

Kháng thể đặc hiệu HBSAg
Kháng nguyên HBSAg
gắn hạt vàng thể keo
Kháng thể đặc hiệu loài kháng
thể HBsAb (anti-human IgG)

Sắc ký miễn dòch phát hiện kháng thể
(Antibody detection Immuno-chromatography)

17