Các cảm biến sinh học dựa trên hạt nano và các thử nghiệm sinh học

CHƯƠNG 14

Các c m bi n sinh h c d a trên h t
nano và các th nghi m sinh h c
Guodong Liu, Jun Wang, Yuehe Lin, and Joseph Wang

Gi i thi u
T i sao s d ng h t nano?
Các c m bi n sinh quang h c d a trên h t nano và th nghi m sinh h c
Các thi t b c m bi n sinh h c đi n hóa d a trên h t nano và th nghi m sinh h c
14.4.1 Các thi t b c m bi n sinh h c đi n hóa DNA d a trên h t nano và các bài
ki m tra sinh h c
14.4.2 Nanoparticle-based electrochemical immunosensors and immunoassays
14.5 K t lu n và hư ng phát tri n
14.6 L i c m ơn
14.7 Tài li u tham kh o
14.1
14.2
14.3
14.4

14.1 Gi i thi u
S xu t hi n c a công ngh nano đang m ra nh ng chân tr i m i cho vi c áp
d ng các h t nano trong các c m bi n sinh h c và các th nghi m sinh h c. Đ c
bi t, h t nano r t đư c khoa h c th gi i quan tâm do các tính ch t v t lý và hóa h c
đ c nh t c a chúng. Các tính ch t đó cung c p nh ng tri n v ng tuy t v i cho các
c m bi n hóa h c và sinh h c [1–3]. Các h t nano v i các thành ph n và kích thư c
khác nhau đã đư c s d ng r ng rãi trong nh ng năm g n đây như là các d u hi u v
s linh ho t và nh y c m đ i v i vi c truy n t i đi n, quang và các tr ng lư ng nh
trong các s ki n ghi nh n phân t sinh h c khác nhau [4–8]. Vàng keo và các h t
nano lư ng t bán d n đ c bi t thu hút đ i v i nhi u ng d ng phân tích sinh h c.

S c m nh và ph m vi c a các h t nano có th đư c tăng cư ng đáng k b ng
cách ghép chúng v i các ph n ng sinh tr c h c và các quá trình đi n (t c là vi
đi n t nano). S tăng cư ng tín hi u kh ng l d a vào vi c s d ng nhãn
khuy ch đ i nano và v i s hình thành c a các b ph n phân t sinh h c
nano t o thành cơ s đ phát hi n siêu nh y quang h c và đi n c c v i ph n ng
ELECTROCHEMICAL SENSORS, BIOSENSORS AND
THEIR BIOMEDICAL APPLICATIONS

Copyright © 2008 by Academic Press, Inc.
All rights of reproduction in any form reserved.


442

Electrochemical Sensors, Biosensors and Their Biomedical Applications

chu i polymerase (PCR). Các giao th c có tính năng khu ch đ i c a các b ph n
phân t sinh h c nano v i các chương trình truy n d n quang h c ho c đi n hóa
có đ nh y cao. Nhi u giao th c khu ch đ i, k t h p m t vài đơn v và các quy trình
khu ch đ i d a trên các v t li u nano, cũng có th đư c thi t k đ đáp ng nhu c u
nh y c m cao c a các nghiên c u sinh h c hi n đ i. G n đây cũng có m t m i
quan tâm đáng chú ý trong vi c s d ng các phân t sinh h c đ xây d ng c u
trúc nano [1, 9] và trong vi c đi u ch nh và ch c năng hóa b m t các h t nano
[2, 9]. Các b c m bi n sinh h c d a trên h t nano cung c p ti m năng l n cho ch n
đoán DNA và protein và có th có tác đ ng sâu s c đ i v i hóa h c phân tích.
Các ng d ng c a các h t nano trong các thi t b c m bi n sinh h c có th đư c
phân lo i thành hai lo i theo các ch c năng c a chúng:(1) đ u dò nano c c nh cho
các ng d ng phân tích sinh h c và (2) h p ch t phân t nano làm nhãn cho các c m
bi n sinh h c và th nghi m sinh h c. Chúng tôi d đ nh xem xét m t s bư c ti n và
nh ng c t m c quan tr ng trong phát tri n c m bi n sinh h c d a trên các nhãn h t nano

và vai trò c a chúng trong các c m bi n sinh h c và các th nghi m sinh h c đ i v i axit
nucleic và protein. Hơn n a, t p trung vào m t s tính ch t cơ b n quan tr ng c a m t s
h t nano nh t đ nh làm cho chúng tr nên lý tư ng cho các ng d ng sinh h c khác nhau.

14.2 T i sao s d ng h t nano?
Các tính ch t đ c đáo c a v t li u nano cung c p tri n v ng tuy t v i cho vi c
thi t k các bài ki m tra sinh h c có đ nh y cao và ch n l c các axit nucleic
và protein. Vi c t o ra các v t li u nano cho các c m bi n sinh h c c th và th
nghi m sinh h c có nhi u l i ích t vi c có th thay đ i kích c , thành ph n và hình
d ng c a v t li u và do đó đi u ch nh các đ c tính v t lý và hóa h c c a chúng. Do
kích thư c nh c a v t li u nano, tính ch t c a chúng b nh hư ng m nh m b i
s ràng bu c c a các phân t sinh h c. Các h t nano v i các thành ph n và kích
thư c khác nhau đã đư c s d ng r ng rãi trong nh ng năm g n đây như là các d u
hi u v s linh ho t và nh y c m đ i v i vi c truy n t i đi n, quang và các tr ng
lư ng nh trong các s ki n ghi nh n phân t sinh h c khác nhau [4–8]. S tăng
cư ng tín hi u kh ng l liên quan đ n vi c s d ng nhãn khu ch đ i b ng nano
và v i s hình thành các b ph n phân t sinh h c phân t nano t o cơ s cho s
phát hi n quang h c và đi n t v i đ nh y PCR. Các giao th c có tính năng
khu ch đ i c a các b ph n phân t sinh h c nano v i các chương trình truy n
d n quang h c ho c đi n hóa có đ nh y cao. Nhi u giao th c khu ch đ i, k t h p
m t vài đơn v và các quy trình khu ch đ i d a trên các v t li u nano, cũng có
th đư c thi t k đ đáp ng nhu c u nh y c m cao c a các nghiên c u sinh h c
hi n đ i. Các tính ch t xúc tác đ c đáo c a các h t nano kim lo i kích thích s
phóng to c a chúng b ng m t kim lo i tương t ho c m t h t kim lo i khác cung
c p tín hi u khu ch đ i vô cùng đáng k . Nó có th tăng đáng k s lư ng th
cho m i s ki n ràng bu c (và đ t đư c m t tín hi u khu ch đ i kh ng l )
b ng cách đóng gói nhi u phân t t o ra tín hi u trong m t máy ch h t
nano. Các c m bi n sinh h c và th nghi m sinh h c d a trên các v t li u nano này
có th đư c k t h p v i các quy trình khu ch đ i b sung, ch ng h n như s t p
trung b m t ho c tái ch enzym. Sau đây s th o lu n v các nhãn nano v quang

h c siêu nh y và c m bi n sinh h c đi n t và các th nghi m sinh h c.


443

Nanoparticle-based Biosensors and Bioassays

14.3 Các c m bi n sinh quang h c d a trên h t nano và th
nghi m sinh h c
Vi c s d ng các nhãn nano trong các c m bi n sinh quang h c (và các th nghi m
sinh h c) đã đư c s d ng đ gi i quy t các gi i h n v hóa h c và quang ph
đáng k c a các ch t h u cơ. Công vi c ban đ u c a Mirkin và các đ ng nghi p đã
ch ng minh r ng s k t h p c a các h t nano vàng, gây ra b i s lai ghép DNA, d n
đ n các v t li u có đ c tính quang h c vư t tr i [10, 11]. Ví d , các thu c tính quang
h c ph thu c vào kho ng cách c a các h t nano vàng đư c t ng h p đã đư c khai
thác đ phát tri n m t phương pháp đo màu đơn gi n và nhanh chóng đ phát hi n
các chu i nucleotides [11]. S k t h p DNA bi n đ i nano này d n đ n s thay đ i
nhanh chóng c a dung d ch t màu đ sang xanh. K t qu DNA nano tích phân sinh
h c hi n th ADN s c nét các đư ng cong nóng ch y cho phép phân bi t thu n ti n
các oligonucleotides v i đơn nguyên không hoàn h o[10, 12]. Taton và c ng s mô
t m t phát hi n m ng scanometric DNA nh y c m cao d a trên vi c s d ng các
m c tiêu oligonucleotide, đư c dán nhãn v i các h t nano vàng, đ nh n di n các
đo n DNA trên m t con chip (Hình. 14.1) [13]. M t h t nano đư c thúc đ y gi m b c
(1) đã d n đ n m t tín hi u khu ch đ i m nh m (105 l n) và tăng đ nh y c m

S’ GGA TTA TTG TTA – AAT ATT GAT AAG GAT 3
ЈCCT AXT AAC AAT TTA TAA CTA TTC CTA

Au

X = A (complementary),
G,C,T (mismatched)

1.

(target DNA)

2.

Au
Au

Ag

AgЈ
hydroquinone
(pH 3.8)

Au

Ag(s)
quinone

Hình 14.1 Phát hi n m ng ADN Scanometric b ng các thăm dò h t nano phóng to. S d ng các
m c tiêu oligonucleotide, dán nhãn v i các h t nano vàng, đ nh n bi t các phân đo n ADN trên m t con
chip (đư c sao chép t [13] v i s ch p nh n).


444

Electrochemical Sensors, Biosensors and Their Biomedical Applications

g p 100 l n so v i các ki m tra d a trên s phát hi n d a trên s phát hu nh quang tương
t . Vi c tăng cư ng ch t b c d a vào s gi m hóa ch t c a ion b c b ng hydroquinone
t i kim lo i b c trên b m t các h t nano vàng. K t t a b c t o đi u ki n cho hình
dung c a nhãn h t nano và cho phép đ nh lư ng các m c tiêu trên cơ s các giá tr
màu xám đư c ch p nh. Ngoài ra, vi c s d ng nhãn nano đã làm thay đ i các quy
trình nóng ch y đ cho phép phân bi t có hi u qu đ i v i các mismatch đơn cơ s .
Pavlov et al. báo cáo v vi c s d ng các h t nano vàng cho vi c khu ch đ i truy n t i
quang h c c a các aptamer liên k t protein [14]. Các h t nano vàng đã có ch c năng
hoá v i aptamer thiolated (80 aptamers trên m i h t). Các aptamer liên k t v i ch t
phân t thrombin protein gây ra các h t nano vàng đ t ng h p và ph h p th plasmon
c a h đ gi m.
Tán x Raman (SERS) là m t phương pháp chuy n đ i quang ph khác, có th r t
thu n l i cho vi c s d ng các h t nano vàng. Cao và c ng s s d ng h t nano ch c
năng v i oligonucleotides và thu c nhu m Ramanactive đ phát hi n DNA lai hóa[15].
Các h t nano vàng t o đi u ki n cho s hình thành c a m t l p m b c ho t đ ng
như m t ch t xúc tác đ tán x Raman c a thu c nhu m. Đ nh y cao đ n m c 20
fM DNA theo báo cáo. Nhi u phát hi n đã đư c th c hi n b ng cách s d ng thu c
nhu m Raman khác nhau. Cư ng đ lư ng t hu nh quang cao c a các ch m lư ng
t bán d n (QDs) cũng có th d n đ n các nghiên c u sinh h c nh y c m đáng k .
Hahn và c ng s báo cáo v m t phát hi n r t nh y c m c a vi khu n gây b nh đơn E.
coli O157 s d ng CdSe / ZnS lõi v QDs liên h p v i streptavidin [16]. H th ng này
th hi n hai m c tăng đ nh y (cùng v i đ n đ nh cao hơn) so v i các thu c nhu m
thông thư ng.
Mirkin và các đ ng nghi p đã phát tri n m t phương pháp mã v ch sinh h c d a
trên nanô b ng vàng d a trên nano đ phát hi n các protein xu ng đ n m c th p
nh t c a t y [17]. Giao th c m nh m này d a vào các qu c u t ch c năng hóa
v i m t kháng th liên k t c th v i protein m c tiêu và m t kháng th th c p
liên h p v i các h t nano vàng đư c mã hoá v i các chu i DNA đ c đáo đ i v i

protein m c tiêu (Hình. 14.2,
a

b
1.

SH

Step 1.
Target Protein
Capture with
MMP Probes

Step 2.
Sandwich Captured Target
Proteins with NP Probes

2. Bevine Serum Albumin
3.
Nanoparticle (NP) Probe

Target Protein
(PSA)
13 nm NPs for Bio-Bar-Code PCR
30 nm NPs for PCR-less Method

1.
Step 5.
Chip-Based Detection
of Bar-Code DNA for

Protein Identification

2. Bevine Serum
Albumin
Magnetic Microparticle
(MMP) Probe
Gold Nanoparticle

SH Capture DNA

Bar-Code DNA

Monoclonal Anti-PSA

Polyclonal Anti-PSA

Amine-Functionalized
Magnetic Particle

Ag
Au

Step 4.
PCR-less Detection
of Bar-Code DNA from
30 nm NP Probes

Step 4.
Polymerase
Chain Reaction

Step 3.
MMP Probe Separation
and Bar-Code DNA
Bar-Code DNA Dehybridization

Magnetic
Field

Hình 14.2 Phương pháp th nghi m mã v ch sinh h c. (a) Thi t k và chu n b thăm dò. (b) Phát hi n
PSA và mã v ch DNA mã v ch và nh n d ng (sao chép t [17] v i s cho phép) (xem b ng 14 cho
phiên b n màu.


Nanoparticle-based Biosensors and Bioassays

445

xem B ng 14 cho phiên b n màu). S tách bi t t các thăm dò và m c tiêu ph c t p,
ti p theo là s kh huy t tương c a các oligonucleotides trên b m t nano, cho phép
đo đ c scanometric có đ nh y cao c a protein m c tiêu b ng cách xác đ nh trình t
oligonucleotide đư c phóng ra t thăm dò h t nano. Vi c tăng cư ng đáng k đã đ t
đư c vì m i máy dò h t nano mang m t s lư ng l n các oligonucleotides cho m i
liên k t protein. M t th nghi m mi n d ch đa phân t có th đư c th c hi n b ng
cách s d ng các trình t oligonucleotide khác nhau đ mã hóa các kháng nguyên
m c tiêu khác nhau. Phép th mã v ch sinh h c d a trên h t nano đư c s d ng đ
phát hi n ra kháng nguyên ti n li t tuy n (PSA) m c đ attomolar th p (aM ϭ 10Ϫ
18
M), t c là đ nh y g p 6 l n đ l n hơn so v i xét nghi m ELISA tương ng.Ngoài
ra, cùng m t cu c kh o sát đã đư c s d ng đ đo d u hi u b nh gây ra b nh

Alzheimer ADDL trong t y s ng não li u lư ng picomolar [18]. Khái ni m mã
v ch sinh h c đã đư c m r ng đ khu ch đ i PCR phát hi n s lai t o DNA xu ng
m c 500 zeptomolar (t c là 30 b n trong 30 µL m u; zM ϭ 10Ϫ21 M) [19]. M t
đóng góp g n đây c a Niemeyer và các đ ng nghi p đã cho th y s phát hi n nh y
c m quang h c c a các protein s d ng các h t nano vàng DNA [20]. Trong trư ng
h p này, th nghi m mi n d ch nhi u l p đã gây ra nhi u l p h t nano vàng liên k t
DNA đ hình thành đư c phát hi n b i quang ph tia c c tím/nhìn th y đư c (UV/
Vis).
M t con đư ng h p d n khác cho vi c truy n t i quang h c các s nh n th c quang
h c liên quan đ n vi c đóng gói m t lư ng l n m t ch t đánh d u hu nh quang trong
các h t nano [21–26]. Harma và c ng s đã báo cáo m t nhãn nano có đ phát hu nh
quang Europium đư c đưa vào m t xét nghi m kháng nguyên đ c hi u ti n li t tuy n
(PSA) c c k nh y c m. PSA đã đư c phát hi n trong các gi ng khoan vi lư ng đư c
ph m t kháng th đ c hi u PSA s d ng kháng th biotinyl hoá và đư c ph streptavidin, các h t nano 107 nm có n ng đ cao ch a hơn 30.000 ion Europium đư c thêm
b i beta-diketones. PSA đư c theo dõi tr c ti p trên b m t c a gi ng mà không có b t
k bư c tăng cư ng b sung nào. Đ nh y c a phép kh o nghi m là
1.6 ng/L, tương ng v i 50 fmol LϪ1 fM ho c 250 zeptomoles (250 ϫ 10Ϫ21 molϪ1)
c a PSA. Ho t đ ng đ c hi u cao và đ c hi u th p c a các h t nano đã đư c
streptavidin c i thi n đ nh y c a phương pháp PSA 100 l n so v i streptavidin thông
thư ng đư c đánh d u b ng europium cùng m t m u kh o sát. Nhãn nanô này đã
đư c s d ng thành công đ phát hi n PSA mi n phí trong m u huy t thanh [22] và
hormon kích thích tuy n giáp (m t d u hi u c a ch c năng tuy n giáp)[23]. Trau và
các đ ng nghi p đã báo cáo v m t th nghi m mi n d ch nh y c m cao đ i v i
protein d a trên v t li u k t t vi tinh th đóng gói polyelectrolyte liên k t v i kháng
th [24]. M t th nghi m mi n d ch m nh m (ϳ2000 l n) đã đư c báo cáo liên quan
đ n s gi i phóng các phân t phát hu nh quang vào môi trư ng phát hi n sau s
tương tác kháng th kháng nguyên. M t phương pháp tương t đ t i đa hóa s lư ng
các phân t phát sáng cho m i s ki n liên k t đư c báo cáo b i Tan và các đ ng
nghi p [25]. V i m c đích này, thu c nhu m phát hu nh quang đư c đóng gói trong
các h t nano silic đư c ch c năng hóa b ng m t thăm dò oligonucleotide. Phương

pháp đưa ra m t gi i h n phát hi n r t th p là 0,8 fM v i s phân bi t có hi u qu
đ i v i DNA không kh p. Ma tr n silic cũng cung c p s b o v t t ch ng l i s
t y tr ng c a tia c c tím. Các h t nano silic k t t a sinh h c cũng đư c s d ng
đ phát hi n vi khu n siêu nh y, xu ng đ n m t t bào đơn E. coli O157 [26].


446

Electrochemical Sensors, Biosensors and Their Biomedical Applications

14.4 Các thi t b c m bi n sinh h c đi n hóa d a trên h t nano và
th nghi m sinh h c
Các thi t b đi n hóa g n đây đã nh n đư c s quan tâm đáng k trong vi c phát
tri n các b c m bi n mi n d ch và sinh h c lai ghép DNA đ c hi u [27–29]. Các
c m bi n sinh h c đi n hóa là nh ng thi t b liên quan m t thi t v i m t y u t
nh n bi t sinh h c v i m t đ u dò đi n c c d a vào s chuy n đ i c a ph n ng
kháng th và kháng th Watson-Crick thành m t tín hi u đi n h u ích. Các thi t b
đi n hóa cung c p các tuy n đ liên k t - c p đ phân t - các b ph n nh n d ng
và nh n di n tín hi u DNA (ho c kháng th -kháng nguyên) và đư c ch ng nh n đ
đáp ng nhu c u v kích c , chi phí, kh i lư ng th p và năng lư ng c a phân tích
ADN và ch n đoán protein [27–29]. Đ nh y cao c a các thi t b c m bi n đi n
hóa, cùng v i quá trình thu nh , kh năng tương thích v i các công ngh vi
mô hi n đ i, yêu c u v chi phí th p và đi n năng, và s đ c l p c a đ đ c
m u làm cho các ng d ng này tr nên tuy t v i cho vi c ki m tra gen và
phân tán. M c dù vi c s d ng b c m bi n sinh h c đi n ho c chip đi n t đang
giai đo n đ u tiên, các máy phân tích DNA và protein đi n c m tay d s d ng
đang ti n g n th trư ng [30] và d ki n s có tác đ ng đáng k lên DNA và
protein trong tương lai ch n đoán. S truy n d n đi n hóa c a các s ki n lai t o
DNA thư ng đ t đư c trong k t n i v i các ch th đi n / b chèn ho c th enzyme.
S truy n t i đi n hóa c a các s ki n nh n di n kháng th - kháng nguyên đã

đư c th c hi n liên quan đ n các ion kim lo i và các nhãn enzyme. Vi c s d ng
các b dò h t nano là tương đ i m i trong phát hi n đi n và cung c p cơ h i duy nh t
cho vi c chuy n n p các tín hi u protein và các c m bi n DNA.

14.4.1 Các thi t b c m bi n sinh h c đi n hóa DNA d a trên h t nano và các bài
ki m tra sinh h c
Các l trình đi n d a trên h t nano đ phát hi n gen đã thu hút đư c
nhi u s quan tâm. Các phương th c m i như v y đư c d a trên vi c s
d ng vàng keo [31, 32], đ u dò ch m lư ng t bán d n [33, 34], h t nano
s t/h p kim vàng[35], h p kim nano đ ng/vàng[36], và các h t nano
b c[37]. Các v t li u h t nano này cung c p cách giao ti p đ k t n i các s
nh n di n ADN v i vi c truy n d n tín hi u đi n hóa và đ khu ch đ i các
ph n ng đi n. H u h t các chương trình này thư ng d a vào m t chuy n đ i
phóng đi n hóa có đ nh y cao/Đo đ c các kim lo i. Tách vôn th là m t k
thu t đi n phân m nh m đ theo dõi các phép đo kim lo i[38]. Đ nh y đáng
kinh ng c c a nó là do bư c t p trung s n sàng “tích h p s n” trong đó các
m c tiêu kim lo i đư c tích lũy (l ng đ ng) vào đi n c c làm vi c. Do đó các
gi i h n phát hi n đư c gi m xu ng t ba đ n b n m c đ , so v i các k
thu t xung lư ng t đư c s d ng trư c đó đ theo dõi s lai t o DNA. S
phát hi n đi n c c siêu nh y như v y đã đư c th c hi n liên quan đ n nhi u
lo i m i và các m ng nano c u trúc liên k t DNA m i.


447

Nanoparticle-based Biosensors and Bioassays

M t s nhóm, bao g m c chúng ta, đã phát tri n các th nghi m lai hóa DNA
đi n hóa nano m nh m [31–37]. Các phương th c đó d a vào vi c thu th p các đ u
dò nano b ng mã v ch DNA t i m c tiêu đã đư c lai, sau đó là s phân h y axit và

đo đi n c c phân c c c a các thi t b dò kim lo i(Hình 14.3, xem b ng 15 cho phiên
b n màu). Vi c c đ nh ho c m c tiêu c đ nh đư c th c hi n k t h p v i các h t t
khuy ch tán streptavidin[31], thông qua vi c s d ng các l p b m t chitosan ho c
polypyrrole [37], ho c thông qua vi c h p ph lên các b c tư ng c a polystyrene
microw-ells [32]. N ng đ Picomolar và Subnanomolar c a đích ADN đã đư c phát
hi n. S tăng cư ng đ nh y hơn n a có th đ t đư c b ng cách phóng to ch t xúc
tác vàng trong k t n i v i s gia tăng vàng c a h t nano [31] ho c b c [39–41] (Hình.
14.3b, xem b ng 15 v i phiên b n màu). K t h p vi c m r ng các th h t kim lo i, v i
vi c tích h p s n có hi u qu phân tích tách đi n phân, m đư ng cho các gi i h n phát
hi n subpicomolar. Vi c tăng cư ng b c trong đư ng d n đi n đã đư c áp d ng g n đây
đ phát hi n trong các h th ng “lab-on-chip” k t n i v i vi c nâng c p trên chip PCR
[42].
ϩ

ϩ

MB

Biotinylated
Capture Probe

Biotinylated
Target

ϩ

Ϫ

CdS labeled
probe

Cd
Amplification
Silver Enhancement

HBr
Au(III)

HNO3
HNO3

Ag(I)

Zn

Au(III)

MD

Meϩ

Au(III)

Disposable ScreenPrinted Electrode

Me2ϩ Me2ϩ

M

Au(I)

MD

Mercury Coated Glassy
Carbon Electrode

Au(I)

Disposable ScreenPrinted Electrode
(a)

Cd Pb

(b)

(c)

(d)

(e)

Hình 14.3 Phát hi n đi n hóa d a trên h t nano trên DNA. Các xét nghi m này liên quan đ n
vi c gi i thi u các h t t tính tráng thăm dò, s b sung c a s ki n m c tiêu / s lai t p, lo i b các v t
li u không mong mu n, s k t dính c a kim lo i, và s phát hi n đi n hóa c a h t nano vàng (a), b c (b),
và cadmium sulfide (d). Me: th kim lo i. Các tín hi u đư c lo i b tr ng thái r n (c) và các giao th c dò tìm
đa m c tiêu (e). Xem văn b n đ bi t chi ti t (xem B ng 15 cho phiên b n màu).


448

Electrochemical Sensors, Biosensors and Their Biomedical Applications

Vi c lai các h t t tính b c thăm dò v i các m c tiêu đư c g n nhãn vàng cho k t
qu là các c u trúc m ng ba chi u c a các h t t tính “l n” (micromet), liên k t
chéo qua DNA và các h t nano vàng. Trong các t p h p này, xo n kép DNA như m t
cây c u n i các h t t v i các h t nano kim lo i. Theo quan sát th y không có s k t h p
như v y khi có m t các oligonucleotide không b sung ho c không kh p nhau. S k t
h p do ADN tương t đã đư c khai thác b i Mirkin và các đ ng nghi p đ phát hi n ra
s liên k t v i các thay đ i màu ph thu c vào kho ng cách[11]. G n đây, chúng tôi đã
mô t m t phương th c đi n hóa đ phát hi n DNA lai d a trên vi c chu n b các đi m
đánh d u kim lo i d c theo xương s ng DNA (thay vì n m b t nó cu i c a xo n kép)
[43]. Phương th c m i d a trên s t o ra các dây nano d n đi n do khuôn m u DNA
t o ra như m t phương th c thu gi các th kim lo i. Vi c s d ng ADN làm khuôn
m u hóa đã t o ra các ho t đ ng nghiên c u nh m t o ra các dây nano d n đi n và xây
d ng các m ch ch c năng [44–46]. Cách ti p c n như v y đã đư c áp d ng đ tăng thêm
b c [44], palladium [45], ho c các nhóm platinum [46] trên m u DNA. Tuy nhiên, vi c
g n các dây kim lo i lên m u DNA đã không đư c khai thác đ phát hi n DNA lai. Các
k ho ch phát hi n m i bao g m các t p h p vector tĩnh đi n “c a các ion b c d c theo
các m c tiêu DNA đư c c đ nh, ti p theo là s hình thành các h p ch t b c
hydroquinone k t tinh d c theo b xương ADN, cùng v i s gi i phóng và đi n phân c a
c m b c nano.
Mirkin và các đ ng nghi p đã phát tri n m t phát hi n đi n d a trên m ng b ng
cách s d ng các h t nano vàng có ch c năng oligonucleotide và các đi n c c nh liên
k t v i nhau[47]. Thăm dò các oligonucloetide đã đư c c đ nh trong kho ng cách
gi a hai đi n c c. S ki n lai t o này giúp đ nh v các h t nano vàng trong kho ng
cách đi n c c và cùng v i s l ng đ ng b c d n đ n xu t hi n tín hi u đi n có th
đo đư c. Các tín hi u d n đi n liên k t v i s thay đ i đi n tr trên khe đi n c c,
mang l i đ nh y cao v i gi i h n phát hi n 0.5 pM. Ki m soát n ng đ mu i cho
phép ch n l c đ t bi n đi m cao (v i m t y u t 100 000: 1) không có đ b n nhi t.
Urban et al. đã ch ra đư c, s thay đ i c a đi n tr trên m t kho ng cách vi đi n là
k t qu t quá trình lai DNA nanô có g n nhãn[48] cho m t h th ng đ c m ng song

song. M t b phân tích vi lư ng khép kín cho phép đ c song song như v y c a toàn
b m ng cho th y s tuy t v i c a ng d ng t i t ng đi m. Vàng keo cũng đư c s
d ng đ c i thi n s b t đ ng c a DNA trên b m t đi n c c và do đó làm tăng kh
năng lai ghép c a b m t[49]. Vi c s d ng các v t li u h tr nano như v y là đáng
tin c y v t l p ráp trên đư ng kính kính nano 16 nm vào đi n c c vàng cystamine
và t o ra m t đ b m t c a oligonucleotides cao đ n 4 ϫ 1014 phân t cmϪ2.Phát
hi n th ferrocenecar-boxaldehyde (liên h p v i DNA m c tiêu) d n đ n m t gi i h n
phát hi n là 500 pM.
Do đ c tính đ c đáo (có th đi u ch nh đi n t ), các tinh th nano bán d n (tinh qu ng
lư ng t ) đã t o ra s quan tâm đáng k cho vi c phát hi n DNA quang h c [12]. Ho t
đ ng g n đây đã ch ng minh đư c ích l i c a h t nano lư ng t ch m đ tăng cư ng
đi nphát hi n DNA [33, 34, 50]. Willner et al. báo cáo v vi c truy n d n quang đi n
hóa các c m bi n DNA k t n i v i các m ng t bào nano CdS liên k t chéo DNA[50].
S ràng bu c tĩnh đi n c a Ru(NH3)63ϩ ch p nh n electron đ n dsDNA


Nanoparticle-based Biosensors and Bioassays

449

cung c p m t đư ng h m cho các đơn v electron và d n đ n tăng photocurrents. Chúng
tôi đã báo cáo v vi c phát hi n DNA lai ghép k t h p v i các ch t dò nano và các
phép đo đi n phân c a cadmium[33]. S gia tăng ch t xúc tác cadmium lên nano đã
đư c s d ng đ phóng to nhãn các h t nano và khu ch đ i tín hi u lai tách DNA(Hình
14.3, xem b ng 15 v i phiên b n màu). Ngoài các phép đo c a ion cadmium, chúng
tôi đã ch ng minh các phép đo tr ng thái r n sau k t h p chu i h t t /DNA lai/
CdS lên đ u dò đi n c c dày. Phương th c như v y k t h p các tính năng khu ch
đ i c a các b ph n h t nano/polynucleotide và vi c phát hi n cadmium b ng tia
c c tím có đ nh y cao v i cách ly t tính hi u qu c a xo n kép. Gi i h n phát
hi n th p (100 fmol) đư c k t h p v i kh năng tái s n xu t t t (RSD ϭ 6%). M t

phương th c g n đây đã đư c m r ng t i các ch t keo vô cơ khác (ví d ZnS
ho c PbS) có th đư c t ng h p tương t trong mixen đ o ngư c. S m r ng
như v y đã m đư ng cho m t công ngh mã hoá đi n hóa đ phát hi n đ ng
th i nhi u đích DNA d a trên các th nanocrystal v i nhi u ti m năng oxy
hóa kh [34]. Ch c năng hóa các th tinh th nano b ng các thăm dò oligonucleotide
thiolated do đó đưa ra m t ký hi u voltammetric v i các tín hi u đi n khác nhau cho
các m c tiêu DNA lai tương ng (Hình. 14.3e, xem b ng 15 phiên b n màu). V trí và
kích thư c c a các đ nh núi k t qu cung c p s nh n d ng mong mu n và thông tin
đ nh lư ng tương ng trên m t DNA m c tiêu nh t đ nh. Kh năng phát hi n DNA
đa m c tiêu đư c k t h p v i đ c tính khu ch đ i c a đi n phân tích voltametry
(đ t o ra gi i h n phát hi n femtomolar) và v i vi c lo i b hi u qu các axit
nucleic không đư c lai t o đ cung c p đ nh y và đ ch n l c cao. Do đó, có
th đo đư c t i sáu m c tiêu cùng m t lúc v i k t n i các h t bán d nZnS, PbS,
CdS, InAs, và GaAs. Ti n hành nhi u th nghi m song song (trong microwells
c a gi ng vi phím ho c s d ng vi m ch đa kênh, v i m i microwell ho c kênh
th c hi n nhi u phép đo) do đó có th d n đ n m t ho t đ ng thông lư ng cao.

14.4.2 C m ng mi n d ch đi n gi i d a trên h t nano và xét nghi m mi n d ch
Trên cơ s m t ph n ng c th c a kháng th và kháng nguyên, các ch t c m ng
mi n d ch cung c p m t công c nh y c m và có ch n l c đ xác đ nh các ch t mi n
d ch. đây, v t li u mi n d ch b c đ nh trên đ u dò; ch t phân tích đư c đo b ng
m t loài nhãn liên h p v i m t trong các ch t mi n d ch. Đ nh lư ng thư ng đ t
đư c b ng cách đo ho t đ ng c th c a nhãn, t c là đ phóng x , ho t đ ng
c a enzyme, s phát hu nh quang, s phát quang hóa h c ho c phát quang sinh
h c. Không có nhãn lý tư ng,m i lo i đ u có nh ng l i th và b t l i riêng c a
mình. Các th nghi m mi n d ch c a Metall, t c là nh ng nghiên c u không
liên quan đ n nhãn mác d a trên kim lo i, đư c phát tri n vào nh ng năm
1970 [51] đ kh c ph c các v n đ liên quan đ n nhãn ph phát x , phóng
x ho c enzyme ph bi n. Th nghi m mi n d ch Metall v i phát hi n đi n
hóa có th mang l i nhi u ưu đi m; ví d . đo lư ng có th đư c th c hi n th

tích ch t l ng r t nh (vài microliters), cu i cùng trong môi trư ng đ c, v i kh
năng có đ nh y t t cho m t thi t b tương đ i r ti n (lĩnh v c cơ đ ng).
M c dù các k thu t đi n hóa cho phép các h p ch t h u cơ [52, 53]


450

Electrochemical Sensors, Biosensors and Their Biomedical Applications

ho c các ion kim lo i [54, 55] đư c phát hi n n ng đ nano, đ nh y c a chúng
v n không đ so v i nhãn chi t xu t t europium chelate có th xác đ nh đư c m c
picomolar.
M t l trình h a h n cho vi c t i đa hóa s lư ng các d u hi u kim lo i cho m i s
ki n là vi c s d ng m t nhãn nano kim lo i, bao g m hàng ngàn nguyên t kim lo i.
Vàng keo là m t trong nh ng ng c viên t t nh t cho mi n d ch đi n gi i và th
nghi m mi n d ch vì ho t đ ng oxy hóa tuy t v i c a nó. Murielle et al. l n đ u tiên
báo cáo m t phép th mi n d ch đi n hóa nh y c m d a trên nhãn vàng keo, sau khi
gi i phóng kim lo i vàng oxy hóa trong dung d ch axit, đư c xác đ nh gián ti p b i
phép đo áp su t bóc tách anod (ASV) t i m t đi n c c in trên màn hình (SPE) [56].
Phương pháp đã đư c đánh giá cho m t th nghi m mi n d ch không đ ng nh t không
c nh tranh c a m t immunoglobulin G (IgG) và n ng đ th p 3 ϫ 10Ϫ12 M đư c xác
đ nh, có kh năng c nh tranh v i phương pháp ELISA ho c v i các th nghi m mi n
d ch d a trên nhãn flutene europium chelate. Chu et al. báo cáo m t phép th mi n
d ch đi n hóa tương t d a trên b c trên nhãn keo vàng, sau khi dung d ch kim lo i
b c trong dung d ch axit, đư c xác đ nh gián ti p b i ASV t i m t đi n c c th y tinhcacbon [57]. Phương pháp đã đư c đánh giá cho m t bài ki m tra mi n d ch không
đ ng nh t không c nh tranh c a m t immunoglobulin G (IgG) như m t mô hình.
Dòng anod t y tr ng b c ph thu c tuy n tính vào n ng đ IgG trong ph m vi t 1.66
ng mLϪ1 t i 27.25 ng mLϪ1 trong m t bi u đ logarit. Gi i h n phát hi n th p 1 ng
mLϪ1 (i.e. 6ϫ10Ϫ12 M) IgG con ngư i đã đ t đư c.
M t phương pháp m i d a trên s tích t cyclic c a các h t nano vàng đã đư c đ

xu t đ phát hi n globulin mi n d ch c a ngư i G (IgG) b ng phép đo áp su t bóc tách
anod [58]. Ph n ng phân rã gi a dethiobiotin và avidin v i s hi n di n c a biotin cung
c p m t phương ti n có hi u qu cho s tích t cyclic c a các h t nano vàng đư c s
d ng cho đ nh lư ng phân tích cu i cùng. Dòng đ nh anodic tăng d n theo chu k tích
lũy ngày càng tăng. Năm chu k tích lũy là đ đáp ng cho thí nghi m. N n th p c a
phương pháp đư c đ xu t là m t l i th khác bi t cung c p kh năng xác đ nh ít nh t
0.1 ng/mLϪ1 human IgG.
M t phương pháp ki m tra mi n d ch đi n hóa d a trên Au, vi c m r ng h mi n
d ch tăng lên b ng nano đư c s d ng đ phát hi n b sung C-3 đã đư c Zhou et al
[59]. Khi các t h p đư c hình thành t nhãn nano Au goat-anti-human C-3 và th
nano Au rabbit-anti-goat IgG đã đư c c đ nh trên b m t đi n c c b ng phương
pháp x p l p (kháng th - kháng nguyên- t ng h p), tín hi u đi n hóa c a đi n c c đã
đư c m r ng r t nhi u. TCác c m bi n mi n d ch báo cáo đ nh lư ng có th xác đ nh
b sung C-3 trong ph m vi 0.12, tương t như ϳ117.3 ng mLϪ1, và gi i h n phát hi n
là 0.02 ng mLϪ1.
Liao et al. báo cáo m t th nghi m mi n d ch đi n gi i b ng cách tích phân t xúc c a
Au3ϩ lên nhãn nano vàng [60]. B ng cách k t h p s l ng đ ng t phân xúc v i phép
đo đ nghiêng sóng vuông, các h t nano vàng phóng to đư c g n nhãn trên goat antirabbit globulin mi n d ch G (GaRIgG-Au) và do đó th nghi m the rabbit globulin
mi n d ch G (RIgG), có th đư c xác đ nh v s lư ng. T m t bi u đ hi u ch nh
trong m t d i đ ng năng t p trung r ng (1–500 pg mLϪ1; R2 ϭ 0.9975), m t gi i h n
phát hi n r t th p đã thu đư c. Gi i h n là 0.25 pg mLϪ1 (1.6 fM),


451

Nanoparticle-based Biosensors and Bioassays

đó là ba đơn đ t hàng c a đ l n th p hơn so v i thu đư c b ng m t xét nghi m mi n
d ch thông thư ng b ng cách s d ng cùng m t nhãn nano vàng.
G n đây, m t ch t c m ng mi n d ch đi n t sinh h c d a trên h t d a trên h t

đã đư c phát tri n trong nhóm c a chúng tôi b ng cách s d ng các h t t và nhãn
h t nano vàng [61]. Các h t t tính đư c đi u ch nh kháng th kháng IgG đư c g n
v i b m t đ u dò cacbon tái t o b ng m t nam châm đã đư c đ nh v bên trong
c m bi n. Các nhãn nano vàng đư c ph lên b m t các h t t tính b ng m t th
nghi m mi n d ch x p l p (Fig. 14.4). Phân tích t y đi n c c nh y c m cao cung c p
m t phương pháp đơn gi n và nhanh chóng
(i)

(ii)

(iii)

(iv)

Stripping
analysis

Anti-IgG attached magnetic beads
(a)

IgG

Gold nanoparticle modified secondary antibody
(i)

Carbon paste
Magnets
(ii)

(b)

Hình 14.4 (a) Phép th mi n d ch đi n phân d a trên h t: (i) đưa các h t t tính đ nam châm/ các
bon dán lên thay đ i kháng th vào b m t đ u dò đi n hóa ; (ii) g n k t kháng nguyên IgG v i kháng th
trên các h t t tính; (iii) ch p các kháng th th c p có nano vàng; (iv) s phát hi n tư c b s i đi n c a các
h t nano vàng. (b) hình nh TEM c a các h t t tính - s k t h p các h t nano vàng k t qu t các ph n
ng mi n d ch k t h p c a 0.2 g mL 1 phân tích IgG(i) và m t cái nhìn m r ng v các b ph n h t (ii)
(sao chép t [61] v i s cho phép).


452

Electrochemical Sensors, Biosensors and Their Biomedical Applications

đ đ nh lư ng các thi t b dò h t vàng nano và tránh bư c gi i phóng và s d ng nhãn
và ch t n n c a enzyme. Tín hi u t y c a h t nano vàng có liên quan đ n n ng đ IgG
m c tiêu trong dung d ch m u. Gi i h n phát hi n c a 0.02 µg mLϪ1 of IgG đư c thu
đư c dư i đi u ki n thí nghi m t i ưu.
Các c m bi n mi n d ch trên và xét nghi m mi n d ch d a trên m t nhãn nano
vàng đư c s d ng đ phát hi n m t m c tiêu và không th đư c s d ng cho các
xét nghi m nhi u m c tiêu. M t quy trình ki m tra mi n d ch đi n hóa đ đo đ ng
th i protein, d a trên vi c s d ng các ch t dò nano vô cơ khác nhau, đư c báo
cáo b i Liu và c ng s . [29]. Kh năng phát hi n đi n c c đa protein đư c k t h p
v i đ c tính khuy ch đ i đi n phân tách (đ t o ra gi i h n phát hi n fmol) và v i s
tách bi t b ng t có hi u qu (đ gi m thi u các hi u ng h p ph không mong
mu n). Th nghi m mi n d ch nhi u l p liên quan đ n m t s ki n ràng bu c kép, d a
trên các kháng th g n li n v i các th nano và h t t (Fig. 14.5). Carbamate liên k t
đư c s d ng đ liên h p k t tinh nano hydroxyl-ch m d t v i các kháng th th c p.
M i s nh n th c sinh h c t o ra m t đ nh cao voltammetric khác bi t, v trí và kích
thư c c a nó ph n ánh b n s c và m c tương ng c a kháng nguyên tương ng.

(b)
Ab1
Ag3

ZnS-Ab1

Ag2

CdS-Ab2

Ag1

Ab2

(a)

PbS-Ab3
(c)

Ab3

Cd

Current (␮A)

Zn

Acid Dissolution

Pb

(d)
LE

Mϩ ϩ
M

E (v)

Hình 14.5 Phương th c phát hi n nhi u protein d a trên nh ng ch t dò nano nano vô cơ vô cơ khác
nhau. (a) Gi i thi u các h t t tính đư c đi u ch nh kháng th ; (b) g n k t các kháng nguyên v i các
kháng th trên các h t t tính; (c) ch p đư c các kháng th th c p; (d) gi i phóng các dây nano và phát
hi n phân gi i đi n hóa (sao chép t [29] v i s cho phép).


453

Nanoparticle-based Biosensors and Bioassays

Khái ni m này đư c ch ng minh cho m t th nghi m mi n d ch đ ng th i c a
β2-microglobulin, IgG, albumin huy t thanh bò, và C-protein ph n ng trong k t n i
v i ZnS, CdS, PbS, và tinh th keo CuS tương ng (Fig. 14.6). Nh ng nhãn tinh th
nano này có đ nh y tương t nhau. Vi c mã hóa đi n hóa như v y có th đư c ghép
đôi và thu nh l i thành các mi ng microtiter đa lư ng đ cho phép phát hi n đ ng
th i nhi u protein ho c m u và d ki n s m ra nh ng cơ h i m i cho ch n đoán
protein và an ninh sinh h c.
Đ tăng cư ng đ nh y c a các c m bi n mi n d ch đi n hóa d a trên nhãn nano và
xét nghi m mi n d ch, g n đây chúng tôi đã phát tri n m t ch t c m quang mi n d ch
hóa h c m i l d a trên nhãn nano silic nano h p ch t poly và các ph n ng xúc tác
t o ra trung gian[62]. Hình 14.7 (xem B ng 16 cho phiên b n màu) minh ho sơ b

nguyên lý c a vi c mi n nhi m hóa đi n hóa d a trên các NPP silic đư c ph ngoài
b ng poly [G] . Các kháng th chính sinh h c biotinyl hoá là l n đ u tiên b c đ nh
trên m t đi n c c c i ti n avidin và kháng th IgG c a chu t sau đó đư c cho thêm vào
kháng th , ti p theo là tương tác v i các kháng th IgG c a chu t đư c bao ph silica
NPs v i poly[G], trong đó đưa vào m t lư ng l n guanine dư trên b m t đi n c c.
Guanin trên silic NPs xúc tác quá trình oxy hóa c a Ru(bpy)32ϩ. Biên đ dòng oxy hóa
ph thu c vào lư ng guanine liên quan đ n n ng đ các dung d ch m u. S khu ch
đ i c a các tín hi u xúc tác đư c g n k t v i s g n k t c a m t s lư ng l n các d u
hi u Guanine cho m i ph c h p

(f)

(e)

Current (␮A)

(d)

(c)
3µA(B-F)
6µA(A)

(b)

(a)

؊1.2

؊0.3
Potential (V)

Hình 14.6 Đi n hình c a tách b voltammograms c a (a) kháng th dán nhãn nano tinh th và (b–f) các
h t t –Ab–Ag–Ab-tinh th nano. (b) Ph n ng đ i v i m t dung d ch có ch a hòa tan liên k t ZnS anti2-microglobulin-microglobulin, PbS–anti-BSA, and CdS–anti-IgG (sao chép t [29] v i s cho phép).


454

Electrochemical Sensors, Biosensors and Their Biomedical Applications

C
A
R
B
O
N

R u ( b p y) 3 ϩ
3

Ru(bpy) 32ϩ

Hình 14.7 Sơ đ minh ho c a m t th nghi m mi n d ch đi n hóa d a trên Poly [G] ch c năng
silica NPs trên đi n c c cacbon. Kim cương tư ng trưng cho IgG c a chu t; “Y” hình d ng cho kháng th
chu t; dây màu đ cho poly[G] (sao chép t [62] v i s cho phép) (xem b ng 16 v i phiên b n màu).

kháng th -kháng nguyên-kháng th đư c hình thành. B c m bi n mi n d ch này r t
nh y c m, và gi i h n phát hi n đư c tìm th y xu ng 0.02 ng mLϪ1. M t tính năng h p
d n c a cách ti p c n này là nó làm cho kh năng phát tri n m t thi t b giá r , nh y
c m và xách tay đ ch n đoán đa năng c a các protein khác nhau. Phương pháp này đơn
gi n, có ch n l c và có kh năng l p l i đ phân tích protein và có th đư c m r ng đ

nghiên c u s tương tác protein-protein, peptide-protein, và DNA-protein.

14.5 K t lu n và hư ng phát tri n
Công ngh nano cung c p các cơ h i đ c đáo cho vi c thi t k các c m bi n sinh
h c siêu phân t và các bài th nghi m sinh h c. Các nghiên c u đư c mô t
trên cho th y ti m năng r ng l n c a các h t nano đư c ghép sinh h c
cho s khu ch đ i truy n t i c a các sinh phân t đư c công nh n. V i các ng
d ng quang h c và đi n hóa, các nhãn nguyên t nano như v y cung c p cơ s
cho vi c ki m tra siêu phân t protein và axit nucleic. S nh y c m c a các
giao th c c m ng d a trên h t nano m i m ra kh năng phát hi n các d u
hi u b nh, các tác nhân sinh lý ho c các tác nhân lây nhi m mà không th đo
b ng các phương pháp thông thư ng. Các chương trình nghiên c u sinh h c có
đ nh y cao như v y có th phát hi n s m b nh ho c c nh báo v m t cu c
t n công. Vi c s d ng các th h t nano đ phát hi n protein v n còn trong giai
đo n tr ng c a nó, nhưng các bài h c kinh nghi m trong phát hi n DNA siêu âm
nên cung c p đi m xu t phát h u ích. Vi c th c hi n thành công các chi n lư c
truy n t i tín hi u khu ch đ i m i yêu c u ph i quan tâm thích h p đ n các v n đ
h p th không c n thi t mà thư ng ki m soát kh năng phát hi n các s li u phân
tích sinh h c. Các bư c r a và làm láng b m t thích h p nên đư c s d ng đ
tránh làm căng các tín hi u n n (liên quan đ n s h p th không mong mu n c a các
khu ch đ i h t nano).


Nanoparticle-based Biosensors and Bioassays

455

M t lo t các v t li u nano m i đư c gi i thi u s ti p t c m r ng ph m vi c a
các c m bi n sinh h c d a trên v t li u nano.

14.6 L i c m ơn
Nghiên c u đư c th c hi n t i Phòng Thí nghi m Qu c gia B c Tây B c (PNNL)
đư c h tr b i Chương trình Nghiên c u và Phát tri n Thí nghi m theo Phòng
thí nghi m, B Khoa h c Qu n lý Môi trư ng Hoa K (DOE-EMSP), Chương
trình Nghiên c u và Phát tri n Môi trư ng Chi n lư c (SERDP) (D án ID 1297)
và NIH / 1R01 ES010976-01A2. Các nghiên c u c a tác gi đư c mô t trong
chương này đư c th c hi n m t ph n t i Phòng thí nghi m Khoa h c Phân t Môi
trư ng, m t cơ s s d ng khoa h c qu c gia do C c Nghiên c u Sinh h c và
Môi trư ng c a DOE tài tr và đ t t i PNNL. PNNL đư c Battelle v n hành cho
DOE theo H p đ ng DE-AC05-76RL01830.

14.7 Tài li u tham kh o
1. F. Carusu, Nanoengineering of particle surfaces. Adv. Mater. 13, 11–22 (2001).
2. J.J. Storhoff and C.A. Mirkin, Programmed materials synthesis with DNA. Chem. Rev. 99, 1849–1862
(1999).
3. I. Willner and B. Willner, Functional nanoparticle architectures for sensoric, optoelectronic, and bioelectronic applications. Pure Appl. Chem. 74, 1773–1783 (2002).
4. C.M. Niemeyer, Nanopartikel, Proteine und Nucleinsäuren: Die Biotechnologie begegnet den
Materialwissenschaften. Angew. Chem. 113, 4254–4287 (2001).
5. P. Alivisatos, The use of nanocrystals in biological detection. Nat. Biotechnol. 22, 47–52 (2004).
6. E. Katz, I. Willner, and J. Wang, Electroanalytical and bioelectroanalytical systems based on metal and
semiconductor nanoparticles. Electroanal. 16, 19–44 (2004).
7. I. Willner and E. Katz, Integrated nanoparticle-biomolecule hybrid systems: synthesis, properties, and
applications. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 6042–6108 (2004).
8. N.L. Rosi and C.A. Mirkin, Nanostructures in biodiagnostics. Chem. Rev. 105, 1547–1562 (2005).
9. C.M. Niemeyer, Nanoparticles, proteins, and nucleic acids: biotechnology meets materials science.
Angew. Chem. Int. Ed. 40, 4129–4158 (2001).
10. R.L. Letsinger, R.C. Mucic, and J.J. Storhoff, A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials.Nature 382, 607–609 (1996).
11. J.J. Storhoff, R. Elghanian, R.C. Mucic, C.A. Mirkin, and R.L. Letsinger, One-pot colorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfections using gold nanoparticle probes. J. Am. Chem.
Soc. 120, 1959–1964 (1998).
12. R. Elghanian, J.J. Storhoff, R.C. Mucic, R.L. Letsinger, and C.A. Mirkin, Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science

277, 1078–1081 (1997).
13. TA. Taton, C.A. Mirkin, and R.L. Letsinger, Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes.
Science 289, 1757–1760 (2000).
14. V. Pavlov, B. Shyahovsky, and I. Willner, Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified
optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126, 11 768–11 769 (2004).
15. Y.C. Cao, R. Jin, and C.A. Mirkin, Nanoparticles with raman spectroscopic fingerprints for DNA and
RNA detection. Science 297, 1536–1540 (2002).


456

Electrochemical Sensors, Biosensors and Their Biomedical Applications
16. M.A. Hahn, J.S. Tabb, and T.D. Krauss, Detection of single bacterial pathogens with semiconductor
quantum dots. Anal. Chem. 77, 4861–4869 (2005).
17. J.M. Nam, C.S. Thaxton, and C.A. Mirkin, Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive
detection of proteins. Science 301, 1884–1886 (2003).
18. D.G. Georganopoulou, L. Chang, J.M. Nam, C.S. Thaxton, E.J. Mufson, W.L. Klein, and C.A. Mirkin,
Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer’s
disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 2273–2276 (2005).
19. J.M. Nam, S.I. Stoeva, and C.A. Mirkin, Bio-bar-code-based DNA detection with PCR-like sensitivity.
J. Am. Chem. Soc. 126, 5932–5933 (2004).
20. P. Hazarika, B. Ceyhan, and C.M. Niemeyer, Sensitive detection of proteins using difunctional DNAgold nanoparticles. Small 1, 844–848 (2005).
21. H. Harma, T. Soukka, S.Lonnberg, J. Paukkunen, P. Tarkkinen, and T. Lovgren, Zeptomole detection
sensitivity of prostate-specific antigen in a rapid microtitre plate assay using time-resolved fluorescence.
Luminescence 15, 351–355 (2000).
22. T. Soukka, K. Antonen, H. Harma, A.M. Pelkkikangas, P. Huhtinen, and T. Lovgren, Highly sensitive
immunoassay of free prostate-specific antigen in serum using europium(III) nanoparticle label technology. Clin. Chim. Acta 328, 45–58 (2003).
23. A.M. Pelkkikangas, S. Jaakohuhta, T. Lovgren, and H. Harma, Simple, rapid, and sensitive thyroidstimulating hormone immunoassay using europium(III) nanoparticle label. Anal. Chim. Acta 517,
169–176 (2004).
24. D. Trau, W. Yang, M. Seydack, F. Caruso, N.T. Yu, and R. Renneberg, Nanoencapsulated microcrystalline particles for superamplified biochemical assays. Anal. Chem. 74, 5480–5486 (2002).

25. X. Zhao, R. Tapec-Dytioco, and W. Tan, Ultrasensitive DNA detection using highly fluorescent bioconjugated nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 11 474–11 475 (2003).
26. X. Zhao, L.R. Hilliard, S.J. Mechery, Y. Wang, R.P. Bagwe, S. Jin, and W. Tan, From the cover: a rapid
bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 101, 15 027–15 032 (2004).
27. E. Palecek and M. Fojta, DNA hybridization and damage, Anal. Chem. 73, 75A–83A (2001).
28. J. Wang, Electrochemical nucleic acid biosensors. Anal. Chim. Acta 469, 63–71 (2002).
29. G. Liu, J. Wang, J. Kim, M.R. Jan, and G.E. Collins, Electrochemical coding for multiplexed immunoassays of proteins. Anal. Chem. 76, 7126–7130 (2004).
30. V. Chan, Y. Chong, L. Cheung, J. Vielmetter, and D.H. Farkas, Bioelectronic detection of point mutations using discrimination of the H63D polymorphism of the Hfe gene as a model. Mol. Diagn. 5,
321–328 (2000).
31. J. Wang, D. Xu, A.N. Kawde, and R. Polsky, Metal nanoparticle-based electrochemical stripping potentiometric detection of DNA hybridization. Anal. Chem. 73, 5576–5581 (2001).
32. L. Authier, C. Grossiord, P. Brossier, and B. Limoges, Gold nanoparticle-based quantitative electrochemical detection of amplified human cytomegalovirus DNA using disposable microband electrodes.
Anal. Chem. 73, 4450–4456 (2001).
33. J. Wang, G. Liu, and R. Polsky, Electrochemical stripping detection of DNA hybridization based on cadmium sulfide nanoparticle tags. Electrochem. Commun. 4, 722–726 (2002).
34. J. Wang, G. Liu, and A. Merkoçi, Electrochemical coding technology for simultaneous detection of multiple DNA targets. J. Am. Chem. Soc. 125, 3214–3215 (2003).
35. J. Wang, G. Liu, and A. Merkoci, Particle-based detection of DNA hybridization using electrochemical
stripping measurements of an iron tracer. Anal. Chim. Acta 482, 149–155 (2003).
36. H. Cai, N.N. Zhu, Y. Jiang, P.G. He, and Y.Z Fang, Cu–Au alloy nanoparticle as oligonucleotide labels
for electrochemical stripping detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 18, 1311–1319
(2003).
37. H. Cai, Y. Xu, N. Zhu, P. He, and Y. Fang, An electrochemical DNA hybridization detection assay based
on a silver nanoparticle label. Analyst 127, 803–808 (2002).
38. J. Wang, Stripping Analysis, VCH Publishers, New York (1985).
39. J. Wang, R. Polsky, and X. Danke, Silver-enhanced colloidal gold electrochemical stripping detection of
DNA hybridization. Langmuir 17, 5739–5741 (2001).


Nanoparticle-based Biosensors and Bioassays

457

40. H. Cai, Y. Wang, P. He, and Y. Fang, Electrochemical detection of DNA hybridization based on silverenhanced gold nanoparticle label. Anal. Chim. Acta 469, 165–172 (2002).
41. T.M.H. Lee, L.L. Li, and I.M. Hsing, Enhanced electrochemical detection of DNA hybridization based
on electrode-surface modification. Langmuir 19, 4338–4343 (2003).
42. T.M.H. Lee, M. Carles, and I.M. Hsing, Microfabricated PCR-electrochemical device for simultaneous
DNA amplification and detection. Lab. Chip 3, 100–105 (2003).
43. J. Wang, O. Rincon, R. Polsky, and E. Dominguez, Electrochemical detection of DNA hybridization
based on DNA-templated assembly of silver cluster. Electrochem. Commun. 5, 83–86 (2003).
44. E. Braun, Y. Eichen, U. Sivan, and G. Ben-Yoseph, DNA-templated assembly and electrode attachment
of a conducting silver wire. Nature 391, 775–778 (1998).
45. J. Richter, R. Seidel, R. Kirsch, M. Mertig, W. Pompe, J. Plashke, and H. Schackert, Nanoscale palladium metallization of DNA. Adv. Mater. 12, 507–510 (2000).
46. M. Mertig, L.C. Ciacchi, R. Siedel, W. Pompe, and A. de Vita, DNA as a selective metallization template. Nano Lett. 2, 841–844 (2002).
47. S. Park, T.A. Taton, and C.A. Mirkin, Array-based electrical detection of DNA with nanoparticle probes.
Science 295, 1503–1506 (2002).
48. M. Urban, R. Moller, and W. Fritzsche, A paralleled readout system for an electrical DNA-hybridization
assay based on a microstructured electrode array. Rev. Sci. Instrum. 74, 1077–1081 (2003).
49. H. Cai, C. Xu, P. He, and Y. Fang, Colloid Au-enhanced DNA immobilization for the electrochemical
detection of sequence-specific DNA. J. Electroanal. Chem. 510, 78–85(2001).
50. I. Willner, P. Patolsky, and J. Wasserman, Photoelectrochemistry with controlled DNA-cross-linked CdS
nanoparticle arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 1861–1864 (2001).
51. M. Cais, S. Dani, Y. Eden, O. Gandolfi, M. Horn, E.E. Isaacs, Y. Joseph, Y. Saar, E. Slovin, and L.
Snarskt, Metalloimmunoassay. Nature 270, 534–535 (1977).
52. M.J. Doyle, H.B. Halsall, and W.R. Heineman, Heterogeneous immunoassay for serum proteins by differential pulse anodic stripping voltammetry. Anal. Chem. 54, 2318–2322 (1982).
53. B. Limoges, C. Degrand, and P.J. Brossier, Redox cationic or procationic labeled drugs detected at a
perfluorosulfonated ionomer film-coated electrode. J. Electroanal. Chem. 402, 175–187 (1996).
54. F.J. Hayes, H.B. Halsall, and W.R. Heineman, Simultaneous immunoassay using electrochemical detection of metal ion labels. Anal. Chem. 66, 1860–1865 (1994).
55. J. Wang, B. Tian, and K.R. Rogers, Thick-film electrochemical immunosensor based on stripping potentiometric detection of a metal ion label. Anal. Chem. 70, 1682–1685 (1998).
56. M. Dequaire, C. Degrand, and B. Limoges, An electrochemical metalloimmunoassay based on a colloidal gold label. Anal. Chem. 72, 5521–5528 (2000).
57. X. Chu, X. Fu, K. Chen, G. Shen, and R. Yu, An electrochemical stripping metalloimmunoassay based
on silver-enhanced gold nanoparticle label. Biosens. Bioelectron. 20, 1805–1812 (2005).
58. X. Mao, J.H. Jiang, J.W. Chen, Y. Huang, G.L. Shen, and R.Q. Yu, Cyclic accumulation of nanoparticles: a new strategy for electrochemical immunoassay based on the reversible reaction between dethiobiotin and avidin. Anal. Chim. Acta 557, 159–163 (2006).

59. G.Z. Zhou, J.S. Li, J.H. Jiang, G.L. Shen, and R. Yu, Chronopotentiometry based on nano-Au labeled
aggregate enlargement used for the immunoassay of complement C3. Acta Chimi. Sinica 63, 2093–2097
(2005).
60. K.T. Liao and H.J. Huang, Femtomolar immunoassay based on coupling gold nanoparticle enlargement
with square wave stripping voltammetry. Anal. Chim. Acta 538, 159–164 (2005).
61. G. Liu and Y. Lin, Electrochemical magnetic immunosensor based on gold nanoparticle labels. J.
Nanosci. Nanotech. 5, 1060–1065 (2005).
62. J. Wang, G. Liu, and Y. Lin, Bioassay label based on electroactive silica beads. Small 2, 1134–1138
(2006).


A

Step 1.
Target Protein
Capture with
MMP Probes

B
1.

SH

Step 2.
Sandwich Captured Target
Proteins with NP Probes

2. Bevine Serum Albumin
3.
Nanoparticle (NP) Probe

Target Protein
(PSA)
13 nm NPs for Bio-Bar-Code PCR
30 nm NPs for PCR-less Method

1.
Step 5.
Chip-Based Detection
of Bar-Code DNA for
Protein Identification

2. Bevine Serum Albumin

Magnetic Microparticle
(MMP) Probe

Step 4.
Polymerase
Chain Reaction

Ag
Au

Gold Nanoparticle

SH Capture DNA

Bar-Code DNA

Monoclonal Anti-PSA

Polyclonal Anti-PSA

Amine-Functionalized
Magnetic Particle

Step 3.
MMP Probe Separation
and Bar-Code DNA
Bar-Code DNA Dehybridization

M

Step 4.
PCR-less Detection
of Bar-Code DNA from
30 nm NP Probes

Magnetic
Field

Plate 14 The bio-bar-code assay method. (a) Probe design and preparation. (b) PSA detection and bar-code DNA amplification
and identification (Reproduced from [17] with permission.) (see Figure 14.2).

ϩ

ϩ

MB

Biotinylated
Capture Probe

Biotinylated
Target
CdS labeled
probe

Silver Enhancement

HBr

Cd
Amplification

Au(III)
HNO3
HNO3

Ag(I)

Zn

Au(III)

MD

Meϩ

Au(III)

Disposable ScreenPrinted Electrode

Me2ϩ Me2ϩ

M

Au(I)

MD

Mercury Coated Glassy
Carbon Electrode

Au(I)

Disposable ScreenPrinted Electrode
(a)

Cd Pb

(b)

(c)

(d)

(e)

Plate 15 Nanoparticle-based electrochemical detection of DNA. These assays involve the introduction of the probe coated
magnetic beads, the addition of the target/hybridization event, magnetic removal of unwanted materials, binding of the metal, and
amplified electrochemical detection of the dissolved gold (a), silver (b), and cadmium sulfide (d) nanoparticles. Me: metal tag. Also
shown are solid-state stripping (c) and multi-target (e) detection protocols. See text for details (see Figure 14.3).

Plates-P373738.indd 7

10/18/07 7:24:54 PM


C
A
R
B
O
N

Ru(bpy) 33ϩ

Ru(bpy) 32ϩ

Plate 16 Schematic illustration of an electrochemical immunoassay based on the poly[G]-functionalized silica NPs on carbon
electrode. Diamond stands for the mouse IgG; “Y” shape for mouse antibody; red strings for poly[G] (Reproduced from [62] with
permission.) (see Figure 14.7)

6
4
2

i/␮A

0
Ϫ2

1

Ϫ4
Ϫ6
Ϫ8

5

Ϫ10
Ϫ0.8

Ϫ0.6

Ϫ0.4

Ϫ0.2
E/V vs Ag/AgCl

0.0

0.2

Plate 17

Cyclic voltammograms of [GOx/CNT]n immobilized on PDDA/GC electrodes in 0.1 M phosphate buffer solution (pH
7.4) at 0.1 V sϪ1, indicating an increasing response of [GOx/CNT]n with layer number from 1 to 5 (unpublished results, J. Zhang,

M. Feng, and H. Tachikawa) (see Figure 15.6).

Plates-P373738.indd 8

10/18/07 7:24:55 PM