Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết chloroform lá đu đủ đực (carica papaya l ) thu hái tại quảng nam đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA

ĐẶNG HỒ KHÁNH HÒA

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH
PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH
CHIẾT CHLOROFORM LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA
PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC

Đà Nẵng- Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH
PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH
CHIẾT CHLOROFORM LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA
PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC
Sinh viên thực hiện : Đặng Hồ Khánh Hòa
Lớp

: 14CHD

Giáo viên hướng dẫn : GS.TS Đào Hùng Cường

Đà Nẵng-Năm 2018


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập tại Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Đà Nẵng,
bằng sự nổ lực của bản thân và sự giúp đỡ, động viên, khích lệ của thầy cô, bạn bè
và người thân, em đã hoàn thành khóa luận này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành đến thầy giáo GS.TS.Đào
Hùng Cường đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài
và hoàn thành báo cáo để khóa luận được hoàn thành đúng tiến độ chương trình.
Em xin chân thành cảm ơn cô ThS.Đỗ Thị Thúy Vân cùng các thầy giáo, cô
giáo trong Khoa Hóa - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng và Nhà trường
đã hỗ trợ kiến thức, cơ sở vật chất, dụng cụ thí nghiệm giúp em hoàn thành tốt
khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong
quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Do những điều kiện chủ quan và khách quan chắc chắn không thể tránh
khỏi những thiếu sót, em rất mong đón nhận những lời góp ý chân tình, thiết thực
từ thầy cô, bạn bè để khóa luận đạt đến sự hoàn thiện nhất.
Trân trọng cảm ơn!
Đà Nẵng, ngày 20 tháng 04 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Đặng Hồ Khánh Hòa


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.

Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 1

2.

Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2

3.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 2

4.

Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 2
4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết ........................................................... 2
4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm ...................................................... 3

5.

Bố cục của luận văn .................................................................................... 3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ .................................................................... 4
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ
TRONG NƯỚC....................................................................................................... 5
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI

NƯỚC ..................................................................................................................... 6
1.4.NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ 8
1.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO 11
1.5.1. Phương pháp MTT .............................................................................. 11
1.5.2. Phương pháp SRB ............................................................................... 12
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 13
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ....................... 13
2.1.1. Nguyên liệu ......................................................................................... 13
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ........................................................... 13
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 14
2.2.1. Xác định các thông số vật lý ................................................................ 14


2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học
trong lá Đu đủ đực ................................................................................................. 15
2.2.3. Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực ..................................... 16
2.2.4. Sơ đồ điều chế các cao chiết ................................................................ 22
2.2.5. Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết chloroform ................................ 23
2.2.6. Định danh một số hợp chất có trong cao chiết chloroform ................... 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 26
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG VẬT LÝ ......................... 26
3.1.1. Độ ẩm ................................................................................................. 26
3.1.2. Hàm lượng tro ..................................................................................... 26
3.1.3. Xác định hàm lượng kim loại .............................................................. 27
3.2.KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT HỢP
CHẤT HÓA HỌC LÁ ĐU DỦ ĐỰC TRONG DUNG MÔI CHLOROFORM ...... 28
3.2.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm
dầm

............................................................................................................. 28

3.2.2. Kết quả khảo thời gian chiết soxhlet trong dung môi chloroform ......... 31
3.2.3. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm
trong dung môi chloroform .................................................................................... 32
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC ...... 35
3.4. KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT .......................................................... 37
3.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT CHLOROFORM TỪ
LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC .................................................................................................. 37
3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT
CHLOROFORM LÁ ĐU ĐỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS........................... 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 41
1. KẾT LUẬN ................................................................................................... 41
2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 42


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BuOH:

Buthanol

CHCl3:

Chloroform

CH2Cl2:

Diclomethane

DPPH:

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

EtOAc:

Ethylacetate

GC-MS: Gas chromatography-Mass spectrometry
MeOH:

Methanol

SRB:

sulforhodamin B


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu

Tên bảng

bảng

Trang

3.1

Kết quả khảo sát độ ẩm của lá Đu đủ đực

26

3.2

Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong lá Đu đủ đực

26

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại trong lá Đu đủ
đực
Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi
chloroform
Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong dung
môi chloroform
Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi
chloroform
Kết quả khảo sát thời gian siêu âm tối ưu bằng dung môi

chloroform
Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm bằng dung môi
chloroform

27

28

30

31

33

34

3.9

Định tính các lớp chất trong lá Đu đủ đực

36

3.10

Khối lượng cao chiết từng phân đoạn

37

3.11

Hoạt tính độc tế bào của phân đoạn dịch chiết chloroform

38

3.12

Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform lá Đu đủ
đực

39


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Số hiệu

Tên hình

hình

Trang

1.1.

Hình ảnh Đu đủ

5

1.2.

Công thức cấu tạo các hợp chất trong cây Đu đủ

7

2.1.

Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực

13

2.2.

Sơ đồ điều chế các cao chiết

22

3.1.

3.2.

3.3.

3.4.

3.5.
3.6.

Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết chloroform theo thời
gian chiết ngâm dầm
Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết chloroform theo tỉ lệ
Rắn/Lỏng

Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết chloroform theo thời
gian chiết Soxhlet
Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết chloroform theo thời
gian chiết siêu âm
Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết chloroform theo
nhiệt độ chiết siêu âm
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết chloroform lá Đu đủ đực

29

30

32

33

35
39


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Thế kỷ thứ XXI là thế kỷ phát triển về mọi mặt của toàn nhân loại, đời sống
con người ngày càng được nâng cao. Bên cạnh đó, con người cũng đang đứng trước
nguy cơ mắc nhiều bệnh tật đặc biệt là các căn bệnh hiểm nghèo như ung thư. Con
người đã và đang từng bước tìm ra các loại thuốc và các phương pháp có khả năng
kìm hãm sự phát triển của chúng. Tuy nhiên, một trong những giải pháp hiện nay là
dùng những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân
tạo, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta.
Ở Việt Nam với khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, thích hợp cho sự phát triển

của thảm thực vật, vì vậy nguồn dược liệu ở nước ta khá phong phú. Một trong số
đó là cây Đu đủ. Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là loại cây ăn quả có nguồn gốc
từ vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở nước ta, cây Đu đủ được trồng rất nhiều với diện tích
trồng của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350
nghìn tấn quả [9].
Cây Đu đủ được biết đến như một vị thuốc hữu hiệu được ông cha ta sử dụng
để chữa bệnh, bồi bổ và chăm lo cho sức khỏe. Trong quả Đu đủ xanh có các
enzyme như papain, pepsin là một trợ giúp tuyệt vời cho quá trình tiêu hóa. Quả Đu
đủ chín là thuốc nhuận tràng đảm bảo cho ruột hoạt động bình thường [19]. Lá Đu
đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm [1,20]. Hợp chất phenol trong lá Đu đủ
đã được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa mạnh [21]. Đặc biệt, người dân
Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ưng thư, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được
nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác
dụng ức chế phát triển khối u gây tế bào ung thư [6].
Chính bởi nguồn nguyên liệu có sẵn dồi dào và phong phú cùng với công
dụng chữa bệnh của cây Đu đủ như trên, có nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác
định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này, chủ yếu là bộ phận
lá và quả cây Đu đủ. Thế nhưng những công trình nghiên cứu về lá đu đủ đực, hoa,
rễ, thân vẫn còn rất hạn chế.
1


Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh
được thành phần hoạt chất cụ thể của cây Đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết,
tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm
thuốc điều trị các căn bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư. Do đó, tôi đã lựa
chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học dịch chiết chloroform lá Đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái tại Quảng NamĐà Nẵng”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hoá học và hoạt tính sinh học

dịch chiết chloroform lá Đu đủ đực (Carica papaya L.), góp phần cung cấp các
thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hóa học của chúng, nâng cao giá trị sử
dụng của loài thực vật này trong thực tiễn.
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
-

Lá Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng.

-

Xác định chỉ số hóa lý.

-

Chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ đực trong dung môi chloroform bằng 3

phương pháp: ngâm dầm, soxhlet, siêu âm để lựa chọn phương pháp chiết tối ưu.
Từ dịch chiết thu được bằng phương pháp chiết soxhlet, tiến hành định danh các
hợp chất hoá học ở quy mô phòng thí nghiệm.
-

Tiến hành chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi: methanol, n-hexane,

chloroform, ethyl acetate, n-butanol. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của dịch
chiết chloroform trên 3 dòng tế bào ung thư phổi, ung thư gan, ung thư vú.
4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
-

Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên.

-

Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế

giới về lá cây Đu đủ.

2


-

Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học,

ứng dụng của các bộ phận của cây Đu đủ.
4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
-

Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm;

-

Phương pháp trọng lượng;

-

Các phương pháp chiết mẫu gồm: ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết

siêu âm;
-

Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC - MS)

-

Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào;

-

Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học.

5. BỐ CỤC CỦA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Khóa luận tốt nghiệp gồm 44 trang; 12 bảng; 10 hình ảnh và 23 tài liệu tham
khảo. Với:
Phần mở đầu (3 trang)
Chương 1 – Tổng quan tài liệu (9 trang)
Chương 2 – Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (13 trang)
Chương 3 – Kết quả và thảo luận (15 trang)
Kết luận và kiến nghị (1 trang)
Tài liệu tham khảo (3 trang)

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ
Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae). Nguồn gốc Châu
Mỹ được trồng khắp nơi ở nước ta. Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4
chi và 45 loài. Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta có một chi
và một loài [1].

Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ
2-4 mét, thân thẳng, không phân nhánh. Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống
lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành
nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1]. Đu đủ có thể xếp
thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái (Hình
1.1). Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và
thay đổi nhiệt độ [5]. Ở Việt Nam, một số giống Đu đủ hiện nay đang được trồng
bao gồm:
-

Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống Đu đủ có từ lâu đời ở nước ta. Đặc tính

chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng,
cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh. Thịt quả màu vàng, mỏng, năng
suất thấp.
-

Giống Đu đủ Mehico: là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ XX.

Quả dài, tương đối đặc ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao. Lá xanh đậm, phiến
lá dày, cuống lá to, màu xanh.
-

Giống Đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là Đu đủ Mỹ, thân cây cao trung

bình, sinh trưởng khỏe. Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lượng tốt, năng
suất cao. Là giống yêu cầu nhiệt cao nên được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam.
-

Giống Đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung

Quốc. Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao. Quả dài, thuôn dài, thịt
quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ. Lá có màu xanh đậm, chia thùy
sâu, phiến lá dày.

4


-

Giống Đu đủ Thái Lan: là giống được nhập trồng trong thời gian gần đây.

Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lượng tốt. Tuy nhiên giống
này dễ bị nhiễm bệnh khảm lá.
-

Giống Đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần

đây. Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60-70 kg
quả/ cây. Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo
quản và vận chuyển. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [9].

A: hoa cái

D: trái của cây cái

B: hoa lưỡng tính

E: trái lưỡng tính

C: hoa đực

F: cây đực

Hình 1.1. Hình ảnh Đu đủ
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ
TRONG NƯỚC
Năm 2012, Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp đã phân lập được 4 chất từ
phân đoạn chiết n-hexanee của lá Đu đủ. Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol,
5


cycloart-23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol. Trong
đó, sterculin A và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol là 2 triterpene lần đầu tiên phân
lập từ lá Đu đủ [2].
Năm 2014, Hồ Thị Hà tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá Đu
đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, CH2Cl2, EtOAc,
buthanol). Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone,
acid pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine. Trong đó carpainone là hợp
chất mới và 2 chất danielone và apocynol A lần đầu tiên được phân lập từ lá Đu đủ
[3].
Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần hóa
học của hoa Đu đủ đực. Kết quả cho thấy sự có mặt của alcaloid, este, acid béo, một
số sterol trong hoa Đu đủ đực thu hái tại Đà Nẵng [4].
Năm 2017, Lê Thị Thanh Phương đã phân lập được 2 hợp chất Kaempferol và
β-sitosterol glucoside từ phân đoạn chloroform trong hoa Đu đủ đực thu hái trên địa
bàn Quảng Nam - Đà Nẵng [7].
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ NGOÀI
NƯỚC
Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol

trong lá Đu đủ cho kết quả các hợp chất như sau: acid caffeic, acid p-coumaric, acid
protocatechuic, kaempferol, quercetin và 5,7-dimethoxycoumair [22].
Năm 2008, Krishna K.L. và cộng sự đã tổng hợp các công trình nghiên cứu
về thành phần hóa học các bộ phận cây Đu đủ, phát hiện trong lá Đu đủ có những
chất như sau: Alcaloid carpaine, pseudocarpain và dehydrocarpaine I và II, choline,
carposide, vitamin C, E [15].
Năm 2017, Sunday Ahamefula Ezekwe và cộng sự đã xác định các hợp chất
hóa học trong quả Đu đủ xanh bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ GCMS bao gồm: octadecanoic acid (23,84%), hexadecenoic acid (19,17%) và
hexadecanoic acid, methyl ester (18,25%) [13].
6


Dưới đây là công thức cấu tạo các hợp chất hóa học trong lá Đu đủ:

β-sitosterol

Carpaine

Dehydrocarpaine I

Dehydrocarpaine II

Kaempferol

Kaempferol-3-O-β-glucopyranosid

Hình 1.2. Công thức cấu tạo các hợp chất trong lá Đu đủ

7

1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ
Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học các bộ phận của cây Đu đủ
như lá, quả, nhựa được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới công bố khá
phong phú.
 Tác dụng trị giun sán
Năm 1994, Satrija F và cộng sự nghiên cứu tác dụng trị giun sán của nhựa
Đu đủ đã được thử nghiệm để diệt giun sán ở súc vật: Tác dụng trên Asaris sum
(sán lợn) ghi nhận liều 4g và 8g nhựa/kg có khả năng diệt được 80% và 100% sán
sau 7 ngày trị liệu [14].
 Tác dụng hạ huyết áp
Năm 2000, Eno AE và cộng sự nghiên cứu dịch chiết ethanol từ trái Đu đủ
Các kết quả này cho rằng nước ép từ quả Đu đủ gây hạ huyết áp do hoạt tính trên
các thụ thể α-adrenoceptive [12].
 Tác dụng kháng sinh, kháng nấm
Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá Đu đủ
có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum và
Staphylococcus aureus. Cao chiết từ vỏ và hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa
và Shigella flexneri. Benzyl isothiocyanate phân lập từ Đu đủ, ức chế sự phát triển
của nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm như Escherichia coli, Penicillium
notatum và Shigella. Rễ Đu đủ có tác dụng kháng khuẩn yếu [1].
Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine có khả năng
kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/mL, không
thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác ở
nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/mL (với IC50 > 128 µg/ml) [3].
Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết lá Đu đủ cái có tác
dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm. Chưa có công bố về hoạt tính kháng
khuẩn và kháng nấm của lá Đu đủ đực.

8


 Tác dụng trị u bướu, ung thư
Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá Đu đủ chỉ có tác
dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/mL, và không có tác dụng
gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7,
ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan
Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách
từ phôi chuột [8].
Năm 2017, Đỗ Thị Thúy Vân và Giang Thị Kim Liên đã công bố kết quả
sàng lọc thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số dịch chiết từ hoa Đu đủ
đực thu hái ở Quảng Nam-Đà Nẵng. Kết quả cho thấy phân đoạn dịch chiết
chloroform có hoạt tính gây độc tế bào tốt trên 3 dòng ung thư phổi A549, ung thư
gan Hep3B và ung thư vú MCF-7 ở hai nồng độ thử nghiệm 30 µg/mL và 100
µg/Ml [4].
Năm 2006, Rumiyati và Sismindari dan Ariyani đã chứng minh trong lá Đu
đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs). RIPs có khả năng gây độc tế bào in
vitro trên các dòng tế bào ung thư vú T47D với IC50 = 2,8 μg/mL. Đồng thời nghiên
cứu này đã chứng minh ảnh hưởng của protein có chứa RIPs lên gen p53 và Bcl-2,
ảnh hưởng của các protein đến quá trình phân bào của dòng tế bào ung thư vú T47D.
Mức độ biểu hiện của p53 tăng lên đến 59,4% còn protein Bcl-2 giảm xuống còn
63%. Các kết quả này cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế
bào ung thư [23].
Như vậy, các kết quả nghiên cứu đã khẳng định trong cây Đu đủ cái có nhiều
hợp chất có hoạt tính chống ung thư. Một số chất trong cây Đu đủ cái đã được
chứng minh là tác dụng lên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Tuy nhiên vẫn
tập trung vào các bộ phận lá cái và quả Đu đủ. Chưa có công bố về hoạt tính gây
độc tế bào của các hoạt chất phân lập từ các bộ phận khác như rễ, thân,… cây Đu
đủ cái và hoa, lá cây Đu đủ đực.

 Tác dụng chống oxy hóa

9


Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh
trong cơ thể, trong đó có ung thư. Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách
khác nhau như: ô nhiễm môi trường, chất phóng xạ, thuốc-hóa chất, căng thẳng thần
kinh,...
Năm 2010, Satrija F và cộng sự dùng nước để chiết các chất có trong lá Đu
đủ. Chất chiết thu được đem thử hoạt tính chống oxy hóa bằng các phương pháp
khác nhau như: DPPH, 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate), acid
nitric, superoxit, hydroxylion và lipid peroxidase. Giá trị IC50 tương ứng của các
phương pháp là: 198, 185, 244, 323, 461 và 922 µg/mL [14].
Năm 2013, Maisarah A.M. và cộng sự nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa
từ các bộ phận khác nhau của cây Đu đủ bao gồm: quả chín, quả xanh, hạt và lá non.
Hai tác nhân được sử dụng để đánh giá là DPPH và β-carotene. Kết quả cho thấy
hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín →
hạt. Tuy nhiên, hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập [11].
Như vậy, kết quả nghiên cứu khẳng định lá cây Đu đủ cái có hoạt tính chống
oxy hóa. Tuy nhiên, nghiên cứu này chủ yếu tập trung ở dịch chiết thô, nghiên cứu
về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tinh khiết phân lập từ lá Đu đủ còn rất
hạn chế. Chưa có nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của lá Đu đủ đực.
 Các tác dụng dược lý khác
Ngoài những hoạt tính sinh học trên, lá của cây Đu đủ cũng đã được chứng
minh có tác dụng như kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng giảm thời gian đông
máu, kháng viêm,…
Năm 2014, Hồ Thị Hà lần đầu tiên chứng minh được khả năng kích hoạt
enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine (tương ứng là
386,5 và 778 RFU) phân lập từ lá Đu đủ ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng

20 và 30 µg/mL) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là
3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/mL) [3].
 Công dụng trong dân gian

10


-

Lá Đu đủ được sử dụng làm mềm thịt khi nấu.

-

Trong dân gian hoa Đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng

chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn, nhất là ở trẻ
em.
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A. và
cộng sự [18]. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư
Quốc gia (NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm
sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung
thư ở điều kiện in vitro.
Trong những năm gần đây, một số phương pháp so màu nhanh đã được miêu
tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay hai
phương pháp thường được sử dụng là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.
Trong đó, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến.
1.5.1. Phương pháp MTT
Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí
Immunological Methods năm 1983 [9]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để

triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển
của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể
của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT
biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính
xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát
triển và hoạt động của tế bào.

Formaran (màu tím)

Tetrazolium (màu vàng)
11


1.5.2. Phương pháp SRB
Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để
đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng
dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm
màu của SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh
vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm.
Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào
pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường
axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào
đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Trisbase để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.

12


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu

Nguyên liệu lá của cây Đu đủ đực được thu hái tại. Quảng Nam- Đà Nẵng
vào tháng 01 năm 2017. Lá Đu đủ đực – đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ
được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu.
Cây Đu đủ đực được chọn lấy hoa cao khoảng 1,5 m – 5,0 m là cây thân thảo,
lá to có màu hơi xanh lục, lá mọc so le, có cuống dài, mỗi phiến lá chia làm 8-9
thùy sâu, đặc biệt cây đu đủ đực không có quả mà chỉ có hoa. Lá Đu đủ đực được
chọn là lá không bị sâu, màu xanh lục không quá non hoặc quá già. Cây được chọn
để thu hái có nhiều lá và hoa. Sau khi hái đem về loại sạch bụi bẩn, mủ, bỏ cuống,
rửa sạch, thái nhỏ từ 1-2cm và đem phơi trong nắng nhẹ cho đến khi khô hẳn, rồi
đem xay thành bột.
Bột lá Đu đủ đực hơi thô, màu xanh lục, được bảo quản trong bình hút ẩm.

Hình 2.1. Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Dung môi chiết chloroform.
Một số hóa chất khác cũng được sử dụng.
Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS

13


Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy chất quay chân không,
lò nung, máy siêu âm, soxhlet, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại
pipet, bình định mức, giấy lọc…
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lý
2.2.1.1. Độ ẩm
Tiến hành
Chuẩn bị các cốc sứ được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô
trong tủ sấy đến khối lương không đổi m0. Sấy xong bỏ vào bình hút ẩm cho đến

khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các cốc sứ.
Mẫu để xác định độ ẩm là nguyên liệu lá Đu đủ đực, cân lấy khối lượng
chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy ở nhiệt
độ 1000C. Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng
rồi cân đến khối lượng mẫu không đổi m2.
Cách tính độ ẩm
-

Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau

khi cân. Suy ra độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
-

Độ ẩm được tính theo công thức sau

W %

m1  m2
.100
m1

Trong đó:
m1: khối lượng mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực bột khô (g).
m2: mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực sau khi sấy (g)
W: độ ẩm của mẫu(%).
Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
2.2.1.2. Hàm lượng tro
Tro toàn phần: Là khối lượng cặn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một
mẫu thử trong điều kiện nhất định.

14


Tiến hành
-

Cân 5 mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực sấy khô với khối lượng m1 đem than

hóa sơ bộ trên bếp điện rồi cho vào lò nung ở 500-5500C trong thời gian từ 4 đến 6
tiếng, cho đến khi thu được tro trắng.
-

Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu.

-

Sau đó cho vào nung 1 tiếng lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong

bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng m2 không đổi.
Khối lượng các chất hữu cơ tổng được tính là tổng chất hữu cơ bị đốt cháy,
là hiệu số giữa khối lượng mẫu ban đầu và khối lượng tro sau khi nung.
Cách tính kết quả:
Hàm lượng tro được tính bằng công thức:
% tro = [(m2– m0) x 100]/ m1
Trong đó:
m0: khối lượng cốc sứ (g)
m1: khối lượng nguyên liệu lá Đu đủ đực khô (g)
m2: khối lượng của cốc sứ và nguyên liệu lá Đu đủ đực sau khi tro hóa (g)
2.2.1.3. Hàm lượng kim loại
Mẫu nguyên liệu lá Đu đủ sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch

HNO3 10% và được định mức bằng nước cất đến 10mL. Lấy dung dịch đã định
mức trên được đem đi xác định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp
thụ nguyên tử AAS, tại đài khí tượng thủy văn khu vực Trung Trung Bộ số 660
Trưng Nữ Vương, Quận Hải Châu, TP Đà Nẵng.
2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học
trong lá Đu đủ đực
2.2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật
Mẫu thực vật thường được chiết theo phương pháp chiết rắn – lỏng. Có nhiều
kỹ thuật chiết như: chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết siêu âm.
-

Chiết ngâm dầm: mẫu thực vật khô được chiết với dung môi chloroform. Cất

loại dung môi bằng bộ soxhlet sẽ thu được cao chiết để tiếp tục nghiên cứu.
15


Đối với kĩ thuật chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu thực vật (bột lá) trong bình
chứa bằng thủy tinh, bịt đầu bằng giấy bạc. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung
môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả.
Thực hiện chiết ngâm dầm khảo sát lượng cao thu được tại tỉ lệ và thời gian
khác nhau. Khảo sát theo các tỉ lệ lần lượt là 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30 với 10g
nguyên liệu mỗi mẫu thử. Khảo sát theo thời gian ngâm lần lượt là 1 ngày, 2 ngày, 3
ngày, 4 ngày, 5 ngày với 10g nguyên liệu/200mL dung môi.
-

Chiết soxhlet: mẫu thực vật khô được chiết với dung môi chloroform bằng

bộ soxhlet. Cất loại dung môi bằng bộ soxhlet sẽ thu được cao chiết.
Thực hiện chiết soxhlet khảo sát lượng cao thu được tại các khoảng thời gian

2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 với 10g nguyên liệu/200mL dung môi.
-

Chiết siêu âm: mẫu thực vật khô được chiết với dung môi chlorofỏm bằng

máy siêu âm. Cất loại dung môi bằng bộ soxhlet sẽ thu được cao chiết.
Thực hiện chiết siêu âm khảo sát lượng cao thu được tại thời gian và nhiệt độ
khác nhau. Khảo sát theo các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và
150 phút. Khảo sát theo các mốc nhiệt độ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C. Với 10g
nguyên liệu/200mL dung môi mỗi mẫu thử.
Trong khuôn khổ đề tài này, tôi thực hiện việc chiết mẫu theo kỹ thuật chiết
ngâm dầm, chiết soxhlet và chiết siêu âm để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến
phương pháp chiết. Lựa chọn phương pháp chiết tối ưu với dung môi chloroform.
2.2.2.2. Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất
Việc định danh thành phần hóa học có trong dịch chiết chloroform lá Đu đủ
đực thu được bằng phương pháp chiết soxhlet, thực hiện thông qua việc đo phổ
GC-MS tại Trung tâm Hóa học – Khoa Hóa – Đại học Bách Khoa Đà Nẵng.
2.2.3. Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực
2.2.3.1. Alkaloid
Tiến hành

16


Cân 5 gam bột lá Đu đủ đực ngâm trong dung dịch là hỗn hợp gồm
chloroform : ethanol 95˚ : NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ là 8:8:1, môi trường phải có
tính base. Ngâm nguội trong 24 tiếng, để ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng lắc trộn.
Sau khi ngâm, đem lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan
phần cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan. Lọc, lấy dịch lọc để thử với
2 loại thuốc thử Mayer, Wagner:

-

Thuốc thử Mayer:
Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60mL nước cất và hòa tan 5 gam KI trong

10mL nước cất. Trộn hai dung dịch, cho vào bình định mức, thêm nước cất đến
vạch 100mL. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dịch chiết.
-

Thuốc thử Wagner:
Hòa tan 1,27 gam Iod và 2 gam KI trong 20mL nước cất. Thêm nước cất cho

đủ 100mL. Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dịch chiết.
Hiện tượng
Khi thử dịch chiết với:
-

Thuốc thử Mayer: nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt hoặc

màu trắng.
Lưu ý: tủa tạo thành có thể tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc tan
trong ethanol có sẵn trong dung dịch thử.
-

Thuốc thử Wagner: nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.

2.2.3.2. Flavonoid
Tiến hành
Cân 10 gam bột lá Đu đủ đực cho vào bình nón 100mL có nắp đậy, thêm
50mL cồn 90˚. Đậy kín. Đun cách thủy trong 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc. Cho

1mL dịch chiết vào ống nghiệm rồi đem đi thử với các phản ứng sau: dung dịch
NaOH 10%; dung dịch H2SO4 đặc; FeCl3 5%
Hiện tượng
-

Phản ứng với dung dịch NaOH 10%:

17