(Luận văn thạc sĩ) Thiết kế vector biểu hiện protein amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 và đánh giá hoạt tính enzyme

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN HÀ THU

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN
AMIDASE ALIPHATIC TỪ
Rhodococcus erythropolis PR4
VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN HÀ THU

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN
AMIDASE ALIPHATIC TỪ
Rhodococcus erythropolis PR4
VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã ngành: 84.20.20.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Bằng Phương

Thái Nguyên - 2018

i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của
TS. Phạm Bằng Phương. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và
chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi thông tin trích dẫn
trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn
Nguyễn Hà Thu


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp
ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ
bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đinh.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Phạm Bằng Phương
người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài
cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học và
công nghệ thực phẩm đã hướng dẫn và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ làm việc tại Viện khoa học sự sống –
Đại học Thái Nguyên đặc biệt là Th.S Ma Thị Trang đã tạo điều kiện để giúp đỡ
tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn
động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn trong quá trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày…..tháng…..năm 2018
Học viên
Nguyễn Hà Thu


iii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu ...............................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2
4. Ý nghĩa của luận văn ...............................................................................................2
4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................2
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................3
1.1. Tổng quan chung về nhóm vi khuẩn Rhodococcus..............................................3
1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Rhodococcus ...............................................................3
1.1.2. Khái quát về vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4 và gen mã hóa
amidase aliphatic ...............................................................................................4
1.2. Tổng quan chung về amidase ...............................................................................5
1.2.1. Hệ thống phân loại enzyme ...............................................................................5
1.2.2. Đặc tính của amidase ........................................................................................6
1.2.3. Khả năng thủy phân sinh học ............................................................................8
1.3. Ứng dụng của amidase trong y dược và công nghiệp ........................................11
1.3.1. Tổng quan về nhóm phức amide aliphatic ......................................................11
1.3.2. Ứng dụng của amidase trong y dược ..............................................................13
1.3.3. Ứng dụng của amidase trong công nghiệp và xử lý chất thải chứa amide
aliphatic ..........................................................................................................14
1.4. Đặc điểm chủng vi khuẩn E. coli sử dụng trong tạo dòng và biểu hiện ............15

1.4.1. E. coli DH5α JM109 .......................................................................................15
1.4.2. E. coli BL21 ....................................................................................................16
1.4.3. E. coli BL21 (DE3) pLysS ..............................................................................16
1.4.4. E. coli M15 (pREP4) .......................................................................................17
1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ........................................................17
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................17


iv
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................................19
CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................21
2.1. Đối tượng, phạm vi và vật liệu nghiên cứu ........................................................21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................21
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................21
2.1.3. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................21
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................24
2.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................24
2.4. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu ...........................................................24
2.4.1. Dụng cụ nghiên cứu ........................................................................................24
2.4.2. Thiết bị nghiên cứu .........................................................................................24
2.4.3. Hóa chất nghiên cứu........................................................................................25
2.5. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................25
2.5.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số.............................................................25
2.5.2. Phương pháp khuếch đại gen PCR ..................................................................26
2.5.3. Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến ...........................................................27
2.5.4. Phương pháp gắn nối gen vào vector ..............................................................28
2.5.5. Phương pháp tách chiết plasmid .....................................................................28
2.5.6. Phương pháp biến nạp .....................................................................................29
2.5.7. Phương pháp kiểm tra gắn nối gen..................................................................30
2.5.8. Phương pháp cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG ......................................31

2.5.9. Phương pháp thu nhận protein ........................................................................31
2.5.10. Phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE ....................................................31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................33
3.1. Nghiên cứu khuếch đại gen mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus
erythropolis PR4 ................................................................................................33
3.1.1. Tách chiết ADN hệ gen của Rhodococcus erythropolis PR4 .........................33
3.1.2. Khuếch đại gen mã hoá amidase bằng phương pháp PCR .............................34
3.2. Tạo dòng gen mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 .....35
3.2.1. Vector tạo dòng ...............................................................................................35


v
3.2.2. Gắn nối đoạn gen amiE vào vector tạo dòng pGEM T-easy ..........................37
3.2.3. Kiểm tra gắn nối bằng enzyme giới hạn .........................................................37
3.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa amidase aliphatic từ
Rhodococcus erythropolis PR4 .........................................................................38
3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện .................................................................................38
3.3.2. Gắn nối đoạn gen amiE vào vector biểu hiện pET28a....................................40
3.3.3. Kiểm tra gắn nối bằng enzyme giới hạn .........................................................41
3.4. Đánh giá khả năng biểu hiện amidase aliphatic từ Rhodococcus
erythropolis PR4 trên vi khuẩn E. coli ...............................................................42
3.5. Kết quả đánh giá sự sinh trưởng của tế bào E. coli tái tổ hợp amiE-PR4 ..........43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................45
1. Kết luận .................................................................................................................45
2. Kiến nghị ...............................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................46


vi
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Tiếng việt

Tiếng nước ngoài

AMP

: Ampicillin

Ampicillin

bp

: Cặp bazơ nitơ

Base pair

CoA

: Coenzyme Acetoacetyl

Cs

: Cộng sự

kDa

: Kilo dalton

ADN

: Deoxyribonucleic Acid

E. coli

: Escherichia coli

EDTA

: Etilendiamin tetraaxetic axit

IPTG

: Isopropyl Thiogalactoside

kb

: Kilo bazơ nitơ

LB

: Laria Broth

NCBI

: Ngân hàng gen

Etilendiamin tetraaxetic acid
Kilo base
Nation Centre for

Biotechnology Information

PCR

: Khuếch đại gen

R. erythropolis

: Rhodococcus erythropolis

RE

: Enzyme giới hạn

TAE

: Tris-acetate-EDTA

TTH

: Tái tổ hợp

SDS –PAGE

: Điện di SDS- polyacrylamide gel

Polymerase Chain Recation
Restriction enzyme

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis)

X-gal

:5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-Dalactoside


vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các thành phần của vector pGEM® T-easy .............................................22
Bảng 2.2. Các thành phần của vector biểu hiện pET-28a(+) ....................................23
Bảng 2.3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài ..............................................24
Bảng 2.4. Hóa chất sử dụng trong đề tài ...................................................................25
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen amiE ....................................27
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng ...............................28
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng EcoRI và SalI ............................30
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt mở vòng plasmid .............................................30
Bảng 3.1: Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ ADN ................................................34


viii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc X-ray của amidase peptide ...........................................................6
Hình 1.2. Phản ứng xúc tác thủy phân amit hình thành axit và amoniac tương ứng ..7
Hình 1.3. Cơ chế kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter .......................................16
Hình 1.4. Sơ đồ ứng dụng sản xuất thuốc kháng HIV ..............................................20
Hình 2.1. Vector plasmid pGEM® T-easy ................................................................21
Hình 2.2. Vector biểu hiện pET-28a(+) ....................................................................23
Hình 2.3. Chu kỳ nhiệt khuếch đại gen amiE ...........................................................27

Hình 3.1. Hình ảnh điện di ADN hệ gen được tách chiết từ .....................................33
Rhodococcus erythropolis PR4. ................................................................33
Hình 3.2. Hình ảnh điện di đoạn gen amiE được khuếch đại từ ADN hệ gen ..........34
Hình 3.3. Hình ảnh điện di đoạn gen amiE đã tinh sạch ...........................................35
Hình 3.4. Hình ảnh điện di vector pGEM T-easy .....................................................35
Hình 3.5. Vector pGEM T-easy-amiE thiết kế trên phần mềm NTI.........................36
Hình 3.6. Hình ảnh điện di vector tạo dòng tách chiết.............................................37
Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt các dòng plasmid có khả năng
mang gen amiE ..........................................................................................38
Hình 3.8. Hình ảnh điện di vector pET28a và pET28a cắt mở vòng .......................39
Hình 3.9. Hình ảnh điện di đoạn gen amiE thu nhận từ vector tạo dòng ..................39
Hình 3.10. Vector pET28a-amiE thiết kế trên phần mềm NTI .................................40
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm gắn nối amiE vào pET28a ...........................41
Hình 3.12. Hình ảnh điện di plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc ....................41
nghi mang gen amiE.................................................................................41
Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid nghi mang gen amiE ................42
Hình 3.14. Hình ảnh điện di protein được cảm ứng biểu hiện trong tế bào E. coli
BL21(DE3)pLysS ....................................................................................43
Hình 3.15. Đánh giá sự sinh trưởng của tế bào E. coli tái tổ hợp amiE-PR4 ...........44


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Amidase là loại enzyme thương mại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong công
nghiệp, đặc biệt trong các quy trình liên quan đến quản lý và xử lý chất thải có chứa
acrylamide – một loại hợp chất độc có khả năng gây ung thư. Bên cạnh đó, sau khi
thủy phân, amidase còn tạo ra một số axit cacboxylic và dẫn xuất amit có ý nghĩa quan
trọng, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống như công nghiệp dược phẩm [46].
Tuy mang lại nhiều ứng dụng nổi bật nhưng hiện nay ở nước ta chưa có nhiều

nghiên cứu liên quan đến loại enzyme này. Nguyên nhân một phần là do con đường
sinh tổng hợp amidase từ các loài vi khuẩn trong tự nhiên hết sức tốn kém thời gian
và công sức, cùng với đó là các yêu cầu ngặt nghèo trong quy trình thu nhận và tinh sạch
chúng. Trong khi đó, nhu cầu về xử lý các chất thải công nghiệp liên quan đến
acrylamide đang ngày càng tăng, điều này đặt ra một áp lực to lớn đối với các nhà
nghiên cứu trong lĩnh vực hóa sinh cũng như công nghệ sinh học, nhằm tạo ra một công
nghệ mới để đơn giản hóa con đường tổng hợp amidase trên quy mô công nghiệp.
Trong những năm gần đây, dưới sự phát triển mạnh mẽ của nền công nghệ
sinh học trên thế giới, một giải pháp đã được đưa ra nhằm mang đến một loại
amidase có khả năng hoạt động hiệu quả, đặc biệt là trong việc thủy phân
acrylamide. Cụ thể là phương pháp sản xuất amidase dựa vào áp dụng kỹ thuật
chuyển gen, đưa đoạn gen mã hóa enzyme này từ vi khuẩn trong tự nhiên vào một
loại vi khuẩn có khả năng tăng sinh mạnh trong một thời gian ngắn. Sản phẩm tạo
thành được tổng hợp trên quy mô lớn vừa có khả năng thủy phân acrylamide, vừa có
thể tạo dẫn xuất ứng dụng trong công nghệ dược phẩm.
Để đáp ứng nhu cầu sử dụng amidase trong công nghiệp, một số nghiên cứu
trong thời gian gần đây đã được tiến hành trên hệ gen của các loại vi khuẩn có khả
năng tự sản sinh amidase để phân hủy và sử dụng acrylamide như một nguồn nitơcacbon duy nhất trong tự nhiên như Pseudomonas sp., Xanthomonas maltophilia,
Rhodococcus erythropolis [53]. Tuy nhiên có rất ít thông tin nghiên cứu chỉ ra rằng
những loại amidase từ các vi khuẩn này có thể được tinh sạch và biểu hiện được đầy
đủ khả năng thủy phân acrylamide [52]. Bên cạnh đó, trong số các nghiên cứu được
thử nghiệm trên các loại vi sinh vật khác, con đường tổng hợp amidase từ việc sử


2
dụng vi khuẩn E. coli làm vật chủ hiện mang lại nhiều kết quả khả quan. Nguyên
nhân là do vi khuẩn E. coli có khả năng sinh trưởng tốt, dễ thu nhận các đoạn gen
ngoại lai và hệ gen của nó không có khả năng mã hóa tạo ra amidase [21]. Sử dụng
công nghệ ADN tái tổ hợp tạo ra các chủng E. coli có khả năng sản xuất ra amidase
đã góp phần đáp ứng nhu cầu sử dụng amidase trong lĩnh vực công nghiệp nói chung

và công nghiệp dược phẩm, xử lý chất thải nói riêng.
Vì vậy, xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Thiết
kế vector biểu hiện protein amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 và
đánh giá hoạt tính enzyme ” nhằm mục đích góp phần vào các nghiên cứu cung cấp
vật liệu cho việc sản xuất amidase trên quy mô công nghiệp.
2. Mục đích nghiên cứu
Thiết kế thành công vector biểu hiện mang gene mã hóa amidase aliphatic từ
Rhodococcus erythropolis PR4 và đánh giá hoạt tính của enzyme amidase aliphatic
tái tổ hợp.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghiên cứu khuếch đại gen mã hóa amidase aliphatic từ
Rhodococcus erythropolis PR4
- Nội dung 2: Tạo dòng gen mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus
erythropolis PR4
- Nội dung 3: Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa amidase aliphatic từ
Rhodococcus erythropolis PR4
- Nội dung 4: Đánh giá sơ bộ biểu hiện và hoạt tính của enzyme amidase tái tổ
hợp
4. Ý nghĩa của luận văn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Ý nghĩa khoa học của đề tài là thiết kế vector biểu hiện và đánh giá khả năng
biểu hiện amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4, từ đó làm tiền đề để
nghiên cứu sản xuất amidase trên quy mô công nghiệp.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện amidase aliphatic từ Rhodococcus
erythropolis PR4 để sản xuất amidase aliphatic trên quy mô lớn. Trên cơ sở đó góp
phần tạo ra nguồn enzyme chủ động trong nước, hạn chế việc nhập khẩu hóa chất từ
nước ngoài nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất trong lĩnh vực công nghiệp.

3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan chung về nhóm vi khuẩn Rhodococcus
1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Rhodococcus
Rhodococcus là một chủng vi khuẩn Gram dương, hiếu khí không bắt buộc,
không nhạy cảm với kháng sinh, có lượng G/C cao, thuộc chi Coryneform của
bộ Actinomycetales, đồng thời có quan hệ gần gũi với nhóm các vi khuẩn
Mycobacterium và Corynebacterium [70]. Hầu hết các vi khuẩn thuộc chủng này đều
lành tính, được tìm thấy phát triển mạnh và đa dạng trong nhiều môi trường bao gồm
đất, nước và tế bào nhân chuẩn. Một số loài có bộ gen lớn như bộ gen 9,7 Mbp (67%
G/C) của Rhodococcus sp. RHA1.
Có thể nói các chủng Rhodococcus có đặc tính linh hoạt trong trao đổi chất do
khả năng thủy phân chuyển hóa một loạt các hợp chất xenobiotic như polyiplorinated
biphenyls (PCBs), acrylamide và tạo ra các steroid có hoạt tính sinh học như axit
acrylic [40]. Sự đa dạng về di truyền và dị hóa trên, không chỉ do nhiễm sắc thể lớn
mà còn do sự hiện diện của ba plasmid tuyến tính. Theo một số nghiên cứu,
Rhodococcus cũng là một hệ vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong thực nghiệm do
tốc độ sinh trưởng tương đối nhanh và chu kỳ phát triển đơn giản, tuy nhiên các ảnh
hưởng đến thí nghiệm của chúng chưa được nhận biết rõ ràng [70]. Một số chủng
Rhodococcus được sử dụng vào sản xuất chất hoạt động bề mặt và một số khác là
nguồn enzyme hữu ích như phenylalanine dehydrogenase và endoglycosidases.
Một ứng dụng quan trọng khác của Rhodococcus đến từ sự chuyển đổi sinh
học. Sử dụng các hệ sinh học để chuyển đổi vật liệu khởi đầu rẻ thành các hợp chất
có giá trị hơn như khả năng chuyển hóa các chất gây ô nhiễm môi trường có hại, bao
gồm toluene, naphtalene, thuốc diệt cỏ và PCBs. Rhodococcus là loài có khả năng
chuyển hóa một số hợp chất thơm bằng cách oxy hóa vòng thơm để tạo thành một
glycol (hai nhóm rượu). Trong khi việc kiểm soát phản ứng hóa học đang là một
thách thức đối với các nhà hóa học tổng hợp thì các quá trình thủy phân sinh học của
Rhodococcus có thể được sử dụng để sản xuất các phân tử 4 nhóm thế (chiral) trong

trường hợp tổng hợp hóa học trực tiếp không khả thi hoặc thiếu hiệu quả. Một ví dụ


4
cụ thể về trường hợp này là việc sử dụng Rhodococcus để tạo ra indene , tiền thân
của thuốc AIDS indinavir, một chất ức chế protease và có chứa hai trong năm lõi
chiral cần thiết trong nhóm phức [20].
Rhodococcus đã được nghiên cứu như là một nhân tố tiềm năng cho việc xử lý
sinh học các chất gây ô nhiễm vì nó thường được tìm thấy trong môi trường tự nhiên
và mang những đặc điểm nhất định như khả năng chuyển hóa nhiều loại
hydrocacbon nhờ bề mặt kỵ nước cho phép chúng phát triển mạnh dưới hàng loạt
điều kiện khắc nghiệt đồng thời chúng [14]. Khả năng hô hấp vi sinh vật giúp
Rhodococcus tồn tại trong môi trường có nồng độ oxy thấp trong khi khả năng hô
hấp hiếu khí cũng cho phép chúng tồn tại trong môi trường oxy hóa. Ngoài ra, chúng
có thể cố định đạm tạo các chất dinh dưỡng trong môi trường có dưỡng chất thấp.
Nhờ một số loại enzyme độc đáo, Rhodococcus có khả năng chuyển hóa mạnh
nhiều hydrocacbon độc hại như phân hủy dầu diesel [40]. Trong một số trường hợp,
Rhodococcus sinh dioxygenases, một chất có thể được sử dụng để làm suy giảm
benzotrifluoride- một hợp chất gây ô nhiễm nhờ tính kiềm chế sinh trưởng. Thêm
vào đó, Rhodococcus sp. chủng Q1, một chủng tự nhiên được tìm thấy trong đất và
giấy nghiền, có khả năng làm giảm quinoline, các dẫn xuất pyridin, catechol,
benzoat và axit protocatechuic. Rhodococcus cũng có khả năng tích lũy các ion kim
loại nặng, chẳng hạn như phóng xạ cesium, cho phép loại bỏ chúng dễ dàng hơn ra
khỏi môi trường [70]. Các chất ô nhiễm khác như thuốc nhuộm azo, thuốc trừ
sâu và polychlorinated biphenyls cũng có thể bị thoái hóa bởi Rhodococcus [12].
Theo một số nghiên cứu, khả năng thủy phân sinh học của chủng
Rhodococcus có liên hệ mật thiết với một loại enzyme có tên amidase, một
enzyme có mặt thường xuyên khi phân lập chủng này từ tự nhiên. Amidase được
biết đến là enzyme xúc tác quá trình thủy phân amit, giải phóng các axit và
amoniac tương ứng [55].

1.1.2. Khái quát về vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4 và gen mã hóa
amidase aliphatic
Trong chủng Rhodococcus, vi khuẩn Rhodococcus erythropolis nổi lên như
một nhóm có khả năng đáp ứng cao đối với các điều kiện ô nhiễm của môi trường
trong đó, Rhodococcus erythropolis PR4 (= NBRC 100887 ) đã được phân lập từ


5
nước biển sâu ở độ sâu 1.000 m ở phía nam của đảo Okinawa, Nhật Bản (Thái Bình
Dương) cho thấy, chúng có thể sử dụng n -alkan của C-8 đến C-20 , alkylbenzenes,
và chất nguyên sơ (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) như là nguồn cacbon và năng
lượng. Nó cũng có thể tạo ra một lượng lớn polysaccharide ngoại bào (EPS), được
cho là đóng một vai trò quan trọng vào khả năng chịu đựng của nó đối với một loạt
các dung môi hữu cơ [49].
Hệ gen hoàn chỉnh bao gồm một nhiễm sắc thể tròn (6,516,310 bp; hàm lượng
GC 62,31%), một plasmid tuyến tính (pREL1: 271,577 bp) và hai plasmid hình tròn
(pREC1: 104,014 bp; và pREC2: 3,637 bp). Tổng cộng có 6,437 ORF được dự đoán
trên nhiễm sắc thể và 3 plasmid. Nhiễm sắc thể và plasmid tuyến tính mã hóa nhiều
gen liên quan đến sự suy thoái của các ankan. Ngoài ra, các gen được nhóm lại trên
nhiễm sắc thể chịu trách nhiệm cho việc phân hủy các chất trung gian trong quá trình
dị hóa của các hợp chất thơm như axit protocatechuic và catechol. Bộ gen này cũng
chứa một số gen cho sự trao đổi chất thứ cấp và sinh tổng hợp EPS [10].
Trong vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4, gen amidase aliphatic (amiE)
mã hóa amidase có kích thước 1038 bp đã được giải trình tự một cách đầy đủ và
công bố trên ngân hàng gen với số hiệu ACNO01000111 từ nucleotide số 543918
đến 544955 [30].
1.2. Tổng quan chung về amidase
1.2.1. Hệ thống phân loại enzyme
Amidase thuộc lớp enzyme hydrolase - enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy
phân. Trong lớp enzyme hydrolase, có các enzyme phân giải este (ví dụ lipid),

glucozid, amid, peptid, protein như urease, asparaginase, glutaminase, arginase,
aliphatic axit hydrolases…
Tên phân loại của nhóm enzyme amidase là acylamide amidohydrolase. Các
tên gọi khác tên gọi khác được sử dụng phổ biến bao gồm acylamidase, acylase,
amidohydrolase, deaminase, acylamidase béo và N-acetylaminohydrolase.
Enzyme này tham gia vào 6 con đường trao đổi chất: chu kỳ urê và chuyển
hóa các nhóm amin, chuyển hóa phenylalanine, chuyển hóa tryptophan ,chuyển hóa
axit cyanoamino, thoái hóa benzoate qua Coenyme A và suy thoái styrene.
Amidase chứa khoảng 130 axit amin, được gọi là trình tự AS. Chúng là loại
enzyme phổ biến, thường được tìm thấy ở cả sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân


6
sơ. Trình tự AS của enzyme xúc tác sự thủy phân của liên kết amit (CO-NH2), mặc
dù họ enzyme này đã phân tán khả năng thủy phân vào từng nhóm do liên quan
đến độ đặc hiệu và chức năng bề mặt của chúng. Tuy nhiên, các enzyme này vẫn duy
trì cấu trúc với lõi alpha/beta/alpha, trong đó các cấu trúc liên kết của các nửa đầu N
và C là tương tự nhau. Trình tự AS của enzyme đặc trưng có một khu vực Cterminal giàu serine và dư lượng glycine, nhưng không có acid aspartic và dư
lượng histidine, do đó chúng khác với hydrolases serine cổ điển. Những enzyme này
có bộ ba xúc tác Ser-Ser-Lys độc đáo, được bảo tồn cao và sử dụng để thủy phân
amit, mặc dù cơ chế xúc tác cho sự hình thành trung gian enzyme acyl có thể khác
nhau giữa các enzyme [69].

Hình 1.1. Cấu trúc X-ray của amidase peptide
Ví dụ về trình tự AS chứa các tín hiệu của enzyme bao gồm:
Peptide amidase (Pam), xúc tác quá trình thủy phân của amit có đầu Cterminal của chuỗi axit amin.
Aliphatic axit hydrolases amide, enzyme xúc tác thủy phân các chất nền chứa
nhóm phức amit hình thành axit béo (ví dụ nhóm hợp chất nội sinh anandamide và
oleamide), do đó có thể kiểm soát mức độ và thời gian biểu hiện của tín hiệu thông
qua sự kiểm soát tính đa dạng của lớp chất nền lipid.

Malonamidase E2, có trong nhóm vi khuẩn cộng sinh chuyển hóa nitơ, hỗ trợ
xúc tác quá trình thủy phân malonamate thành malonate và ammonia đồng thời tham
gia vào việc vận chuyển cố định nitơ từ bacteroids để nuôi dưỡng các tế bào chủ.
1.2.2. Đặc tính của amidase
Amidase (EC 3.5.1.4) được tìm thấy bởi Mohamed S. và cộng sự vào năm
1994, có khối lượng phân tử tiểu đơn vị xấp xỉ 44,5 kDa (xác định bằng SDS-PAGE)


7
và điểm đẳng điện được ước tính là pH 4.0 [47]. Trình tự aa N-terminal của enzyme
này được công bố như sau: M R H G D I T S S P D T V G V A V [30].
Amidase được biết đến là enzyme xúc tác quá trình thủy phân amit, giải
phóng các axit và amoniac tương ứng [55].

Hình 1.2. Phản ứng xúc tác thủy phân amit hình thành axit và amoniac tương ứng
Enzyme này có thể được phân thành hai loại theo đặc tính bề mặt của chúng
[18], loại thứ nhất bao gồm các amidase chỉ làm thuỷ phân các amit mạch ngắn, loại
thứ hai là các amidase aliphatic thủy phân chuỗi amit mạch trung bình, acrylamide
và heterocyclicamide như isobutyramide và valeroamide [38]. Đến nay, đã có hơn 26
loại amidase có nguồn gốc từ vi khuẩn được sàng lọc và xác định [55], bên cạnh đó
hầu hết trong vi khuẩn, amidase tồn tại ở loại thứ hai.
Amidase được ghi nhận là có mặt thường xuyên ở chi Rhodococcus. Ở chủng
Rhodococcus erythropolis TA37 ghi nhận, một enzyme acylamidase có khối lượng
tiểu đơn vị chạy SDS -PAGE là 55 kDa, hoạt động tối đa ở điều kiện pH=7-8 và
nhiệt độ 55 oC [37], trong khi đó ở Rhodococcus erythropolis MP50, enzyme này có
trọng lượng phân tử khoảng 480 kDa và bao gồm các tiểu đơn vị giống hệt nhau với
trọng lượng khoảng 61 kDa [28].
Theo nghiên cứu gần đây của Z. Xue và cộng sự, amidase tái tổ hợp có nguồn
gốc từ vi khuẩn Rhodococcus erythropolis, một loài vi khuẩn đặc trưng thuộc nhóm
Actinobacteria có khả năng biểu hiện đầy đủ hoạt tính cũng như khả năng tổng hợp

chọn lọc bất đối xứng hiệu quả với một phổ rộng các amit (nổi bật là một số chất gây
độc cho tế bào như acetamide, propionamide, acrylamide, và benzamide) [72].


8
Cùng với đó, amidase được coi như là một loại enzyme có thể phân giải
acrylamide và là một chất xúc tác sinh học trong việc sản xuất axit acrylic trên quy
mô lớn, có thể nói đây là một hợp chất có ứng dụng công nghiệp mạnh [52].
1.2.3. Khả năng thủy phân sinh học
1.2.3.1. Cơ chế thủy phân
Theo nghiên cứu của Fournand D trên chủng Rhodococcus sp. R312, một loại
enzyme có tên amidase aliphatic có khả năng biểu hiện vượt mức thông qua
Escherichia coli và được tinh chế dựa vào kỹ thuật sắc ký. Enzyme này được chứng
minh là có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa acyl và hình thành hydroxylamine
từ một loạt các amit với khả năng hoạt động tối ưu ở pH = 7 (với amide trung tính)
và 8 (với α-aminoamit) [18].
Theo đó thì phản ứng xúc tác chuyển hóa acyl xảy ra theo cơ chế Ping Pong
Bi Bi. Các hằng số động học đã chứng minh rằng sự hiện diện của các phân tử kỵ
nước trong chuỗi bên carbon trong phân tử protein amidase làm giảm đáng kể các giá
trị Km cũng như hằng số động học của enzyme (kcat) với các amide béo tuyến tính.
Trong khi đó, hoạt động các nhánh bên trong amidase, nhóm thơm hoặc dị vòng bị
cản trợ. Các axit cacboxylic, axit a-amino và metyl este được cho là các chất gây kìm
hãm phản ứng, trong khi các chất chứa liên kết amit như amit và axit hydroxit, được
xác định là nhóm hoạt hóa acyl hiệu quả. Mặt khác, sự tương tác giữa phức hợp acylenzyme với hydroxylamine hình thành nên các amit ngắn, phân cực hoặc không bão
hòa nhờ nhóm hoạt hóa, đồng thời không tìm thấy nhóm amit bão hòa khác ngoại trừ
nước và hydroxylamine trong sản phẩm [19].
Nghiên cứu của K. V. Lavrov cho thấy, acylamidase có hoạt tính tối ưu trong
phạm vi giá trị pH trung tính (pH 5-11). Cụ thể là, nhằm đánh giá tính ổn định của
enzym, acylamidase được ủ ở các giá trị pH có tính axit và cơ bản, và sau khi trở lại
pH trung tính, hoạt động được đo lại. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở các giá trị pH

thấp, acylamidase nhanh chóng bị bất hoạt, trong khi hoạt động bất hoạt trung bình
cơ bản là khá chậm [37].
Chính vì vậy, có thể nói tùy thuộc vào từng loại môi trường phân hủy và độ
ổn định của giá trị pH mà enzyme có khả năng hoạt động khác nhau, mặc dù vậy
nhìn chung enzyme ổn định và có hoạt tính mạnh nhất ở pH trung tính.


9

1.2.3.2. Khả năng thủy phân biểu hiện qua một số chủng vi khuẩn trong tự nhiên
Trong tự nhiên tồn tại rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng thủy phân các nhóm
phức aliphatic amide và amide thơm thành axit cacboxylic và amoniac tương ứng
[22], [24] như Pseudomonas sp., X. Maltophilia, Geo-bacillus pallidus,
Pseudomonas chlororaphis B23 [13], Rhodococcus erythropolis MP50 [26], [61],
Rhodococcussp.

strain

R312

[44],

Rhodococcussp.

strain

N-774

[25],

Rhodococcussp. [45], và Rhodococcus rhodochrous J1 , M8 [34], [40],…. Trong đó,
Pseudomonas sp là loại vi khuẩn được nghiên cứu rộng rãi nhất.
Vào năm 1994, một chủng Pseudomonas sp. có khả năng sử dụng acrylamide
như một nguồn nitơ và cacbon duy nhất, đã được thử nghiệm để thủy phân hỗn hợp
gồm các amit. Sau thử nghiệm kết quả cho thấy Pseudomonas sp. làm giảm
acrylamide và methacryl-amide bị thủy phân thành axit acrylic và axit metacrylic
trong 72 giờ với tốc độ tương ứng là 97 và 78 pmol/h. Cũng trong nghiên cứu này,
nhóm Mohamed S. Nawaz ghi nhận được sự có mặt của amidase, lần lượt là 14,3,
14,0 và 17,3 đơn vị ở môi trường chứa acetamide, acrylamide và isobutyramide [47].
Theo nghiên cứu trên hai chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. và Xanthomonas
maltophilia được phân lập từ các mẫu đất bị ô nhiễm chất diệt cỏ cho thấy, cả hai
chủng vi khuẩn này đều có khả năng thủy phân hoàn toàn 62,8 mM acrylamide sau
lần lượt 24 và 48 giờ. So sánh khả năng phân hủy acrylamide nhận thấy hoạt tính của
Pseudomonas sp. amidase cao hơn của X. maltophilia amidase. Cũng trong thí
nghiệm này, một amidase nội bào được cho là có thể cảm ứng và chịu trách nhiệm
thủy phân acrylamide thành axit acrylic và amoniac [53].
Amidase được tinh chế từ dịch tế bào của vi khuẩn Arthrobacter sp. J-l có
khả năng xúc tác quá trình thủy phân acetamide để tạo thành axit acetic và amoniac.
Các hoạt động thủy phân acetamide, acrylamide và propionamide có các giá trị Km
lần lượt là 0,97, 23,3 và 8,05 mM. Ngoài ra, amidase cho thấy nó có còn mang hoạt
tính của một loại enzyme acyl transferase [71].
Bên cạnh đó, trong một số nghiên cứu gần đây, một loại acylamidase với khối
lượng tiểu đơn vị chạy SDS -PAGE là 55 kDa đã được phân lập từ chủng
Rhodococcus erythropolis TA37. Enzyme này có thể hoạt động tối đa ở điều kiện
pH=7-8 và được biểu hiện trong các môi trường nuôi thay thế chứa các hợp chất như


10
acrylamides, axit para nitroanilides và các dẫn xuất axetyl của glycine, alanine và
leucine. Acylamidase hoạt động ổn định trong 15 giờ ở 22 oC và trong 0,5 giờ ở 45

o

C. Ngoài ra, hoạt tính acylamidase bị ức chế bởi các chất ức chế protease serine

nhưng không bị ức chế bởi các chất ức chế amidase aliphatic [37].
Mặc dù, các chủng Pseudomonas và Arthrobacter đã được báo cáo có khả
năng sử dụng acrylamide như nguồn cacbon và nitơ duy nhất nhưng sự tăng trưởng
của các chủng này bị ức chế bởi các amide khác [48].
Nhìn chung, tuy có khả năng phân hủy một số nhóm acrylamide nhất định
nhưng ở một số trường hợp, các vi khuẩn ngoài tự nhiên vẫn bị ức chế một số hoạt
động thủy phân nhất định.
1.2.3.3. Khả năng thủy phân biểu hiện nhờ E. coli trong phòng thí nghiệm
Trong khi một số vi khuẩn trong tự nhiên có khả năng chuyển hóa một lượng
lớn nitrit thông qua con đường nitrile hydratase/amidase, việc ứng dụng công nghệ
sinh học vào nghiên cứu các phương pháp mới nhằm sản xuất amidase quy mô lớn
vẫn đóng vai trò quan trọng và được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới.
Trong nghiên cứu của Zhiquan Xue và cs, một gen mã hóa amidase từ
chủng vi khuẩn R. erythropolis AJ270 đã được nhân bản và thể hiện trong
Escherichia coli BL21 (DE3). Với hoạt tính thủy phân đạt mức cao nhất là 22,04
U/ml trên một mẻ nuôi theo một chu trình tự động hóa lên men phức tạp. Amidase
tái tổ hợp được tinh chế đến hơn 95% nhờ lysat thô sử dụng sắc ký ái lực Ni-NTA
và lọc Superose S10-300 gel. Ngoài ra, khả năng thủy phân được thể hiện qua các
thông số Vmax và Km của enzyme tinh khiết với acrylamide (50 mM) là 6,89 lmol /
phút / mg protein và 4,12 mM, tương ứng. Kết quả này tương tự như của enzyme
từ vi khuẩn trong tự nhiên [72].
Trong khi đó, một amidase (EC 3.5.1.4) trong nhánh 2 của họ superititase, từ
chủng nhiệt đới Geobacillus pallidus RAPc8, được đánh giá là có khả năng biểu hiện
cao (20 U / mg) trong E. coli ở quá trình lên men quy mô nhỏ. Amidase tạo thành có
khả năng xúc tác quá trình thủy phân của các amit béo có trọng lượng phân tử thấp,
có khả năng tổng hợp chọn lọc đối với các lactamide. Các nghiên cứu phân tích dữ

liệu về hoạt tính ức chế cho thấy, sự tương tác kích hoạt/ức chế phù hợp với sự hiện
diện của nhóm thiol [18].


11
Amidase có tiềm năng ứng dụng trong điều kiện nhiệt độ cao như một chất
sinh học phục vụ cho thủy phân amit có chọn lọc nhằm sản xuất axit cacboxylic tinh
khiết trên quy mô lớn thông qua việc chuyển hóa acyl [53].
Dựa vào các nghiên cứu trước đây, Fournand. D và cộng sự chứng minh rằng
các amit béo mạch ngắn (ngoại trừ formamide) là các chất nền hiệu quả nhất của
amidase tái tổ hợp nhằm chuyển hóa acyl trên hydroxylamine. Điều này phù hợp với
kết quả của Thiery và cộng sự năm 1986 [63], đồng thời cũng chỉ ra amit chuỗi ngắn
là các chất nền tiềm năng để amidase tái tổ hợp xúc tác thủy phân amit tạo acyl
tương tự như amidase của chủng tự nhiên Rhodococcus sp. R312.
Theo Hidenobu Komeda, amidase tái tổ hợp được mã hóa từ gen LaaABd của
vi khuẩn Brevundimonas diminuta có hoạt tính thủy phân đối với một loạt các
amino axit L-amino bao gồm L-phenylalaninamide, L-glutaminamide, Lleucinamide, L-methioninamide, L-argininamide, và L-2-aminobutyric axit amit.
Nhưng tùy vào loại amino acid amide mà nó có khả năng tổng hợp chọn lọc khác
nhau [27].
Ngoài ra, enzyme amidase tái tổ hợp trên vi khuẩn E. coli BL21(DE3)pLysS
có khả năng tổng hợp có chọn lọc nhờ vào việc ưu tiên xúc tác trên điểm S
enantiomer của racemic (R, S)-2-phenylpropionamide. Sự biểu hiện của amidase
hoạt tính trong E. coli phụ thuộc vào nhiệt độ, với hoạt tính cao được tìm thấy khi
nuôi cấy từ 20 oC đến 30 oC nhưng không có hoạt động ở 37 oC. Khi cảm ứng,
amidase chiếm 28% tổng protein hòa tan trong vi khuẩn E. coli [15].
1.3. Ứng dụng của amidase trong y dược và công nghiệp
Các ứng dụng của amidase chủ yếu liên quan đến việc thủy phân acrylamide
và các nhóm phức amide aliphatic khác như acetamide, acrylamide và isobutyramide
methacrylamide, propionamide và butyramide.
1.3.1. Tổng quan về nhóm phức amide aliphatic

Acrylamide (hay amide acryl) là một hợp chất hóa học với công thức phân
tử C3H5NO. Danh pháp IUPAC là prop-2-enamide. Nó là tinh thể rắn, màu trắng,
không mùi, dễ tan trong nước (2155g/l nước), ethanol, ête và chloroform, tan chảy ở
84,5 oC, nhiệt độ sôi 125 oC (ở áp suất 25 mmHg).


12
Acrylamide phân hủy với sự hiện diện của axit, bazơ, các tác nhân oxy hóa,
sắt và muối sắt. Nó phân hủy không nhiệt để tạo thành amoniac và phân hủy do nhiệt
tạo ra khí carbon monoxide, carbon dioxide và oxit nitơ.
Acrylamide có thể được điều chế bằng cách thủy phân acrylonitrile nhờ nitrile
hydratase. Trong công nghiệp, hầu hết acrylamide được sử dụng để tổng hợp
các polyacrylamide, nổi bật với ứng dụng như chất làm đặc hòa tan trong nước.
Cụ thể, chúng là thành phần cấu tạo nên các hợp chất polyacrylamide và
acrylamide copolymer, được sử dụng trong các ngành công nghiệp như giấy, nhuộm,
chất dẻo, xử lý nước uống và nước thải. Phần lớn acrylamide được sử dụng để sản xuất
các loại polyme khác nhau. Trong những năm 1970 và 1980, việc sử dụng polyme
tương đối lớn nhất là trong xử lý nước [7]. Thêm vào đó chúng còn được dùng để bổ
sung vào các chất kết dính, làm dày hoặc làm đặc trong vữa, xi măng, xử lý nước thải,
công thức thuốc trừ sâu, mỹ phẩm, sản xuất đường, phòng chống xói mòn đất, chế biến
quặng, bao bì thực phẩm, sản phẩm nhựa và sản xuất giấy. Một ứng dụng khác của
polyacrylamide là một chất trung gian hóa học trong sản xuất các amide aliphatic, chẳng
hạn như acrylamide và methylacryl amide, được sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu trong
sản xuất nhựa acrylic và methacrylic cũng như các dung môi trong các ngành công
nghiệp hóa dầu [68].
Ở môi trường phòng thí nghiệm, polyacrylamide lần đầu tiên được sử dụng
vào đầu những năm 1950. Năm 1959, các nhóm của Davis & Ornstein và Raymond
& Weintraub công bố độc lập về việc sử dụng điện di gel polyacrylamide để phân
tách các phân tử tích điện. Kỹ thuật này được chấp nhận rộng rãi ngày nay và là một
phương pháp quy chuẩn sử dụng trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Bên

cạnh đó, acrylamide còn có nhiều ứng dụng khác bao gồm việc sử dụng
polyacrylamide tuyến tính (LPA) như một chất mang, hỗ trợ trong đo hàm lượng
ADN [7].
Nhiều loại amide là một trong hai thành phần chính của một số loại thuốc diệt
cỏ và thuốc trừ sâu hoặc trung gian khác của quá trình khử thuốc trừ sâu [59].
Ở Hoa Kỳ, acrylamide được coi là chất gây ung thư nghề nghiệp tiềm tàng
của các cơ quan chính phủ Hoa Kỳ và được IARC xếp vào nhóm chất gây ung thư
2A. Cơ quan an toàn và sức khỏe nghề nghiệp và Viện an toàn và sức khỏe nghề


13
nghiệp quốc gia đã thiết lập giới hạn phơi nhiễm nghề nghiệp ở mức 0,03 mg/m3
trong một ngày làm việc 8 giờ [68].
Acrylamide còn được biết là chất gây ung thư trên động vật thí nghiệm và lần
đầu tiên được tìm thấy trong thực phẩm bởi cơ quan Cục Thực phẩm quốc gia Thụy
Điển năm 2002 [17]. Cụ thể là theo khuyến cáo của Tổ chức FAO/WHO, mức cho
phép tiêu thụ acrylamide để không gây ảnh hưởng lên hệ thần kinh là 0,5 mg/kg cân
nặng/ngày [7].
Hợp chất acrylamide có thể dễ dàng hấp thụ qua da và phân bố khắp cơ thể;
Đây một chất kích thích da và có thể là một chất kích thích khối u trong da, có khả
năng làm tăng nguy cơ ung thư da. Các triệu chứng của phơi nhiễm acrylamide bao
gồm viêm da ở vùng tiếp xúc và bệnh thần kinh ngoại vi. Mức độ cao nhất của
acrylamide sau phơi nhiễm được tìm thấy trong máu, không tiếp xúc với da, thận,
gan, tinh hoàn và lá lách. Acrylamide có thể được chuyển hóa bởi cytochrome P450
thành chất chuyển hóa độc tố, glycidamide, được coi là một tác động quan trọng đối
với sự sinh ung thư của acrylamide [61].
Một số nghiên cứu tìm thấy, acrylamide có tác dụng gây độc thần kinh ở
người đã tiếp xúc [35]. Khi tiêu thụ acrylamide với hàm lượng cao trong thời gian
ngắn sẽ gây ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương; trong khi đó cho phơi nhiễm
acrylamide trong thời gian dài với liều lượng thấp thì gây ảnh hưởng lên thần kinh

ngoại biên là chủ yếu, trong khi việc tiếp xúc với acrylamide gây ra các khối u ở
tuyến thượng thận, tuyến giáp, phổi và tinh hoàn [61].
Bên cạnh đó, một số dẫn xuất của acrymide được chứng minh là mang lại
nhiều lợi ích cho ngành dược phẩm như axit hydroxamic –hợp chất hóa học có đóng
góp lớn trong sản xuất một số thuốc chống viêm, hỗ trợ điều trị ung thư cũng như
tăng cường miễn dịch [22].
Có thể nói việc thủy phân sinh học các hợp chất liên quan đến acrylamide
mang lại đóng góp đáng kể cho sự phát triển bền vững của các ngành công nghiệp,
một phần do ứng dụng rộng rãi của chúng, mặt khác nhằm hạn chế tác động có hại
đến sức khỏe con người [17], cũng như sự ô nhiễm môi trường sinh thái [12], [14].
1.3.2. Ứng dụng của amidase trong y dược
Nhìn chung amidase giữ vai trò không thể thay thế trong việc xúc tác thủy
phân nhóm hợp chất acrylamide hình thành một số dẫn xuất có ứng dụng quan trọng
trong công nghệ dược phẩm.


14
Amidase thủy phân tạo axit hydroxamic (R-CO-NR '-OH) được biết là có đặc
tính tạo phức hợp cao [16], [36]. Các ứng dụng y tế của các dẫn xuất này đã được
nghiên cứu rộng rãi và hiện được biết đến là chất ức chế mạnh của một số chất nền
metalloproteases, một họ endopeptidaza kẽm, một họ được cho là có ảnh hưởng tiêu
cực đến việc tái tạo mô [31]. Enzyme này có khả năng hỗ trợ điều trị các bệnh ở
người, chẳng hạn như viêm xương khớp và viêm khớp dạng thấp cũng như các
trường hợp loét giác mạc, chứng loãng xương, viêm nha chu, tăng trưởng khối u và
di căn.
Một số dẫn xuất axit hydroxamic cũng đã được nghiên cứu là tác nhân chống
suy giảm miễn dịch ở người (kháng HIV), vì tác dụng của chúng được thể hiện thông
qua sự kết hợp với thuốc AZT và DDI [50]. Siderophores (các axit hy-droxamic
trọng lượng phân tử tự nhiên hoặc tổng hợp), chẳng hạn như desfetioxamine,
ferrichromes,.. cũng đã được sử dụng làm thuốc chống sốt rét do tác động của chúng

lên sự tăng trưởng Plasmodium falciparum [65]. Axit acetohydroxamic đã được
khuyến cáo để điều trị ureaplasma và thiếu máu [11], [29]. Hơn nữa một số axit
hydroxit béo đã được nghiên cứu như là chất ức chế cyclooxygenase và 5lipoxygenase với hoạt tính chống viêm mạnh [24].
Penicillin acylases enzyme có bản chất là amidase [23], đóng vai trò quan
trọng trong thủy phân từ nhân thơm từ N-amide thay thế hình thành hợp chất chính
trong sản xuất penicillin. Ngoài ra, một số N-Amide thay thế khác như
polyacrylamide, sản phẩm thủy phân của amidase được sử dụng rộng rãi trong sản
xuất thực phẩm dinh dưỡng và một số thực phẩm chức năng khác.... [7]. Hợp chất
này cũng đóng vai trò chủ đạo trong sản xuất polyme và Anandamide hydrolases,
một hợp chất nội sinh kích hoạt các cơ quan tế bào thụ cảm (CB1, CB2…) sử dụng
cho bệnh nhân Alzheimer [12].
1.3.3. Ứng dụng của amidase trong công nghiệp và xử lý chất thải chứa amide
aliphatic
Ngoài các ứng dụng y tế trên, một số dẫn xuất axit hydroxit (đặc biệt là các
axit hydroxit chưa bão hòa polyme và các axit hydroxit chuỗi trung bình hoặc chuỗi
dài) từ việc thủy phân acrylamide, cũng đã được nghiên cứu rộng rãi trong xử lý
nước thải và nghiên cứu công nghệ hạt nhân như một cách để loại bỏ các ion kim


15
loại gây ô nhiễm [26], [41]. Cụ thể là, các sản phẩm phản ứng cuối cùng (axit
hydroxamic) sau phản ứng thủy phân của amidase với acrylamide được biết là có khả
năng chống sự tạo phức chelate giữa các hợp chất hữu cơ dẫn xuất từ amino
polycacboxylic axit với các ion kim loại [11]. Một số trong số đó (đặc biệt là các dẫn
xuất axit amin-aminohydroxamic) là các chất ức chế mạnh hoạt động các chất nhóm
hỗn tạp các kim loại [18].
Về công nghiệp, polyacrylamide, sản phẩm thủy phân của amidase được sử
dụng rộng rãi trong sản xuất polyme [6], [12], thủy phân donoyl ethanolamin - một
hợp chất được sử dụng làm nguyên liệu trong sản xuất chất tẩy rửa, chất nhũ hoá,
chất đánh bóng, dược phẩm,... [29], [41].

1.4. Đặc điểm chủng vi khuẩn E. coli sử dụng trong tạo dòng và biểu hiện
Từ đầu thập niên 1990 đến nay, hầu hết người ta sử dụng E. coli làm tế bào
chủ để sản xuất các protein tái tổ hợp do chúng có tốc độ tăng trưởng nhanh với mật
độ tế bào cao trên cơ chất, không đắt tiền cũng như các đặc điểm di truyền đã được
nghiên cứu đầy đủ [9], [51]. Đồng thời, nhiều chủng E. coli khác nhau đã được
nghiên cứu để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp, bằng các vector khác nhau.
Vì vậy, khi lập phương án sản xuất protein tái tổ hợp trong E. coli, cần phải lựa chọn
hệ thống vector tạo dòng, biểu hiện và chủng E. coli thích hợp với protein mục tiêu.
1.4.1. E. coli DH5α JM109
Vi khuẩn E. coli DH5α, JM109 [recA1, supE44, endA1, hsdR17, gyrA96,
relA1, thi, Δ(lac-proAB), F′ [traD36, proAB+ , laqI qZΔM15] thường được dùng cho
việc biến nạp các vector M13, pGEM® và Bacteriophage, nhằm lưu trữ và sao chép
các đoạn gen kích thước đa dạng. Dòng vi khuẩn này có khả năng tiếp nhận gen và
phát triển tốt cùng với khả năng biểu hiện hiệu quả. Bởi vì alen recA1- thiếu hệ
thống ức chế phiên mã nên rất thích hợp cho việc biến nạp và lưu trữ do ít xuất hiện
sự sao chép làm sai khung đọc của ADN nguyên bản hoặc ADN tái tổ hợp, ngoài ra,
đột biến endonuclease A– cũng giúp cải thiện năng suất và chất lượng của ADN
plasmid được phân lập.
Tuy β-galactosidase hoạt động thiếu hiệu quả do thiếu thông tin di truyền từ
episome của gen lacZ, có thể chúng có thể được bổ sung bằng cách thêm một đoạn mã
hóa chức năng α-peptide qua việc biến nạp một pGEM®-Z hoặc pGEM®-Zf Vector. Nếu
sự bổ sung không xảy ra, các khuẩn lạc có màu trắng. Điểm này một phần gây nên sự