Khảo sát hoạt tính ức chế nảy mầm của chitosan được xử lý cắt mạch với bào tử nấm collectotrichum gloeosporioides

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ NẢY MẦM
CỦA CHITOSAN ĐƯỢC XỬ LÝ CẮT MẠCH
VỚI BÀO TỬ NẤM Collectotrichum
gloeosporioides
Giảng viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện

Th.S Đoàn Thị Tám

Nguyễn Thành Trọng

Th.S Đỗ Thị Hoàng Tuyến

MSSV: 2008140342
Lớp: 05DHSH2

Tp Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ NẢY MẦM
CỦA CHITOSAN ĐƯỢC XỬ LÝ CẮT MẠCH
VỚI BÀO TỬ NẤM Collectotrichum
gloeosporioides

Giảng viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện

Th.S Đoàn Thị Tám

Nguyễn Thành Trọng

Th.S Đỗ Thị Hoàng Tuyến

MSSV: 2008140342
Lớp: 05DHSH2

Tp Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2018

2


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu và quý
thầy cô Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP. HCM, đặc biệt là quý thầy cô khoa
Công nghệ sinh học, những người đã trực tiếp truyền đạt những kiến thức quý giá cho em
trong suốt thời gian học tập ở trường.
Em xin chân thành cảm ơn Trung Tâm Công nghệ sinh học TP.HCM đã hỗ trợ

trang thiết bị, máy móc giúp em hoàn thành tốt trong suốt thời gian thực tập.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Đoàn Thị Tám, Ths. Đỗ Ngọc Anh Huy và chị
Lâm Thị Ngọc Hiền, anh chị đã trực tiếp hướng dẫn, hỗ trợ em rất nhiều trong suốt quá
trình thực tập. Em đã học được rất nhiều kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm nghiên cứu
khoa học cũng như những kiến thức trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn anh chị Tổ Công nghệ Sinh học Thực phẩm đã luôn
quan tâm giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn cô Ths. Đỗ Thị Hoàng Tuyến luôn quan tâm và giúp đỡ
em trong quá trình thực hiện đề tài. Thầy cũng là người đã dạy cho em nhiều kiến thức và
kinh nghiệm trong thời gian học tập ở trường.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn bè
em, đã quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn trong quá trình thực tập và hoàn thành báo cáo
thật tốt.
Trong quá trình hoàn thiện báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót nhất định mà
em chưa thể khắc phục nên em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để đề tài
này được hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2018
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thành Trọng

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng báo cáo thực tập này là do chính tôi thực hiện. Các số liệu thu thập
và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên
cứu khoa học nào.
Ngày …. tháng …. năm 2018
Sinh viên thực hiện

ii


Mục lục
Chương 1: LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2
1.3. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................... 2
1.4. Kết quả thực tập ........................................................................................................ 2
Chương 2: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ............................................................................................ 3
2.1. Giới thiệu chung: ....................................................................................................... 3
2.2. Chức năng – nhiệm vụ: ............................................................................................. 3
2.3. Định hướng nghiên cứu: ........................................................................................... 3
2.4. Sơ đồ tổ chức: ........................................................................................................... 5
2.5. Cơ cấu tổ chức: ......................................................................................................... 5
Chương 3: TỔNG QUAN ................................................................................................... 7
3.1. Tổng quan về chitin và chitosan ............................................................................... 7
3.1.1. Giới thiệu về chitin và chitosan. ......................................................................... 7
3.1.2. Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan:................................................................ 8
3.2. Tổng quan về xoài và bệnh thán thư do nấm Collectotrichum gloeosporioides gây
ra ..................................................................................................................................... 12
3.2.1. Tổng quan về xoài: ........................................................................................... 12
3.2.2. Tổng quan về nấm Collectotrichum gloeosporioides. ...................................... 12
3.2.3. Bệnh thán thư hại xoài do nấm C. gloeosporioides và điều kiện phát sinh, phát
triển. ............................................................................................................................ 14
Chương 4: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................... 15
4.1. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................. 15
4.1.1 Vật liệu............................................................................................................... 15

4.1.2. Dụng cụ ............................................................................................................. 15
4.1.3. Hóa chất ............................................................................................................ 15
4.1.4. Thiết bị .............................................................................................................. 15
4.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................... 16
4.2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu ............................................................................... 16
4.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ......................................................................... 16
4.3 Kết quả .................................................................................................................. 20
iii


4.4 Kết luận và kiến nghị ............................................................................................ 24
Phần 5: Tài liệu tham khảo ................................................................................................ 26
5.1 Tài liệu tiếng Việt..................................................................................................... 26
5.2

Tài liệu tiếng Anh. ............................................................................................... 27

PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 28

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CTS: Chitosan
KLPT: Khối lượng phân tử
cs: Cộng sự
Da: Dalton
CTS550: Chitosan có khối lượng phân tử trung bình ~ 550 kDa
CTS250: Chitosan có khối lượng phân tử trung bình ~ 250 kDa
CTS100: Chitosan có khối lượng phân tử trung bình ~ 100 kDa

CTS50: Chitosan có khối lượng phân tử trung bình ~ 50 kDa
CTS20: Chitosan có khối lượng phân tử trung bình ~ 20 kDa
PTNT: Phát triển nông thôn
UBND: Ủy ban Nhân dân
TP.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh
USD: Đô la Mỹ
h: Giờ

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2. 1 Một số thông số đặc trưng của chitin và CTS (Võ Quang Mai và cs, 2015) ...... 9
Bảng 4. 1. Bố trí các thí nghiệm kiểm tra khả năng kháng nảy mầm của CTS có các KLPT
khác nhau. .......................................................................................................................... 19
Bảng 4. 2. Nồng độ CTS chiếu xạ thích hợp để ức chế sự phát triển của bào tử C.
gloeosporiodes. .................................................................................................................. 20
Bảng 4. 3. Tỷ lệ bào tử bị ức chế với CTS có KLPT khác nhau ....................................... 21
Bảng 4. 4. Tỷ lệ bào tử bị ức chế theo nồng độ khác nhau của CTS250 .......................... 24

vi


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2. 1. Sơ đồ mặt bằng Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM. ............................. 5
Hình 2. 2. Cơ cấu tổ chức của Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM ....................... 6
Hình 3. 1. Chitosan dạng bột ............................................................................................... 7
Hình 3. 2. Cấu tạo phân tử chitin ......................................................................................... 8
Hình 3. 3. Cấu tạo phân tử chitosan .................................................................................... 8
Hình 3. 4. Cây xoài ............................................................................................................ 12

Hình 3. 5. Hình dạng khuẩn ty và bào tử nấm C. gloeosporioides ................................... 13
Hình 3. 6. Bệnh thán thư hại xoài ...................................................................................... 14
Hình 4. 1. Các mẫu CTS .................................................................................................... 15
Hình 4. 2. Sơ đồ nội dung nghiên cứu ............................................................................... 16
Hình 4. 3. Cách thu bào tử ................................................................................................. 17
Hình 4. 4. Bào tử C. Gloeosporioides và kích thước trên buồng đếm hồng cầu............... 18
Hình 4. 5. Hình dạng bào tử C. Gloeosporioides đã nảy mầm ......................................... 20
Hình 4. 6. Tỷ lệ tăng trưởng của bào tử C. gloeosporiodes sau 2h, 4h và 6h ................... 21
Hình 4. 7. CTS chiếu xạ có KLPT khác nhau ức chế sự tăng trưởng bào tử của.............. 22
Hình 4. 8. CTS250 ở nồng độ khác nhau ức chế sự tăng trưởng bào tử của ..................... 23

vii


Chương 1: LỜI MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, vấn đề bảo quản nông sản nói chung và bảo quản trái cây nói riêng rất được
chú trọng trong nông nghiệp ở Việt Nam. Trong đó, việc bảo quản bằng phương pháp
sinh học nhằm an toàn cho người sử dụng, tăng thời gian bảo quản, giữ nguyên giá trị
dinh dưỡng và cảm quan cho trái cây. Xoài cũng là một loại trái cây có tiềm năng lớn để
xuất khẩu ra nước ngoài do nước ta đứng thứ 13 về sản xuất xoài trên thế giới với diện
tích trồng xoài của cả nước khoảng 87 000 ha và sản lượng hơn 969 000 tấn/năm vào năm
2013 (Trịnh Đức Trì, Võ Thị Thanh Lộc, 2015). Tuy nhiên, số lượng xoài xuất khẩu còn
hạn chế và nằm ngoài top 10 nước xuất khẩu xoài (Đại sứ quán Việt Nam tại Úc, Thương
vụ Việt Nam tại Úc, 2016). Ngoài việc thiếu nghiên cứu về thị trường và giá bán xoài
không ổn định, nguyên nhân chủ yếu là biến đổi khí hậu và sâu bệnh gây hại trên xoài làm
ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng xoài (Trịnh Đức Trì, Võ Thị Thanh Lộc, 2015).
Ngoài ra, bệnh thối trái sau thu hoạch cũng là nguyên nhân, một trong những bệnh thường
gặp là bệnh thán thư do nấm Collectotrichum gloeosporioides gây ra, trong quá trình bảo
quản bào tử nấm nảy mầm gây bệnh và làm xoài bị hư hỏng, vết bệnh trên quả lúc đầu chỉ

là những chấm nhỏ màu đen, sau đó lan rộng thành vết bệnh có màu đen nâu hình góc
cạnh hơi lõm xuống, thường xuất hiện nhiều ở má và đáy của quả (Vũ Triệu Mân, 2007).
Hiện nay, một số phương pháp được sử dụng để đề phòng nấm gây hại trên xoài là sử
dụng nước nóng (phương pháp vật lý), các chất như benzimidazole, prochloraz và imazilil
(phương pháp hóa học), Bacillus subtilis, nấm men (phương pháp sinh học) và các hợp
chất từ thực vật (cao thực vật, tinh dầu) (Alemu và cs, 2014). Tuy nhiên, các phương pháp
trên còn nhiều nhược điểm như khả năng kháng nấm chưa hiệu quả, gây ảnh hưởng đến
sức khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường. Do đó, việc sử dụng các hợp chất tự
nhiên đang được quan tâm, trong đó phổ biến nhất là chitosan (CTS). CTS là một loại
polymer carbohydrate có nguồn gốc từ chitin được tìm thấy trong một loạt các nguồn
nguyên liệu tự nhiên như loài giáp xác, nấm, côn trùng và một số loài chân khớp (Abbasi
và cs, 2009). Thông thường CTS có khối lượng phân tử lớn gây khó khăn trong quá trình
hòa tan tạo màn và khả năng kháng nấm không cao (Zhao và cs, 2003) vì vậy để tạo CTS
khối lượng phân tử thấp có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm cắt mạch chitosan,
phương pháp hóa học được sử dụng như NaNO2, HCl... nhưng hiệu suất mang lại thấp và
gây ô nhiễm môi trường (Bùi Phước Phúc và cs, 2014), phương pháp sinh học sử dụng
enzym chitosanase cho sản phẩm có độ tinh khiết không cao (Trần Thái Hòa và cs, 2013;
Bùi Xuân Đông, 2013). Trong đó, phương pháp nổi bật nhất là chiếu xạ cho thấy hiệu
suất cắt mạch và sản phẩm có độ tinh khiết cao.
Để tìm loại chitosan sau chiếu xạ có khả năng kháng nảy mầm với bào tử nấm C.
spoeosporioides đề tài: “Khảo sát khả năng nảy mầm của bào tử nấm Collectotrichum
gloeosporioides trên chitosan cắt mạch” được tiến hành.
1


1.2. Mục đích nghiên cứu
Khảo sát loại CTS sau chiếu xạ và nồng độ tác dụng gây ức chế nảy mầm với bào tử
nấm C. gloeosporioides để tìm ra loại CTS giúp ức chế bào tử nấm C. gloeosporioides
nảy mầm tốt nhất.

1.3. Phạm vi nghiên cứu
 Nơi thực hiện đề tài: Tổ Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm, Trung tâm Công nghệ
Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, số 2374 Quốc lộ 1, phường Trung Mỹ Tây, quận
12, TP. Hồ Chí Minh.
 Thời gian thực hiện đề tài:từ tháng 11/2017 - 3/2018

1.4. Kết quả thực tập
CTS có khối lượng phân tử 250 kDaltons kháng nảy mầm với bào tử tốt nhất ở nồng
độ 0,01%. Lựa chọn loại chitosan này để tiến hành thí nghiệm tiếp theo nhằm khảo sát
nồng độ thích hợp nhất để kháng nảy mầm của bào tử C. gloeosporioides (nồng độ
0,005%, 0,01%, 0,015% và 0,02% ) với mục đích tìm được nồng độ thích hợp để kháng
nảy mầm tốt nhất và tiết kiệm được lượng chitosan, kết quả ở mẫu 0,01% vẫn là tốt nhất.

2


Chương 2: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ
SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
2.1. Giới thiệu chung:
Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh (HCMBIOTECH) được
thành lập theo Quyết định số 161/2004/QĐ-UB ngày 02 tháng 07 năm 2004 của Ủy ban
Nhân dân TP. Hồ Chí Minh. Trung tâm chính thức đi vào hoạt động vào tháng 01/2005.
Cơ quan chủ quản của Trung tâm là Sở Nông nghiệp và PTNT Thành phố Hồ Chí Minh.
Trụ sở Trung tâm được xây dựng trên khuôn viên rộng 23 ha tại số 2374 Quốc lộ 1,
phường Trung Mỹ Tây, quận 12, TP. Hồ Chí Minh.

2.2. Chức năng – nhiệm vụ:
Nghiên cứu, ứng dụng, chuyển giao công nghệ sinh học phục vụ trong lĩnh vực nông
nghiệp, xử lý môi trường, công nghiệp thực phẩm và y dược học.
Tiếp nhận, triển khai các quy trình, kỹ thuật hiện đại về Công nghệ sinh học (công

nghệ gene, công nghệ tế bào động thực vật, công nghệ vi sinh, công nghệ lên men...) phục
vụ sản xuất, bảo quản, chế biến các sản phẩm nông nghiệp và xử lý môi trường.
Đào tạo huấn luyện các kỹ thuật viên về Công nghệ sinh học, sản xuất, thương mại
hóa các sản phẩm Công nghệ Sinh học

2.3. Định hướng nghiên cứu:
Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh là một trung tâm nghiên cứu
và ứng dụng công nghệ sinh học đa lĩnh vực:
 Công nghệ Sinh học phục vụ nông nghiệp:
- Công nghệ Sinh học thực vật:
Chọn tạo giống cây trồng biến đổi di truyền có các đặc tính và phẩm chất tốt phục
vụ sản xuất nông nghiệp.
Nghiên cứu sinh lý bệnh thực vật, phát triển kit chẩn đoán bệnh ở cây trồng.
3


Nghiên cứu nuôi cấy mô cây dược liệu thu nhận các hoạt chất thứ cấp.
- Công nghệ Sinh học thủy sản:
Phát triển vắc-xin phòng ngừa các bệnh nghiêm trọng ở thủy sản.
Phát triển các bộ kit phát hiện bệnh, các chế phẩm sinh học - probiotic phục vụ
nuôi trồng thủy sản.
Cải thiện chất lượng con giống thủy sản bằng công nghệ gene.
- Công nghệ sinh học tế bào động vật:
Phát triển và ứng dụng công nghệ hỗ trợ sinh sản kết hợp kỹ thuật di truyền để tạo
động vật chuyển gene phục vụ nghiên cứu hay tạo giống vật nuôi mới.
 Công nghệ sinh học phục vụ môi trường và năng lượng sinh học:
Phát triển các chế phẩm sinh học phòng trừ dịch bệnh, kích thích tăng trưởng cho
cây trồng.
Tuyển chọn, cải biến các chủng vi sinh vật bằng công nghệ gene để xử lý chất thải
gây ô nhiễm môi trường.

Nghiên cứu quy trình sản xuất cồn sinh học và các dạng nhiên liệu sinh học khác từ
nguồn phế phụ liệu nông nghiệp.
 Công nghệ sinh học phục vụ y dược:
Nghiên cứu, thử nghiệm và sản xuất các hoạt chất tự nhiên hay các protein tái tổ hợp
có dược tính ứng dụng trong điều trị bệnh.
Nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh, các phương pháp chẩn đoán và điều trị nhiều bệnh
khác nhau ở người và vật nuôi.
Phát triển vắc-xin cho người và vật nuôi phòng ngừa các bệnh phổ biến.
Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc trong y học tái tạo.
4


2.4. Sơ đồ tổ chức:
Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM sẽ được xây dựng trên khu đất 23 ha tại
2374 Quốc lộ 1A, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, Quận 12 từ nguồn vốn ngân sách
của TP.HCM, dự kiến đầu tư khoảng 100 triệu USD, bao gồm các phân khu chức năng
như sau:

Hình 2. 1. Sơ đồ mặt bằng Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM.

1. Khu Hành chính Tổng hợp.

7. Khu nuôi động vật thí nghiệm.

2. Khu Nghiên cứu và sản xuất thử.

8. Khu Đào tạo và Hợp tác quốc tế.

3. Khu nhà lưới, nhà kính.

9. Vườn Sinh vật cảnh.

4. Khu thí nghiệm thực vật.

10, Khu nhà khách và công vụ

5. Khu Phân tích và xét nghiệm.

11. Khu thể thao.

6. Khu sản xuất chế phẩm sinh học.

12. Khu Xử lý chất thải.

2.5. Cơ cấu tổ chức:
Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM hiện có tất cả 13 phòng ban và có cơ cấu tổ
chức chặt chẽ.

5


Hình 2. 2. Cơ cấu tổ chức của Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM

CÁC PHÒNG BAN CỦA TRUNG TÂM
1. Khu Hành chính Tổng hợp.

7. Khu nuôi động vật thí nghiệm.

2. Khu Nghiên cứu và sản xuất thử.

8. Khu Đào tạo và Hợp tác quốc tế.

3. Khu nhà lưới, nhà kính.

9. Vườn Sinh vật cảnh.

4. Khu thí nghiệm thực vật.

10, Khu nhà khách và công vụ

5. Khu Phân tích và xét nghiệm.

11. Khu thể thao.

6. Khu sản xuất chế phẩm sinh học.

12. Khu Xử lý chất thải.

Được sự quan tâm chỉ đạo sâu sát và ưu tiên đầu tư của UBND Thành phố, bằng khát
vọng vươn lên và chiến lược phát triển bền vững, Trung tâm Công nghệ Sinh học
Tp.HCM phấn đấu trở thành một trung tâm nghiên cứu và ứng dụng CNSH hàng đầu Việt
Nam, đạt trình độ tiên tiến trong khu vực và trên thế giới.

6


Chương 3: TỔNG QUAN
3.1. Tổng quan về chitin và chitosan
3.1.1. Giới thiệu về chitin và chitosan.
Năm 1811, chitin được phát hiện trong nấm, có tên khoa học là poly-(2-4)-2acetamido-2-desoxy- -D-glucose, là một polysaccaride phổ biến trong tự nhiên chỉ sau

cellulose, tồn tại trong cả thực vật và động vật như vỏ giáp xác, côn trùng, nấm và các
loại tảo. CTS là dẫn xuất của chitin và được sản xuất bằng cách deacetyl hóa chitin trong
môi trường kiềm (Rinaudo, 2006; Đặng Xuân Dự, 2015). Năm 1859, CTS được khám phá
bởi Roughet và được đặt tên bởi nhà khoa học người Đức Hoppe Seyler (1894) và CTS là
polymer hữu cơ tự nhiên duy nhất mang điện tích dương do có các amino tích điện dương
(Nguyễn Thị Thùy Trang, 2011).
CTS an toàn với người và động vật (No và cs, 2007). Trong những năm gần đây các
nhà khoa học Việt Nam bắt đầu quan tâm nhiều đến các polymer sinh học và CTS là một
trong những polymer được quan tâm nhiều nhất, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau như y tế, bảo vệ môi trường, công nghiệp in (Bùi Duy Du và cs, 2008; Đặng
Xuân Dự, 2015)... Hoạt tính kháng khuẩn và khả năng tạo màng của CTS giúp nó trở
thành một trong những lựa chọn của ngành bảo quản thực phẩm và trái cây (No và cs,
2007).

Hình 3. 1. Chitosan dạng bột

7


3.1.2. Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan:

Hình 3. 2. Cấu tạo phân tử chitin (Nguồn: Đặng Xuân Dự, 2015)

.
Hình 3. 3. Cấu tạo phân tử chitosan (Nguồn: Lê Nguyễn Đoan Duy và cs, 2014)

Công thức phân tử CTS: (C6H11O4)n.
Khối lượng phân tử trung bình: Mn = (161,157)n
Thành phần: 44,72% Carbon, 6,88% Hydro, 39,71% Oxi và 8,69% Nito.
CTS là polymer sinh học có KLPT lớn, là sản phẩm deacetyl hóa của chitin, trong

đó nhóm -NH2 thay thế nhóm -NHCOCH3 ở vị trí carbon thứ 2 (C2). CTS được cấu
tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glicoside, do
vậy CTS có thể gọi là poly β -(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozơ hoặc là poly β-(1-4)-D
glucozamin. Trên thực tế cấu trúc của CTS vẫn còn tồn tại những gốc acetyl đan xen do
sự deacetyl hóa không hoàn toàn (Đặng Xuân Dự, 2015).

8


Bảng 2. 1 Một số thông số đặc trưng của chitin và CTS (Võ Quang Mai và cs, 2015)
Thông số

Chitin

Chitosan

Công thức

(C8H13NO5)n

(C6H11NO4)n

KLPT của một mắc xích

203

161

Hàm lượng nito lý thuyết

6,7%

8,7%

Hảm lượng nito thực tế

6 - 7%

7,0 - 8,4%

KLPT trung bình

3 - 5 x 105

1 - 3 x 105

Mức độ deacetyl hóa

10 - 15%

80 - 90%

Độ ẩm

< 10%

< 10%

Độ tro ở 900OC

< 2%

< 1%

Hàm lượng protein

< 0,5%

< 0,3%

3.1.3. Tính chất của CTS.
 Độ deacetyl hóa của CTS
Độ deacetyl hóa là một trong những thông số quan trọng của CTS. Về mặt khối
lượng, độ deacetyl hóa của CTS được tính dựa trên tỷ lệ giữa nhóm -NH2 với tổng số
nhóm -NH2 và -NHCOCH3. Độ deacetyl hóa của CTS rất quan trọng trong phân biệt
chitin và CTS, nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của CTS. Độ
deacetyl hóa của CTS vào khoảng 56 - 99% (trung bình là 80%) phụ thuộc vào nguồn thu
nhận và phương pháp sử dụng, độ deacetyl của CTS thường lớn hơn 50% (Trần Thái Hòa
và cs, 2013; Võ Quang Mai và cs, 2015). Có nhiều phương pháp để xác định độ deacetyl
hóa của CTS bao gồm ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, dùng
quang phổ UV,... Tuy nhiên phương pháp được sử dụng nhiều nhất hiện nay là UV
(Ultraviolet spectroscopy), NMR (Nuclear Magnetic Resonance), IR (infrared spectra)
(Rinaudo, 2006; Đặng Xuân Dự, 2015). Phương pháp sử dụng phổ biến là dùng quang
phổ UV vì khá đơn giản, tiện lợi và có độ chính xác cao (Đặng Xuân Dự, 2015).

 Tính chất vật lý của CTS
9


Là một chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng bột có màu trắng ngà, ở dạng vảy có màu trắng

trong hay màu hơi vàng. Chitosan có nhiệt độ nóng chảy 309 - 3110C, có khả năng tạo
màng và có độ nhớt cao (Nguyễn Thị Nga, 2013).
CTS là một polycationic mang điện tích dương (pH < 6,5) nên chitosan có
khả năng bám dính trên các bề mặt có điện tích âm như protein, amino
polysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid.
CTS có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ sinh học,
có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể (Nguyễn Thị Nga, 2013).
CTS là chất có độ nhớt khá cao, độ nhớt của CTS phụ thuộc vào nhiều yếu tố như
KLPT, độ deacetyl hóa, pH, nồng độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ. Độ
nhớt là một yếu tố quan trọng cần được xác định nếu muốn tính KLPT của CTS. Có nhiều
phương pháp để xác định KLPT của CTS như đo độ nhớt, sắc ký gel thấm qua... nhưng
phương pháp xác định KLPT CTS đơn giản nhất là đo độ nhớt. Phương pháp đo độ nhớt
cần nhiều bước tính toán và nhiều giá trị hằng số liên quan đến độ deacetyl hóa nên có
nhiều sai số và độ chính xác không cao (Đặng Xuân Dự, 2015).
 Tính chất hóa học
Phân tử CTS có chứa các nhóm chức OH, NHCOCH3 trong các mắt xích N –acetyl
– D - glucosamin và nhóm – OH, nhóm NH2 trong các mắt xích glucosamin nên vừa là
amin vừa là amide. Các monomer được nối với nhau bởi các liên kết β – 1,4 - glucoside.
CTS tác dụng với acid đậm đặc tạo muối khó tan, tác dụng với H2SO4 cho phản ứng màu
tím, tham gia phản ứng dễ dàng hơn chitin (Lê Nguyễn Đoan Duy và cs, 2014).
Một số phản ứng của CTS:
- Phản ứng nitrate hoá: CTS có khả năng phản ứng với HNO3 loãng hoặc hỗn
hợp acid acetic loãng: anhydric acetic: acid nitric nguyên chất ở nhiệt độ thấp hơn
5oC theo tỉ lệ 1:1:3. Sản phẩm tạo thành là muối acid của CTS nitrate.
- Phản ứng phosphate hoá: CTS tác dụng với hỗn hợp pyridine: phosphorus
axychloride theo tỉ lệ 3:1. Sản phẩm thu được có hàm lựợng P là 24%.
- Phản ứng sulphate hoá:
10

Chitosan-NH2 + O3S-O-CH=N(CH3)2 Chitosan-NH-SO2OH + HCON(CH3)2.
- Phản ứng alkyl hoá khử: Phản ứng này dùng để điều chế các dẫn xuất Nalkyl của
CTS.
 Hoạt tính kháng nấm:
CTS chỉ ức chế sự phát triển của nấm và không tiêu diệt hoàn toàn nấm, nó có tác
dụng ức chế hiệu quả sự nảy mầm của bào tử, khả năng kéo dài và lan rộng của sợi nấm.
Cơ chế kháng nấm của chitosan liên quan đến việc các phân tử CTS tác động vào sự hình
thành vách tế bào từ đó can thiệp trực tiếp đến sự phát triển của sợi nấm (Goy và cs,
2009). Sự tương tác trực tiếp của nhóm NH3+ có trong cấu trúc chitosan lên bề mặt vách
tế bào nấm hình thành các phức polyelectrolyte giữa CTS với nhóm điện tích âm trên bề
mặt tế bào gây rò rỉ, thay đổi vật chất bên trong tế bào (tính thấm thay đổi, co rút nguyên
sinh chất) (Lê Thanh Long và cs, 2005).
CTS có khối lượng phân tử thấp và oligochitosan có chứa các nhóm amino tự do
trong cấu trúc của chúng. Các nhóm amino này thể hiện vai trò quan trọng trong hoạt tính
kháng nấm do có thể làm thay đổi đặc tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và nấm từ đó
hạn chế sự tiếp nhận khoáng chất hoặc gây tổn thương các thành phần tế bào. Một cơ chế
khác giải thích về hoạt tính kháng khuẩn của CTS có khối lượng phân tử thấp là sự ngăn
chặn việc sao chép RNA do sự hấp phụ của CTS khối lượng phân tử thấp thâm nhập vào
DNA của vi khuẩn. Ngoài ra, hoạt tính tạo chelat của oligochitosan cũng đã hấp thụ các
kim loại, yếu tố vi lượng hoặc các chất dinh dưỡng nên giới hạn sự tăng trưởng của vi
khuẩn (Kim và cs, 2003).

 Ứng Dụng:
- Trong nông nghiệp:CTS có tính không độc nên được sử dụng như màng bảo quản
một số loại trái cây: xoài, cam, vú sữa... bảo quản quả, hạt giống mang hiệu quả
cao, phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng, dùng làm thuốc kích thích sinh trưởng cho
thực vật (Nguyễn Thị Trâm Châu, 2013).
11

- Trong y dược: CTS có tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu, điều
trị viêm loét dạ dày và ứng dụng trong điều trị bỏng, được ứng dụng trong bào chế
thuốc như làm chất mang dược chất hay hệ vận tải thuốc vào cơ thể, sản xuất
Glucosamin trong điều trị xương khớp, điều trị viêm loét dạ dày (Zhang và cs,
2003).
- Trong thực phẩm: CTS còn ứng dụng làm trong nước hoa quả, thu hồi protein,
phân tách rượu - nước và làm màng bao trong bảo quản hoa quả. Màng CTS có khả
năng cải thiện khả năng lưu trữ của các thực phẩm và trái cây dễ hư hỏng khi bảo
quản, bằng cách thay đổi khí quyển bên trong cũng như hạn chế sự mất nước (No
và cs, 2007).
- Trong công nghiệp: CTS làm tăng tính bền hoa vải, tăng độ bền giấy, sản xuất sơn
chống thấm, chống mốc… (Bùi Duy Du và cs, 2008).

3.2. Tổng quan về xoài và bệnh thán thư do nấm Collectotrichum gloeosporioides
gây ra
3.2.1. Tổng quan về xoài:
Phân loại (Nguyễn Văn Luật, 2009)
Giới: Plantae
Bộ: Sapindales
Họ: Anacardiaceae
Chi: Mangifera
Loài: Mangifera indica L.
Nguồn gốc và phân bố
Xoài có nguồn gốc ở Nam Á và Đông
Nam Á, từ đó nó đã được phân bố trên
toànthế giới và trở thành một trong những

Hình 3. 4. Cây xoài (Nguồn: cayantrai.org)

loại trái cây được trồng hầu hết ở vùng nhiệt

đới.
3.2.2. Tổng quan về nấm Collectotrichum gloeosporioides.

12


 Phân loại (Gautam, 2014)
Giới:

Fungi

Ngành:

Sordariomycetes

Bộ:

Phyllachorales

Họ:

Phyllachoraleceae

Chi:

Collectitrichum

Loài:

Collectotrichum gloeosporioides

Hình 3. 5. Hình dạng khuẩn ty và bào tử nấm C.
gloeosporioides (Nguồn: iasvn.org)

 Nguồn gốc và phân bố:
- Phân loại: Giống Collectotrichum lần đầu tiên đựợc nghiên cứu bởi Corda (1837),
lúc đó đựợc gọi là Colletothrichum, sau đó cũng chính tác giả đã đổi lại tên gọi
thành Collectotrichum, chúng có những đặc điểm rất khác nhau về phạm vi ký chủ,
đặc điểm hình thái và đặc tính gây bệnh... Nấm C. gloeosporioides là loài có đặc
điểm bào tử không đồng nhất trên môi trường nuôi cấy, chính vì vậy mà việc phân
loại chúng rất khó khăn vì không thể chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái (Vũ Triệu
Mân, 2007).
- Phân bố: nấm Colletotrichum gloeosporioides có mặt ở hầu hết các nơi trên thế
giới đặc biệt phổ biến ở vùng nhiệt đới và vùng cận nhiệt đới, nấm có thể phát triển
ở nhiệt độ 40C nhưng nhiệt độ tối thích là từ 25 - 290C (Vũ Triệu Mân, 2007).
- Trên môi trường PDA, nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm. Quả thể mở
hình thành trên các bộ phận khác nhau của cây trồng, mọc riêng rẽ hoặc từng đám
hình cầu hay hình quả lê, kích thước 85 - 350 µm có 1 - 4 vách ngăn. Bên trong
quả thể có các túi bào tử (thường có 8 túi bào tử) nằm rải rác, xen kẽ với các sợi
nấm vô tính, bào tử túi hình trụ hoặc hình chuỳ, kích thước 35 - 80 x 8 - 14 µm.
Bào tử phân sinh hình trụ với đầu hơi tù, đỉnh tròn, cuống hẹp trong suốt, không có
vách ngăn, kích thước 9 – 24 x 3- 6 µm (Vũ Triệu Mân, 2007).

13


3.2.3. Bệnh thán thư hại xoài do nấm C. gloeosporioides và điều kiện phát sinh, phát
triển.
Bệnh
do

nấm
C.
gloeosporioides (bệnh thán thư) xuất
hiện và gây hại ở tất cả các bộ phận
của cây trên mặt đất, chúng chủ yếu
gây hại phổ biến ở lá non, hoa và
quả làm ảnh hưởng rất lớn đến năng
suất và chất lượng trái, nấm gây hại
trên cành non, lá, hoa và quả làm
thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất
của xoài. Cơ chế gây bệnh: C.
gloeosporioides là loại nấm hoại
sinh phổ biến xâm nhập chủ yếu trên Hình 3. 6. Bệnh thán thư hại xoài (Nguồn: nhanongxanh.vn)
các mô chết và mô bị thương, tại các
vết thương, các sợi nấm chiếm vị trí của các lớp tế bào vỏ, sau đó xâm nhập vào bên trong
trái (Brown và Burns, 1998).
Triệu chứng: triệu chứng và dấu hiệu của bệnh thán thư có thể thay đổi theo ký chủ,
bộ phận cây bị tấn công và điều kiện ngoại cảnh. Trên cây xoài bệnh làm cho hoa bị tàn
rụi, thối trái và đốm lá trên vết đốm xuất hiện các ổ bào tử màu gạch non hoặc đen còn
trên quả, bào tử nấm nảy mầm và phát triển ở các vết thương của trái sau đó vết bệnh
phát triển từ những chấm nhỏ màu đen rồi phát triển thành vết bệnh lớn ở má và đáy của
quả (Vũ Triệu Mân, 2007).

14


Chương 4: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
4.1. Vật liệu thí nghiệm
4.1.1 Vật liệu
Vật liệu: Chitosan được xử lý cắt mạch và nấm Collectotrichum gloeosporioides

được cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh học.

CTS550

CTS250

CTS50

CTS20

CTS100

Hình 4. 1. Các mẫu CTS

4.1.2. Dụng cụ
Dụng cụ được sử dụng để tiến hành thí nghiệm gồm: Đĩa petri thủy tinh, ống đong,
ống nghiệm, chai Duran, buồng đếm hồng cầu, micropipet 10 - 100 μl, micropipet 100 1000 μl, micropipet 1 - 10 ml, que cấy móc, que cấy trải, lamel, lam kính, falcon, dao cấy,
màng bao thực phẩm…
4.1.3. Hóa chất
Hóa chất để tiến hành thí nghiệm bao gồm: Nước cất, cồn 70o, cồn 96o, HCl, NaOH,
CH3COOH, Agar, dầu soi kính, dầu lau kính, Potato Dextron Broth (PDB).... (Từ hãng
Sigma, Merck).
4.1.4. Thiết bị

15


Thiết bị: Một số thiết bị sử dụng để tiến hành thí nghiệm gồm: Nồi hấp tiệt trùng, tủ cấy
vô trùng, tủ sấy mẫu, tủ ấm, tủ hút, tủ lạnh, cân phân tích, máy đo pH, máy khuấy từ, bếp
điện, kính hiển vi, lò vi sóng, máy voltex.

4.2. Phương pháp nghiên cứu
4.2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu

Hình 4. 2. Sơ đồ nội dung nghiên cứu

4.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
4.2.1.1. Thu bào tử nấm Collectotrichum gloeosporioides
-

Chuẩn bị màn lọc: Khăn giấy ướt được ngâm với cồn 700 trong 15 phút sau đó
rửa lại với nước cất nhiều lần cho thật sạch. Kế đến, sấy cho thật khô và hấp
khử trùng ở 1210C trong 15 phút để sử dụng.

-

Thu bào tử: Đĩa Petri nấm C. gloeosporioides có bào tử (cấy khoảng 5 ngày
trên môi trường PDA) được thu bằng cách cho vào 10 mL nước cất vô trùng,
16