NGHIÊN CƢ́ U SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤ M Metarhizium anisopliae DƢ̣A VÀO TRÌNH TƢ̣ GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

*************

KHÓA ḶN TỐT NGHIỆP

́
́
NGHIÊN CƢU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦ A NÂM
Metarhizium anisopliae DƢ̣A VÀO TRÌNH TƢ̣
GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2003 - 2007
Sinh viên thƣ ̣c hiên: TRẦN NHẬT NAM
̣

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

*************

KHỐ ḶN TỐT NGHIỆP
́

́
NGHIÊN CƢU SƢ̣ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦ A NÂM
Metarhizium anisopliae DƢ̣A VÀO TRÌNH TƢ̣
GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS

Giáo viên hƣớng dẫn:

Sinh viên thƣc hiên:
̣
̣

ThS. VÕ THỊ THU OANH

TRẦN NHẬT NAM

TS. LÊ ĐÌ NH ĐƠN

Thành phớ Hờ Chí Minh
Tháng 9/2007


LỜI CẢM ƠN
 Con xin cảm ơn Ba Mẹ cùng gia đình đã ni con đến ngày khơn lớn và
cho con ăn học thành tài.
Em xin chân thành cảm ơn:
 Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hờ Chí Minh đã tận
tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học.
 Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã
động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận.
 TS. Lê Đình Đơn, ThS. Võ Thị Thu Oanh , CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình

chỉ dẫn em trong śt quá trình thực hiện khóa luận.
 Anh Nguyễn Văn Lẫm đã hết lòng hƣớng dẫn em trong quá trình thực
hiện khóa luận.
 Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa sinh đã động
viên, chia sẻ kinh nghiê ̣m và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện

khóa

luận.
 Xin cám ơn c ̣c sớ ng đã đem la ̣i cho tôi nhƣ̃ng ngƣời ba ̣n , nhƣ̃ng ngƣờ i
đã cùng tôi chia sẻ và động viên tôi trong suố t quá trinh thƣ̣c hiê ̣n khóa
̀
luâ ̣n.
Xin chân thành cảm ơn!

̀
TRÂN NHẬT NAM

iii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu sƣ̣ tính đa dạng di truyền của nấm Metarhizium
anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng rDNA-ITS “ đƣợc thực hiện từ ngày 26
tháng 3 năm 2007 đến ngày 31 tháng 8 năm 2007 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm thành
phố Hồ Chí Minh.
Đề tài do Trầ n Nhâ ̣t Nam thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS

. Võ Thị Thu

Oanh và TS. Lê Đình Đơn.
Đới tƣợng nghiên cứu là nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng gây
hại. Đây là giố ng nấ m có hoa ̣t tính tiêu diê ̣t côn trùng ma ̣nh

. Mục đích đề tài nhằm

nghiên cƣ́u sƣ̣ đa da ̣ng về mă ̣t di truyề n giƣ̃a các dòng nấ m dƣ̣a trên cơ sở trinh tƣ̣
̀
nucleotide của gen Pr1 và vùng rDNA-ITS
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Xác định đƣợc những dòng nấm Metarhizium anisopliae sƣ̉ du ̣ng trong nghiên
cƣ́u thuô ̣c dòng Metarhizium anisopliae var. anisopliae.
- Phát hiện gen Pr1 ở trên 10 dịng nấm Metarhizium anisopliae. Tiế n hành giải
trình tự gen Pr1 của10 mẫu nấ m. Kích thƣớc của gen Pr1 ở 7 mẫu nấ m là 1091bp.
- Có sự khác biê ̣t về mă ̣t di truyề n giƣ̃a các dòng Metarhizium anisopliae trong
nƣớc và giƣ̃a các dòng trong nƣớc với các dòng trên genbank

.Tỉ lệ tƣơng đờng giữa

các dịng trong nƣớc khoảng 95-100%, và giữa các dòng trong nƣớc so với các dòn g
trên thế giới là 94-99% khi so sánh trinh tƣ̣ gen Pr1
̀
- Phát hiện đƣợc 4 vị trí đột biến ở 2 dòng BXDTG và RBCQ 9 so với nhƣ̃ng
dịng cịn lại. Nhƣ̃ng đơ ̣t biế n này đề u xảy ra ở vùng ITS 1.
- Có sự bảo tờn cao trong vùng 5.8S và vùng ITS2 giƣ̃a nhƣ̃ng dòng nấ m Metarhizium
anisopliae đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong đề tài . Tỉ lệ tƣơng đồng giữa những dòng trong nƣớc là

99-

100% và giữa các dòng trong nƣớc với các dòng trên genbank là 92-100% khi so sánh trinh tƣ̣

̀
vùng rDNA-ITS.

iv


MỤC LỤC
CHƢƠNG

TRANG

Trang tựa
Lời cảm tạ .............................................................................................................iii
Tóm tắt .................................................................................................................. iv
Mục lục .................................................................................................................. v
Danh sách các chữ viết tắt...................................................................................viii
Danh sách các bảng ............................................................................................... ix
Danh sách các hình ................................................................................................ x
1.

̀
̉
MƠ ĐÂU ................................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài .................................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu ...................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu đề tài .............................................................................................. 2
1.3.Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................... 2

2.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3
2.1. Giới thiê ̣u nấ m Metarhizium anisopliae ............................................................... 3
2.2. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng. ................. 6
2.3. Hoạt tính sinh học ................................................................................................. 7
2.4. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm ....................................................
2.5. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarhizium anisopliae
và những nấm ký sinh cơn trùng khác ứng dụng để phịng trừ sâu hại. ............... 8
2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................... 8
2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................................... 9
2.6. Giới thiê ̣u gen Pr1 .............................................................................................. 10
2.7. Vai trò của Protease Pr1 ..................................................................................... 10

v


2.8.Tổ ng quan về ITS-rDNA ..................................................................................... 10
2.8.1. Giới thiê ̣u về vùng rDNA và vùng ITS ...................................................... 10
2.9. Mô ̣t số nghiên cƣ́u trong nƣớc và nƣớc ngoài về sƣ̣ đa da ̣ng của nấ m
Metarhizium anisopliae dƣ̣a vào gen Pr1 và vùng rDNA-ITS ................................. 12
2.9.1. Nghiên cƣ́u nƣớc ngoài ............................................................................. 12
2.9.2. Nghiên cƣ́u trong nƣớc .............................................................................. 14
2.10. Phƣơng pháp phát hiê ̣n gen Pr1 và vùng rDNA-ITS ....................................... 14
3.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 16
3.1. Thời gian và địa điểm ......................................................................................... 16
3.1.1. Thời gian ................................................................................................... 16
3.1.2. Địa điểm .................................................................................................... 16
3.2. Vật liệu và hoá chất............................................................................................. 16

3.2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 16
3.2.2. Hoá chất .................................................................................................... 17
3.2.3. Các thiết bị chính ...................................................................................... 17
3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 18
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 18
3.4.1.Kiể m tra DNA tổ ng số đƣơ ̣c ly trich tƣ̀ các dòng nấ m
́

Metarhizium

anisopliae ............................................................................................................. 18
3.4.2. Khuếch đại gen Pr1 ................................................................................. 18
3.4.3. Khuế ch đa ̣i vùng rDNA-ITS ..................................................................... 21
3.5.
3.6.

Tinh sa ̣ch sản phẩ m PCR ................................................................................ 22

3.7.

Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự..................................................................... 24

3.8.
4.

Tiế n hành giải trinh tƣ̣ gen gây đô ̣c Pr1 và vùng ITS .................................... 22
̀

Phƣơng pháp phân tich trinh tƣ̣ ...................................................................... 24
́

̀

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 26
4.4.

DNA của các mẫu nấ m Metarhizium anisopliae đƣơ ̣c dùng trong nghiên

vi


cƣ́u ............................................................................................................................. 26
4.5.
4.6.

Kế t quả khuế ch đa ̣i vùng ITS1-5.8S-ITS2. .................................................... 28

4.7.

Kế t quả giải trình tƣ̣ vùng ITS1-5.8S-ITS2 .................................................... 29

4.8.

Kế t quả khuếch đại gen Pr1………………………………………………...36

4.9.
5.

Kế t quả tinh sa ̣ch DNA tổ ng số ...................................................................... 28

Kế t quả đo ̣c trình tƣ̣ gen Pr1………………………………………………………36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 42
5.4.

Kết luận .......................................................................................................... 42

5.4.2. Phát hiện và đọc trình tự gen Pr1 ............................................................. 42
5.4.3. Phát hiện và đọc trình tự vùng rDNA-ITS ................................................ 42
5.5.

Đề nghị ........................................................................................................... 43

5.6.

Hạn chế của đề tài ........................................................................................... 43

6.

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 44

7.

PHỤ LỤC ............................................................................................................... 47

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BXĐTG
BXĐTV

RBCQ9
BDQ96
BDTV5
BDTN
BDBD7
SCLLLA
RNBT
RNLA
ng
nm
g
m
M
l
TE
dNTP
TAE
UI
bp
Kb
ctv
PCR
Rpm

: Bọ xít đen Tiền Giang
: Bọ xít đen Trà Vinh
: Rầy bông cúc Quận 9
: Bọ dừa Quận 9 6
: Bọ dừa Trà Vinh 5
: Bọ dừa Tây Ninh

: Bọ dừa Bình Định 7
: Sâu cuốn lá lúa Long An
: Rầy nâu Bến Tre
: Rầ y nâu Long An
: nano gram
: nano mol
: micro gram
: micro mol
: micro mol/lít
: micro lít
: tris EDTA
: deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate
: tris acetic EDTA
: unit international
: base pair
: kilo base
: cộng tác viên
: Polymerase Chains Reaction
: Revolutions per minute

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 Giới thiê ̣u nấ m Metarhizium anisopliae ............................................... 3
Bảng 3.1 Nguồ n nấ m Metarhizium anisopiae đƣơ ̣c thu thâ ̣p ở mô ̣t số điạ

phƣơng dùng trong thí nghiê ̣m ........................................................................................ 16
Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen

Pr1 với că ̣p primer

METPR1/METPR4 ......................................................................................................... 19
Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen

Pr1 với că ̣p primer

METPR2/METPR5 ......................................................................................................... 20
Bảng 3.4 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen vùng rDNA -ITS .... .21
Bảng 3.5 Thành phần của phản ứng đọc trình tự ................................................ 23
Bảng 4.1 Các ng̀n nấm Metarhizium anisopliae trên genbank đƣơ ̣c dùng để
so sánh trinh tƣ̣ vùng rDNA-ITS..................................................................................... 30
̀
Bảng 4.2 Ma trâ ̣n khoảng cách giƣ̃a các dòng nấ m Metarhizium anisopliae trong
nƣớc khi dƣ̣a vào trinh tƣ̣ vùng rDNA-ITS..................................................................... 31
̀
Bảng 4.3 Ma trâ ̣n khoảng cách giƣ̃a các dòng nấ m Metarhizium anisopliae trong
nƣớc và trên thế giới dƣ̣a vào trinh tƣ̣ vùng rDNA-ITS.................................................33
̀
Bảng 4.4 Các nguồn nấm Metarhizium anisopliae trên genbank đƣơ ̣c dùng để so
sánh trình tự gen Pr1 ....................................................................................................... 37
Bảng 4.5 Ma trâ ̣n khoảng cách giƣ̃a các dòng nấ m Metarhizium anisopliae trong
nƣớc khi dƣ̣a vào trình tƣ̣ gen Pr1 .................................................................................. 38
Bảng 4.6 Ma trâ ̣n khoảng cách giƣ̃a các dòng nấ m Metarhizium anisopliae trong
nƣớc và trên thế giới dƣ̣a vào trinh tƣ̣ gen Pr1..............................................................40
̀

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên những cơn trùng khác
nhau ........................................................................................................ 5
Hình 2.2 Sơ đờ của các vùng trên rDNA ............................................................. 12
Hình 3.1 Sơ đờ primer đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng để khuế ch đa ̣i gen Pr1 .............................. 18
Hình 3.2 Sơ đờ primer đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng để khuế ch đa ̣i vùng ITS ........................... 21
Hình 3.3 Nhƣ̃ng phƣơng pháp đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong phân tích trình tự ................ 24
Hình 3.4 Sơ đồ phân tich trinh tƣ̣ có đô ̣ tƣơng đờ ng cao ..................................... 25
́
̀
Hình 4.1 DNA tổng sớ của nấm Metarrhizium anisopliae ...................................... 26
Hình 4.2 Sơ đờ tinh sa ̣ch DNA tổ ng số của các mẫu nấ m Metarhizium
anisopliae đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u ......................................... 27
Hình 4.3 DNA tở ng sớ của nấ m Metarhizium anisopliae đƣơ ̣c tinh sa ̣ch ........... 28
Hình 4.4 Hình khuếch đại vùng rDNA-ITS ........................................................ 28
Hình 4.5 Cây phát sinh loài giữa các dịng Metarhizium anisopliae trong nƣớc
dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS ........................................................ 32
Hình 4.6 So sánh quan hê ̣ giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và
trên thế giới dƣ̣a vào trinh tƣ̣ vùng rDNA-ITS.................................... 34
̀
Hình 4.7 Hình khuếch đại gen Pr1 ..................................................................... 36
Hình 4.8 Cây phát sinh loài giữa các dịng Metarhizium anisopliae trong nƣớc
dựa vào trình tự gen Pr1...................................................................... 39

Hình 4.9 So sánh quan hê ̣ giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và
trên thế giới dƣ̣a vào trinh tƣ̣ gen Pr1 ................................................. 41
̀

x


1

Chƣơng 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề.
Nơng nghiệp đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế nƣớc ta. Trong sản xuất
nơng nghiệp ngƣời nơng dân gặp rất nhiều khó khăn, trong đó khó khăn lớn nhất là
việc phịng trừ và tiêu diệt các loại côn trùng gây hại cho cây trồng. Hiện nay trên thị
trƣờng xuất hiện rất nhiều loại th́c hóa học dùng trong nơng nghiệp.Tuy nhiên việc
sử dụng những sản phẩm này trong một thời gian dài cộng với liều lƣợng ngày càng
tăng đã và đang ảnh hƣởng nặng nề đến môi trƣờng, làm xuất hiện nhiều loại sâu bệnh
và côn trùng kháng thuốc, làm giảm chất lƣợng đất.Và nguy hiểm hơn cả là việc thuốc
trừ sâu xuất hiện trong sản phẩm sau khi thu hoạch đã ảnh hƣởng trực tiếp tới sức khỏe
ngƣời tiêu dùng. Trƣớc thực trạng này các nhà khoc học đã nghiên cứu và đƣa ra
phƣơng pháp mới trong việc phòng trừ và tiêu diệt các loài gây hại cho côn trùng. Một
trong những phƣơng pháp đó là kiểm soát sinh học thơng qua việc sử dụng các chế
phẩm có ng̀n gớc từ nấm, virus, vi khuẩn hoặc sử dụng ký sinh thiên địch, các hợp
chất thứ cấp có ng̀n gớc thảo mộc để phịng trừ và tiêu diệt các loài cơn trùng gây hại
một cách hiệu quả và an toàn hơn.
Trong các loại vi sinh vật gây hại cho côn trùng đáng chú ý nhất là ngành phụ
nấm bất toàn mà đại diện tiêu biểu là nấm Metarhizium anisopliae-một trong những
loài có đặc tính diệt côn trùng mạnh nhất. Trên thế giới nấm Metarhizium anisopliae là
đối tƣợng nghiên cứu của rất nhiều cơng trình khoa và đã đƣợc thƣơng mại hóa từ lâu –
nhƣ là một loại thuốc trừ sâu sinh học trong cơng tác phịng chớng một sớ loại cơn

trùng gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau.


2

Trƣớc đây việc nghiên cứu về đa dạng sinh học chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá
hình thái nên còn nhiều hạn chế. Ngày nay với sự ra đời của nhiều kĩ thuật mới nhƣ kĩ
thuật PCR và những ứng dụng từ PCR nhƣ RAPD, RFLP, AFLP, Southern blot,
Sequence v.v.. đã giúp cho quá trình nghiên cứu nhanh và chính xác hơn.Tuy nhiên
những nghiên cứu nhƣ vậy ở nƣớc ta còn rất ít.
Xuất phát từ những đặc điểm trên, đƣợc sự cho phép và phân công của Bộ môn
Công Nghệ Sinh Học chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng
di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng rDNAITS “.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài.
1.2.1.Mục tiêu
Nghiên cƣ́u sƣ̣ đa da ̣ng di truyề n của nhƣ̃ng dòng nấ m Metarhizium anisopliae
đƣơ ̣c phân lâ ̣p trên nhiề u đố i tƣơ ̣ng cây trồ ng khác nhau ở các tỉnh th ành trên cả nƣớc
dƣ̣a vào trình tƣ̣ của gen gây đô ̣c Pr1 và vùng rDNA-ITS.
1.2.2. Yêu cầu đề tài.
- Kiể m tra DNA đƣơ ̣c ly trích tƣ̀ nhƣ̃ng dòng nấ m

Metarhizium anisopliae

đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u.
- Xác định gen gây độc Pr1 và vùng rDNA-ITS bằ ng kỹ thuâ ̣t PCR.
- Xác định trình tự gen Pr1 và vùng rDNA -ITS và tìm sƣ̣ khác biê ̣t về trình tƣ̣
giƣ̃a các dòng nấ m Metarhizium anisopliae.
1.3. Đối tƣợng nghiên cứu.
Nấm Metarhizium anisopliae thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long
An, Trà Vinh, Tây Ninh, Bến Tre, Bình Đinh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại

̣
cho côn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau.


3

Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae.
Bảng 2.1: Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae.
Kingdom (Giới) Fungi
Phylum (Ngành) Ascomycota
Class (Lớp)

Sordariomycetes

Order (Bộ)

Hypocreles

Family (Họ)

Clavicipitaceae

Genus (Giống)

Metarhizium

Species (Loài)

Metarhizium anisopliae

Nấm này đƣợc Metschinikov phát hiện đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung hại
lúa mì. Nấm thƣờng gây bệnh cho cơn trùng sớng trong đất, thuộc vi sinh vật đất trong
tự nhiên. Bào tử của nấm sau 24 giờ tiếp xúc với bề mặt cơ thể cơn trùng thì bắt đầu
mọc mầm và xâm nhập vào bên trong. Trong cơ thể côn trùng sợi nấm phát triển xâm
nhập vào các bộ phận nội quan. Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn
trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hơi hờng nhạt. Trên đó tạo thành các khuẩn lạc màu
xanh xám. Quá trình phát triển của bệnh trong cơ thể côn trùng là 4 – 6 ngày tùy thuộc
vào loài và tuổi vật chủ cũng nhƣ nguồn bệnh ban đầu. Vào giai đoạn ći cùng của
quá trình phát triển bệnh lý thì cơn trùng chết.


4

Nấm Metarhizium anisopliae có 2 dạng chính: M. anisopliae var. major có bào
tử dài với kích thƣớc bào tử túi 10,0 – 14,0 (18,0) m và M. anisopliae var. anisopliae
có bào tử ngắn với kích thƣớc bào tử túi là 3,5 – 9,0 (thƣờng 5,0 – 8,0) m. Nấm xanh
(nấm Metarrhizium anisopliae) sinh ra các độc tố destruxin A và B (Bùi Xuân Đồng,
Nguyễn Huy Văn, 2000).
Nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên 200 loài côn trùng thuộc các bộ:
Orthoptera (11 loài), Dermaptera (1 loài), Hemiptera (21 loài), Lepidoptera (27 loài),
Diptera (4 loài), Hymenoptera (6 loài) và Coloptera (134 loài). Nấm xanh có thể ni
cấy trên mơi trƣờng thức ăn nhân tạo.
Metarhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất cho côn trùng thuộc bộ
Coleoptera. Hơn 204 loài côn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae bị nhiễm
bệnh bởi Metarhizium anisopliae (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng
Giang, 1997).
Ngoài ra Metarhizium anisopliae còn gây bệnh trên ấu trùng muỗi Aedes
aegypti, Anopheles stephensi và Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa
Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc

họ Testigolidae, loài mối Nasutitermes exitiosus thuộc họ Termitidae. Nấm này phân
bố rộng trong tự nhiên.
M. anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu tối
hoặc hồng vỏ quế. Khuẩn lạc mọc chậm, trên môi trƣờng OA sau 10 ngày ni cấy ở
20oC có đƣờng kính 2 cm.
Đã có nhiều nghiên cứu về sự phân bớ của chúng: Nepal, New Zealand, New
Caledonia, Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xơ (cũ). Ở những
nơi khơng có cơn trùng cũng phân lập đƣợc Metarhizium anisopliae: nang của
Nematod (Heterodenas chachatii và Globodera rostochensis), các hạt ngoài đồng và
trong đất trồng ở Canada, đất trồng chuối ở Honduras, đất trồng dâu ở Braril, đất trồng
cỏ ở New Zealand. Ngay ở những nơi có thời tiết khắc nghiệt của nƣớc Đức, ở đất


5

rừng sau khi đốt cháy, trong chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm), trầm tích cửa sông,
đất đầm lầy trồng cây đƣớc, tổ của một số loài chim và rễ của dâu tây cũng đều phân
lập đƣợc Metarhizium anisopliae.
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Metarhizium anisopliae:
- Khơng thể sinh trƣởng tớt trên nền cơ chất khơng có chitin.
- Sống đƣợc ở nhiệt độ thấp (8oC), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy
nhiều CO2 và O2 chúng có thể sớng sót tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất, bào tử
dính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đó có chủng Aeromonas (thí
nghiệm in vitro).
- Ở dƣới 10oC và trên 35oC thì sự hình thành bào tử khơng thể xảy ra.
- Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30oC và chết ở 49oC trong
10 phút.
- Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trƣởng là 25oC và pH 3,3 – 8,5.
- Metarhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin
(lông và da côn trùng). (Trần Văn Mão, 2004).

Hình 2.1: Nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên những côn trùng khác nhau


6

2.2. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng.
Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật
chủ không qua đƣờng miệng, mà qua lớp vỏ cơ thể, nghĩa là phải có sự tiếp xúc của
ng̀n nấm với bề mặt cơ thể vật chủ. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ,
trong điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn
trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động men của nấm. Nấm tiết ra
loại men làm mềm lớp vỏ chitin và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm,
qua lỗ thủng dó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Do khả năng xâm
nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh đƣợc
cơn trùng chích hút và cả những pha phát triển của côn trùng nhƣ trứng, nhộng mà các
vi sinh vật khác không ký sinh đƣợc.
Nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đƣờng miệng.
Từ miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các tế bào nội quan để
gây bệnh. Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm ở nƣớc. Dƣới tác
động của độc tố do bào tử nấm tiết ra có thể dẫn tới hiện tƣợng ngừng nhu động ruột
của vật chủ. Thí dụ, trƣờng hợp bào tử nấm Aspergillus trong ruột ong mật. Bào tử
nấm cịn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể
côn trùng nhƣng rất ít.
Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm trong cơ thể cơn trùng là một quá trình
phức tạp, gồm 3 giai đoạn chính sau đây
Sự xâm nhập
Nấm ký sinh cơn trùng có thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng bằng sự xâm nhập
trực tiếp qua lớp cutin, theo cách này thì nấm tiết ra enzyme phân hủy lớp cutin để có
thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Ngoài ra nấm ký sinh côn trùng cịn có

thể xâm nhập gián tiếp vào cơ thể vật chủ qua thành ống tiêu hoá, qua lổ thở, qua vết
thƣơng trên cơ thể côn trùng.


7

Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết
Sau khi xâm nhập vào cơ thể cơn trùng thì chúng bắt đầu sinh sôi nảy nở bên
trong cơ thể côn trùng và côn trùng chết trong khoảng 3 tuần.
Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sau khi côn trùng vật chủ chết
Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển hình thành lớp bào tử bao phủ
toàn bộ bề mặt ngoài của vật chủ. Lớp bào tử này ban đầu có màu trắng sau chuyển
qua màu xanh lục
Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trƣởng phát triển để hoàn thành một
chu kỳ sống của chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới. Nấm gây bệnh
cơn trùng có tính chun tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc một giai đoạn nhất
định của vật chủ. Nhiều trƣờng hợp chúng là ký sinh có tính chuyên hóa thức ăn rộng,
có thể ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc các giống, họ, bộ khác nhau.
Để có thể gây đƣợc những dịch bệnh nấm lớn cho sâu hại, các đặc điểm của
nấm đóng một vai trò quan trọng là: độc tính của nấm, khả năng di chuyển bào tử
trong những điều kiện không thuận lợi và khả năng phát tán trong thiên nhiên. Đặc
điểm đặc biệt đới với các nấm họ Entomophthoraceae đó là hoạt động bắn bào tử xa
một khoảng cách gấp hàng nghìn lần kích thƣớc của nó. Điều đó tạo khả năng phát tán
rộng lớn hơn trong quần thể côn trùng. Sự phát tán có hiệu quả cao hay khơng ở mức
độ nhất định cũng phụ thuộc vào độ nhất định cũng phụ thuộc vào.
2.3. Hoạt tính sinh học.
Theo nhiều tài liệu của nhiều tác giả cho biết các nấm Muscardine (ví dụ nấm
Muscardine trắng: Beauveria bassiana, nấm Muscardine xanh : Metarhizium
anisopliae có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn các enzyme.Trong đó có ý nghĩa lớn
nhất có khả năng gây bệnh cho cơn trùng có chitinase, proteinase, lipase và amylase.

2.4. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm
Nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria đƣợc nghiên cứu sản xuất để trừ
một số sâu hại quan trọng trong nông nghiệp. Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối với


8

rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phòng thí nghiệm và
ở nhà lƣới. Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy lƣng trắng 64 –
92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2%. Hiệu lực diệt các loài
rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động từ 33 – 75% tùy
theo vụ và năm khác nhau. Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun nấm, vì
vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các loài rầy hại lúa trong
vụ. Dùng nấm B. bassiana để quản lý các loài rầy hại lúa đã làm tăng năng suất từ 19 –
95% so với đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm). Nấm B. bassiana khơng gây
ảnh hƣởng gì cho lúa và cũng không gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa
(Trần Văn Mão, 2004).
Nấm M. anisopliae có khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu
Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M. flavoviride gây chết 100% châu
chấu thí nghiệm sau 7 ngày. Chế phẩm nấm diệt châu chấu đƣợc tiến hành ở Bà Rịa –
Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tƣơng đối tốt nhƣng không đều. (Trần Văn Mão,
2004).
2.5. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarrhizium anisopliae
và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại.
2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc
Lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thuỳ (2000) đã sử dụng nấm Metarhizium
để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarhizium sau khi đã thử nghiệm trong
phòng, trong nhà lƣới và ngoài đờng có hiệu quả đới với bọ dừa ở Bến Tre.
Tạ Kim Chỉnh và ctv (2001), đã chọn đƣợc môi trƣờng nhân giống cho các
chủng Metarhizium anisopliae là mơi trƣờng Saubouraund có bổ sung vỏ trấu

Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000) đã thử nghiệm chế phẩm B.75 từ
Beauveria bassiana dạng bột để phòng trừ sâu róm hại cây thơng và cho biết sâu chết
80% sau một năm xử lý. Nguyễn Thị Lộc và ctv (2004) đã thử nghiệm , sản xuất và


9

ứng dụng chế phẩm nấm ký sinh để phòng trừ sâu hại lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu
Long.
Ngoài ra, ở nƣớc ta cũng tiến hành nghiên cứu nấm gây bệnh trên các loài sâu
hại đậu nành. Theo Tống Kim Thuần, Vũ Quang Cơn (2001), các vi nấm có khả năng
gây bệnh sâu hại trên đậu tƣơng chủ yếu là các loài sau: Beauveria bassiana,
Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi. Chúng gây bệnh hầu hết các loài sâu hại
thuộc bộ cánh vảy – Lepidoptera, Entomophthora sp gặp ở bộ cánh nửa cứng –
Hemiptera.
2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc
Trên thế giới, việc sử dụng nấm trong đấu tranh chớng sâu hại có lịch sử khá lâu
đời, Meschnikoff (1884) là ngƣời đầu tiên trình bày vấn đề sử dụng nấm trong đấu
tranh sinh học với sâu hại (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997).
Theo Juntin L. Hatting, Richard A. Humber, Tadeusz J. Poprawsski và Ray
M.Miller (1999), các nghiên cứu về các nấm gây bệnh rầy mềm ở Nam Phi đƣợc định
hƣớng từ 1995-1998, và cho biết trong 8 loài nấm đƣợc tìm thấy đều lan truyền và giết
chết rầy mềm, gồm 6 loài thuộc Entomophthorales (Pandora neoaphidis,
connidiobolus thromboides, C.coronatus, Entomophthora planchoniana và neozygites
fresenii) và hai loài thuộc Hyphomycetes (Beauveria basssiana, Verticillium lecanii).
Theo A.M. Kammp và M. J. Bidochka (1994), tiến hành đánh giá sự sản xuất
bào tử của 3 loại nấm gây bệnh côn trùng Metarrhizium anisopliae, Beauveria
bassiana và Verticillium lecanii đƣợc đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2mm, 3mm,
4mm tƣơng ứng với 10ml, 15ml, 20ml) và các loại môi trƣờng khác nhau (SDA, MEA,
NA, CMA, YPDA, PDA) và cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm

Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana tốt nhất trong môi trƣờng PDA ở độ
sâu 2mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trƣờng YPDA
và độ sâu của mơi trƣờng thì khơng đáng kể.


10

Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997), thì Codaira
Y. (1961) đã tách đƣợc hai độc tớ ở nấm Metarhizium anisopliae là destruxin A, liều
gây chết với tầm là 0,28kg/g trọng lƣợng cơ thể và destruxin B, liều gây chết là
0,34kg/g trọng lƣợng cơ thể.
2.6. Giới thiệu gen Pr1
Những nấm gây bệnh trên côn trùng xâm nhập vào côn trùng bằng cách xâm
nhập trực tiếp qua lớp cutin. Chúng sản xuất những enzyme ngoại bào ảnh hƣởng trực
tiếp lên lên lớp vỏ bọc của côn trùng. Nấm Metarhizium sản xuất một protease
subtilisinlike ngoại bào đƣợc gọi là Pr1. Pr1 gây thoái hoá protein của lớp cutin. Pr1
đƣợc tổng hợp nhƣ là một tiền chất lớn (40.3 kDa) chứa một peptide tín hiệu, một tiền
peptide và một protein hoàn thiện . Cấu trúc sơ cấp của Pr1 có độ tƣơng đồng lớn (3060%) với những enzyme của phân lớp subtilisin của serine endopeptidase và serine,
histidine và aspartyl.
2.7. Vai trò của protease Pr1
Những enzyme tác nhân gây bệnh hội tụ ngoài tế bào có thể làm suy thoái cấu
trúc polymer của biểu bì (protein, chitin và lipid) trong śt giai đoạn phát sinh bệnh,
giúp cho quá trình thâm nhập của nấm đƣợc dễ dàng và cung cấp những dinh dƣỡng
cho nấm phát triển nhanh hơn. Sản phẩm của những enzyme làm phân hủy biểu bì này
thì thƣờng đƣợc phân lập bởi sự nuôi cấy trên môi trƣờng chứa biểu bì hoặc chitin
(Raymond và ctv, 1995).
2.8. Tổng quan về ITS-rDNA
2.8.1. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS
rDNA là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome và đóng vai trị quan trọng
trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA đƣợc nghiên cứu vì nó là gen có

nhiều bản sao và đặt biệt không mã hoá cho bất kỳ protein nào. Các bản sao của gen
nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hoá. Ribosome hầu
nhƣ tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng ng̀n gớc. Phần lớn phân tử rDNA tƣơng


11

đối bảo tồn nên đƣợc xem là cơ sở để tìm ra sự tƣơng đờng và các khác biệt khi so sánh
các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những Oligonucleotide có tính bảo
tờn cao đƣợc sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tƣơng đƣơng dùng
trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng đƣợc thiết kế dựa trên các vùng
không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de peer và cộng sự,
1996).
rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5,8S (một tiểu đơn vị ribosome nhỏ hơn trở thành
một phần của LSU), ITS2, 28S và vùng IGS (intergenic spacer). Vùng phiên mã 18S
kết thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi 28S cộng với 5,8S và một gen 5S thêm vào từ
những phần khác của genome hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosome RNA.
Những vùng ITS đƣợc phiên mã (tổng hợp từ RNA), nhƣng bị cắt trƣớc khi rRNA
hoàn thiện đƣợc hình thành, tuy nhiên ITS lại có chức năng trong sự hình thành
ribosome (Albert và cộng sự 1994). Ở đầu kết thúc 5’ của 18S và đầu kết thúc 3’ của
28S, cũng có một vùng đƣợc biết đến là ETS (external transcribel spacer). IGS
(intergenic spacer) là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA. Tuy nhiên vùng không gian
không phiên mã của những rDNA chứa trình tự kết thúc phiên mã của những gene
rRNA .
Các rDNA 5,8S; 18S; 28S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ
với các vùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS). Giữa
các nhóm gen gờm nhiều bản sao lập lại là vùng khơng phiên mã . Có một rDNA 5S
thƣờng khơng có vị trí cớ định và có chiều sao mã ngƣợc với các gen cịn lại, rDNA 5S
thƣờng chỉ có ở nhân, khơng có ở ty thể của một sớ loài nấm (Guarro, 1999).
rDNA 18 S thƣờng đƣợc quan tâm nghiên cứu, rDNA 5,8 S có kích thƣớc rất

nhỏ và ít có sự biến đới song rRNA 5 S là thành phần khơng thể thiếu của nu-LSUrRNA, có vai trị ổn định cấu trúc ribosome và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein
(Szymanski và cộng sự, 2001).


12

Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù vùng ITS thƣờng đƣợc sử dụng
trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này
chỉ thƣờng sử dụng ở mức độ xác định các biệt hoá trong cùng loài (Guarro, 1999).
Những gene rRNA ở sinh vật có nhân điển hình (ribosome DNA hay rDNA)
đƣợc tìm thấy nhƣ những phần đơn vị lặp lại đƣợc sắp xếp thành từng cặp.
Mỗi đơn vị lặp lại chứa một vùng phiên mã (ETS1, ETS2, 18S, 25S và 5,8S) và
một vùng không phiên mã (NTS). Trong vùng phiên mã, ITS đƣợc tìm thấy trên gen
5,8S rRNA bao gờm ITS1 và ITS2.

Hình 2.2: Sơ đờ của các vùng trên rDNA
2.9. Mô ̣t số nghiên cƣu trong và ngoài nƣớc về sƣ ̣ đa da ̣ng của nấ m
́

Metarhizium

anisopliae dƣ ̣a vào gen Pr1 và vùng rDNA-ITS
2.9.1. Nghiên cƣu nƣớc ngoài
́
Savita Bagga, Gang Hu, Steven E. Screen, Raymond J. St.Leger đã phân tich sƣ̣
́
giố ng nhau về mă ̣t trình tƣ̣ và cấ u trúc exon -intron các subtilisin của nấ m M.anisopliae
và đã chia thành 4 nhóm:
Nhóm I gờm có Pr1C
Nhóm II đƣợc chia thành hai nhóm phụ có hoạt tính extracellular

13

Nhóm phụ I: gờ m có Pr1A, Pr1B, Pr1G, Pr1I, Pr1K.
Nhóm phụ II gờm có Pr1D, Pr1E, Pr1F, Pr1J.
Nhóm III gờm có Pr1H có hoạt tính endocellular.
Cheng Wang, Milton A. Typas, Tariq M. Butt (2002) đã sƣ̉ du ̣ng kỹ thâ ̣t
Nested-PCR để xác đi ̣nh nhƣ̃ng đô ̣t biế n ở hai gen Pr1A và Pr1B bằ ng cách sƣ̉ du ̣ng
nhƣ̃ng că ̣p pr imer chuyên biê ̣t cho tƣ̀ng gen và kiểm tra bằng kỹ thuật Southern Blot .
Kế t quả : phát hiện đƣợc gen Pr1 ở dịng cha mẹ , khơng phát hiê ̣n đƣơ ̣c ở nhƣ̃ng dòng
đột biến .Tuy nhiên hoa ̣t tinh của enzyme giƣ̃a dòng cha me ̣ và dòng đô ̣t biế n không
́
thay đổ i . Nhƣ vâ ̣y dòng đô ̣t biế n nế u bi ̣mấ t gen quan tro ̣ng nhấ t là gen Pr1 vẫn có thể
gây bê ̣nh trên côn trùng.
Sorayac C . M.. Leal và ctv (1997) đã mô tả mô ̣t phƣơng pháp để xác đinh
̣
nhƣ̃ng dòng nấ m Metarhizium bằ ng cách sƣ̉ du ̣ng kỹ thuâ ̣t RFLP để phân cắ t sản phẩ m
PCR của gen Pr1 và phân tích những phân đoạn b ằng kỹ thuâ ̣t điê ̣n di . Bằ ng kỹ thuâ ̣t
này 40 dòng nấm Metarhizium thu đƣơ ̣c tƣ̀ 15 loại ký chủ khác nhau đã đƣợc xác định
và chia làm 4 nhóm.
Chikako và Susumu Shimizu (2002) đã tiế n hành khuế ch đa ̣i vùng rDNA tƣ̀ đầ u
3’ của 18S rDNA tới đầ u 5’ của 28S rDNA bằ ng cách sƣ̉ du ̣ng că ̣p mồ i đă ̣c hiê ̣ u là TW
81 và AB28 và giải trình tự vùng 5.8S và vùng Flanking để nghiên cứu mối quan hệ di
truyề n giƣ̃a nấ m Metarhizium anisopliae đƣơ ̣c phân lâ ̣p tƣ̀ Nhâ ̣t Bản và Hàn Quố c với
các loài có mới quan hệ.
Malena P. Panton, Annoula Mavridou, Milton A.Typas (2003) so sánh sƣ̣ khác
biê ̣ trong trinh tƣ̣ của vùng IGS và vùng rDNA -ITS để nghiên cƣ́u sƣ̣ khác biê ̣t về mă ̣t
̀
di truyề n của 40 dòng nấm Metarhizium.

N.D.Pipe, D.Chandler, B. W. Bainbridge và J .B.Heale (1995) sƣ̉ du ng kỹ thuâ ̣t
̣
RFLP-PCR để phân tich gen mã hóa cho ribosome RNA
́

(rDNA) tƣ̀ nhƣ̃ng dòng nấ m

Metarhizium khác nhau nhƣ M.anisopliae var. anisopliae, M.anisopliae var. majus,
M.album và M.flavoviride có ng̀n gớc từ nhiều quốc gia khác nhau.


14

Marilena Aquino de Muro, Samina Mehta, David Moore (2003) sƣ̉ du ̣ng kỹ
thuâ ̣t RFLP, giải trình tự và AFLP để phân tích vùng ITS của 50 dòng nấm Beauveria
bassiana. Trình tự vùng ITS đã chỉ ra sự khác biệt về trình tự của các dịng B.bassiana
thấ p hơn 2%.
Mavridou và ctv

(1998) đã phân tich sƣ̣ đa hinh trong loài
́
̀

Metarhizium

anisopliae var. anisopliae bằ ng cách sƣ̉ du ̣ng phân tích RFLP đố i với phƣ́c hơ ̣p gen
rDNA và mtDNA . Dƣ̣a vào viê ̣c phân tich sƣ̣ lai của DNA , 25 dịng đƣợc chia làm 20
́
nhóm khác biệt về di truyền.
Driver và ctv (2000) đã sƣ̉ du ̣ng kỹ thuâ ̣t RAPD và trình tƣ̣ của toàn bô ̣ vùng

ITS của rDNA để xác đinh sƣ̣ phân loài . Nhƣ̃ng dòng nấ m đƣơ ̣c chia thành 10 nhánh
̣
riêng biê ̣t.
Curran và ctv (1994) đã nghiên cƣ́u mố i quan hê ̣ phát sinh loài

của nấm

Metarhizium bằ ng viê ̣c sƣ̉ du ̣ng trinh tƣ̣ rDNA.
̀
Rakotonirainy và ctv (1994) đã phân tích sƣ̣ khác biê ̣t về isoenzyme và trình tƣ̣
của ribosomal RNA trong giống nấm Metarhizium.
2.9.2. Nghiên cƣu trong nƣớc
́
Nhƣ̃ng nghiên cƣ́u về sƣ̣ đa da ̣ng di truyề n trong quầ n thể nấ m

Metarhizium

anisopliae dƣ̣a vào gen Pr1 và vùng rDNA -ITS ở Việt Nam có rất ít . Phầ n lớn nhƣ̃ng
nghiên cƣ́u về sƣ̣ đa da ̣ng di truyề n của quầ n thể nấ m Metarhizium anisopliae chỉ dừng
lại ở mức độ đánh giá hình thái của bào tử hoặc khuẩn lạc.
2.10. Phƣơng pháp phát hiện gen Pr1 và vùng rDNA-ITS
Có nhiều phƣơng pháp khác nhau (nhƣ ELISA, allozyme electrophoresis hoặc
RFLPs) có những ƣu và khuyết điểm khác nhau, chỉ phân biệt giữa mỗi loài hoặc địi
hỏi sớ lƣợng lớn của DNA tinh khiết (Hegedus và ctv, 1993). Sự phân lập DNA thì tớn
nhiều thời gian và giới hạn sớ lƣợng mẫu có thể phân tích đƣợc trong thời gian thích
hợp. RAPD – PCR thì cũng đƣợc sử dụng để mơ tả đặc điểm những giống
Metarhizium anisopliae. Tuy nhiên, RAPD – PCR rất dễ bị nhiễm tạp và thƣờng


15

khơng ổn định, chỉ có thể thực hiện một cách chắc chắn trên DNA từ nuôi cấy ở ký
chủ.
Sử dụng phƣơng pháp mà cho phép sự khám phá về những đặc điểm của
những giống Metarhizium anisopliae lây nhiễm trên côn trùng. Đó là phƣơng pháp kết
hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP – PCR), dựa trên sự khuếch đại của phần
gen mã hóa chủ yếu là protease subtilisin Pr1 (St Leger và ctv, 1992) đƣợc tiết ra bởi
nấm Metarhizium anisopliae và vùng ITS1- 5.8S – ITS2.