Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn bacillus subtilis và salmonella typhymurium của tinh dầu lá tràm gió (melaleuca cajuputi powell)

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các loài thực vật chứa nhiều tinh dầu phổ biến.................................................7
Bảng 3.1. Khảo sát hiệu suất chiết tinh dầu dựa vào thời điểm thu hái trong ngày..........37
Bảng 3.2. Khảo sát hiệu suất chiết tinh dầu dựa vào kích thước nguyên liệu...................37
Bảng 3.3. Pha loãng tinh dầu tràm gió theo.....................................................................38
Bảng 4.1. Thành phần hóa học chính của tinh dầu lá tràm gió thu hái tại Cần Thơ được
phân tích bằng phương pháp GC-MS...............................................................................41
Bảng 4.2. Điều kiện tối ưu để chiết tinh dầu tràm gió......................................................43
Bảng 4.3. Thể tích tinh dầu thu được sau 6 giờ và được lập lại 3 lần...............................44
Bảng 4.4. Kết quả khảo sát sơ bộ khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tràm gió trên 2
chủng vi khuẩn Ba và Sal.................................................................................................45

1


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Người Ai Cập đã sử dụng tinh dầu cách đây hàng ngàn năm.............................3
Hình 2.2. Cây tràm gió trong tự nhiên.............................................................................10
Hình 2.3. Hình thái sinh học của cây Tràm gió................................................................10
Hình 2.4. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi...........................13
Hình 2.5. Vi khuẩn Salmonella typhymủium soi trên kính hiển vi...................................17
Hình 2.6. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtillis............................................17
Hình 2.7. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước bằng bộ clevenger.........................19
Hình 3.1. Máy vortex.......................................................................................................32
Hình 3.2. Lò vi sóng........................................................................................................32
Hình 3.3. Tủ ủ vi sinh......................................................................................................32
Hình 3.4. Buồng cấy vô trùng..........................................................................................33
Hình 3.5. Tủ hút............................................................................................................... 33
Hình 3.6. Nồi khử nhiệt ướt.............................................................................................33
Hình 3.7. Tủ sấy chân không...........................................................................................33
Hình 3.8. Cối xay nguyên liệu.........................................................................................33

Hình 3.9. Máy cô quay.....................................................................................................33
Hình 3.10. Bộ chưng cất Clevenger.................................................................................34
Hình 3.11. Sơ đồ chiết và thu tinh dầu tràm gió tinh khiết...............................................36
Hình 3.12. Sơ đồ thử kháng khuẩn của tinh dầu lá tràm gió............................................40
Hình 4.1. Tinh dầu được chiết từ lá cây tràm...................................................................41
Hình 4.2. Các hoạt chất chính trong tinh dầu lá tràm gió thu hái tại Cần Thơ.................41
Hình 4.3. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến thể tích tinh dầu.......................42
Hình 4.4. Kết quả thử kháng khuẩn trên 2 vi khuẩn Sal và Ba sau 24 giờ ủ....................43
Hình 4.5. Vòng vô khuẩn ở các nồng độ pha loãng thử trên vi khuẩn Ba........................45
Hình 4.6. Vòng vô khuẩn ở các nồng độ pha loãng thử trên vi khuẩn Sal........................45
Hình 4.7. Khả năng kháng khuẩn của 2 tinh dầu tràm gió và gừng trên vi khuẩn Sal......46
Hình 4.8. Khả năng kháng khuẩn của 2 tinh dầu tràm gió và gừng trên vi khuẩn Ba......46
Hình 4.9. Khả năng kháng khuẩn của 2 tinh dầu tràm gió và húng quế trên vi khuẩn Sal
......................................................................................................................................... 47
Hình 4.10. Khả năng kháng khuẩn của 2 tinh dầu tràm gió và gừng trên vi khuẩn Ba.....47
Hình 4.11. Đường kính vòng vô khuẩn của tinh dầu tràm gió so với tinh dầu gừng và tinh
dầu quế trên 2 chủng vi khuẩn Sal và Ba.........................................................................47
2


DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
cm
g
µg

centimet
gam
micro gam

µL

micro lit

mL
d20
nD20

mililit
tỷ trọng ở 20oC
góc khúc xạ ánh sáng
góc quay cực
số đơn vị khuẩn lạc trên 1 gam mẫu
Salmonella typhimurium ATCC 14028
Bacillus subtilis ATCC 6633
Tryptone casine soy agar
Sắc ký khí ghép khối phổ
Dimethyl sulfoxide
Minimal Inhibited Concentration
Môi Trường Vi Sinh MRS Agar (DE MAN,
ROGOSA, SHARPE)

20
D

CFU/g
Sal
Ba
TSA
GCMS
DMSO

MIC
MRSA

3


MỤC LỤC

4


TÓM TẮT
Tỷ lệ đề kháng kháng sinh cao của các chủng vi khuẩn đang trở thành mối đe dọa
nghiêm trọng trong việc điều trị nhiễm khuẩn. Ngày nay xu hướng sử dụng các sản phẩm
bảo vệ sức khỏe có nguồn góc từ thiên nhiên đang được mọi người ưa chuộng vì các ưu
điểm mà nó mang lại như: ít dị ứng, ít tác dụng phụ, rẻ tiền, đạt hiệu quả điều trị tốt.
Lần đầu tiên, thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá
tràm gió (Melaleuca cajuputi Powell) thu hái tại TP.Cần Thơ được khảo sát. Tinh dầu lá
tràm gió được ly trích thành công bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đạt hiệu
suất trung bình là 0,18%. Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GCMS), thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá tràm gió được xác định là hợp chất
(1R,4E,9S)-4,11,11-trimethyl-8-methylidenebicyclo[7.2.0]undec-4-ene với hàm lượng
15,04%. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tràm gió được thử nghiệm trên 2 chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633 và Salmonella typhimurium ATCC 14028 có nguồn
góc từ viện kiểm nghiệm thuốc TP. HCM theo phương pháp khuếch tán nồng độ đã pha
loãng trên mặt thạch.
Kết quả khảo sát cho thấy hiệu suất chiết tinh dầu tràm gió bằng phương pháp lôi
cuốn hơi nước đạt giá trị trung bình là 0,1826%. Tinh dầu tràm gió có tác động kháng
khuẩn tốt trên 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633 ở nồng độ tinh dầu pha
loãng 25% có vòng vô khuẩn là 12 mm, 50% có vòng vô khuẩn là 14 mm và Salmonella
typhimurium ATCC 14028 với giá trị nồng độ tinh dầu đã pha loãng 25% có vòng vô

khuẩn là 12 mm, 50% có vòng vô khuẩn là 13 mm.
Tinh dầu tràm có tác động kháng khuẩn tốt trên 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC
6633 và Salmonella typhimurium ATCC 14028. Điều này mở ra khả năng sử dụng tinh
dầu này trong trị liệu, sản suất dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm.

5


CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU
Tỷ lệ đề kháng kháng sinh cao của các chủng vi khuẩn thường gây khó khăn trong
trị liệu dẫn đến việc kéo dài thời gian điều trị và có thể dẫn đến tử vong. Theo chương
trình giám sát quốc gia về tính kháng thuốc của một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp, thì
năm 1999, tỉ lệ kháng thuốc đối với 2 loại kháng sinh Ampicilin, Amoxicilin chỉ từ 1030%, nhưng năm 2001 tỉ lệ này là 50- 70% và hiện nay đã lên tới trên 90%.
Theo báo cáo của hoạt động theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây
bệnh thường gặp ở Việt Nam năm 2005 thì trong khoảng 22.647 chủng vi khuẩn được xác
định độ nhạy cảm với kháng sinh tại 8 bệnh viện đại diện cho 3 miền Bắc, Trung, Nam,
kết quả cho thấy 5 vi khuẩn vẫn thường gặp nhất là: E. coli (13,3%), trực khuẩn mủ xanh
(13,3%), Staphylococcus (9,3%), Acinetobacter (9,9%) và Klebsiella (15,1%). Cả 5 loại
vi khuẩn này đều đề kháng với nhiều kháng sinh trong điều trị. Ngày nay, con người đã
dần thay đổi phương hướng sử dụng thuốc trong điều trị bệnh. Các sản phẩm có nguồn
gốc từ thiên nhiên đang dần được sử dụng rộng rãi và phổ biến hơn trong điều trị một số
bệnh, trong đó đặc biệt là điều trị nhiễm khuẩn do vi sinh vật gây ra. (Huỳnh Thị Ngọc
Lan, Hồ Ánh Nguyệt, Lâm Thị Ngọc Phương, 2014)
Tinh dầu tràm gió đã chứng minh được tính kháng khuẩn tốt trên các vi khuẩn S.
aureus, P. aerusinosa. Việc tiếp tục nghiên cứu tính kháng khuẩn của tinh dầu này trên
các vi khuẩn khác sẽ mở ra khả năng ứng dụng cao hơn của tinh dầu này trên lâm sàng
bởi vì việc kiểm soát sự nhiễm khuẩn một cách nhanh chóng và hiệu quả là rất cần thiết
và là yếu tố quyết định trong điều trị các vết thương nhiễm trùng.
Tôi chọn thực hiện đề tài “ Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Bacillus subtilis
và Salmonella typhymurium của tinh dầu lá tràm gió (Melaleuca Cajuputi Powell). Đề

tài nhằm hướng tới các mục tiêu chính sau:
- Ly trích tinh dầu từ lá tràm gió theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước.
- Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn của tinh dầu tràm gió trên 2 chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633 và Salmonella typhymurium ATCC
14028.

6


CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về tinh dầu
2.1.1. Định nghĩa tinh dầu
Tinh Dầu là một hỗn hợp của nhiều thành phần. Thường có mùi thơm, không tan
trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi ở nhiệt độ thường. Có thể điều chế từ
thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước.
Tinh dầu từ trước đến nay luôn mang lại cảm giác tươi mát và thoải mái cho người
sử dụng cả về mặt thể chất lấn tinh thần.
Giọt tinh dầu là một loại chất lỏng cô đặc lại và có hình dạng giống như những
phân tử dầu nhỏ. Đặc biệt hơn là nó có mùi thơm và rất dễ bay hơi. Một hạt tinh dầu nhỏ
bé nhưng lại là sự hòa trộn đặc biệt tinh tế của những chất chiết xuất hoàn toàn từ thiên
nhiên. Gọi là “dầu” nhưng trong thực tế chúng không hề chứa chất béo nào cả và cũng dễ
phai nhanh vì khả năng bay hơi rất nhanh.
Các nhà khoa học đồng ý rằng tinh dầu có thể thực hiện nhiều hơn một chức năng
trong thực vật. Trong một số trường hợp, tinh dầu dường như là một phần hệ miễn dịch
của cây. Trong trường hợp khác, tinh đầu có thể chỉ đơn giản là sản phẩm cuối cùng của
quá trình trao đổi chất. Tinh dầu chứa hàng trăm thành phần hữu cơ, bao gồm hormone,
vitamin và những thành phần tự nhiên khác với hoạt tính khác nhau. Độ cô đặc của chúng
gấp 75 đến 100 lần so với dầu trong các loại thảo mộc khô.
Tinh dầu được chiết xuất từ những phần rất nhỏ của các loài thực vật, thậm chí từ

rễ, cánh hoa, hạt hay vỏ. Người ta sẽ chiết xuất bằng phương pháp chưng cất hoặc làm
lạnh. Mỗi loại thực vật khác nhau sẽ cho ra tinh dầu với số lượng khác nhau ở nhiều mức
nhiệt độ.
Chẳng hạn, 100 kg cánh hoa có thể sản xuất ra 20 mL tinh dầu hoa hồng, trong khi
đó 100 kg lá có thể sản xuất ra nhiều hơn ở mức 1-1,5 lít tinh dầu bạc hà. Điều này sẽ chỉ
quyết định đến giá thành của từng loại tinh dầu mà không hề ảnh hưởng đến chất lượng,
hiệu quả của mỗi loại. (Lê Ngọc Thạch, 2003)
2.1.2. Lịch sử phát triển tinh dầu
Tinh dầu là một loại chất lỏng được tinh chế (thông thường nhất là bằng cách
chưng cất bằng hơi hoặc nước) từ lá cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây, hoặc những thành
phần khác của thực vật.

7


Với lịch sử phát triển hàng ngàn năm, tinh dầu được mệnh danh là báu vật của
thiên nhiên, được phát triển thành phương pháp trị liệu, chăm sóc sức khỏe, làm đẹp trên
toàn thế giới.
Tinh dầu thực vật đã được dùng trong những nền văn minh cổ đại vào thời gian
cách đây khoảng 6.000 năm hoặc xưa hơn.

Hình 2.1. Người Ai Cập đã sử dụng tinh dầu cách đây hàng ngàn năm
Người Ai Cập cổ đại dùng phương pháp ngâm chiết để trích ly tinh dầu từ các loại
cây cỏ có mùi thơm, và hương trầm có lẽ là một trong những phương cách cổ xưa nhất
trong việc sử dụng hương liệu. Người Ai Cập rất thông thạo việc ướp xác bằng hương liệu
để bảo quản cơ thể. Họ cũng thường dùng dầu thơm để xoa bóp cơ thể.
Người Hy Lạp tiếp tục sử dụng tinh dầu thơm và dùng các loại dầu này cho cả hai
mục đích điều trị và trang điểm. Một y sĩ Hy Lạp (Pedcaius Dioscorides) đã viết một
quyển sách về một loại thảo dược, và trong ít nhất 1200 năm sau đó sách này được dùng
làm tham khảo cho Tây y. Nhiều phương thuốc ông đưa ra cho đến nay vẫn còn được

dùng trong liệu pháp hương.
Người La Mã sao chép phần lớn kiến thức y khoa từ người Hy Lạp và đã cải thiện
khả năng sử dụng các hương liệu, khi La Mã trở thành kinh đô của thế giới cổ đại. Sau khi
tắm, họ thường xức dầu và xoa bóp. Họ bắt đầu nhập các sản phẩm hương liệu mới từ
Đông Ấn và Ả Rập khi đã mở mang các tuyến đường mậu dịch.
8


Kiến thức về các loại dầu hương liệu và nước hoa đã được truyền bá đến vùng
Viễn Đông và Ả Rập, một y sĩ tên Avcenna (980 – 1037 SCN) đã lần đầu tiên dùng một
quy trình gọi là chưng cất để cất ra tinh dầu hoa hồng.
Các thời kì văn minh Trung Hoa cổ đại cũng dùng một số các hương liệu đồng thời
với người Ai Cập. Thần Nông là quyển sách y học cổ xưa nhất hiện nay vẫn còn tại Trung
Quốc, được viết ra khoảng 2700 năm TCN và có ghi chép về hơn 300 loài dược thảo.
Người Trung Hoa đã dùng các loại hương liệu và đốt các loại gỗ thơm và hương trầm để
thực hành tín ngưỡng.
Y học cổ truyền Ấn Độ gọi là Ayurveda, liệu pháp đã được thực hành từ hơn 3000
năm qua, với việc xoa bóp bằng dầu thơm là một trong những công đoạn chính.
Người Tây Ban Nha có số lượng dược thảo trồng trong các vườn nhà của họ rất
nhiều, người da đỏ ở Bắc Mỹ cũng dùng dầu hương liệu và đưa ra những phương thuốc trị
bệnh của họ bằng dược thảo.
Giữa thế kỉ 19, tinh dầu được tập trung nghiên cứu và trở thành một phương pháp
trị liệu tổng thể và phổ cập tại nhiều nước như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Anh ,
Pháp…
2.1.3. Vai trò của tinh dầu đối với đời sống của thực vật
Vấn đề về vai trò của tinh dầu trong đời sống của cây đã được đề cập tới trong rất
nhiều công trình nghiên cứu. Theo quan niệm được trình bày trong các công trình khác
nhau, vai trò của tinh dầu được quy tụ trong các nội dung sau đây (Ph. X. Tanaxienco,
1985):
- Bảo vệ cây khỏi các tác động của sâu bệnh.

- Che phủ các vết thương ở cây gỗ.
- Ngăn chặn các bệnh do nấm.
- Biến đổi sức căng bề mặt của nước trong cây, thúc đẩy sự vận chuyển nước, tăng
hiệu quả của các phản ứng enzym.
Khi nghiên cứu vấn đề này, Charabot cho rằng tinh dầu đóng vai trò như các chất
dự trữ trong cây, nó có khả năng vận chuyển đến các phần khác nhau của cây, tại đây tinh
dầu được sử dụng như một nguồn năng lượng hay tạo thành các sản phẩm mới có cấu trúc
gần với nó.
Theo quan điểm của Tschirch (1925) trong đời sống của cây, tinh dầu giữ vai trò
quan trọng (tuy nhiên, theo tác giả chưa thể biết rõ đó là vai trò gì) và vì vậy không nên
xếp tinh dầu vào nhóm các chất tiết một cách tuyệt đối. Khác với Charabot, Tschirch cho
9


rằng đôi khi tinh dầu được “lưu giữ lại” trong các bể chứa tinh dầu và không tham gia vào
các phản ứng tiếp theo.
Phân tích các giả thuyết về vai trò của tinh dầu trong đời sống thực vật, Coxtrisep
X. P. (1937) cho rằng tinh dầu có thể được xếp vào 2 nhóm chức năng:
- Nhóm các tinh dầu có chức năng sinh lý được cây sử dụng trong quá trình sinh
trưởng.
- Nhóm các tinh dầu không có chức năng sinh lý, không được cây sử dụng, chúng
đơn thuần chỉ là các chất tiết của cơ thể và được tích lũy trong các bể chứa tinh dầu.
Như vậy, theo quan điểm này, các thành phần của tinh dầu được tích lũy trong tuyến tiết
không có vai trò sinh lý trong hoạt động sống của cây. Trong khi đó theo quan điểm thông
thường, tinh dầu thực vật chính là sản phẩm của quá trình tổng hợp và tích lũy do các cơ
quan tiết đảm nhiệm.
Những năm sau này, khi dùng carbon đánh dấu để nghiên cứu quá trình chuyển
hóa tinh dầu trong cơ thể sống, Mutxtiatse (1985) đã chứng minh rằng, các thành phần
tinh dầu được tích lũy trong tuyến tiết không phải là các chất tiết cố định mà còn tham gia
tích cực vào quá trình trao đổi chất của cây, do vậy thành phần hóa học của tinh dầu ở

trong cây luôn luôn được đổi mới.
Những năm gần đây, vai trò sinh lý của tinh dầu trong đời sống thực vật được
thống nhất trong hầu hết các tài liệu đã công bố. Tuy nhiên, chức năng cụ thể của từng
hợp chất còn phải được nghiên cứu sâu hơn.
Qua các bằng chứng thực nghiệm, có thể khẳng định chắc chắn rằng, nhiều thành
phần hóa học của tinh dầu, ví dụ một số acid có phân tử lượng thấp, rượu, các aldehyde
mạch vòng … là những nguyên liệu khởi đầu để tổng hợp hàng loạt các chất có hoạt tính
sinh học. Trong thành phần của tinh dầu, có thể gặp hàng loạt các chất khởi nguyên nói
trên, các acid hữu cơ thường gặp gồm: acid acetic, acid valerianic, acid isovalerianic …,
và các rượu tương ứng với chúng, ngoài ra còn thường gặp các aldehid, các ester, một số
terpenoid như geraniol, linalool, pharnesol, nerolydol … Đó là những hợp chất liên quan
tới nhiều kiểu cấu trúc hóa học khác nhau và tham gia vào các hệ thống đồng hóa khác
nhau. Trong thành phần tinh dầu còn thường thấy các hợp chất có nhân thơm như aneton,
1-phenylethanol, benzaldehyde, vanilin, thậm chí cả các hợp chất có chứa nitơ và lưu
huỳnh. Vì vậy không thể lý giải vai trò của tinh dầu một các chung chung hoặc nhìn nhận
vấn đề chỉ trong một vài giả thuyết cụ thể nào đó. Để đánh giá chính xác vai trò của tinh
dầu trong hoạt động sống ở cây, cần phải tiến hành nghiên cứu từng thành phần riêng lẻ
của tinh dầu hoặc các hợp chất có cấu trúc gần nhau.
10


Hiện nay, các bằng chứng xác đáng chủ yếu tập trung vào sự tham gia của các
thành phần tinh dầu trong quá trình trao đổi chất, có nghĩa là tinh dầu tham gia vào các
quá trình sinh lý hóa bên trong tế bào. Và nhiều kết quả nghiên cứu gần đây đã chứng
minh rằng, một số dạng terpenoid của tinh dầu như các geraniol, linalool, farnesol …
thường có mặt trong hầu hết các cơ thể sống ở tất cả các mức độ tiến hóa khác nhau, từ
các vi sinh vật, các loài thực vật bậc thấp, thực vật bậc cao, đến cả động vật cũng như con
người. Các terpen được hình thành từ 2,3 hoặc nhiều phân tử isopren (C 5H8) và isopren lại
là một trong những hợp chất cơ sở để tạo thành các carotenoid, các steroid và cao su. Các
kết quả nghiên cứu tiếp theo đã xác nhận rằng, quá trình sinh tổng hợp trong mọi cơ thể

thực vật đều bắt nguồn từ hợp chất ban đầu là acid acetic qua các sản phẩm trung gian là
acid mevalonic, isopentenil pirophosphat đến geranil và farnesil phosphat. Bằng thực
nghiệm, người ta đã chứng minh được các chuỗi carbon trong các phân tử geraniol,
linalool, farnesol và nerolidol là những sản phẩm trung gian chủ yếu trong quá trình sinh
tổng hợp các terpenoid có hoạt tính sinh học như các phyton, hocmon steroid, acid mật,
các vitamin D, vitamin K, vitamin E, các carotenoid, các chất kích thích sinh trưởng thuộc
nhóm giberilin … Một số hợp chất thường gặp trong thành phần của tinh dầu như
linalool, farnesol, nerolidol … luôn có mặt trong hầu hết các hoạt động sống của cây.
Người ta cũng đã chứng minh được rằng, trong cơ quan tiết của cây cao su Heven
brasiliensis (Willd. Ex. A. Juss. Mull.-Arg.), cùng với các phân tử cao su còn có acid
nucleic, các hệ men …, một hỗn hợp của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cùng tham
gia duy trì các quá trình trao đổi chất. Tinh dầu không chỉ được tích lũy ở các cơ quan tiết
riêng biệt mà còn gặp trong các tế bào sống ở nhiều cơ quan khác nhau của thực vật: trong
cánh hoa, đài hoa, trong rễ, trong thân, trong quả …). Trong cơ thể thực vật, tinh dầu
thường là một hỗn hợp có thành phần cấu tạo phức tạp, chúng thường gồm rất nhiều hợp
chất ở dạng tự do hoặc liên kết. Ví dụ, bằng cách sử dụng nguyên tử carbon đánh dấu
trong thử nghiệm trên cây cà rốt Dacus carota L., chúng ta có thể nhận thấy có sự chuyển
hóa của geraniol vào citral và citral lại được chuyển vào geraniol.
Chúng ta cũng có thể nhận thấy rằng, trong tinh dầu, các hợp chất có chứa nhóm
rượu bậc I, bậc II luôn có mặt cùng với các hợp chất carbonil tương ứng. Các geraniol –
citral, citronellol – citronellal, carvol – carvon, rượu và các chất tương ứng này (các
ceton, aldehyde) luôn thay đổi trong quá trình phát triển cá thể ở cây: giảm ceton thì tăng
rượu hoặc ngược lại, nhưng tổng rượu và ceton luôn ổn định. Như vậy giữa rượu và ceton
hoặc aldehyde tương ứng luôn tồn tại một cân bằng động, mà cân bằng này có quan hệ

11


chặt chẽ với quá trình phát triển cá thể của cây cũng như các yếu tố ngoại cảnh theo
những quy luật nhất định. (Lê Ngọc Thạch, 2003)

2.1.4. Nguyên liệu sản xuất tinh dầu
Hiện nay người ta đã biết được rằng các tinh dầu có trong 298 họ cây khác
nhau, trong đó có 87 họ có giá trị.
Sau đây là ba họ có nhiều loài cho tinh dầu:
Họ Cúc (Asteraceae)
Là họ cây tinh dầu lớn nhất bao gồm h ơn 1000 giống và 25000 loài. Đây là một họ
rất đa dạng bao gồm: cây xanh quanh năm, cỏ có căn h ành, cây lưu niên có củ, cỏ mọng
nước hay cỏ thân cứng . Nhiều loại cúc có thể nhận biết nhờ đặc trưnghoa tự của nó. Các
cây họ Cúc chủ yếu trong v ùng bán khô cằn nhiệt đới, cận nhiệt đới, hầu hết trong vùng
Địa Trung Hải, ôn đới, hiếm có ở vùng mưa nhiệt đới.
Họ Hoa Môi (Lamiaceae)
Có mặt hầu như ở khắp mọi nơi trên thế giớ, bao gồm khoảng 200 giống và từ
2000 đến 5000 loài có chứa tinh dầu thường ở dạng cây bụi thấp. Hầu hết họ Hoa Môi
chứa terpene và một số cấu phần khác chủ yếu trong tuyến tinh dầu ở biểu bì của lá, thân.
Họ Hoa tán, Ngò (Umbellifferae, Apiaceae)
Là một họ lớn gồm khoảng 300 giống v à 3000 loài có hương thơm, được phân bố
khắp nơi. Các cây thuộc họ này có đới sống bán niên hoặc nhất niên, chiều cao thay đổi từ
vài cm đến vài m, hầu hết được dùng làm hương liệu, sản xuất tinh dầu dùng trong thực
phẩm, dược phẩm, hương liệu …
Bảng 2.1. Các loài thực vật chứa nhiều tinh dầu phổ biến
Tên khoa học

Tên thuong mại

Họ

Lavandula angusti folia Mill
Mentha arvensis L.
Mentha piperita L.
Mentha spicata L.

Pogostemon patchouly Pellet
Citrus aurantilfolia Christm.
Citrus aurantium L.
Citrus limon Burm.
Cymbopogon spp. Spreng.
Vetiveria zizanioides Nash.
Litsea cubeba Lam.
Sassafras albidum Trew.
Eucalyptus spp.

Lavender - Oải hương
Conmint - Bạc hà Á
Peppermint - Bạc hà Âu
Spearmint - Bạc hà lục
Patchouli - Hoắc hương
Lime - Chanh ta
Orange - Cam
Lemon - Chanh tây
Citronella - Sả
Vetiver - Hương bài
Màng tang
Sassafras - Xá xị
Eucalyptus - khuynh diệp

Lamiaceae

12

Rutaceae
Poaceae

Lauranceae
Myrtaceae


Eugenia caryopillus Spreng. Clove - Đinh hương
Jasminum spp.
Jasmin - Lài
Cleaceae
Rosa sp.
Rose - Hồng
Rosaceae
Santalum album R.
Sandalwood - Đàn hương
Santalaceae
Thuja occidentalis L.
Thuja
cupressaceae
Tinh dầu có thể chứa ở rễ, căn h ành, thân, cành, lá, hoa, trái, hạt. Tinh dầu ở mỗi
bộ phận trên cùng một cây có thể giống nhau hoặc khác nhau rất nhiều về thành phần hoá
học, hàm lượng tinh dầu, hàm lượng cấu phần chính. Để phù hợp với quá trình sơ bộ chế
biến nguyên liệu và các điều kiện kỹ thuật khai thác riêng cho từng loại nguyên liệu một,
nhằm hợp lý hoá quá trình sản xuất, nâng cao chất lượng và hiệu quả của thành phẩm,
người ta chia nguyên liệu tinh dầu ra thành những dạng như sau:
- Nguyên liệu quả và hạt: sa nhân, xuyên tiêu, màng tang, thảo quả, phật thủ…
- Nguyên lệu cỏ, lá: cỏ vertiver, lá bạc hà, hương nhu, húng quế, húng chanh, tía tô,
kinh giới, rau má, lá sả, lá tràm…
- Nguyên liệu hoa: hoa hồng, hoa bưởi, đinh hương, hoa hồi…
- Nguyên liệu củ, rễ: củ gừng, riềng, nghệ, h ành, tỏi, xuyên khung, bạch chỉ, bạch
truật, đương quy…
Ngoài ra còn có những nguyên liệu từ dạng gỗ, hoặc vỏ quả (cam, chanh, quýt), vỏ

cây các loại (quế) và các loại nhựa (cánh kiến, thông)… (Vũ Ngọc Lộ, 1996)
2.1.5. Các công dụng của tinh dầu
Là nguyên liệu chính trong dược phẩm, mỹ phẩm & thực phẩm. Được sử dụng rất
nhiều trong trị liệu và chăm sức khỏe trên thế giới từ rất lâu. Khử mùi, tạo hương thiên
nhiên cho hầu hết các doanh nghiệp, gia đình ...
Không có gì là ngạc nhiên khi giá thành của mỗi loại tinh dầu rất cao. Bên cạnh
quy trình chiết xuất phức tạp thì những lợi ích mà tinh dầu mang lại cũng góp phần làm
cho giá thành các loại sản phẩm này cao: tinh dầu có thể giúp khử trùng, giảm sưng tấy,
tăng tuần hoàn máu, giúp làm lành các vết thương hay bỏng một cách nhanh chóng, …
Ngoài ra, về mặt tinh thần tinh dầu giúp đầu óc minh mẫn, thoải mái, tăng cường
khả năng tập trung và lấy lại nguồn cảm hứng. Một số bài nghiên cứu gần đây đã có nhiều
phát hiện thú vị về ảnh hưởng của tinh dầu đối với tinh thần cảm xúc của con người như
nó làm tăng sự hứng thú, dễ thông cảm, khiến con người trở nên ôn hòa hơn.
Tuy nhiên, tăng cường khả năng hấp thụ khí oxy của tế bào là một trong những lợi
ích quan trọng của tinh dầu. Những hạt tinh dầu khiết sẽ sản sinh ra các chất kháng thể và
giải phóng các hormone giảm đau cũng như các chất dẫn truyền dây thần kinh. Mỗi hạt

13


tinh dầu sẽ có tần số giải phóng cao hơn nhiều so với tần số nếu cơ thể tự sản sinh ra. Vì
vậy tinh dầu còn có khả năng chữa một số bệnh.
Một số thực vật, như Rose (Hoa Hồng) hoặc Jasmine (Hoa Nhài) chứa rất ít tinh
dầu. Thành phần mang hương thơm của thực vật được chiết xuất bằng cách sử dụng một
số dung môi hóa chất. Sản phẩm cuối cùng, được gọi là chất toàn hương (absolute), chứa
một ít tinh dầu cùng với những thành phần mang hương khác. Mặc dù đây không thực sự
là tinh dầu, chất toàn hương (absolute) vẫn thường được sử dụng để tạo hương cho mỹ
phẩm, chẳng hạn như nước hoa cao cấp.
Ngoài ra, có sự khác biệt đáng kể giữa hương liệu thơm hóa tổng hợp (synthetic
fragrance oil) và tinh dầu nguyên chất (pure essential oil). Dầu thơm hóa tổng hợp được

sản xuất bằng cách pha trộn những hóa chất có mùi thơm chủ yếu có nguồn gốc từ nhựa
than đá. Những loại dầu này có thể bắt chước khá giống các mùi thơm của tinh dầu
nguyên chất, nhưng thành phần hóa học phức tạp của tinh dầu nguyên chất mới chính là
yếu tố xác định lợi ích thật sự của tinh dầu.
Trong khi hương liệu thơm hóa tổng hợp (synthetic fragrance oil) không phù hợp
với liệu pháp tinh dầu, người ta vẫn dùng để thêm những mùi hương bắt chước này vào
hàng thủ công, hương liệu hỗn hợp, xà phòng, nước hoa để giảm giá giá thành.
Ngoài ra, có sự khác biệt đáng kể giữa hương liệu thơm hóa tổng hợp (synthetic
fragrance oil) và tinh dầu nguyên chất (pure essential oil). Dầu thơm hóa tổng hợp được
sản xuất bằng cách pha trộn những hóa chất có mùi thơm chủ yếu có nguồn gốc từ nhựa
than đá. Những loại dầu này có thể giả các mùi thơm của tinh dầu nguyên chất, nhưng
thành phần hóa học phức tạp của mỗi tinh dầu tạo ra trong tự nhiên xác định lợi ích thật
sự hương thơm của tinh dầu.
Trong khi hương liệu thơm hóa tổng hợp (synthetic fragrance oil) không phù hợp
với liệu pháp tinh dầu, người ta thêm những mùi hương bắt chước này vào hàng thủ công,
hương liệu hỗn hợp, xà phòng hay nước hoa để giảm giá giá thành. (Văn Ngọc Hướng,
2003)
2.2. Tổng quan về Tràm gió
Tên khoa học: Melaleuca cajuputi Powell
Tên đồng nghĩa: Myrtus leucadendra L., 1759, Myrtus saligna Burm. f., 1786,
Melaleuca leucadendra (L.) L., 1767, Melaleuca minor Smith, 1812, Melaleuca
leucadendron (L.) L. var. minor (Smith) Duthie, 1878.
Tên khác: Chè cay, chè đồng, khuynh diệp, bạch thiên tầng.
Họ: Sim - Myrtaceae
14


Tên thương phẩm: Cajeput oil, cineol oil, 1,8-cineol oil.
2.2.1. Phân loại
Melaleuca cajuputi Powell subsp. cajuputi: hoa nở vào tháng 3 đến tháng 11. Cây

phát triển và phân bố ở bán đảo Dampier, sông Calder, Tây Úc và Đông Timor.
Melaleuca cajuputi subsp. cumingiana ( Turcz.) Barlow: hoa nở từ tháng 2 đến
tháng 12. Rừng tràm gió phân bố ở ven biển Việt Nam, Myanmar, Thái Lan, Malaysia và
Indonesia.
Melaleuca cajuputi subsp. platyphylla Barlow: hoa nở từ tháng 1 đến tháng 5 và
tháng 8 đến tháng 9. Cây phát triển ở New Guinea, đảo Torres Strait và tây bắc
Queensland.
2.2.2. Hình thái
Cây gỗ nhỏ hay trung bình, thường xanh, cao 10-15 m (đôi khi tới 20-25 m), và
đường kính có thể đạt 50-60 cm. Đôi khi là cây bụi, cao 0,5-2 m, nếu mọc ở vùng đồi cằn
cỗi thân thường không thẳng, vỏ ngoài mỏng, xốp, màu trắng xám, thường bong thành
nhiều lớp. Hệ rễ phát triển mạnh. Lá đơn, mọc so le, phiến lá hình mác hay hình trái xoan
hẹp, thường không cân đối, kích thước 4-8 (-10) x 1-2,0 (- 2,5) cm, đầu nhọn hoặc tù, gốc
tròn hoặc hơi hình nêm, dày, lúc non có lông mềm màu trắng bạc, sau nhẵn, màu xanh
lục, gân chính 5 (đôi khi 6), hình cung, cuống lá ngắn, có lông.

Hình 2.2. Cây tràm gió trong tự nhiên

Hình 2.3. Hình thái sinh học của cây Tràm gió
15


Cụm hoa bông mọc ở đầu cành hay nách lá. Hoa nhỏ, màu trắng, trắng xanh nhạt,
trắng vàng nhạt hoặc trắng kem, đài hợp ở gốc thành ống hình trụ hay hình trứng, 5 thuỳ
đài rất ngắn, cánh tràng 5, có móng rất ngắn (các thuỳ đài và cánh tràng đều sớm rụng),
nhị nhiều, hợp thành 5 bó, xếp đối diện với thuỳ đài, đĩa mật chia thuỳ, có lông mềm, bầu
ẩn trong ống đài, 3 ô.
Quả nang gần hình chén hoặc hình bán cầu hoặc hình cầu, kích thước 3- 3,5x3,54mm, khi chín nứt thành 3 mảnh. Hạt hình nêm hoặc hình trứng. Sau khi hoa nở, tạo quả,
trục cụm hoa tiếp tục sinh trưởng, phát triển tạo thành từng đoạn mang hoa quả và mang
lá xen kẽ nhau.

2.2.3. Đặc điểm sinh học
Tràm (M. cajuputi) có biên độ sinh thái rộng. Song rừng tràm nguyên sinh thường
phân bố trên các bãi cửa sông, các bãi lầy ven biển trong vùng nhiệt đới nóng, ẩm. Tràm
sinh trưởng tốt ở những khu vực có nhiệt độ trung bình tối đa khoảng 31-330 oC và trung
bình tối thấp khoảng 17-220oC. Tràm không chịu được băng giá. Các khu vực tràm phân
bố tập trung thường có lượng mưa trung bình năm 1.300-1.700 mm và có gió mùa điển
hình. Ở nước ta, “tràm đồi” thường mọc trong các thảm cây bụi ưa sáng, trên các đồi đất
thấp, đất feralit, đất cát, đất pha cát, đất lầy phèn mặn, đất khô hạn hay ngập nước theo
mùa, đất chua (pH 3,7-5,5) và nghèo dinh dưỡng. Dạng “tràm cừ” mọc trên các khu vực
đất phèn ngập nước theo mùa hay thường xuyên thuộc vùng Đồng Tháp Mười, như ở các
tỉnh Long An, An Giang, Đồng Tháp, Cà Mau, Kiên Giang. Tại khu vực này, đất thường
có thành phần cơ giới nặng, rất chua (pH 3-3,5), giàu mùn hoặc tích tụ thành lớp than bùn
dày 0,3-1,0 m.
Tràm là cây lâu năm, ưa sáng và có bộ tán thưa. Trong tự nhiên, tràm phát tán, tái
sinh từ hạt, từ gốc hoặc từ rễ. Tràm cừ có tốc độ tăng trưởng khá nhanh, có thể đạt tới 2,3
m/năm theo chiều cao và 7 cm/năm theo đường kính thân. Với điều kiện nước ta, cây
thường bắt đầu ra hoa ở giai đoạn 2-3 tuổi. Hoa thụ phấn chéo nhờ côn trùng là chủ yếu.
Tại các tỉnh miền Trung, tràm thường ra hoa vào tháng 10-12 và quả chín vào các tháng
1-3 năm sau.
2.2.4. Phân bố
Tràm mọc nhiều ở vùng đồi núi và đầm lầy của nhiều nước Đông Nam Á:
Indonesia, Việt Nam, Philippin, Myanmar, Malaysia, Campuchia.
Ở Việt Nam, tràm mọc cả ở 2 miền Bắc và Nam nhưng tập trung nhiều ở các tỉnh
phía Nam: Long An, Đồng Pháp, Hậu Giang, An Giang, Kiên Giang, Cà Mau. Diện tích
tràm mọc tự nhiên ở các tỉnh phía Nam ước tính 120.000 ha.
16


2.2.5. Bộ phận dùng
Cành mang lá - Ramulus cum folio Melaleucae

Tinh dầu - Oleum Cajeputi.
Đặc điểm vi học của lá tràm:
- Biểu bì có lớp cutin dày mang nhiều lỗ khí ở cả 2 mặt lá.
- Mô mềm giậu có từ 1 đến 2 hàng tế bào ở cả 2 mặt của phiếu lá.
- Bó libe gỗ được bao bọc bởi 1 vòng nội bì và 1 vòng sợi trụ bì.
- Các túi tiết tinh dầu nằm rải rác trong mô mềm.
2.2.6. Thành phần hóa học
Lá có chứa tinh dầu. Hàm lượng tinh dầu thay đổi theo từng vùng và theo mùa ở
các tỉnh miền Trung. DĐVN IV qui định hàm lượng tinh dầu không dưới 1% (tính trên
nguyên liệu khô tuyệt đối).
Tinh dầu tràm gió, Oleum Cajeputi, tên thương phẩm Cajeput oil là chất lỏng màu
vàng nhạt, mùi dễ chịu, d20 : 0,910 - 0,925, nD20 : 1,466 - 1,472, D20 : - 30 đến – 10.
Thành phần chính là cineol. Hàm lượng cineol thay đổi theo từng vùng. Tinh dầu
tràm Long An chứa từ 52 đến 69% cineol, Quảng Bình 51 - 72%. Ngoài ra trong tinh dầu
còn có chứa một hàm lượng đáng kể linalol (2 - 5%) và terpineol (6 - 11%).
2.2.7. Công dụng
Tràm gió được trồng và sử dụng như nguồn nhiên liệu, làm than ở Đông Nam Á.
Gỗ cây Tràm gió còn được dùng làm cột, sàn nhà, hàng rào,… Vỏ cây được dùng làm
nguyên liệu để lợp, tráng kín thuyền,…
Người Úc bản địa đã sử dụng lá của loài này để chữa bệnh đau nhức, trị bệnh về
đường hô hấp. Tại Thái Lan, lá tràm gió được sử dụng để chế trà thảo dược để trị bệnh.
Cây Tràm Gió được dùng chủ yếu để chiết xuất tinh dầu tràm gió Cajuput, hay còn gọi tắt
là dầu tràm. Tnh dầu tràm gió trên thị thường hầu hết là từ loại Melaleuca cajuputi subsp.
cajuputi.
Dầu Tràm chứa đến 60% 1,8 – cineole (Cineol), thành phần kháng khuẩn chính tạo
nên tác dụng của của dầu. Dầu tràm gió được phân loại là không độc, không nhạy cảm
(mặc dù kích ứng da có thể xảy ra ở nồng độ cao). Dầu tràm có nhiều tác dụng hữu ích
như chữa bệnh đường hô hấp, an thần, điều trị giun, nhiễm trùng đường sinh dục, đuổi
côn trùng,…
Lá tràm (ngọn mang lá) được dùng trong phạm vi nhân dân để chữa cảm phong

hàn, tiêu hoá kém, ho có đờm.

17


Tinh dầu tràm và cineol có tác dụng sát khuẩn đường hô hấp, kích thích trung tâm
hô hấp, chữa viêm nhiễm đường hô hấp. Có khoảng hơn 200 chế phẩm có cineol. Tinh
dầu tràm còn có tác dụng kháng khuẩn, làm lành vết thương, chữa bỏng, làm chóng lành
da. Từ nước ót tinh dầu khi đã loại cineol đã chiết xuất được linalol và terpineol.
Terpineol có tác dụng kháng khuẩn mạnh.
Tinh dầu tràm được sử dụng để tạo hương vị cho thực phẩm, xà phòng, mỹ phẩm,
… và trong liệu pháp hương thơm Aromatherapy. (Nguyễn Năng Vinh, 1977)

2.3. Tổng quan về chủng vi khuẩn nghiên cứu
2.3.1. Salmonella typhimurium
2.3.1.1. Đặc điểm sinh vật học
Salmon phân lập từ năm l885 giống như các vi khuẩn đường ruột khác: Hình trực,
Gram âm, có nhiều lông nên di động.
Nuôi cấy: Trong môi trường canh thang, mọc nhanh, sau 10 giờ và làm đục môi
trường. Môi trường thạch thường, Salmonella phát triển tốt sau 24 giờ, tạo khuẩn lạc dạng
s màu trắng xám.

Hình 2.4. Vi khuẩn Salmonella typhymủium soi trên kính hiển vi
2.3.1.2 . Tính chất sinh vật hoá học
- Lên men và sinh hơi đường glucose (trừ Salmonella typhi lên men nhưng không
sinh hơi).
- Không lên men đường lactose, saccharose.
- Sinh H2S trong môi trường thạch chì.
- Không sinh indol trong môi trường pepton.
- Không có urease, có enzym catalase.

- Không chuyển hoá được citrat trong môi trường Simmons.
2.3.1.3. Sức đề kháng
18


- Ở tự nhiên: Trong nước sống được 1 tuần, trong phân sống được 2 tháng. Đây là lý
do để bệnh lan thành dịch lớn.
- Với nhiệt độ cao: Chịu đựng kém (vi khuẩn bị chết ở 50°C/sau 1 giờ và 100°C/sau
5 phút).
- Với các hoá chất sát trùng: Bị tiêu diệt bởi các thuốc sát trùng ở nồng độ thông
thường như phenol 5%, HCl 1/500, v.v...
2.3.1.4. Độc tố
Có nội độc tố với các đặc điểm:
- Là độc tố chính trong việc gây bệnh.
- Có độc lực cao: 400 mg/chết người.
- Có khả năng chịu nhiệt độ cao: Ở 100°C sau 2 giờ vẫn còn tác dụng.
- Gây tổn thương: Ruột non, dạ dày, mảng payer, tuyến thượng thận, tim, não thất
Ш.
2.3.1.5. Kháng nguyên
Có 2 loại chính
- Kháng nguyên O: Có tính đặc hiệu cao, tạo được miễn dịch sớm (kháng thể xuất
hiện sau 7 ngày và hết sau 3 tháng) vì thế được dùng trong chẩn đoán bệnh thương hàn.
- Kháng nguyên H: Tạo miễn dịch muộn và hết muộn (kháng thể xuất hiện sau 12
ngày và hết sau 1 năm), thường đùng trong điều tra dịch tễ bệnh thương hàn.
2.3.1.6. Phân loại:
Salmonella được phân loại dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên. Hiện
nay có khoảng 1.500 typ huyết thanh (còn gọi là loài) Salmonella. Đặt tên cho mỗi loài
Salmonella mới tìm ra có thể lấy tên động vật mang mầm bệnh hoặc tên địa phương đã
phân lập ra chúng lần đầu tiên.
Sau đây là một số loài Salmonella đáng được chú ý nhất:

- S.typhi: Chỉ gây bệnh cho người. Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu do S.typhi
gây ra.
- S.paratyphi A: Cũng chỉ gây bệnh thương hàn cho người. Ở nước ta cũng hay gặp
loài này sau S.typhi.
- S.paratyphi В: Gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi ở cả súc vật. Bệnh
thường gặp ở các nước Châu Âu.
- S.paratyphi С: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn, vừa có khả năng gây viêm
dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết thường gặp ở các nước đông nam Châu Á.
- S.typhimurium và S. enteritidis gây bệnh cho người và súc vật. Hai loài này là
nguyên nhân chủ yếu của nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn do Salmonella.
- S.choleraesuis: Là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do
Salmonella ở nước ta. (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003)
19


2.3.1.7. Khả năng gây bệnh
- Bệnh thương hàn
- Bệnh viêm dạ dày ruột
2.3.2. Bacillus subtilis
2.3.2.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg
và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir
Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác
định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis.
Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học
Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức
chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần
khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng
rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng
ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường

tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…
Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm
năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…
2.3.2.2. Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:
- Giới (Kingdom): Bacteria
- Ngành (Division): Firmicutes
- Lớp (Class): Bacilli
- Bộ (Order): Bacillales
- Họ (Family): Bacillaceae
- Giống (Genus): Bacillus
- Loài (Species): Bacillus subtilis

20


2.3.2.3. Đặc điểm của Bacillus subtilis
a. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ
khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 10 6 –
107 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của
chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì
(trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo,
trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về
mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học.
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi
một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là
vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae,
Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi

trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB).
Năm 1993, giáo sư Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston (Mỹ)
và Jose Gonzalez-Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Madrid (Tây Ban
Nha) đã chứng minh được loài Bacillus subtilis có tập tính ăn thịt đồng loại. Chúng dùng
cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời sống giới
hạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt. Một cách đơn giản là các cá thể khỏe
mạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả khác loài lẫn cùng
loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ đến khi môi trường
thuận lợi hơn. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng
thường tạo ra bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng. (Nguyễn Lân Dũng
và cộng sự, 2003)
b. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước
0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có
8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước
từ 0,8 – 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng
acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ,
áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng
cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 – 300 năm.

21


Hình 2.5. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi
c. Đặc điểm sinh hóa
Lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol,
saccharose, xylose và arabinose.
Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H 2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase
(+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+).

Hình 2.6. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtillis
2.3.2.4. Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát
triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37 oC, pH thích hợp khoảng 7,0 –
7,4.
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ
bản:
22


- Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa
răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn
nheo, màu hơi nâu.
- Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục
môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.
- Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan
rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4cm sau 72 giờ nuôi cấy.
Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi
lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như
glucose) và nitơ (như peptone).
2.3.2.5. Bộ gen của Bacillus subtilis
Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus
subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn này. Bộ gen chứa 4,2 mega-base,
xấp xỉ 4.110 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán
là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào.
2.3.2.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử
a. Bào tử:
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản
như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có
thêm một số thành phần mới.

Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0
– 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein,
peptidoglycan…
Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảy
mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất
probiotic từ Bacillus subtilis.
b. Khả năng tạo bào tử:
Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất
lợi (dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi chất
có hại và nhiệt độ cao…).
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:
- Hình thành những búi chất nhiễm sắc.
- Tạo tiền bào tử.
- Tiền bào tử hình thành hai lớp mảng, tăng cao tính bức xạ.
- Tổng hợp các lớp vỏ bào tử.
- Giải phóng bào tử.
23


- Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh
dưỡng mới. (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003)
2.4. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Phương pháp này dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo hơi nước
của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở
nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên
liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định. Trường hợp mô thực vật
có chứa sáp, nhựa, acid béo chi phương dây dài thì phải dùng nhiều hơi nước hơn và sự
chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp
suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn.

Hình 2.7. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước bằng bộ clevenger
2.4.1. Lý thuyết chưng cất
Chưng cất có thể được định nghĩa là: “Sự tách rời các cấu phần của một hỗn hợp
nhiều hợp chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng”. Trong trường hợp
đơn giản, khi chưng cất một hỗn hợp gồm hai hợp chất lỏng không hòa tan vào nhau, áp
suất hơi tổng cộng là tổng của hai áp suất hơi riêng phần. Do đó, nhiệt độ sôi của hỗn hợp
sẽ tương ứng với một áp suất hơi tổng cộng xác định, không tùy thuộc vào thành phần
bách phân của hỗn hợp, miễn là lúc đó hai pha lỏng vẫn còn tồn tại. nếu vẽ đường cong áp
suất hơi của từng hợp chất theo nhiệt độ, rồi vẽ đường cong áp suất hơi tổng cộng, thì ứng
với mỗi áp suất ta dễ dàng suy ra nhiệt độ sôi tương ứng của hỗn hợp và nhận thấy là
nhiệt độ sôi của hỗn hợp nhiêt độ sôi của hỗn hợp luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của
từng hợp chất. Ví dụ: Ở áp suất 760 mmHg nước sôi ở 100ºC và benzene sôi ở 80ºC và
chúng là hai chất lỏng không tan vào nhau. Thực hành cho thấy nếu đung hỗn hợp này
24


dưới áp suất 760 mmHg nó sẽ sôi ở 69ºC cho đến khi nào còn hỗn hợp hai pha lỏng ở bất
kỳ tỷ lệ nào. Giản đồ nhiệt độ thép áp suất cho thấy tại 69ºC áp suất hơi của nước là 225
mmHg và benzene là 535 mmHg.
Chính vì những đặc tính làm giảm nhiệt độ sôi này mà từ lâu phương pháp chưng
cất hơi nước là phương pháp đầu tiên dùng để tách tinh dầu ra khỏi nguyên liệu thực vật.
2.4.2. Những ảnh hưởng chính trong sự chưng cất hơi nước
2.4.2.1. Sự khuếch tán
Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụ thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu là bị vỡ
và cho tinh dầu thoát ra tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi. Phần lớn tinh dầu còn lại
trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩm
thấu. Von Rechenberg đã mô tả quá trình chưng cất hơi nước như sau: “Ở nhiệt độ nước
sôi, một phần tinh dầu hòa tan vào trong nước có sẵn trong tế bào thực vật. Dung dịch này
sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nước lôi cuốn đi. Còn nước đi vào
nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục hòa tan vào lượng nước này. Quy

trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát ra ngoài hết. Như vậy, sự
hiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong trường hợp chưng cất sử dụng hơi nước
quá nhiệt, chú ý tránh đừng để nguyên liệu bị khô. Nhưng nếu lượng nước sử dụng thừa
quá cũng không có lợi, nhất là trong trường hợp tinh dầu có chứa những cấu phần tan dễ
trong nước.
Ngoài ra, vì nguyên liệu được làm vỡ vụn ra càng nhiều càng tốt, cần làm cho lớp
nguyên liệu có một độ xốp nhất định để hơi nước có thể đi xuyên ngang lớp này đồng đều
và dễ dàng. Vì các cấu phần tinh dầu được chưng cất hơi nước theo nguyên tắc nói trên
cho nên thông thường những hợp chất nào dễ hòa tan trong nước sẽ được lôi cuốn trước.
Ví dụ, khi chưng cất hơi nước hạt caraway nghiền nhỏ và không nghiền, đối với
hạt không nghiền thì carvon (nhiệt độ sôi cao nhưng tan nhiều trong nước) sẽ ra trước,
còn limonen (nhiệt độ sôi thấp. nhưng ít tan trong nước) sẽ ra sau. Nhưng với hạt caraway
nghiền nhỉ thì kết quả chưng cất ngược lại.
2.4.2.2. Sự thủy giải
Những cấu phần ester trong tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho ra acid và alcol khi
đun nóng trong một thời gian dài với nước. Do đó, để hạn chế hiện tượng này, sự cất hơi
nước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt.
2.4.2.3. Nhiệt độ
Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu. Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi nước quá
nhiệt (trên 100°C) nên thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của sự chưng cất, sau
25