Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn staphylococcus aureus và escherichia coli của tinh dầu lá tràm gió (melaleuca cajeputi powell)

MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN................................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN..........................................................................................................ii
MỤC LỤC.................................................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH.......................................................................................................v
DANH MỤC BẢNG....................................................................................................vi
TÓM TẮT...................................................................................................................vii
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU.................................................................................................1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU........................................................................2
1. TỔNG QUAN VỀ TRÀM GIÓ..............................................................................2
1.1 Mô tả................................................................................................................2
1.2 Phân bố sinh thái..............................................................................................3
1.3 Trồng trọt và khai thác......................................................................................3
1.4 Bộ phận dùng....................................................................................................3
1.5 Thành phần hóa học..........................................................................................3
1.6 Công dụng của tinh dầu tràm............................................................................3
2. TỔNG QUAN VỀ TINH DẦU..............................................................................4
2.1 Khái niệm tinh dầu...........................................................................................4
2.2 Phân loại tinh dầu.............................................................................................4
2.3 Phân loại tinh dầu theo cấu trúc hóa học..........................................................5
2.4 Tính chất lý hóa của tinh dầu............................................................................5
2.5 Tác dụng sinh học và ứng dụng của tinh dầu trong y học như:.........................5
3. PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT TINH DẦU........................................................6
3.1 Các phương pháp chiết xuất tinh dầu như:.......................................................6
3.2 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.......................................................6
3.3 Pháp pháp vi sóng.............................................................................................9
3.4 Phương pháp siêu âm......................................................................................11
4. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN....................................................13
4.1 Vi khuẩn Staplylococcus aureus.....................................................................13
4.2 Vi khuẩn Escherichia coli...............................................................................16
CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................20

1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU......................................................20
1.1 Thời gian nghiên cứu......................................................................................20
1.2 Địa điểm nghiên cứu.......................................................................................20
2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU.........................................................................20
2.1 Nguyên liệu....................................................................................................20
2.2 Thiết bị...........................................................................................................20
1


2.3 Dụng cụ..........................................................................................................21
2.4 Hóa chất..........................................................................................................21
3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................21
3.1 Trích ly tinh dầu..............................................................................................21
3.2 Xác định thành phần hóa học tinh dầu............................................................21
3.3 Khả năng kháng vi khuẩn...............................................................................21
3.4 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu thực nghiệm........................................................21
4. THỰC NGHIỆM..................................................................................................22
4.1 Ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước..................22
4.2 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của tinh dầu tràm gió..............................24
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................25
1. KẾT QUẢ TRÍCH LY TINH DẦU BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÔI CUỐN HƠI
NƯỚC...................................................................................................................... 25
1.1 Đánh giá cảm quan.........................................................................................25
1.2 Kết quả thành phần hóa học GC - MS (tiểu luận tốt nghiệp Đinh Lê Khánh
Hậu 8G)................................................................................................................ 25
2. KẾT QUẢ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TRÀM GIÓ......28
2.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus của tinh dầu
tràm gió................................................................................................................28
2.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Escherichia coli của tinh dầu tràm gió
.............................................................................................................................. 29

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................31
1. KẾT LUẬN..........................................................................................................31
2. ĐỀ NGHỊ.............................................................................................................31

2


DANH MỤC
Hình 2.1. Lá tràm gió.....................................................................................................2
Hình 2.2. Cây Tràm gió.................................................................................................2
Hình 2.3. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.....................................................6
Hình 2.4. Phương pháp chưng cất bằng vi sóng.............................................................9
Hình 2.5. Hình thái của Staphylococcus aureus............................................................14
Hình 2.6. Quan sát dưới kính hiển vi...........................................................................14
Hình 2.7. Escherichia coli...........................................................................................17
Hình 2.8. Quan sát dưới kính hiển vi...........................................................................17
YHình 3.1. Lò vi
sóng…………………………………………………………………..20
Hình 3.2. Tủ ủ vi sinh..................................................................................................20
Hình 3.3. Tủ cấy vi khuẩn............................................................................................20
Hình 3.4. Nồi khử trùng...............................................................................................20
Hình 3.5. Tủ sấy...........................................................................................................21
Hình 3.6. Tủ hút...........................................................................................................21
Hình 3.7. Sơ đồ tiến hành nghiên cứu..........................................................................22
Hình 3.8. Sơ đồ quy trình chưng cất tinh dầu..............................................................22
YHình 4.1. Tinh dầu tràm
gió…………………………………………………………..25
Hình 4.2. Kết quả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của tinh dầu tràm gió........28
Hình 4.3. Vòng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus ở nồng độ 20 và 40 của tinh
dầu tràm gió.................................................................................................................29

Hình 4.4. Kết quả kháng vi khuẩn Escherichia coli của tinh dầu tràm gió..................29
Hình 4.5. Vòng ức chế vi khuẩn Escherichia coli ở từng nồng độ 20 và 40................30
Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tràm gió....................30

3


DANH MỤC BẢ
Bảng 2.1. Đặc tính của S. aureus.................................................................................14
Bảng 2.2. Đặc tính của E.coli......................................................................................18
YBảng 4.1. Kết quả thành phần hóa học
GCMS………………………………………..26
Bảng 4.2. Công thức phân tử trong tinh dầu tràm gió..................................................27
Bảng 4.3. Kết quả kháng khuẩn Staphylococcus aureus của tinh dầu tràm gió............28
Bảng 4.4. Kết quả kháng khuẩn Escherichia coli của tinh dầu tràm gió......................29

4


TÓM TẮT
Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, có khí hậu nóng ẩm với thảm thực vật
phong phú và cũng là một trong các điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các loại
vi khuẩn. Việc ứng dụng tinh dầu thiên nhiên có tính kháng khuẩn đang được quan tâm
nghiên cứu.
Nội dung nghiên cứu đề tài nhằm giới thiệu tổng quan về tinh dầu tràm gió,
công dụng cũng như cách trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước từ nguyên liệu lá tràm gió được thu hái tại địa phương. Khái quát về hai loại
khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia Coli, sau đó là khảo sát độ kháng khuẩn
của tinh dầu tràm gió sau chưng cất.
Tràm gió trong nghiên cứu này được thu hái ở Cái Răng, Thành phố Cần Thơ

được đem trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Sau đó
đem khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt.
Kết quả thu được tinh dầu tràm gió với hàm lượng khoảng 0,18 % (tương
đương 1,8 mL/kg), tinh dầu thu được có màu vàng nhạt, thơm tự nhiên, tỷ trọng là
0,9130 kết quả GCMS tinh dầu tràm gió. Các hợp chất chính trong đó 1,8-cineol là
thành phần chính (1,34%). Các hợp chất khác có hàm lượng đáng kể gồm α¬terpineol
(1,90%) limonen (0,97%), ledol (10,60%).
Qua nghiên cứu tinh dầu tràm gió có khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus
aureus và Escherichia Coli cao với nồng độ tinh dầu 20 và 40.
Từ những kết quả trên giúp ta có thể xác định được độ kháng khuẩn của tinh
dầu tràm giúp nghiên cứu bào chế ra các loại dược phẩm, thực phẩm chức năng từ tinh
dầu tràm thiên nhiên an toàn và đạt hiểu quả cao nhưng ít tác dụng phụ.

5


CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
Nằm tại một vị trí tự nhiên hiếm có, khí hậu có nhiều nét độc đáo và đa dạng,
Việt Nam được ưu đãi với hệ thống sinh thái phong phú, đa dạng về chủng loại các cây
dược liệu với hơn 12 nghìn loại thực vật, trong đó gần 4 nghìn loại có công dụng làm
thuốc được xếp vào loại quý hiếm trên thế giới như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam
thất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng, Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh
thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú…theo số liệu thống kê từ năm 2001, số loài có chứa tinh
dầu trong hệ thực vật nước ta gồm 657 loài thuộc 357 chi và 114 họ (chiếm 6,3% tổng
số loài, 15,8% tổng số chi, 37,8 tổng số họ). Do vậy Việt Nam có nguồn tài nguyên
thực vật chứa tinh dầu rất tiềm năng. Tràm gió cũng là một trong những loải thực vật
chứa tinh dầu với tác dụng chữa bệnh và mang lại nhiều lợi ích so với tác dụng làm
đẹp của tinh dầu của loại tràm thông thường.
Tinh dầu đã sớm được sử dụng từ thời xa xưa, có khả năng ngăn ngừa và giải
quyết các trường hợp nhiễm trùng, được dùng để làm lành vết thương và xoa bóp trị

liệu. Rất nhiều người lại không biết đến tác dụng tiêu diệt vi khuẩn, nấm, virus của rất
nhiều tinh dầu được ứng dụng để phòng chống bệnh tật và điều trị các bệnh lí về da,
khử trùng bề mặt đồ dùng nhà cửa và loại bỏ vi khuẩn đang tồn tại lơ lửng trong không
khí.
Tinh dầu tràm là một trong ít những tinh dầu có tính kháng khuẩn vì kháng
virus, có thể bôi trực tiếp lên da mà không cần pha với dầu nền, được sử dụng rộng rãi
trong ngành y để điều trị các ca nhiễm trùng da như mụn nhọt, eczema, mụn cóc và
vẩy nến (Đỗ Tất Lợi, 2006).
Do Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm cũng là yếu tố
thuận lợi cho vi khuẩn phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là các chủng vi khuẩn thường gây
hư hỏng và ngộ độc thực phẩm. Gần đây WHO công bố danh sách các vi khuẩn đề
kháng kháng sinh cần ưu tiên nghiên cứu và phát triển kháng sinh mới trong đó có
Staphylococcus aureus kháng Erythromycin ở mức độ ưu tiên cao. Chính vì vậy chúng
tôi thực hiện đề tài này “Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus
và Escherichia coli của tinh dầu lá tràm gió (Melaleuca cajeputi Powell)” việc làm
này cần thiết góp phần vào việc sử dụng các hợp chất thiên nhiên trong lĩnh vực thực
phẩm, dược phẩm nhằm hỗ trợ cho việc điều trị cho bệnh nhân tốt hơn.
Đề tài được thực hiện với các mục tiêu:
 Trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
 Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus và
Escherichia coli của tinh dầu tràm gió.

1


CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1. TỔNG QUAN VỀ TRÀM GIÓ
1.1 Mô tả
Tên thường gọi: Tràm gió.
Tên khoa học: Melaleuca cajeputi Powell.

Họ khoa học: thuộc họ Sim – Myrtaceace.

Hình 2.1. Lá tràm gió

Hình 2.2. Cây Tràm gió
Cây gỗ nhỏ hay trung bình, thường xanh, cao 10-15 m (đôi khi tới 20 - 25 m),
và đường kính có thể đạt 50 – 60 cm. Đôi khi là cây bụi, cao 0,5 – 2 m, nếu mọc ở
vùng đồi cằn cỗi. Thân thường không thẳng, vỏ ngoài mỏng, xốp, màu trắng xám,
thường bong thành nhiều lớp. Hệ rễ phát triển mạnh. Lá đơn, mọc so le; phiến lá hình
mác hay hình trái xoan hẹp, thường không cân đối, kích thước (4 - 8) -10 x (1 - 2)-2,5 cm;
đầu nhọn hoặc tù, gốc tròn hoặc hơi hình nêm, dày, lúc non có lông mềm màu trắng
2


bạc, sau nhẵn, màu xanh lục, gân chính 5 (đôi khi 6), hình cung, cuống lá ngắn, có
lông (Đỗ Tất Lợi, 2006).
Cụm hoa bông mọc ở đầu cành hay nách lá. Hoa nhỏ, trắng xanh nhạt, trắng
vàng nhạt hoặc trắng kem; đài hợp ở gốc thành ống hình trụ hay hình trứng, 5 thuỳ đài
rất ngắn; cánh tràng 5, có móng rất ngắn (các thuỳ đài và cánh tràng đều sớm rụng),
nhị nhiều, hợp thành 5 bó, xếp đối diện với thuỳ đài, đĩa mật chia thuỳ, có lông mềm,
bầu ẩn trong ống đài.
1.2 Phân bố sinh thái
Phân bố rộng rãi khắp nước ta cụ thể theo từng khu vực như:
Phía bắc: Bắc Kạn, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hải Dương, Hà Tây, Nghệ An, Hà
Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Phú Yên.
Phía nam: Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu,
Vĩnh Long, Đồng Tháp, Long An, An Giang, Kiên Giang, Cà Mau.
1.3 Trồng trọt và khai thác
Tràm trồng bằng hạt, có khả năng tái sinh cao. Khai thác quanh năm nhưng vào
mùa mưa hàm lượng tinh dầu ít hơn mùa khô.

1.4 Bộ phận dùng
Cành mang lá
1.5 Thành phần hóa học
Lá tươi của dạng “tràm đồi” thường chứa 0,8 – 1,2 % tinh dầu, trong đó 1,8cineol là thành phần chính (chiếm 46,0-72%). Các hợp chất khác có hàm lượng đáng
kể gồm α¬terpineol (14,03-15,31%) limonen (3,69-3,98%), linalool (2,84-4,17%), αpinen (0,90-1,24%) và ρ-cymen (0,90%)…
Hàm lượng tinh dầu trong lá (tươi) ở dạng “tràm cừ” thấp hơn, thường trong
khoảng 0,5 – 0,7 %. Và hàm lượng 1,8-cineol trong tinh dầu cũng thấp (1,43-9,49%),
các thành phần còn lại gồm α-pinen (13,82-14,5%), ρ-cymen (8,98-9,59%), limonen
(1,7%), α¬terpinen (1,78-1,80%) và linalool (0,44-0,50%)… (Đỗ Tất Lợi, 2006)
1.6 Công dụng của tinh dầu tràm
Hoạt chất α- Terpineol chiết xuất từ tinh dầu tràm có tính sát trùng (diệt khuẩn, nấm và
siêu vi) tốt, do đó α- terpineol là một nguyên liệu quý để bào chế nhiều loại thuốc bôi xức
trực tiếp hoặc dầu khí dung bay hơi.
Nhiều nghiên cứu khoa học cho thấy α- Terpineol có rất nhiều ưu điểm:
- Không độc với con người ở liều có tác dụng kháng khuẩn.
- Có thể dùng cho mọi lứa tuổi, kể cả trẻ em và trẻ sơ sinh.
- Có tác dụng sát trùng khá rộng trên vi khuẩn, nấm và siêu vi.

3


- Theo nghiên cứu cấp Bộ Y tế, thực hiện tại Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, 2008 của
Hãng dược phẩm OPDIS PHARMA thì hoạt chất α-terpineol có tác dụng ức chế diệt cả hai vi
rút cúm A H5N1 và A H1N1.
- Nguyên liệu α- Terpineol (Tiêu chuẩn dược điển Anh) dùng làm thuốc đã được
Bộ Y tế cấp mã số đăng ký sản xuất VNA-2686-99.
- Từ năm 2008, Bộ Y tế đã cho phép đưa dầu tràm vào danh mục thuốc thiết yếu
để kiểm soát bệnh địa phương (local diseases control) trong chương trình chăm sóc
sức khoẻ ban đầu (Đỗ Tất Lợi, 2006).
2. TỔNG QUAN VỀ TINH DẦU

2.1 Khái niệm tinh dầu
Tinh dầu là một hỗn hợp của nhiều thành phần, thường có mùi thơm, không tan
trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi được ở nhiệt độ thường và có thể
điều chế từ thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước.
Tinh dầu là một loại chất lỏng được tinh chế (thông thường nhất là bằng cách
chưng cất bằng hơi hoặc nước) từ lá cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây, hoặc những
thành phần khác của thực vật.
Tinh dầu được ví như nhựa sống của cây, vì vậy nó mang sức sống, năng lượng
và mạnh hơn 100 lần các loại dược thảo sấy khô.
Các loại cây có tinh dầu được phân bố rộng trong thiên nhiên. Trữ lượng tinh
dầu trong cây phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng. Cây mọc ở vùng nhiệt đới
có hàm lượng tinh dầu nhiều hơn ở vùng ôn đới. Ngay trong một cây, thành phần và
lượng tinh dầu trong các bộ phận khác nhau cũng khác nhau. Ngoài ra, lượng tinh dầu
còn phụ thuộc vào môi trường sống của cây, phương pháp thu hoạch, bảo quản, tách
chiết.
Về phân bố lượng tinh dầu, đặc biệt có nhiều trong họ long não, họ hoa môi, họ
cam, họ sim, họ hoa tán.
Tinh dầu có trong các bộ phận khác nhau của cây, như ở hoa (hồng, nhài, cam,
chanh,…), ở lá (bạch đàn, bạc hà, hương nhu,…), ở thân cây (hương đàn, peru,…), ở
vỏ cây (quế), ở rễ (gừng, nghệ, hương bài,…).
Trong cây, tinh dầu có thể ở dạng có sẵn hoặc chỉ tạo thành trong một điều kiện
nhất định nào đó. Khi đó, tinh dầu không phải là những bộ phận bình thường trong cây
mà chỉ xuất hiện trong những điều kiện nhất định khi một số bộ phận bị chết.
2.2 Phân loại tinh dầu
Có hai loại là tinh dầu nguyên chất và tinh dầu không nguyên chất.
- Tinh dầu nguyên chất: hoàn toàn không có độc tố, không có chất bảo quản hóa
học nên rất an toàn cho người sử dụng và mang lại kết quả nhanh khi điều trị.
4

- Tinh dầu không nguyên chất: là tinh dầu được pha từ tinh dầu nguyên chất với
các chất hóa học khác mà vẫn giữ được hương của tinh dầu. Vì vậy với lịch sử phát
triển hàng ngàn năm, tinh dầu được mệnh danh là báu vật của thiên nhiên, được phát
triển thành phương pháp trị liệu, chăm sóc sức khỏe, làm đẹp trên toàn thế giới. Giữa
thế kỉ 19, tinh dầu được tập trung nghiên cứu và trở thành một phương pháp trị liệu
tổng thể và phổ cập tại nhiều nước như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Autralia, Nhật Bản,
Anh Quốc, Pháp.
2.3 Phân loại tinh dầu theo cấu trúc hóa học
Theo cấu trúc hóa học, có thể chia làm 4 loại tinh dầu:
- Các dẫn chất của monoterpen: Myrcen, lymonen, α- pinen, β- pinen, geraniol,
linanol, nerol…
- Các dẫn chất của sesquiterpen: zingiberen, curcumen, nerolidol,…
- Các dẫn chất có nhân thơm: eugenol, p-cymen, thymol…
Các hợp chất có chứa nitơ (N) và lưu huỳnh (S): mythyl isothiocyanat, alicin….
2.4 Tính chất lý hóa của tinh dầu
* Thể chất: đa số là chất lỏng ở nhiệt độ thường, một số thành phần ở thể rắn:
Menthol, borneol, camphor, vanilin, heliotropin.
* Màu sắc: không màu hoặc vàng nhạt. Do hiện tượng oxy hóa màu có thể sẫm
lại. Một số có màu đặc biệt: các hợp chất azulen có màu xanh mực
* Mùi: đặc biệt, đa số có mùi thơm dễ chịu, một só có mùi hắc, khó chịu (tinh
dầu giun).
* Vị: cay, một số có vị ngọt: tinh dầu quế, hồi.
* Bay hơi được ở nhiệt độ thường.
* Tỷ trọng: đa số nhỏ hơn 1. Một số lớn hơn 1 như: Quế, đinh hương, hương
nhu.
Tỷ lệ thành phần chính (aldehyd cinnamic, eugenol) quyết định tỷ trọng tinh
dầu. Nếu hàm lượng các thành phần chính thấp, những tinh dầu này có thể trở nên nhẹ
hơn nước.
* Độ tan: không tan, hay đúng hơn ít tan trong nước, tan trong alcol và các dung
môi hữu cơ khác.

* Độ sôi: phụ thuộc vào thành phần cấu tạo, có thể dùng phương pháp cất phân
đoạn để tách riêng từng thành phần trong tinh dầu.
* Năng suất quay cực cao, tả tuyền hoặc hữu tuyền.
* Chỉ số khúc xạ: 1,4500 - 1,5600
* Rất dễ oxy hoá, sự oxy hoá thường xảy ra cùng với sự trùng hợp hoá, tinh dầu
sẽ chuyển thành chất nhựa.
5


* Một số thành phần chính trong tinh dầu cho các phản ứng đặc hiệu của nhóm
chức, tạo thành các sản phẩm kết tinh hay cho màu, dựa vào đặc tính này để định tính
và định lượng các thành phần chính trong tinh dầu.
2.5 Tác dụng sinh học và ứng dụng của tinh dầu trong y học như:
- Tác dụng trên đường tiêu hoá.
- Tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn.
- Tác dụng kích thích thần kinh trung ương.
- Tác dụng diệt ký sinh trùng: trị giun, sán, diệt ký sinh trùng sốt rét.
- Rất nhiều tinh dầu có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương, sinh cơ
v.v.. khi sử dụng ngoài da.
Ngoài ra tinh dầu còn được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền, qua các bài
thuốc từ rất lâu đời.
3. PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT TINH DẦU
3.1 Các phương pháp chiết xuất tinh dầu như:
- Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
- Phương pháp vi sóng.
- Phương pháp siêu âm.
- Phương pháp tẩm tích.
3.2 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
3.2.1 Khái niệm
Phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo

hơi nước của những hợp chất hữu cơ của tinh dầu chứa trong các mô của nguyên liệu
khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh
dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian
nhất định. Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo chi phương dây dài thì
khi chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm
giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn.

6

Hình 2.3. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.


3.2.2 Lý thuyết chưng cất
Chưng cất có thể được định nghĩa là: ”Sự tách rời các cấu phần của một hỗn
hợp nhiều chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng”. Trong trường hợp
đơn giản, khi chưng cất một hỗn hợp gồm 2 chất lỏng không hòa tan vào nhau, áp suất
hơi tổng cộng là tổng của hai áp suất hơi riêng phần. Do đó, nhiệt độ sôi của hỗn hợp
sẽ tương ứng với áp suất hơi tổng cộng xác định, không tùy thuộc vào thành phần bách
phân của hỗn hợp, miễn là lúc đó hai pha lỏng vẫn còn tồn tại. Nếu vẽ đường cong áp
suất hơi của từng chất theo nhiệt độ, rồi vẽ đường cong áp suất hơi tổng cộng, thì ứng
với một áp suất, ta dễ dàng suy ra nhiệt độ sôi tương ứng của hỗn hợp và nhận thấy là
nhiệt độ sôi của hỗn hợp luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của từng hợp chất. Thí dụ, ở
áp suất 760 mmHg nước sôi ở 100oC và benzen sôi ở 80oC và chúng là hai chất lỏng
không tan vào nhau. Thực hành cho thấy, nếu đun hỗn hợp này dưới áp suất 760
mmHg nó sẽ sôi ở 69oC cho đến khi nào còn hỗn hợp hai pha lỏng với bất kì tỉ lệ nào.
Giản đồ nhiệt độ sôi theo áp suất cho thấy, tại 69 oC, áp suất hơi của nước là 225
mmHg và benzen là 535 mmHg.
Chính vì đặc tính làm giảm nhiệt độ sôi này mà từ lâu phương pháp chưng cất
hơi nước là phương pháp đầu tiên dùng để tách tinh dầu ra khỏi nguyên liệu thực vật
(Nguyễn Văn Minh, 2017).

3.2.3 Những ảnh hưởng chính trong sự chưng cất lôi cuốn hơi nước
3.2.3.1 Sự khuếch tán
Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu bị vỡ
và cho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi. Phần lớn tinh dầu còn
lại trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và
thẩm thấu. Von Rechenberg đã mô tả quá trình chưng cất hơi nước như sau: “Ở nhiệt
7


độ nước sôi, một phần tinh dầu hòa tan vào trong nước có sẵn trong tế bào thực vật.
Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nước cuốn đi. Còn
nước đi vào nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục bị hòa tan vào
lượng nước này. Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát ra
ngoài hết.
Như vậy, sự hiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong trường hợp chưng
cất sử dụng hơi nước quá nhiệt, chú ý tránh đừng để nguyên liệu bị khô. Nhưng nếu
lượng nước sử dụng thừa quá thì cũng không có lợi, nhất là trong trường hợp tinh dầu
có chứa những cấu phần tan dễ trong nước.
Ngoài ra, vì nguyên liệu được làm vỡ vụn ra càng nhiều càng tốt, cần làm cho
lớp nguyên liệu có một độ xốp nhất định để hơi nước có thể đi xuyên ngang lớp này
đồng đều và dễ dàng.
Vì các cấu phần trong tinh dầu được chưng cất hơi nước theo nguyên tắc nói
trên cho nên thông thường những hợp chất nào dễ hòa tan trong nước sẽ được lôi cuốn
trước. Thí dụ, khi chưng cất hơi nước hạt caraway nghiền nhỏ và không nghiền, đối
với hạt không nghiền thì carvon (nhiệt độ sôi cao nhưng tan nhiều trong nước) sẽ ra
trước, còn limonen (nhiệt độ sôi thấp, nhưng ít tan trong nước) sẽ ra sau. Nhưng với
hạt caraway nghiền nhỏ thì kết quả chưng cất ngược lại.
3.2.3.2 Sự thủy giải
Những cấu phần ester trong tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho ra acid và alcol
khi đun nóng trong một thời gian dài với nước. Do đó, để hạn chế hiện tượng này, sự

chưng cất hơi nước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt.
3.2.3.3 Nhiệt độ
Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu. Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi nước
quá nhiệt (trên 100oC) nên thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của sự chưng
cất, sau khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết. Thực ra, hầu hết các tinh dầu
đều kém bền dưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề là làm sao cho thời gian chịu nhiệt độ
cao của tinh dầu càng ngắn càng tốt.
Tóm lại, dù ba ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế thì chúng
có liên quan với nhau và quy về ảnh hưởng của nhiệt độ. Khi tăng nhiệt độ, sự khuếch
tán thẩm thấu sẽ tăng, sự hòa tan tinh dầu trong nước sẽ tăng nhưng sự phân hủy cũng
tăng theo.
Trong công nghiệp, dựa trên thực hành, người ta chia các phương pháp chưng
cất hơi nước ra thành ba loại chính:
- Chưng cất bằng nước.
- Chưng cất bằng nước và hơi nước.
- Chưng cất bằng hơi nước.
8


3.2.3.4 Chưng cất bằng nước
Trong trường hợp này, nước phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảng
không gian tương đối lớn phía bên trên lớp nước, để tránh khi nước sôi mạnh làm văng
chất nạp qua hệ thống hoàn lưu. Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặc
bằng hơi nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy). Trong trường hợp chất
nạp quá mịn, lắng chặt xuống đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị những cánh khuấy trộn
đều bên trong trong suốt thời gian chưng cất.
Sự chưng cất này không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải. Những
nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này. Những cấu phần có
nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ đầy,
khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những chất này. Thí dụ điển hình là mùi tinh dầu

hoa hồng thu được từ phương pháp chưng cất hơi nước kém hơn sản phẩm tẩm trích vì
eugenol và alcol phenetil nằm lại trong nước khá nhiều, vì thế người ta chỉ dùng
phương pháp này khi không thể sử dụng các phương pháp khác.
* Ưu điểm
- Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản.
- Thiết bị gọn, dễ chế tạo.
- Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ.
- Thời gian tương đối nhanh.
* Khuyết điểm
- Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp.
- Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu
phần dễ bị phân hủy.
- Không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó là những chất
định hương thiên nhiên rất có giá trị).
- Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn.
- Nhưng tinh dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém.
3.2.3.5 Thu hồi thêm tinh dầu từ nước chưng
Thường tinh dầu trong nước chưng nằm dưới hai dạng phân tán và hòa tan.
Dạng phân tán thì có thể dùng phương pháp lắng hay ly tâm, còn dạng hòa tan thì phải
chưng cất lại. Nếu trọng lượng riêng của tinh dầu và nước quá gần nhau thì có thể
thêm NaCl để gia tăng tỉ trọng của nước làm tinh dầu tách ra dễ dàng.
Trong phòng thí nghiệm, để chưng cất hơi nước tinh dầu, người ta thường dùng
bộ dụng cụ thủy tinh Clevenger (hình vẽ phần phụ lục) với hai loại ống hứng tinh dầu,
tùy theo tinh dầu nặng hay nhẹ.
3.3 Pháp pháp vi sóng
9

Hình 2.4. Phương pháp chưng cất bằng vi sóng

3.3.1 Đại cương
Vi sóng (micro-onde, microwave) là sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh
sáng. Sóng điện từ này được đặc trưng bởi:
- Tần số f, tính bằng Hetz (Hz = cycles/s), là chu kỳ của trường điện từ trong
một giây, nằm giữa 300 MHz và 30 GHz.
- Vận tốc c là 300.000 km/giây.
- Độ dài sóng l (cm) là đoạn đường đi của vi sóng trong một chu kỳ, liên hệ với
tần số theo công thức l = c/f.
Hầu hết các lò vi sóng gia dụng đều sử dụng tần số 2450 MHz, ở tần số này l =
12,24 cm.
3.3.2 Hiện tượng làm nóng
Một số phân tử, thí dụ như nước, phân chia điện tích trong phân tử một cách bất
đối xứng. Như vậy các phân tử này là những lưỡng cực có tính định hướng trong chiều
của điện trường. Dưới tác động của điện trường một chiều, các phân tử lưỡng cực có
khuynh hướng sắp xếp theo chiều điện trường này. Nếu điện trường là một điện trường
xoay chiều, sự định hướng của các lưỡng cực sẽ thay đổi theo chiều xoay đó. Cơ sở
của hiện tượng phát nhiệt do vi sóng là sự tương tác giữa điện trường và các phân tử
phân cực bên trong vật chất. Trong điện trường xoay chiều có tần số rất cao
(2,45x109 Hz), điện trường này sẽ gây ra một xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử,
đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất.
Với một cơ cấu có sự bất đối xứng cao, phân tử nước có độ phân cực rất lớn, do
đó nước là một chất rất lý tưởng dễ đun nóng bằng vi sóng. Ngoài ra, các nhóm định
chức phân cực như: -OH, -COOH, -NH 2 … trong các hợp chất hữu cơ cũng là những
nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ.
Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu xạ của
vi sóng. Việc này có liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó. Tóm lại, sự đun
nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng.
10

3.3.3 Tính chất
Vi sóng có đặc tính là có thể đi xuyên qua được không khí, gốm sứ, thủy tinh,
polimer và phản xạ trên bề mặt các kim loại. Độ xuyên thấu tỉ lệ nghịch với tần số, khi
tần số tăng lên thì độ xuyên thấu của vi sóng giảm. Đối với một vật chất có độ ẩm 50%
với tần số 2450 MHz có độ xuyên là 10 cm. Ngoài ra, vi sóng có thể lan truyền trong
chân không, trong điều kiện áp suất cao …
Năng lượng của vi sóng rất yếu, không quá 10 -6 eV, trong khi năng lượng của
một nối cộng hóa trị là 5 eV, do đó bức xạ vi sóng không phải là một bức xạ ion hóa.
Có một số công trình đã khẳng định được tính vô hại của vi sóng đối với sinh
vật. Chẳng hạn, khi nghiên cứu sự phát triển của enzim trong điều kiện vi sóng, người
ta nhận thấy rằng ảnh hưởng của vi sóng rất giống ảnh hưởng của các gia nhiệt thông
thường.
Vi sóng cung cấp một kiểu đun nóng không dùng sự truyền nhiệt thông thường.
Với kiểu đun nóng bình thường, sức nóng đi từ bề mặt của vật chất lần vào bên trong,
còn trong trường hợp sử dụng vi sóng, vi sóng xuyên thấu vật chất và làm nóng vật
chất ngay từ bên trong. Vi sóng tăng hoạt những phân tử phân cực, đặc biệt là nước.
Nước bị đun nóng do hấp thu vi sóng bốc hơi tạo ra áp suất cao tại nơi bị tác dụng, đẩy
nước đi từ tâm của vật đun ra đến bề mặt của nó.
3.3.4 Ly trích dưới sự hỗ trợ của vi sóng
Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên, áp suất
bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ ra. Tinh dầu thoát ra bên
ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ (phương pháp chưng cất hơi
nước) hoặc hòa tan vào dung môi hữu cơ đang bao phủ bên ngoài nguyên liệu (phương
pháp tẩm trích).
Lưu ý là mức độ chịu ảnh hưởng vi sóng của các loại mô tinh dầu không giống
nhau do kiến tạo của các loại mô khác nhau, ngay khi nguyên liệu được làm nhỏ. Kết
quả này được phản ánh qua thời gian ly trích.
Trong sự chưng cất hơi nước, việc ly trích tinh dầu có thể thực hiện trong điều
kiện có thêm nước hay không thêm nước vào nguyên liệu (trường hợp nguyên liệu
chứa nhiều nước, đây là đặc điểm của phương pháp chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ

của vi sóng). Ngoài ra, nước có thể thêm một lần hoặc thêm liên tục (trường hợp lượng
nước thêm một lần không đủ lôi cuốn hết tinh dầu trong nguyên liệu) cho đến khi sự ly
trích chấm dứt.
Ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng, các cấu phần phân cực (hợp chất có
chứa oxigen) hiện diện trong tinh dầu cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng. Ngược lại các
cấu phần hidrocarbon ít chịu ảnh hưởng của vi sóng (do chúng có độ phân cực kém)
11


nên sự ly trích chúng tựa như trong sự chưng cất hơi nước bình thường nhưng với vận
tốc nhanh hơn rất nhiều vì nước được đun nóng nhanh bởi vi sóng.
Trong phòng thí nghiệm, chúng tôi đã nghiên cứu, sữa chữa và cải tiến lò vi
sóng gia dụng để cho lò này có thể sử dụng trong cả việc ly trích tinh dầu bằng phương
pháp chưng cất hơi nước, lẫn cho phương pháp tẩm trích ở áp suất thường.
Năm 1998, Luque de Castro và cộng sự đã đưa ra kiểu lò vi sóng tiêu điểm hỗ
trợ cho sự ly trích bằng Soxhlet (FMASE – Focused Microwave Assisted Soxhlet
Extraction) theo hình vẽ trong phần phụ lục. Hệ thống này giúp cho thời gian ly trích
hợp chất thiên nhiên sử dụng Soxhlet giảm xuống đáng kể và khả năng bảo vệ những
hợp chất dễ bị phân hủy tăng lên (Nguyễn Văn Minh, 2017).
3.4 Phương pháp siêu âm
3.4.1 Nguyên tắc
Siêu âm là âm thanh có tần số nằm ngoài ngưỡng nghe của con người (16 Hz –
18 kHz). Về mặt thực hành, siêu âm được chia làm hai vùng:
- Vùng có tần số cao (5 – 10 MHz), ứng dụng trong y học để chuẩn đoán
bệnh.
- Vùng có tần số thấp hơn (20 – 100 kHz), ứng dụng trong các ngành khác
(kích hoạt phản ứng hóa học, hàn chất dẻo, tẩy rửa, cắt gọt, …) dựa trên khả năng
cung cấp năng lượng của siêu âm.
Siêu âm cung cấp năng lượng thông qua hiện tượng tạo và vỡ “bọt” (khoảng
cách liên phân tử). Trong môi trường chất lỏng, bọt có thể hình thành trong nửa chu kỳ

đầu và vở trong nữa chu kỳ sau, giải phóng một năng lượng rất lớn. Năng lượng này
có thể sử dụng tẩy rửa chất bẩn ngay trong những vị trí không thể tẩy rửa bằng phương
pháp thông thường, khoan cắt những chi tiết tinh vi, hoạt hóa nhiều loại phản ứng hóa
học, làm chảy và hòa tan lẫn vào nhau trong việc chế tạo những sản phẩm bằng nhựa
nhiệt dẻo,…
3.4.2 Hiện tượng tạo bọt và vỡ bọt.
Trong lĩnh vực hợp chất thiên nhiên, siêu âm chủ yếu sử dụng để hỗ trợ cho
phương pháp tẩm trích giúp thu ngắn thời gian ly trích. Trong một số trường hợp,
phương pháp siêu âm cho hiệu suất cao hơn phương pháp khuấy từ. Trong trường hợp
tinh dầu vi sự ly trích bằng siêu âm được thực hiện ở nhiệt độ phòng nên sản phẩm
luôn có mùi thơm tự nhiên.
Các thiết bị siêu âm hiện nay chủ yếu bao gồm hai dạng:
- Bồn siêu âm (40 kHz).
- Thanh siêu âm (20 kHz).
Hiện nay trong phòng thí nghiệm chúng tôi chỉ sử dụng bồn siêu âm trong
phương pháp tẩm trích (Nguyễn Văn Minh, 2017).
12


3.4.3 Bồn siêu âm
Bồn thường làm bằng inox, bên dưới đáy bồn có gắn những bộ phận phát ra
siêu âm. Một số bồn có trang bị thêm bộ phận gia nhiệt nhưng không cho phép tăng
nhiệt độ lên cao. Bồn siêu âm có ưu điểm là năng lượng được phân bố đồng đều, thuận
tiện thao tác, và dễ sử dụng nhưng lại có khuyết điểm là chỉ có một tần số cố định, đôi
khi không kiểm soát được nhiệt độ (khi siêu âm trong một thời gian dài), không thực
hiện được ở nhiệt độ thấp.
Hiện nay bồn siêu âm được chế tạo với nhiều kích thước lớn nhỏ khác nhau để
phù hợp với vật chứa bên trong. Khi sử dụng bồn siêu âm, nhớ cho một ít chất hoạt
động bề mặt vào lượng nước trong bồn để gia tăng khả năng siêu âm. Bình chứa
nguyên liệu cần đổ ngập dung môi với mức dung môi nên thấp hơn hoặc ngang bằng

lớp nước bên ngoài.
4. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN
4.1 Vi khuẩn Staplylococcus aureus
4.1.1 Giới thiệu chung
Staphylococcus aureus, hay tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩn Gramdương kỵ khí tùy nghi, và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong
các loài tụ cầu. Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở
cả mũi và da. Khoảng 20% dân số loài người là vật mang lâu dài của S. aureus. Sắc
tố carotenoid staphyloxanthin làm nên tính chất màu vàng của 'S. aureus', vốn có thể
thấy được từ các khúm cấy trên thạch của vi khuẩn này. Sắc tố đóng vai trò là một tác
nhân độc hại có tính chất chống ôxy hóa giúp cho vi sinh vật không bị chết bởi các
chủng oxy gây phản ứng được sử dụng bởi hệ thống miễn dịch. Các tụ cầu thiếu sắc tố
sẽ dễ dàng bị tiêu diệt bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể ký chủ.
Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày
tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng
khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi
khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng.
Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878,
phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời
kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học.
Năm 1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa
sự hiện diện của hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây
bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới được chấp nhận rộng
rãi.
4.1.2 Phân loại khoa học
Giới (Kingdom):
Eubacteria
13


Nghành (Division): Firmicutes

Lớp (Class):
Bacilli
Bộ (Order):
Bacillales
Họ (Family):
Staphylococcaceae
Chi (Genus):
Staphylococcus
Loài (Species):
Staphylococcus aureus.
4.1.3 Hình thái
Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính
chất chung của Staphylococcus. S. aureus là những vi khuẩn hình cầu, không di động,
gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho, không di động.
Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu
nối pentaglycin của tụ cầu.

4.1.4 Đặc điểm sinh hóa
Hình 2.5. Quan sát dưới kính hiển vi
Một số dòng S. aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu,
vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan máu hẹp hơn so
với đường kính khuẩn lạc. Hầu hết các dòng S. aureus đều tạo sắc tố vàng, nhưng các
sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi
cấy ở nhiệt độ phòng. Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong môi trường có hiện diện
lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng
(Collin C.H và cs, 1995).
Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus có màu
đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5
mm (do khả năng khử potassium tellurite K 2TeO3 và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng
của lethinase) (Rosamund M B. và cs, 1995; Mary K. S. và cs, 2002). Trên môi trường

MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều
và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc
(do lên men đường manitol) (Mary K. S. và cs, 2002).
Bảng 2.1. Đặc điểm sinh hóa của S. aureus
Đặc tính

S. aureus
14

Hình 2.6. Hình thái của
Staphylococcus aureus


Catalase
Coagulase
Thermonuclease
Nhạy với Lysostaphin
Sử dụng glucose
Sử dụng manitol

+
+
+
+
+
+

4.1.5 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố
Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi tùy
thuộc vào từng dòng. S. aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng,

từ 7 – 48 oC, với nhiệt độ cực thuận là 30 – 45 oC; khoảng pH 4,2 - 9,3, với độ pH cực
thuận là 7 - 7,5, và trong môi trường chứa trên 15 % NaCl. Tụ cầu bền vững khi có
nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60 %, nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu
vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế.
Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết
bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm. Chính nhờ những
đặc điểm trên giúp S. aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng
nhày, tóc và mũi của người và động vật máu nóng. S. aureus được cho là vi khuẩn khá
mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ. Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi
và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất
diệt khuẩn. Tuy nhiên, S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 60 oC từ 2 - 50
phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật
khác ức chế (Bremer P.J và cs, 2004).
Có 10 - 50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S. aureus (Bremer P.J và cs,
2004). Tuy nhiên khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S. aureus cũng rất
lớn do chúng phân bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố. Tụ cầu nhiễm thực phẩm
vào chủ yếu qua con đường chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người. Sự
hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều 12 kiện vệ sinh
của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không
tốt. Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc,
điều đó chỉ xảy ra khi S. aureus được phân lập tạo độc tố. Ngược lại, chỉ với một
lượng nhỏ S. aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc (Reginald W. B. và cs, 2001).
4.1.6 Khả năng gây bệnh
Tụ cầu vàng thường ký sinh ở da và mũi họng. Vi khuẩn này gây bệnh cho
những người bị suy giảm đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực. Tụ cầu vàng là
vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau (Lê Huy
chính, 2001):
- Nhiễm khuẩn da
15

Do tụ cầu ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua lỗ chân
lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da. Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ : mụn
nhọt, các ổ áp xe, eczema, hậu bối. Mức độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề
kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn. Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em
và người suy giảm miễn dịch. Đinh râu có thể gây nên những biến chứng nguy hiểm.
- Nhiễm khuẩn huyết
Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn đường huyết nhất. Do chúng
gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, từ đây vi khuẩn
xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn đường huyết. Ðây là một nhiễm trùng rất
nặng. Từ nhiễm khuẩn đường huyết tụ cầu đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các
ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc viêm nội tâm mạc. Có thể gây nên các viêm tắc tĩnh
mạch. Một số nhiễm trùng khu trú này trở thành viêm mãn tính như viêm xương.
- Viêm phổi
Viêm phổi do tụ cầu vàng rất ít gặp. Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đường hô hấp
do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết. Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát do tụ cầu
vàng ở trẻ em hoặc người suy yếu. Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân này khá cao, vì
thế nó được coi là bệnh nguy hiểm.
- Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc
do tụ cầu cư trú ở ruột chiếm số lượng ưu thế. Nguyên nhân là sau một thời gian dài
bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn chí bình thường
của đường ruột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện cho tụ cầu vàng
(kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng.
Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính. Sau ăn
phải thức ăn nhiễm phải độc tố tụ cầu 2-8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân
lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước. Do mất nhiều nước và chất
điện giải nên có thể dẫn tới sốc. Ngoài bệnh nguyên nhân do tụ cầu một số trường hợp
có thêm vai trò của Clotridium diffiticile, sau khi dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng.
- Nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu

Thường rất hay gặp, nhất là đối với nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng từ đó đẫn tới
nhiễm khuẩn đường huyết. Các chủng tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rất
mạnh và phải dùng đến vancomycin. Tỷ lệ tử vong ở bệnh này rất cao.
- Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome)
Một số chủng tụ cầu vàng tiết ra độc tố exfoliatin, gây viêm da hoại tử và phồng
rộp. Bệnh này thường gặp ở trẻ em mới đẻ và tiên lượng xấu.
- Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome)
16


Hội chứng này thường gặp ở phụ nữ sử dụng bông gạc không sạch khi có kinh
nguyệt. Bệnh khư trú ở âm đạo và căn nguyên là tụ cầu vàng. Cấy máu không tìm thấy
tụ cầu vàng. Các dấu hiệu lâm sàng và vi khuẩn cho thấy rằng cơ chế của bệnh là sự
nhiễm độc ngoại độc tố sinh mủ. Năm 1980, ở Mỹ có 940 trường hợp bị hội chứng
này, trong đó có tới 99% là phụ nữ và 98% có liên quan đến việc sử dụng bông gạc
không sạch khi có kinh.
4.2 Vi khuẩn Escherichia coli
4.2.1 Giới thiệu chung
Năm 1885, tại München (Đức), một bác sĩ nhi khoa tên là Theodor Escherich
rất quan tâm đến những phát hiện quan trọng của Louis Pasteur và Robert Kock về vi
khuẩn. Cùng với việc nghiên cứu bệnh tiêu chảy, Escherich tỏ rõ mối lưu ý tới một vi
sinh vật đường ruột trẻ em qua nhiều thí nghiệm lâm sàng. Vi khuẩn do Escherich phát
hiện từ trong tã lót của trẻ em được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli
commune. Chỉ 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich
nhằm tri ân người có công khám phá. Tuy nhiên, nó vẫn được gọi bằng tên Bacillus
coli vào năm 1895 và Bacterium coli vào một năm sau đó, Sau nhiều kiểu gọi, đến
năm 1991, vi khuẩn mới được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli.
4.2.2 Phân loại khoa học
Giới (Kingdom):
Bacteria

Nghành (Division): Proteobacteria
Lớp (Class):
Gammaproteobacteria
Bộ (Order):
Enterobacteriales
Họ (Family):
Enterobacteriaceae
Chi (Genus):
Escherichia
Loài (Species):
E. coli.
4.2.3 Hình thái
E.coli là trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình từ 2 đến 3µm x
0,5µm, trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng
sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu
hết có lông và có khả năng di động.

17

Hình Hình
2.7. Quan
2.8. Escherichia
sát dưới kínhcoli
hiển vi


4.2.4 Đặc điểm sinh hóa
Có tính chất chung của họ Enterobacteriaceae: Oxydase (-); Glucose (+); Khử
NO3 thành NO2.
- Phản ứng [+]: Lên men glucose và nhiều loại đường khác, đa số các chủng lên

men đường lactose, Đỏ methyl, Indol, Sinh hơi.
- Phản ứng [-]: Citrat,Urea, H2S.
Bảng 2.2. Đặc điểm sinh hóa của E.coli
Đặc tính

E. coli
+
+
+
+
-

Lactose
Glucose
Sinh hơi
H2S
Urea
Indol
Citrat

4.2.5 Nuôi cấy
E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có
thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu kỵ khí tuỳ
tiện. Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 – 40 °C.
Trong những điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ
chỉ khoảng 20 đến 30 phút. Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 – 4 giờ đã
làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều, sau hai ngày trên mặt môi trường có
váng mỏng. Những ngày sau dướii đáy ống có thể thấy cặn.

18

Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 – 10h, dùng kính lúp đã có thể
quan sát được khuẩn lạc. Sau 24h khuẩn lạc khoảng 1,5 mm. Hình thái khuẩn lạc điển
hình dạng II nhưng cũng có thể gặp dạng R, hoặc M.
4.2.6 Khả năng gây bệnh
Dựa vào tính chất gây bệnh, người ta chia E. coli thành các loại:
+ EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đường ruột.
+ ETEC (Enterotoxigenic E. coli): E. coli sinh độc tố ruột.
+ EIEC (Enteroinvasive E. coli): E. coli xâm nhập đường ruột.
+ EAEC (Enteroadherent E. coli): E. coli bám dính đường ruột.
+ EHEC (Enterohaemorragic E. coli): E. coli gây chảy máu đường ruột.
Trong đường tiêu hóa, E. coli chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu
khí (khoảng 80%).
Tuy nhiên, E. coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu
trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, đứng hàng
đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết.
E. coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm
khuẩn vết thương.
Tính kháng thuốc của E. coli đứng thứ hai (sau S.aureus) trong các vi khuẩn
gây bệnh thường gặp.

19


CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
1.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 02/2018 đến 05/2018.
1.2 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Hóa hữu cơ và phòng thực hành Vi sinh
của Khoa Dược – Điều dưỡng trường Đại học Tây Đô.
Địa chỉ: số 68, Trần Chiên, Phường Lê Bình, Quận Cái Răng, Tp Cần Thơ.
2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu
Lá tràm gió được thu hái tại Quận Cái Răng, Tp Cần Thơ.
Vi khuẩn Staphylococcusaureus ATCC6538, Escherichia Crom ATCC8739
được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2 Thiết bị

Hình 3.1. Lò vi sóng

Hình 3.2. Tủ ủ vi sinh

Hình 3.3. Nồi khử trùng

Hình 3.4. Tủ cấy vi khuẩn

20