CHẾ tạo CHỨNG nội CÙNG mồi với DNA ĐÍCH TRONG PCR

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA Khoa học ứng dụng

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHẾ TẠO CHỨNG NỘI CÙNG MỒI
VỚI DNA ĐÍCH TRONG PCR
PHÁT HIỆN HBV-DNA

Người hướng dẫn: TS PHẠM TRƯỜNG SƠN
Người thực hiện: LƯU CẨM ĐƯỜNG
Lớp

: 14060302

Khoá

: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018 - 2019


TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA Khoa học ứng dụng

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHẾ TẠO CHỨNG NỘI CÙNG MỒI
VỚI DNA ĐÍCH TRONG PCR

PHÁT HIỆN HBV-DNA

Người hướng dẫn: TS. PHẠM TRƯỜNG SƠN
Người thực hiện: LƯU CẨM ĐƯỜNG
Lớp

: 14060302

Khoá

:

18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018 - 2019


3

Lời cảm ơn
Trong chuyến đi thực hiện Khóa luận lần này, một lần nữa đã khai sáng những kiến
thức vô cùng bổ ích và mới mẻ giúp em có thêm nhiều phấn đấu để tìm hiểu ngành
Công nghệ sinh học.
Để hoàn thành nhiệm vụ được giao, ngoài sự nỗ lực học hỏi của bản thân còn có sự
hướng dẫn tận tình của thầy cô, cô chú, anh chị đang làm việc tại Công ty TNHH
Dịch Vụ Và Thương Mại Nam Khoa.
Em chân thành cảm ơn TS. PHẠM TRƯỜNG SƠN, người đã hướng dẫn cho em
trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Thầy đã sắp xếp thời gian của mình để chỉ
cho em những cách làm, định hướng đi cho em, để em hoàn thành tốt bài khóa luận
tốt nghiệp của mình. Một lần nữa em chân thành cảm ơn thầy và chúc thầy dồi dào

sức khoẻ.
Tuy nhiên vì kiến thức chuyên môn còn hạn chế và bản thân còn thiếu nhiều kinh
nghiệm thực tiễn nên nội dung của báo cáo không tránh khỏi những thiếu xót, em
rất mong nhận sự góp ý, chỉ bảo thêm của quý thầy cô cùng toàn thể cán bộ, công
nhân viên tại công ty để báo cáo này được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa xin gửi đến thầy cô, bạn bè cùng các cô chú, anh chị tại các doanh
nghiệp lời cảm ơn chân thành và tốt đẹp nhất!


4

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự
hướng dẫn khoa học của TS. PHẠM TRƯỜNG SƠN. Các nội dung nghiên cứu, kết
quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước
đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh
giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu
tham khảo.
Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số
liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn
gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm về nội dung luận văn của mình. Trường đại học Tôn Đức Thắng không liên
quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực
hiện (nếu có).
TP. Hồ Chí Minh, ngày 13 tháng 02 năm 2019
Tác giả

5

Tóm tắt
Sinh viên LƯU CẨM ĐƯỜNG, Đại học Tôn Đức Thắng. Tên đề tài: “Chế tạo
chứng nội cùng mồi với DNA đích trong PCR phát hiện HBV-DNA”.
Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử đạt chuẩn của Công ty
TNHH Dịch Vụ Và Thương Mại Nam Khoa.
Địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn, P. Tân Hưng, Q. 7, TP HCM, Việt Nam.
GVHD: TS. PHẠM TRƯỜNG SƠN.
Ly trích một đoạn DNA từ đối tượng là tôm post mang bệnh còi MBV, chèn một
đoạn mồi overhang có trình tự giống với mồi của DNA đích trên virus HBV. Từ đó
khuếch đại đoạn gen này, tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR thông qua quá trình
điện di, tạo dòng sản phẩm PCR theo phương pháp TOPO cloning với enzyme
topoisomerase vừa có khả năng cắt vừa có khả năng nối DNA tái tổ hợp, ly trích sản
phẩm DNA tái tổ hợp, Real-time PCR để xem sản phẩm có như mong muốn ban
đầu, qua các thử nghiệm với mẫu bệnh phẩm có thêm vào chứng nội vừa được chế
tạo qua kỹ thuật Real-time PCR với mỗi nồng độ pha loãng khác nhau để tìm ra
chứng nội cho kết quả tốt nhất và độ tin cậy cao.
Trong quá trình thiết kế và thử nghiệm, ứng với chứng nội có nồng độ pha loãng IC
7 sẽ được lưu trữ và áp dụng làm chứng nội cho các thí nghiệm cũng như các quá
trình xét nghiệm về sau.


6

Mục lục


7

Danh mục
• Danh mục hình


8

Chương 1. Lời mở đầu
1.1.

Đặt vấn đề

Bệnh viêm gan siêu vi B do virus HBV (Hepatitis B virus) là bệnh truyền nhiễm
khá phổ biến và nguy hiểm. Hằng năm theo thống kê của tổ chức y tế thế giới
(WHO), số người mắc bệnh và biến chứng do viêm gan siêu vi B không có dấu hiệu
thuyên giảm. Việc phát hiện và định lượng virus HBV đóng một vai trò cực kỳ quan
trọng trong chuẩn đoán cũng như phác đồ điều trị cho các bệnh nhân. Vì vậy, kỹ
thuật PCR cùng với real-time PCR ra đời để phát hiện và định lượng HBV-DNA
chính xác hơn, nhanh hơn, hiệu suất cao hơn và đã được áp dụng ở nhiều nơi.
Đề tài “Chế tạo chứng nội cùng mồi với DNA đích trong PCR phát hiện HBVDNA” để kiểm soát quá trình xét nghiệm của một loại bệnh phẩm có tên là HBV
không những giúp kết quả đạt độ tin cậy cao hơn mà còn kiểm soát được các quá
trình thao tác cũng như kết quả. Trải qua rất nhiều công đoạn từ việc ly trích DNA
của loài tôm post, phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen đó cho đến các quá trình thử
nghiệm nhằm tạo ra loại chứng nội phù hợp nhất là những thách thức cho người chế
tạo. Lý do là bởi từng công đoạn là một phương pháp kỹ thuật khác nhau, cách sử
dụng các loại hóa chất và thiết bị cũng không giống nhau, mỗi thí nghiệm cũng phải
được lặp lại nhiều lần để đảm bảo giá trị kết quả không quá chênh lệch và độ chuẩn
xác cao.

1.2.

Ý nghĩa

Việc xét nghiệm cho ra các kết quả không chuẩn xác có thể gây ra nhiều hệ luỵ cho
người gửi mẫu xét nghiệm. Chính vì vậy, trong quá trình xét nghiệm, việc cho vào
mẫu một loại chứng nội tại phù hợp sẽ giải quyết được tình trạng kết quả xét
nghiệm chưa chuẩn xác.
Bệnh nhân gửi mẫu đến các trung tâm xét nghiệm sẽ có kết quả chính xác, trong
trường hợp kết quả là dương tính với bệnh thì việc phát hiện bệnh sớm và đưa ra
các phác đồ điều trị thích hợp nhằm giảm thiểu những trường hợp đáng tiếc có thể
xảy ra.


9

Chương 2. Tổng quan
2.1.

Giới thiệu chung
2.1.1. Đặc điểm hình thái

Virus viêm gan siêu vi B (Hepatitis B virus, HBV), thuộc chi Orthohepadnavirus,
thuộc họ virus Hepadnaviridae, bộ Unassigned [18]. Virus này gây nên bệnh viêm
gan siêu vi B. Đây là virus viêm gan duy nhất có acid nhân là DNA (các virus khác
đều là RNA)
HBV được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quang học có 3 loại tiểu thể khác
nhau: tiểu thể với đường kính 22 nm có hình cầu, tiểu thể hình ống (hoặc hình que)
có đường kính 20-22 nm, dài từ 40-400 nm và tiểu thể hình cầu lớn (Dane) với
đường kính 42-45nm, chính là virus hoàn chỉnh.
HBV thuộc loại siêu vi trùng (hay virus), bền vững với nhiệt độ: ở 100 o C có khả
năng sống được 30 phút, nếu ở -20o C sống tới 20 năm, HBV kháng ester , nhưng

bất hoạt trong formalin [15].

2.1.2. Cấu tạo
HBV mang DNA vòng có cấu trúc hai sợi kép không khép kín có trọng lượng phân
tử là 2x106, được cấu tạo bởi 3200 nucleotide [18]. Vỏ capsid có hình khối đối
xứng, kích thước khoảng 27nm, vỏ ngoài dày khoảng 7 nm được cấu tạo bởi 3
protein cấu trúc: protein lớn, protein trung bình và protein nhỏ, vỏ bao tạo cho virus
có hình cầu đường kính 42 nm (Hạt Dane). Hạt ngoài không chứa vật liệu di truyền
nên không có khả năng lây nhiễm, bao gồm lipid và protein tạo thành một phần của
bề mặt virion, được gọi là kháng nguyên bề mặt HBsAg được tạo ra liên tục trong
suốt vòng đời của virus.

2.1.3. Phân loại kiểu gen của HBV
2.1.3.1 Kiểu huyết thanh (Serotype)
Có 4 phân nhóm huyết thanh chính của HBV có thể được xác định dựa trên yếu tố
quyết định kháng nguyên của HBsAg được chỉ định bởi các kiểu gen riêng biệt của


10

virus HBV. Những đặc tính này bao gồm các kháng nguyên phổ biến được gọi là a
và hai cặp chất phụ, d/y và w/r. Các thành viên của mỗi cặp chất phụ loại trừ lẫn
nhau, dẫn đến 4 nhóm chính của HBsAg: adw, adr, ayw và ayr [15].

2.1.3.2 Kiểu gen (Genotype)
HBV đã có 8 kiểu gen được phát hiện theo ký hiệu bảng chữ cái từ A-H. Cho đến
gần đây, một biến thể HBV mới đã được phát hiện tại Việt Nam, do đó kiểu gen của
HBV đã được mở rộng từ A-I [18]. Việc phân loại kiểu gen theo thứ tự này là dựa
trên sự khác nhau ít nhất là 8% giữa các chuỗi nucleotide hoàn chỉnh. HBV từ vượn
được chia thành 4 phân nhánh bao gồm Chimpanzee, Gorilla, Orangutan và Gibbon.

Hình 2.1 Cây phát sinh gen dựa trên gen S của HBV đại diện cho mối quan hệ giữa họ
HBV ở người và vượn.


11

Sự tương quan và phân vùng các loại kiểu gen của HBV rất khác nhau về mặt địa
lý. Kiểu A thường được phát hiện ở khu vực phía Bắc Châu Âu, Bắc Mỹ hoặc Nam
Phi. Trong khi đó, kiểu gen B và C được tìm thấy nhiều ở Châu Á và Châu Đại
Dương, Kiểu D là rất phổ biến ở khắp nơi, và các kiểu gen còn lại nằm rải rác ở các
khu vực còn lại [14], [11].

2.1.4. Cấu trúc gen
•

Gen S (surface):

Mã hóa cho kháng nguyên bề mặt HBsAg gồm 3 vùng (pre S1, pre S2, S) mã
hóa 3 loại protein của HBsAg.
Vùng S: mã hóa protein nhỏ chứa 226 acid amin, có vị trí gắn glucose.
Vùng pre S2: mã hóa protein trung bình chứa 281 acid amin, có vị trí gắn
glucose.
Vùng pre S1: mã hóa protein lớn chứa 389-400 acid amin, không có vị trí gắn
glucose[15].
•

Gen C (core):

Nếu quá trình dịch mã từ codon AUG thứ hai ở vị trí 1901 sẽ tổng hợp nên

kháng nguyên lõi HBcAG cấu trúc của phần nucleocapside. Nếu quá trình dịch
mã bắt đầu từ codon AUG thứ nhất ở vị trí 1814 sẽ tổng hợp nên HBeAg.
•

Gen P (polymerase)

Mã hóa DNA polymerase, là gen có chức năng như một bản sao chép ngược, do
sự sao chép của HBV yêu cầu RNA trung gian.


12

Hình 2.2: Cấu trúc bộ gen của HBV
•

Gen X mã hóa hai protein đóng vai trò là chất chuyển mã phiên mã, hỗ trợ sự
nhân lên của virus.
− HBsAg (kháng nguyên bề mặt): thuộc lớp vỏ của HBV - dùng trong xét
nghiệm máu để nhận diện HBV trong cơ thể.
− HBcAg (kháng nguyên lõi): thuộc lớp lõi của HBV - dùng để phát hiện
HBV đang trong quá trình phát triển. Kháng nguyên HBcAg chỉ có ở virus
kích thước 42 nm.
− HBeAg (kháng nguyên nội sinh): nếu có trong máu bệnh nhân sẽ dẫn tới
khả năng lây rất cao [12].


13

Hình 2.3: Cấu trúc antigen của HBV

2.1.5. Cơ chế lây truyền
• Lây từ mẹ sang con
Viêm gan B có thể lây từ mẹ sang con trong lúc sinh. Đây là đường lây truyền
phổ biến nhất tại Việt nam và là nguyên nhân gây viêm gan B thường gặp nhất.
Nhiều phụ nữ mang thai không biết mình bị viêm gan B do không có triệu
chứng và không được xét nghiệm.
• Lây qua đường máu
− Viêm gan B có thể lây qua tiếp xúc trực tiếp với máu nhiễm virus.
− Tiếp xúc với màng ngoài da và niêm mạc máu với cơ thể đã bị nhiễm.
− Tiếp xúc trực tiếp giữa các vết thương.
− Dùng chung dao cạo, kiềm cắt móng hoặc bằng chải đánh răng đã có
nhiễm máu của người bệnh.
− Tái sử dụng bơm kim tiêm hoặc dụng cụ y tế.
− Truyền máu không an toàn.
• Lây qua quan hệ tình dục
Viêm gan B có thể lây qua quan hệ tình dục không an toàn, không dùng bao cao
su. Mặc dù dùng bao cao su có thể giảm nguy cơ truyền viêm gan B, cách tốt
nhất để phòng bệnh viêm gan B vẫn là tiêm phòng [5].


14

2.1.6. HBV và các giai đoạn bệnh
•

Giai đoạn cấp tính

Thời gian ủ bệnh từ 6 tuần đến 6 tháng. Trẻ sơ sinh không biểu hiện các triệu
chứng cũng như dấu hiệu lâm sàng, mà chỉ xảy ra trong khoảng 5-15% từ 1 – 5
tuổi và 33-55% ở nhóm tuổi cao hơn. Gồm sốt, biếng ăn, buồn nôn, khó chịu,

vàng da, nước tiểu có màu đen hoặc thậm chí là phát ban, đau khớp.
•

Giai đoạn mạn tính

Thời gian tồn tại của HBsAg trong huyết thanh người bệnh tối thiếu 6 tháng
hoặc có hiện diện của HBsAg nhưng lại vắng mặt IgM kháng HBc. Trẻ sơ sinh
mang viêm gan mạn tính khá cao, 25 - 50% xảy ra ở trẻ em độ tuổi 1 – 5 tuổi và
6 - 10% ở người trưởng thành. Viêm gan mạn tính có khả năng chuyển sang giai
đoạn xơ gan và ung thư gan [2].

2.1.7. Hướng tầm soát và điều trị
2.1.7.1 Để tầm soát viêm gan B cần tiêm vaccine viên gan B cho những
đối tượng
• Trẻ sơ sinh, tiêm mũi đầu trong 24 giờ sau khi sinh và 3 mũi tiếp theo vào 2,
•
•
•
•
•
•

3 và 4 tháng tuổi.
Người lớn và trẻ em chưa mắc bệnh và chưa được tiêm phòng.
Cán bộ, nhân viên y tế.
Thành viên gia đình người mắc viêm gan B.
Người tiêm chích ma túy, nam có quan hệ tình dục đồng giới.
Người mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục người.
Bệnh nhân mắc bệnh thận giai đoạn cuối hoặc bệnh gan mãn tính không liên
quan đến viêm gan B.

Trong trường hợp sau đây cần phải xét nghiệm lại sau khi tiêm phòng:


15

•

Trẻ sinh ra từ mẹ HBsAg dương tính: Cần xét nghiệm cả HBsAg và anti-HBs
1-2 tháng sau khi tiêm vaccine.

•

Nhân viên y tế, những người có tình trạng miễn dịch suy giảm (bệnh nhân
mắc HIV, bệnh nhân chạy thận nhân tạo).

•

Có vợ, chồng hoặc bạn tình có kết quả HBsAg dương tính: Cần xét nghiệm
anti-HBs 1-2 tháng sau khi tiêm đủ các mũi vaccine [15].

2.1.7.2 Hướng xử lý sau khi phơi nhiễm
Globulin miễn dịch kháng viêm gan B (HBIG) dùng để điều trị ngay sau phơi
nhiễm với máu hoặc dịch của người mắc viêm gan B (trẻ sơ sinh mẹ có HBsAg
dương tính, nhân viên y tế phơi nhiễm với kim dính máu của người mắc viêm gan
B, sau quan hệ tình dục với người mắc viêm gan B).
Tiêm HBIG 7 ngày sau khi phơi nhiễm qua đường máu hoặc mẹ sang con, và 14
ngày sau khi phơi nhiễm qua đường tình dục sẽ không hiệu quả
Các bước cần làm sau phơi nhiễm kim tiêm từ bệnh nhân viêm gan B
•

Rửa ngay vết thương bằng nước và xà phòng và báo cáo chấn thương.

•

Xét nghiệm máu để kiểm tra anti-HBs, anti-HBc, HBsAg.

•

Nếu chưa tiêm phòng, không chắc chắn đã tiêm hay chưa, hoặc chưa có
miễn dịch bảo vệ: tiêm một liều HBIG trong vòng 24 giờ đầu sau phơi
nhiễm (200- 400 IU), đồng thời tiêm vaccine phòng viêm gan B mũi đầu
tiên tại một vị trí tiêm khác. Sau đó cần tiêm đủ 3 liều vắc-xin trong vòng 6
tháng sau.

•

Nếu người bị phơi nhiễm có tiền sử không đáp ứng với vắc-xin viêm gan B,
cần tiêm thêm một liều HBIG vào tháng tiếp theo.


16

•

Nếu đã đạt mức HBsAg ≥ 10mIU/mL tức là người đó đã đạt mức miễn dịch
bảo vệ và không cần tiêm tiếp HBIG hoặc vaccine.

•

Xét nghiệm lại anti-HBs, HBsAg sau 6 tháng để đánh giá lại.

2.1.7.3 Hướng điều trị
Thuốc ức chế sự sao chép của virus (đường uống), các thuốc kháng virus ức chế sự
nhân lên của virus viêm gan B. Bệnh nhân cần tuân thủ chặt chẽ hướng dẫn sử dụng
thuốc để tránh tạo ra các chủng virus kháng thuốc. Điều trị bằng thuốc kháng virus
là điều trị lâu dài.
• Adefovir (ADV): dạng viên, dùng 1 lần/ngày. Cần lưu ý theo dõi chức năng
•
•
•
•

thận khi dùng (bằng xét nghiệm creatinine hoặc ure huyết).
Lamivudin (LAM): dạng viên hoặc dung dịch uống, dùng 1 lần/ngày.
Entecavir (ETV): dạng viên hoặc dung dịch uống, dùng 1 lần/ngày.
Telbivudine (LdT): dạng viên, dùng 1 lần/ngày.
Tenofovir (TDF): dạng viên, dùng 1 lần/ngày. Cần lưu ý theo dõi chức năng

thận khi dùng (bằng xét nghiệm creatinine hoặc ure huyết).
• Thuốc tiêm interferon: không nên dùng thuốc này ở người già hoặc bệnh
nhân xơ gan. Liệu trình dùng thuốc tiêm thường kéo dài 6 đến 12 tháng. Hiện
nay có 2 loại thuốc sau: Interferon alfa-2b tiêm dưới da 3-5 lần/tuần và Pegintergeron alfa-2b tiêm dưới da 1 lần/tuần [6].

2.2.

Kỹ thuật phát hiện và xác định tải lượng HBV
2.2.1. Định tính

2.2.1.1 Các xét nghiệm hệ miễn dịch:

• Xét nghiệm HBsAg
HBsAg là kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B. Nếu một người được xét
nghiệm máu, kết quả tìm thấy HBsAg (tức là HBsAg dương tính) chứng tỏ
người đó đang bị nhiễm virus viêm gan B.
Nguyên tắc: dựa trên kỹ thuật ELISA “sandwich”, kháng thể anti-HBs gắn với
HRP (Horseradish Perosidase) sử dụng như chất liên kết với TMB
(Tetramethylbenzidne) và Peroxide như là một cơ chất. Sự xuất hiện màu tương


17

ứng với sự hiện diện của HBsAg, không có màu hoặc màu yếu khi không có
HBsAg.
Hóa chất: Bộ kit Monolisa Ag HBs plus của hãng Bio-Rad sản xuất.
Máy thực hiện: Máy ELISA dựa trên thử nghiệm Hepanostika HBsAg của hãng
Organon sản xuất. Đọc kết quả với máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm.
• Xét nghiệm Anti-HBs
Khi cơ thể có đáp ứng miễn dịch bảo vệ chống virus viêm gan B thì sẽ tạo được
kháng thể chống kháng nguyên HBsAg, kháng thể này được gọi là Anti-HBs.
Kháng thể Anti-HBs cũng xuất hiện trong máu nếu cơ thể có đáp ứng miễn dịch
sau khi được tiêm vaccine phòng bệnh viêm gan B.
Anti-HBs dương tính chứng tỏ cơ thể đã có miễn dịch đặc hiệu, không cần tiêm
vaccine phòng bệnh viêm gan virus B; Anti-HBs âm tính suy ra cơ thể chưa có
miễn dịch đặc hiệu với virus viêm gan B, cần tiêm vaccine phòng bệnh.
• Xét nghiệm HBeAg
HBeAg là một kháng nguyên ở phần vỏ của virus viêm gan B. Sự xuất hiện của
HBeAg trong máu chứng tỏ virus đang nhân lên và có khả năng lây lan mạnh.
HBeAg dương tính là một dấu hiệu chứng tỏ virus đang hoạt động.
HBeAg âm tính có 2 khả năng: virus không hoạt động hoặc virus vẫn đang hoạt
động nhưng có đột biến vùng gen mã hóa tổng hợp HBeAg. Để khẳng định virus

có đột biến vùng gen này cần xét nghiệm HBV-DNA và HBV-genotyping.
Nguyên tắc: Dựa trên kỹ thuật ELISA “sandwich”.
Hóa chất: Bộ kit Monolisa HBeAg-Ab PLUS của hãng Bio-Rad sản xuất.
Máy thực hiện: Máy ELISA dựa trên thử nghiệm HBeAg UniForm II của hãng
Organon sản xuất. Đọc kết quả với máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm.
• Xét nghiệm Anti-HBe
Anti-HBe là kháng thể chống kháng nguyên HBeAg.
Nếu xét nghiệm Anti-HBe dương tính chứng tỏ người bệnh đã có miễn dịch một
phần. Xét nghiệm Anti-HBe âm tính chứng tỏ cơ thể chưa có miễn dịch với
virus viêm gan B.


18

• Xét nghiệm Anti-HBc
Anti-HBc là kháng thể chống kháng nguyên lõi HBcAg của virus viêm gan B
(kháng nguyên HBcAg chỉ hiện diện trong tế bào gan bị nhiễm virus viêm gan
B, không tìm thấy trong máu).
Anti-HBc xuất hiện trong huyết thanh chứng tỏ cơ thể đã từng nhiễm virus viêm
gan B trong quá khứ hay đang nhiễm virus viêm gan B.
Anti-HBc chỉ được tạo ra khi cơ thể nhiễm virus, không được tạo ra sau khi tiêm
vaccine phòng bệnh viêm gan B.
Có 2 loại kháng thể Anti-HBc là IgM và IgG.Anti-HBc IgM xuất hiện trong giai
đoạn nhiễm cấp tính hay trong đợt kịch phát của nhiễm HBV mạn tính, Anti
HBc-IgG xuất hiện trong giai đoạn nhiễm mạn tính.

2.2.1.2 Sinh học phân tử:
• Phản ứng PCR kết hợp điện di
− Nguyên tắc
PCR khuếch đại DNA dựa trên mạch khuôn là DNA đích với số lượng bản sao

lớn, từ đó thực hiện phương pháp điện di kèm nhuộm ethidium bromide hoặc
gel red có khả năng phát hiện sự hiện diện của HBV trong mẫu với độ nhạy
cao.
− Các bước thực hiện
Nâng nhiệt độ lên 95o C trong 10 phút để hoạt hóa enzyme Taq polymerase.
Sau đó thực hiện 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:


Trong giai đoạn biến tính, nhiệt độ ở 95 o C phá vỡ cầu nối hydrogen,
các sợi DNA mạch đôi sẽ tách ra tạo thành các sợi đơn, thời gian: 30



giây.
Trong giải đoạn bắt cặp, primer bắt cặp bổ sung ở hai đầu 3’ và 5’,
nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi, nhiệt độ hạ thấp dưới
nhiệt độ nóng chảy của các mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính,
ở 57° C trong thời gian 30 giây. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn


19

này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu hay gắn


một cách tùy tiện.
Ở giai đoạn kéo dài, enzyme Taq polymerase kéo dài các primer đồng
thời thực hiện theo nguyên tắc bổ sung đối với mạch khuôn DNA mẫu
tạo thành hai sợi đôi mới ở 72o C, trong 1 phút. Sao đó duy trì tiếp ở
nhiệt độ này khoảng 5 phút để đảm bảo các sản phẩm PCR đều được

khuếch đại. Vì thực hiện PCR, nên qua mỗi chu kỳ số bản sao mới tạo
ra được tăng theo cấp số nhân.

Vì DNA tích điện âm (có nhóm PO 4) sẽ dịch chuyển từ cực âm sang cực
dương trên bảng gel agarose khi thực hiện điện di dưới tác dụng của điện
trường. Tương ứng với mỗi nồng độ các DNA sẽ di chuyển với tốc độ khác
nhau do sai biệt kích thước phân tử từ đó tách thành các vạch (band) xa nhau,
dựa vào thang chuẩn đã được thiết kế giúp ghi nhận kích thước gen khuếch đại
tương ứng.
• Phát hiện bằng Nested PCR
Nested PCR làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách giảm độ nhiễu
do sự khuếch đại DNA không đặc hiệu. Sử dụng hai cặp mồi trong hai phản ứng
PCR liên tiếp gồm bộ mồi MD24/MD26 (234 bp) được sử dụng cho PCR đầu
tiên và mồi đặt HBx1/HBx2 (118 bp) cho lần PCR thứ hai [15]. Các mồi cho
Nest PCR này được thiết kế từ việc bảo tồn vùng X trong tất cả các kiểu gen của
HBV.
Trong phản ứng PCR lần thứ nhất, sử dụng một cặp mồi để khuếch đại DNA
đích, song song đó các đoạn DNA không đặc hiệu cũng sẽ được khuếch đại. Các
sản phẩm này được dùng để thực hiện tiếp phản ứng PCR lần thứ hai với cặp
mồi khác mà có vị trí gắn khác một phần từ vị trí 3′ hoặc khác hoàn toàn hoặc
của mỗi mồi so với phản ứng đầu tiên [9].
Nested PCR thường thành công hơn phản ứng PCR thông thường, đặc biệt là khi
khuếch đại các đoạn DNA dài, Nested PCR có một hạn chế là đòi hỏi thông tin
chi tiết hơn về các trình tự đích.


20

Lưu ý: Phương pháp PCR sử dụng các kết hợp mồi này là rất ổn định để phát
hiện DNA thuộc tất cả các kiểu gen của HBV. Độ nhạy cao của nó cho phép phát

hiện tối thiểu 10 bản sao HBV-DNA.

2.2.2. Định lượng
Có nhiều phương pháp định lượng HBV: phương pháp lai chéo dưới tác dụng của
tia UV (ultraviolet cross-linking hybridization), phương pháp lai thấm điểm (Dot
Blot Hybridization), phương pháp lai RNA-DNA (RNA-DNA hybridization), …

2.2.2.1 Phương pháp lai chéo dưới tác dụng của tia UV (ultraviolet crosslinking hybridization)
− Nguyên tắc

Kỹ thuật này sử dụng 2 loại phân tử Probe gồm Probe được đánh dấu tín hiệu
phát huỳnh quang và Probe đánh bắt đánh dấu Biotin.
− Các bước thực hiện

Mẫu được biến tính dưới tác dụng của proteinase K, sodium dodecyl sulfate và ủ
ở nhiệt độ cao. Sau đó, nucleic acid trong mẫu sẽ được biến tính dưới tác dụng
của kiềm và nhiệt độ. HBV-DNA được lai với cả hai phân tử Probe và chiếu xạ
dưới tia UV. Qua bước này, các hạt từ tính có gắn Streptavidine được thêm vào
để đánh bắt các phân tử lai qua lượng biotin còn dư. Các hạt trong giếng được
rửa hai lần và ủ với sự có mặt của Kháng thể kháng huỳnh quang liên kết
Alkaline phosphatase và tiến hành rửa tiếp bốn lần. Sau đó mới ủ với Attophos,
huỳnh quang được thu tín hiệu qua phản ứng Attophos với alkaline phosphatase
qua đầu đọc microplate. Nồng độ HBV-DNA được tính toán từ việc so sánh tín
hiệu phát huỳnh quang từ mỗi mẫu với đường chuẩn đã biết nồng độ.


21

2.2.2.2 Phương pháp lai thấm điểm (Dot Blot Hybridization)
− Nguyên tắc

Cho phép định lượng HBV-DNA trong mẫu thử mà không cần trải qua phản ứng
PCR.
− Các bước thực hiện

DNA của HBV trong mẫu dưới tác dụng của dung dịch kiềm hoặc nhiệt độ cao
có khả năng làm biến tính tạo thành các sợi đơn. Mẫu biến tính được cố định trên
màng lai thành các điểm và mỗi điểm được lai với phân tử Probe đã được đánh
dấu phóng xạ 32P, các phân tử Probe này sẽ bắt cặp đặc hiệu với HBV-DNA.
Rửa sạch màng lai và ủ với Rnase hai lần. Thông qua kỹ thuật phóng xạ tự ghi,
tín hiệu lai sẽ cho biết kích thước và cường độ của các điểm lai được so với thang
chuẩn đã biết trước nồng độ, từ đó suy ra lượng HBV-DNA trong mẫu. Phương
pháp này cần khoảng 4-7 ngày để thực hiện.
Có thể thay thế Probe đánh dấu phóng xạ 32P bằng Alkaline phosphatase,
digoxigenin, Biotin thì khi đó thời gian sẽ được giảm xuống còn khoảng 2-3 ngày.

2.2.2.3 Phương pháp lai bắt RNA-DNA (DNA-RNA hybridization)
•

Nguyên tắc

Là phương pháp sử dụng hai loại kháng thể kháng phân tử lai RNA-DNA và
kháng thể kháng phân tử lai RNA-DNA có đánh dấu alkaline phosphatase.
•

Các bước thực hiện

HBV-DNA phải trải qua giai đoạn biến tính, sau đó phân tử lai RNA-DNA được
tạo thành từ việc lai HBV-DNA trong huyết thanh với RNA probe. Phân tử lai
này được cố định trên giếng có gắn sẵn kháng thể kháng phân tử RNA-DNA. Thể

22

lai mới sẽ tiếp tục phản ứng với kháng thể kháng phân tử RNA-DNA có đánh dấu
Alkaline phosphatase. Ánh sáng được phát ra ghi nhận bằng máy đo ánh sáng.
Nồng độ HBV-DNA được so với đường chuẩn.
Trong các phương pháp trên đều phải trải qua nhiều thao tác, khoảng phát hiện hạn
hẹp hoặc tốn nhiều thời gian, thậm chí khả năng lặp lại không cao. Với sự ra đời của
phương pháp Real-time PCR, khả năng phát hiện sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ
thông qua tín hiệu phát huỳnh quang. Phản ứng được tiến hành trong hệ thống kín
không qua quá trình điện di nên làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm, phát hiện nhiều tác
nhân khác nhau.

2.2.2.4 Kỹ thuật Real-time PCR
•

Nguyên tắc

Kỹ thuật của Real-time PCR phát hiện và định lượng DNA-HBV dựa trên
nguyên tắc của PCR. Tuy nhiên, PCR thông thường thu nhận kết quả tại thời
điểm cuối chu kỳ phản ứng, trong khi đó Real-time PCR tín hiệu thu nhận trong
suốt giải đoạn tiến triển của phản ứng. Mẫu càng nhiều DNA đích sẽ càng có
nhiều tín hiệu phát huỳnh quang và chu kỳ bắt đầu ghi nhận được tín hiệu sẽ
càng nhanh.
•

Các bước tiến hành
− Lấy máu và cho vào 2 tube chống đông bằng EDTA. Tại phòng thí nghiệm,

các mẫu máu sẽ được ly tâm tách huyết thanh lưu trữ ở -20 o C.
− Ly trích DNA được thực hiện theo quy trình của bộ Kit.
− Xây dựng quy trình kỹ thuật Real-time PCR cho HBV có sử dụng Taqman

probe. Khởi động thiết bị với 95o C trong 1 phút, thực hiện lặp lại 39 chu
kỳ tiếp theo với 95o C trong 15 giây, 60o C trong 1 phút.


23

Taqman probe là những oligonucleotide được đánh dấu bởi chất phát huỳnh
quang (reporter) và chất hấp phụ huỳnh quang (quencher). Khi reporter và
quencher ở gần nhau, tín hiệu phát huỳnh quang do reporter phát ra sẽ ngay lập
tức bị quencher hấp phụ nên tín hiệu huỳnh quang không có hoặc rất thấp. Ở giai
đoạn bắt cặp, probe bổ sung trình tự với mạch khuôn của DNA mẫu ở nhiệt độ
cao hơn nhiệt độ primer. Khi primer kéo dài nhờ Taq polymerase, reporter sẽ bị
cắt và tách khỏi quencher nhờ hoạt tính 5’ exonuclease. Reporter được giải phóng
khỏi phân tử probe, tín hiệu huỳnh quang không bị quencher kìm hãm nên phát
tín hiệu và được thu nhận.
•

Các điểm lưu ý
− Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng Real-time PCR là một phản ứng

nhạy và cho kết quả định lượng rất chính xác. Tuy nhiên, cũng như phản
ứng PCR thông thường, Real-time PCR có thể bị ức chế bởi một số thành
phần tồn tại ngay trong chính phản ứng như hàm lượng bản mẫu, nhiệt độ
bắt cặp của mồi, nồng độ của mẫu dò… Chính vì vậy, tiến hành khảo sát
một số điều kiện cần thiết cho phản ứng Real-time PCR nhằm tạo ra phản
ứng Real-time PCR với hiệu quả tối ưu nhất, bao gồm: nhiệt độ bắt cặp của

mồi, khảo sát nồng độ mồi, khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman.
− Độ lặp lại của phản ứng Real-time PCR, đây cũng là một yếu tố quan

trọng. Trên cùng một mẫu, kết quả thu nhận có thể khác nhau giữa các lần
thí nghiệm cũng như giữa các phòng thí nghiệm. Khả năng gây ra sự khác
biệt này có thể là do thao tác của người thực hiện, sự biến động của các
thành phần hóa chất trong phản ứng Real-time PCR ,… Để đánh giá độ lặp
lại của phản ứng Real-time PCR, tiến hành khảo sát độ lặp lại của phản
ứng trong cùng một lần thí nghiệm và giữa các lần thí nghiệm.


24

− Phản ứng PCR dễ dàng bị ức chế bởi sự hiện diện của các chất trong các

mẫu bệnh phẩm như muối mật, polysaccharide có trong phân, hemoglobin
có trong máu, thành phần ure trong nước tiểu, … Các chất này ức chế PCR
thông qua ức chế enzyme DNA polymerase trong giai đoạn kéo dài. Ngoài
ra còn bị ức chế bởi một số hóa chất trong dung dịch tách chiết như phenol,
cloroform, sodium deoxy sulphonate, triton X-100, ethanol, aceton, …
− Để khắc phục được những nhược điểm đó, cách đơn giản và đáng tin cậy

nhất là sử dụng mẫu đối chứng âm, dương và mẫu chứng nội tại (internal
control). Mẫu chứng nội sẽ được tách chiết và khuếch đại đồng thời với
mẫu chứa acid nucleic cần phát hiện. Vì vậy, chứng nội tại sẽ là chỉ tiêu để
đánh giá độ tin cậy và tính chính xác của phát ứng real-time PCR.

2.3.

Các yếu tố kiểm soát quá trình xác định tải lượng HBV-DNA

2.3.1. Chứng dương (positive control)

Là một phản ứng kiểm soát khi sử dụng một lượng mẫu đã biết, thông thường là
một DNA (plasmid chứa DNA của HBV) được cho vào PCR mix để cho sản phẩm
khuếch đại có kích thước và trình tự giống hệt DNA đích. Khi đọc bảng kết quả,
chứng dương mà dương tính chứng tỏ sản phẩm đạt độ tin cậy cho phép sử dụng.
Vai trò:
− Kiểm soát quá trình thao tác kỹ thuật trong phòng thí nghiệm.
− Kiểm tra thành phần master mix, lượng MgCl 2, mồi, nhiệt độ ủ mồi khi
dùng vào phản ứng PCR.
− Để kiểm tra độ nhạy của quá trình PCR có đạt hay không.

2.3.2. Chứng âm (negative control)
Là một phản ứng kiểm soát mà chứa các thành phần thiết yếu trừ khuôn mẫu, thông
thường là mẫu nước tinh sạch hay TE 1X được cho vào PCR mix. Khi đọc bảng kết
quả, chứng âm mà âm tính có thể suy ra mẫu chưa bị ngoại nhiễm.


25

Vai trò:
Chứng minh mẫu và các thành phần khác không bị nhiễm chéo hoặc ngoại nhiễm
sản phẩm khuếch đại bằng cách đối chiếu kết quả của chứng âm phải cho ra âm
tính.

2.3.3. Chứng nội tại (internal control)
Chứng nội tại (internal control) là một DNA được khuếch đại song song với DNA
đích để kiểm soát quá trình PCR.

2.3.3.1 Phân loại

• Chứng nội tại là DNA bộ gen vật chủ
Để có thể khuếch đại được DNA chứng nội tại, phải cho thêm vào hỗn hợp
PCR một cặp mồi đặc hiệu với DNA chứng nội tại và thiết kế mồi sao cho
nhiệt độ bắt cặp tương tự nhiệt độ của mồi dành cho DNA đích.
Do sử dụng bộ gen vật chủ nên chỉ kiểm soát được hệ thống tách chiết nucleic
acid trên mẫu có tốt không, kiểm soát sự ức chế có diễn ra hay không. Do đó,
chứng nội tại này không có khả năng kiểm soát hệ thống khuếch đại DNA
đích vì dùng mồi khác biệt.

• Chứng nội tại là một hệ thống mồi và DNA khác biệt với DNA đích
Là DNA được khuếch đại song song với DNA đích nhưng dùng mồi khác biệt
DNA đích và DNA chứng nội cũng có nguồn gốc khác biệt hoàn toàn DNA
đích. Cho vào PCR một cặp mồi đặc hiệu với DNA chứng nội tại và mồi đó
phải có nhiệt độ bắt cặp tương tự nhiệt độ của mồi dành cho DNA đích.
Phải cần một plasmid mà trong đó có chứa một DNA khác với DNA đích và
cần thiết kế primer.

• Chứng nội tại là DNA tổng hợp có nguồn gốc khác DNA đích nhưng sử
dụng cùng mồi với DNA đích
Là DNA được tổng hợp bằng cách sử dụng sản phẩm khuếch đại của một
DNA khác biệt với DNA đích nhưng chèn ở hai đầu các trình tự giống hệt
trình từ mồi của DNA đích (oligo overhang primer).