Đề tài nghiên cứu và khảo sát một số phương pháp tiền xử mùn cưa gỗ cao su với mục đích lên men tạo bioethanol

1

LỜI CẢM ƠN
Con xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã cực khổ lao
động cho con ăn học đến ngày hôm nay. Là nguồn động viên tinh thần và chăm lo
cho con trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Tôn Đức Thắng, quý thầy cô Khoa
Khoa học ứng dụng và Bộ môn Công nghệ sinh học đã đem hết tâm huyết để truyền
đạt cho em những kiến thức về lý thuyết và thực tiễn để em hoàn thành tốt nhiệm vụ
học tập của mình tại trường.
Để có được bài luận văn tốt nghiệp này em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành
và sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Đình Qn và cơ Trần Thị Tưởng An đã trực tiếp
hướng dẫn, giúp đỡ, dìu dắt em với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá
trình triển khai, nghiên cứu và tạo mọi điều kiện để em có thể hồn thành tốt luận
văn.
Xin cảm ơn các anh chị nhân viên phịng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và
Biomass đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện.
Cuối cùng xin cảm ơn bạn bè lớp 14060301, những bạn bè cùng thực hiện đề
tài ở Biomass lab đã giúp đỡ tôi rất nhiều, giúp cho khoảng thời gian làm luận văn
của tôi trở nên vui vẻ và có động lực hơn.
Xin chân thành cảm ơn!


2

LỜI CAM ĐOAN
CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐHQG TP. HỒ CHÍ MINH
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi và được sự hướng
dẫn khoa học của TS. Nguyễn Đình Quân và Ths. Trần Thị Tưởng An. Các nội dung

nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa cơng bố dưới bất kỳ hình
thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích,
nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ
trong phần tài liệu tham khảo.
Ngồi ra, trong luận văn cịn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số
liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn
gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về
nội dung luận văn của mình. Trường đại học Tôn Đức Thắng không liên quan đến
những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong q trình thực hiện (nếu
có).
TP. Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 1 năm 2019
Tác giả

Lê Thị Thúy Vi


3

TĨM TẮT
Mỗi năm ngành cơng nghiệp gỗ thải ra khoảng 38% phụ phẩm gỗ trên tổng
sản lượng khai thác (theo số liệu công ty TNHH MTV Ngôi sao vàng), tuy nhiên
đây lại là nguồn nguyên liệu giàu cellulose, mang lại tiềm năng rất lớn trong việc
sản xuất bioethanol. Nếu tận dụng tốt nguồn nguyên liệu này sẽ giải quyết được vấn
đề năng lượng sinh học cho tương lai vừa tránh lãng phí lượng phụ phẩm thải ra
mỗi năm.
Bài khóa luận này tập trung vào việc tiền xử lý mùn cưa gỗ cao su loại lignin,
làm giàu cellulose trong nguyên liệu để lên men tạo bioethanol. Sử dụng nguyên
liệu mùn cưa cao su vì loại gỗ này thường được người ta khai thác sau khi hết chu
kỳ khai thác nhựa nên rất thân thiện môi trường và lượng phụ phẩm tạo ra nhiều.

Thực hiện phương pháp tiền xử lý bằng tác nhân hóa học, áp dụng 2 tác nhân
là H2SO4 và KOH. Sự chọn lựa KOH là do thành phần lignin bị phân hủy bởi tác
nhân kiềm nhờ vậy enzyme thủy phân dễ dàng tác động lên mạch cellulose tạo ra
đường cho nấm men sử dụng. Hiện nay, có nhiều nghiên cứu đã sử dụng NaOH để
tiền xử lý loại lignin, tuy nhiên những lo ngại về sự có mặt NaOH trong nước thải
gây độc hại với sinh vật khác nên khó áp dụng với quy mơ thương mại vì vậy KOH
có thể là sự lựa chọn tốt hơn, do ít độc hơn. H 2SO4 là sự lựa chọn thứ 2 với vai trò
như một chất đối chứng với tác nhân kiềm sử dụng, tuy nhiên acid này có khả năng
thủy phân mạch cellulose gây thất thoát đường nên cần lưu ý khi sử dụng.
Tiến hành khảo sát nồng độ và thời gian tiền xử lý. Kết quả hiệu suất tiền xử
lý cao nhất với nồng độ H2SO4 3%, đối với tác nhân kiềm hiệu suất tiền xử lý cao
nhất ở nồng độ KOH 2%, thời gian tiền xử lý tốt nhất với cả 2 tác nhân là 24h. Kết
quả lên men kiểm chứng cho thấy mẫu tiền xử lý bằng KOH 2% tạo được nồng độ
cồn cao nhất là 0,65% ở 32h nhiệt độ 37ºC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, tuy nhiên mẫu
tiền xử lý với H2SO4 3% khơng có khả năng tạo cồn do thành phần cellulose vơ định
hình bị acid thủy phân hết chỉ còn phần cellulose tinh thể và enzyme không thể thủy
phân được cellulose tinh thể cho nấm men sử dụng.


4

MỤC LỤC


5

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AIR: Acid-insoluble residue – dư lượng các chất không tan trong acid.
ASL: Acid-soluble lignin – lignin tan trong acid.
SHF: Separate Hydrolysis and Fermentation – thủy phân và lên men riêng lẻ.

SSF: Simultaneous Saccharification and Fermentation – thủy phân và lên men đồng
thời.
SDA: Sabouraud Dextrose Agar
OD: Optical Density – mật độ quang.
PT: phương trình.


6

DANH MỤC BẢNG


7

DANH MỤC HÌNH


8

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay, Việt Nam trở thành nước cung cấp dăm gỗ lớn nhất thế giới từ năm
2011 ước tính chiếm khoảng 20% khối lượng giao dịch dăm gỗ trên toàn thế giới.
Nước ta cũng là nước xuất khẩu gỗ và các sản phẩm từ gỗ lớn nhất khu vực Đông
Nam Á, thứ 2 châu Á, thứ 5 thế giới chiếm thị phần khoảng 6% thị trường gỗ toàn
cầu theo số liệu của Hiệp hội Gỗ và Lâm sản Việt Nam (VIFORES) [34]. Từ đó có
thể thấy, Việt Nam là một nước có tiềm năng về gỗ vô cùng lớn và những phụ phẩm
tạo ra trong chế biến gỗ là rất nhiều, đây cũng là một nguồn nguyên liệu giàu
cellulose nếu có thể tận dụng tốt lượng phụ phẩm này để sản xuất bioethanol thì có
thể đảm bảo được lượng nhiên liệu tái sinh trong tương lai và tận dụng được tối đa

những sản phẩm thừa của công nghiệp gỗ hiện nay.
Với việc giá dầu mỏ bấp bênh, ảnh hưởng xấu tới môi trường trên trái đất và
đây là nguồn tài nguyên có hạn chỉ sử dụng trong khoảng 40-50 năm tới đang là
một thách thức vô cùng lớn cho việc sử dụng năng lượng thay thế trong tương lai.
Các nước phát triển trên thế giới đều nhận thức được việc tiết kiệm năng lượng và
liên tục nghiên cứu để khai thác và tận dụng tối đa các nguồn năng lượng tái sinh.
Họ đánh giá cao tầm quan trọng của nhiên liệu tái sinh trong việc thúc đẩy kinh tế
phát triển đồng thời bảo vệ môi trường. Như đã nêu ở trên, Việt Nam là một nước
có nguồn năng lượng tái sinh tương đối phong phú nhưng chưa được sử dụng hợp lý
và triệu để. Hàng năm chúng ta lãng phí hàng triệu tấn mùn cưa cũng như các phế
phẩm của ngành gỗ. Sử dụng nguồn sinh khối này mang lại lợi ích cho kinh tế, môi
trường và xã hội.
Bioethanol được đánh giá là nguồn nhiên liệu cho tương lai vì đây là nhiên
liệu tái sinh có thể sản xuất với sản lượng lớn, khơng gây ơ nhiễm cho mơi trường
và có thể thay thế cho nhiên liệu hóa thạch hiện nay là xăng. Bioethanol hồn tồn
có thể được sản xuất từ nguồn cellulose thực vật như rơm, rạ, trấu, mùn cưa…


9

Mục tiêu của đề tài này là tìm ra phương pháp cũng như tác nhân tiền xử lý
phù hợp giúp nâng cao khả năng lên men của dăm gỗ trong nước. Đề tài dựa trên
việc tìm hiểu những thành tựu trên thế giới kết hợp với những kiến thức đã học từng
bước hoàn thiện kết quả nghiên cứu.
1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Thực hiện nghiên cứu tìm phương pháp tiền xử lý hiệu quả cho mùn cưa gỗ
cao su có thể giải quyết được các vấn đề cịn tồn tại từ sản xuất bioethanol từ sắn
thái lát như sau:
- Tìm được một nguồn nguyên liệu thay thế nguyên liệu ảnh hưởng tới an ninh
lương thực toàn cầu, chủ động hơn trong việc cung cấp nguyên liệu, giá cả ổn

định hơn đồng thời giải quyết vấn đề môi trường ở các nhà máy chế biến gỗ.
- Có nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất sản lượng bioethanol lớn hơn cung cấp
cho nhu cầu tiêu thụ xăng sinh học trong nước.
1.3 Mục tiêu đề tài
Nghiên cứu sử dụng một số tác nhân kiềm mạnh, acid mạnh để tiền xử lý
lignocellulose (loại lignin, làm giàu cellulose) trong phụ phẩm gỗ cao su với mục
đích tạo bioethanol.
1.4 Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát thành phần mùn cưa cao su ban đầu.
- Khảo sát quá trình tiền xử lý mùn cưa gỗ cao su bằng KOH, H 2SO4: thời gian,
nồng độ, tỉ lệ rắn/lỏng.
- Lên men ethanol: khảo sát thời gian lên men.
- Chỉ tiêu đánh giá: độ cồn, đường khử, mật độ nấm men.


10

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về Bioethanol
2.1.1 Định nghĩa
Bioethanol là sản phẩm lên men cồn, được tạo ra nhờ quá trình lên men của vi
sinh vật, khác hẳn với nguồn ethanol được tạo ra từ công nghệ hóa dầu. Bioethanol
được tạo ra từ các nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo như: lương thực, cây
trồng, rơm rạ,…, được sử dụng như một nguồn nhiên liệu cho động cơ đốt trong
hoặc có thể pha trộn vào trong xăng [23].
2.1.2 Nguyên liệu sản xuất bioethanol
Bảng 2.1 Các nguồn nguyên liệu chính sản xuất bioethanol
Nguồn nguyên

Ưu điểm

Nhược điểm

liệu
Bioethanol Nguyên liệu giàu Hiệu suất chuyển Là nguồn thực phẩm
thế hệ 1

tinh bột như ngơ, hóa tạo bioethanol chính xâm phạm đến an
lúa mì, ngũ cốc.

cao.

ninh lương thực nên
khơng thích hợp.

Bioethanol Phụ phẩm ngành
thế hệ 2

Giải quyết được vấn Hiệu suất chuyển hóa

nơng nghiệp như đề phụ phế phẩm thấp.
rơm, vỏ trấu, bã ngành nơng nghiệp.
mía, mùn cưa,…

Bioethanol Các loại tảo.
thế hệ 3

Hiệu suất cao mà Tốn diện tích ni trồng
khơng ảnh hưởng lớn, chưa được nghiên
đến vấn đề an ninh cứu rộng rãi.

lương thực.
(Nguồn: Walker, 2010)


11

2.1.3 Quy trình sản xuất ethanol
- Sản xuất ethanol bằng phương pháp hóa học
Trong cơng nghệ tổng hợp hóa dầu, người ta sản xuất ethanol bằng cách
hydrat hóa khí ethylene (PT 2.1) hoặc cacbonyl hóa methanol (PT 2.2).
Hydrat hóa: CH2=CH2 + H2O -> C2H5OH (PT 2.1)
Cacbonyl hóa: CH3OH + CO + 2H2 -> C2H5OH + H2O (PT 2.2)
- Sản xuất ethanol bằng phương pháp sinh học
Bioethanol được sản xuất từ sinh khối chủ yếu thơng qua q trình lên men sử
dụng glucose có nguồn gốc từ đường (mía, củ cải đường và mật rỉ đường), tinh bột
(ngơ, lúa mì, ngũ cốc) hoặc cellulose (trong gỗ) làm nguyên liệu thô.
2.1.4 Ưu và nhược điểm của bioethanol
2.1.4.1 Ưu điểm
Bioethanol được ứng dụng trong thực phẩm, y tế, đặc biệt chúng được pha
trộn với xăng để tạo xăng sinh học. Bioethanol là nhiên liệu có chỉ số octane cao và
thường được bổ sung vào như một chất làm tăng chỉ số octane của xăng. Bioethanol
trộn trong xăng làm giảm các chất gây ô nhiễm gồm: carbon monoxide, khí thải
hydrocarbon và các hạt bụi, giảm hàm lượng benzen, hàm lượng lưu huỳnh của
xăng, giảm đáng kể lượng khí phát thải gây hiệu ứng nhà kính GHG (Greenhouse
Gas) [23].
2.1.4.2 Nhược điểm
Bioethanol chứa ít năng lượng hơn xăng (khoảng 70%) nên cần một lượng lớn
hơn để sử dụng, gây tốn kém. Trong bioethanol luôn lẫn một lượng nước rất nhỏ,
điều này có thể gây hư hỏng động cơ, đòi hỏi phải thiết kế những động cơ chuyên
dụng để sử dụng chúng làm nhiên liệu.

12

2.2 Quy trình sản xuất bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose
2.2.1 Nguyên liệu lignocellulose
Lignocellulose có thể được sử dụng để sản xuất bioethanol, nguồn năng lượng
đầy hứa hẹn sẽ thay thế ethanol được sản xuất từ than đá đang dần cạn kiệt. Hai quá
trình chủ yếu xảy ra trong sản xuất là: thủy phân cellulose trong lignocellulose tạo
đường khử và lên men đường khử nhờ nấm men tạo bioethanol [22].
Có 4 nhóm ngun liệu lignocellulose chính:
-

Tàn dư trong khai thác rừng (gỗ vụn, lá cây, tán lá,…)
Phụ phẩm nông nghiệp (thân bắp, rơm rạ,…)
Các loại cây trồng năng lượng (cỏ kê Mỹ, bạch dương vàng,..)
Chất thải cellulose (chất thải rắn đô thị, chất thải thực phẩm,…) [8].
Tuy nhiên đối với nguồn nguyên liệu này cũng có một số thách thức đặt ra là

chi phí cho thủy phân cao và năng suất thấp. Hiện nay, các nhà khoa học đang
không ngừng nghiên cứu để cải thiện quá trình thủy phân, tiền xử lý loại bỏ lignin
và hemicellulose để tăng cường sự thủy phân cellulose, tối ưu hóa điều kiện hoạt
động cho cellulase. Áp dụng phương pháp thủy phân và lên men đồng thời nhằm
loại bỏ tốt glucose, tác nhân ức chế hoạt động enzyme cellulase. Nhờ đó làm tăng
đáng kể tốc độ thủy phân và lên men [22].
2.2.1.1 Cấu trúc nguyên liệu lignocellulose
Bao gồm các sợi cellulose xếp song song với nhau thành dạng bó, xen lẫn là
các sợi hemicellulose sắp xếp không theo trật tự tạo thành cấu trúc vi sợi, ngoài
cùng là lớp lignin cứng chắc giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn cơng của các tác
nhân thủy phân.

Hình .1 Cấu trúc lignocellulose
(USDA Agricultural Research Service)


13

a) Lignin
Lignin là một polymer có vịng thơm được tạo nên từ các đơn vị
phenylpropanoid, chiếm từ 25 – 39% khối lượng khô của gỗ mềm, trong gỗ cứng
con số này dao động trong khoảng 17 – 32%. Các đơn vị phenylpropanoid liên kết
với nhau bằng liên kết cộng hóa trị, góp phần cấu tạo nên thành tế bào thực vật [17].
Trong gỗ mềm thành phần lignin chủ yếu gồm các đơn vị guaiacyl liên kết với
nhau. Còn trong gỗ cứng chủ yếu là các đơn vị syringyl và một ít đơn vị guaiacyl. Ở
những cây gỗ hàng năm ngoài những đơn vị kể trên trong cấu trúc lignin còn có
thêm p-hydroxyphenyl [6].
b) Cellulose
Cellulose là thành phần cấu tạo nên tế bào thực vật, công thức phân tử
(C6H10O5)n, là một polysaccharide không phân nhánh được tạo nên từ các phân tử Dglucose bằng liên kết β-1,4-glucoside. Cellulose trong tự nhiên có mức độ trùng hợp
cao khoảng 15000 đơn vị glucose, các đơn vị này liên kết với nhau bằng liên kết
hydro tạo thành vùng cấu trúc tinh thể (khó phân hủy) và vùng vơ định hình (dễ
phân hủy) [8].


14

Hình 2.1 Cấu trúc sợi cellulose
(Mikaela Bưrjesson, 2015)

c) Hemicellulose

Khác với cellulose, hemicellulose là một polysaccharide phân nhánh, được tạo
thành từ nhiều gốc đường 5C, mức độ trùng hợp thấp và dễ bị thủy phân hơn. Thành
phần chính trong hemicellulose của gỗ mềm là O-acetylgalactoglucomannan,
arabino-4-O-methylglucurono-D-xylan, trong gỗ cứng là O – acetyl – 4 –O
methylglucurono – D – xylan.
2.2.2 Tiền xử lý
Nguyên tắc: biến đổi nguyên liệu lignocellulose thành những sản phẩm giàu
cellulose. Tiền xử lý được áp dụng nhằm tăng khả năng tiếp cận cellulose của
enzyme thủy phân, đối với các loại nguyên liệu lignocellulose khác nhau sẽ có các
điều kiện tiền xử lý khác nhau [8].

Hình .3 Cấu trúc lignocellulose trước và sau tiền xử lý
(Latika Bhatia, 2012)


15

Quá trình tiền xử lý phải đảm bảo các yếu tố sau:
-

Khơng làm thất thốt đường.
Khơng tạo ra các sản phẩm ức chế hoạt động của enzyme thủy phân.
Tránh các loại hóa chất độc hại, gây ơ nhiễm mỗi trường, ăn mòn thiết bị.
Sử dụng hết nguồn nguyên liệu để tránh gây lãng phí.
Kiểm sốt được chi phí và đem lại những lợi ích về kinh tế [5], [17].

2.2.2.1 Tiền xử lý bằng tác nhân vật lý
Thường sử dụng các tác nhân như: nghiền, lị vi sóng, siêu âm, cao áp,…
Những phương pháp này ít gây ơ nhiễm mơi trường và tương đối đơn giản, tuy

nhiên địi hỏi máy móc hiện đại, làm tăng giá thành sản xuất.
a) Nghiền cơ học
Là phương pháp xử lý cơ học gồm: nghiền khô, nghiền ướt, nghiền bi rung,
nén. Mục đích để làm nhỏ nguyên liệu, tăng diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với
tác nhân thủy phân trong giai đoạn kế tiếp. Tuy nhiên q trình này khơng thể loại
bỏ lignin và hemicellulose, chi phí thực hiện tương đối cao [8], [12].
b) Sử dụng lị vi sóng
Phương pháp này có thể cải thiện được khả năng tiếp cận và phản ứng của tác
nhân thủy phân cellulose. Sử dụng lị vi sóng đơn giản, tiết kiệm năng lượng. Sau
khi tiền xử lý khả thích nghi của nguyên liệu lignocellulose với enzyme tăng lên.
Tuy nhiên chi phí đầu tư thiết bị máy móc cao, sử dụng lị vi sóng với ngun liệu


16

dạng sợi đòi hỏi thực hiện ở nhiệt độ cao (>160ºC), vì hầu hết đều khơng có sự thay
đổi trong cấu trúc nguyên liệu khi thực hiện ở nhiệt độ dưới 100ºC [8].
c) Tiền xử lý bằng siêu âm
Sóng siêu âm có thể mở ra các vùng tinh thể của lignocellulose, phân hủy
lignin, cải thiện đáng kể khả năng xâm nhập và thủy phân của cellulase. Sóng siêu
âm phân hủy hemicellulose, làm giảm số lượng sợi trên bề mặt nguyên liệu [8].
Đến nay một số nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu lĩnh vực này, một số
báo cáo chỉ ra rằng việc sử dụng sóng siêu âm cải thiện sự đường hóa cellulose.
Dùng phương pháp siêu âm có tác nhân kiềm hỗ trợ có thể bẻ gãy liên kết hydro
giữa các phân tử lignocellulose, làm giảm các vùng tinh thể của cellulose. Kết quả
là loại bỏ được lignin, việc thủy phân cellulose của enzyme dễ dàng hơn do ít vùng
tinh thể [7], [21].
d) Tiền xử lý bằng nổ hơi
Là quá trình kết hợp giữa tác động cơ học, nhiệt học và hóa học lên nguyên
liệu nhằm phá vỡ cấu trúc của nguyên liệu bằng nhiệt ở dạng hơi nước, lực cắt sinh

ra do sự giãn nở của hơi nước và thủy phân các liên kết glucoside.
Giai đoạn 1: Nước dưới áp suất cao sẽ xâm nhập và làm ẩm ngun liệu, chính
độ ẩm này sẽ thủy phân các nhóm acetyl trong hemicellulose tạo thành các acid hữu
cơ như acid acetic và acid uronic.
Giai đoạn 2: Áp suất vài chục atm hạ đột ngột xuống bằng với áp suất khí
quyển khiến cho ẩm trong nguyên liệu bị hóa hơi. Hiện tượng này giống với hiện
tượng nổ làm cho cấu trúc cơ học của lignocellulose bị phá vỡ do sự giãn nở của hơi
nước sẽ gây ra lực cắt xung quanh nguyên liệu [8].
2.2.2.2 Tiền xử lý bằng tác nhân hóa học
a) Tiền xử lý bằng acid
Cơ chế: Acid len lõi vào cấu trúc biomass, ion hydrogen tấn công vào nguyên
tử oxy của liên kết glucoside, dẫn đến sự thủy phân phần lớn hemicellulose (do nằm


17

bên ngồi), một ít cellulose (nằm bên trong khó bị thủy phân hơn) và một phần
lignin liên kết với hemicellulose.
Thường sử dụng các acid vô cơ (acid sulfuric, acid nitric, acid hydrochloric,
acid phosphoric) và hữu cơ (acid acetic, acid propionic, acid formic).
Tiền xử lý bằng acid có thể được chia thành tiền xử lý bằng acid đậm đặc và
tiền xử lý bằng aicd loãng. Đối với acid đậm đặc, nồng độ acid có thể trên 30%,
lignocellulose được chuyển hóa thành monosaccharide ở nhiệt độ 100ºC trong 2 –
10h ở áp suất khí quyển [8].
Tuy nhiên phần lớn các acid đậm đặc đều có độc tính, thường tạo ra các sản
phẩm phụ gây ức chế lên men (ví dụ: furfural ức chế nấm men), ngồi ra chúng cịn
ăn mịn thiết bị khiến chi phí vận hành, bảo dưỡng tăng cao.
Tiền xử lý bằng acid loãng thường được sử dụng trong nghiên cứu hiện nay,
nồng độ acid sử dụng <10%, phản ứng diễn ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao
trong vài giây hoặc vài phút. Trong các loại acid sulfuric, acid nitric, acid

hydrochloric, acid phosphoric thì acid sulfuric lỗng được nghiên cứu sử dụng
nhiều nhất [8].
Năm 2005, Saha đã chứng minh rằng tiền xử lý rơm từ cây lúa mì ở nồng độ
acid sulfuric 0,75%, 121ºC trong 1h đạt hiệu suất đường hóa cao nhất (76,5%) [19].
Ngồi ra một số acid hữu cơ cũng góp phần tăng cường sự thủy phân
cellulose. Năm 2009, Kootstra đã so sánh hiệu quả tiền xử lý và sự hình thành các
hợp chất phân hủy đường trong quá trình tiền xử lý với acid maleic,acid fumaric và
acid sulfuric. Acid hữu cơ có hiệu suất tiền xử lý cao hơn với rơm lúa mì và thu
được lượng furfural ít hơn trong tiền xử lý với acid sulfuric [14].
Ưu điểm của tiền xử lý acid loãng: Tiền xử lý bằng acid loãng diễn ra nhanh
hơn và không cần tái sử dụng acid, cải thiện lượng cellulose thủy phân.
Nhược điểm của tiền xử lý acid loãng: acid gây ăn mòn vật liệu đòi hỏi phải
sử dụng vật liệu đắt tiền.


18

b) Tiền xử lý bằng kiềm
Cơ chế: Sử dụng kiềm loãng để tiền xử lý làm cho cấu trúc lignocellulose trở
nên lỏng lẻo, do xuất hiện phản ứng xà phòng hóa liên kết este của các phân tử
trong cấu trúc lignocellulose (ví dụ: liên kết giữa lignin và nhóm xylan của
hemicellulose) làm cho cấu trúc nguyên liệu có nhiều lỗ rỗng khiến cho enzyme dễ
dàng tiếp cận cellulose, phá vỡ liên kết hóa học giữa lignin và carbohydrate, giúp
loại bỏ lignin [13].
Tiền xử lý bằng kiềm chủ yếu phụ thuộc vào độ hòa tan của lignin trong dung
dịch kiềm, NaOH, KOH, Ca(OH) 2, Al(OH)3 thường được sử dụng cho tiền xử lý
lignocellulose [16]. Tiền xử lý bằng kiềm có thể thực hiện ở nhiệt độ phịng, áp suất
khí quyển trong vịng 2 ngày, và ít làm thất thốt đường hơn so với tiền xử lý bằng
acid [8].
Cho đến nay, tiền xử lý bằng KOH, NaOH loãng là phương pháp tiền xử lý

bằng kiềm hiệu quả nhất đối với việc loại bỏ lignin làm giàu cellulose trong nguyên
liệu. Tuy nhiên, những lo ngại về sự có mặt NaOH trong nước thải gây độc hại với
sinh vật khác nên khó áp dụng với quy mơ thương mại. KOH có thể là sự lựa chọn
tốt hơn, do ít độc hơn, ngồi ra sự phân giải kỵ khí KOH có vai trị quan trọng trong
việc tạo ra phân bón nơng nghiệp.
Chosdu sử dụng kết hợp chiếu xạ và NaOH 2% để tiền xử lý thân cây ngô.
Hàm lượng glucose của thân cây ngô trong các mẫu khơng xử lý là 20% cịn ở các
mẫu được xử lý bằng chiếu xạ ở 500kGy và NaOH 2% là 43%. Khả năng thủy phân
của enzyme đối với gỗ cứng được xử lý bằng NaOH tăng từ 14% lên 55%, hàm
lượng lignin giảm từ 24 - 50% xuống còn 20% [10].
Ưu điểm tiền xử lý bằng kiềm: Loại bỏ được lignin trong nguyên liệu, làm
tăng khả năng tiếp xúc của enzyme với cellulose.
Nhược điểm tiền xử lý bằng kiềm: Phương pháp này có hiệu quả đối với
nguyên liệu có hàm lượng lignin thấp, như chất thải nơng nghiệp nhưng kém hiệu
quả hơn nếu hàm lượng lignin trong sinh khối tăng lên.


19

c) Tiền xử lý bằng tác nhân oxy hóa
Q trình này liên quan đến việc lignin bị thối hóa dưới tác động của chất
oxy hóa. Có 3 tác nhân tiền xử lý chính là: ozone hóa, oxy hóa ướt, quang xúc tác
[13].
Ozone có thể phân hủy lignin và hemicellulose ở mức độ lớn vì tính oxy hóa
mạnh của nó. Với tiền xử lý ozone hóa, tốc độ thủy phân của enzyme đối với
cellulose có thể tăng gấp 5 lần do loại bỏ được 60% lignin. Có thể thực hiện ozone
hóa ở nhiệt độ phịng, ngồi ra q trình này khơng tạo ra các hợp chất độc hại ảnh
hưởng đến quá trình thủy phân và lên men tiếp theo. Tuy nhiên tác nhân tiền xử lý
này không khả thi về mặt kinh tế do địi hỏi chi phí cao cho lượng lớn ozone [8].
Phương pháp oxy hóa ướt liên quan đến việc oxy hóa của oxy với sự có mặt

của nước, đòi hỏi phải thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao [8].
Phương pháp quang xúc tác không làm ảnh hưởng đến sự phân bố các thành
phần trong nguyên liệu nhưng nó giúp giảm thiểu thời gian phản ứng [8].
2.2.2.3 Tiền xử lý bằng tác nhân sinh học
Phương pháp này chủ yếu sử dụng một số vi sinh vật, vi khuẩn để phân hủy
lignin. Các loại sinh vật này tiết ra một loại enzyme có khả năng thủy phân lignin,
những loài thường sử dụng: nấm thối thân gỗ, nấm thối trắng, nấm thối nâu. Trong
đó nấm thối trắng có khả năng phân hủy lignin tốt nhất. Một số nấm thối trắng,
chẳng hạn như: Ceriporiopsis subvermispora, Pleurotus Ostreaus, Ceriporia
lacerata, Cyathus stercolerus, Pycnoporus cinnarbarinus và Phanerochaete
chrysosporium, đã được kiểm tra trên các sinh khối lignocellulose khác nhau cho
thấy hiệu quả phân hủy lignin cao, tuy nhiên nếu thời gian tiền xử lý quá dài nấm
thối trắng sẽ phân hủy luôn cả cellulose và hemicellulose [8].
2.2.3 Thủy phân
Sau khi tiền xử lý, cellulose và hemicellulose còn lại trong mẫu sẽ được đem
đi thủy phân để tạo ra đường đơn phục vụ cho quá trình lên men.


20

Phương trình thủy phân: (C6H10O5)n + nH2O -> nC6H12O6
2.2.3.1 Thủy phân bằng cellulase
Thủy phân bằng cellulase có tính đặc hiệu cao, các sản phẩm thủy phân
thường là đường khử bao gồm glucose, chi phí thủy phân bằng enyme thường thấp
hơn so với thủy phân bằng acid hay kiểm vì điều kiện thực hiện ở pH khoảng 4,8 và
nhiệt độ dao động trong khoảng 45 – 50ºC, khơng gây ăn mịn thiết bị. Cả vi khuẩn
và nấm đều có khả năng cung cấp cellulase cho quá trình thủy phân lignocellulose
[22].
Cellulase là một tổ hợp nhiều nhóm enzyme, trong đó có 3 nhóm enzyme
chính tham gia vào q trình thủy phân:

-

Endoglucanase (EG, endo-1,4-D-glucanohydrolase, hoặc EC 3.2.1.4.) tấn cơng

-

vùng có độ kết tinh thấp trong sợi cellulose, tạo cấu trúc đuôi tự do.
Exoglucanase hoặc cellobiohydrolase (CBH, cellobiohydrolase 1,4-β-D-glucan
hoặc EC 3.2.1.91.) tiếp tục phân giải chuỗi cellulose bằng cách loại bỏ các đơn vị

-

cellobiose từ đuôi tự do.
β - glucosidase (EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose thành glucose [22].
2.2.3.2 Thủy phân bằng acid
Quá trình thủy phân được thực hiện bởi phản ứng giữa cellulose với acid. Các
acid sulfuric, acid chlohydric là tác nhân thủy phân mạnh, tuy nhiên thường tạo ra
các sản phẩm phụ độc hại, gây ăn mòn thiết bị và cần tái sử dụng để đem lại hiệu
quả về kinh tế. Hiện nay thường sử dụng acid lỗng để thủy phân vì phản ứng thủy
phân diễn ra nhanh hơn và không cần tái sử dụng acid [22].
2.2.4 Lên men
Len men là quá trình biến đổi vật chất hữu cơ thông qua hoạt động của vi sinh
vật trong điều kiện có hoặc khơng có oxy khơng khí, một phần chất hữu bị phân giải
thành chất khử, phần còn lại phân giải thành chất oxy hóa. Lên men là phương thức
chủ yếu của vi sinh vật yếm khí, khơng nhận điện tử từ bên ngồi, oxy hóa khơng
triệt để, năng lượng sinh ra khơng nhiều. Từ xa xưa con người đã sử dụng quá trình


21

lên men để sản xuất thực phẩm và đồ uống như cải chua, sữa chua, kim chi, các đồ
uống có cồn như rượu vang và bia.
Khi nguồn đường vào trong tế bào vi sinh vật sẽ xảy ra các biến đổi sinh hóa
trước tiên, sau đó mới xảy ra quá trình lên men. Quá trình đầu tiên là quá trình
đường phân đây là một chuỗi các phản ứng sinh hóa biến đổi nguyên liệu ban đầu là
glucose thành sản phẩm cuối cùng là acid pyruvic và năng lượng dưới dạng ATP.
Những sản phẩm của quá trình đường phân sẽ là nguyên liệu tiếp theo cho quá trình
lên men của vi sinh vật [23].

Hình .4 Quá trình đường phân
(Prescott, 2005)

Acid pyruvic được tạo ra trong q trình đường phân khơng tiến vào chu
trình krebs như hơ hấp hiếu khí mà sẽ được chuyển hóa thành các sản phẩm lên men
như ethanol, acid lactic… trong điều kiện khơng có oxy khơng khí [23].
Đối với quy trình lên men ethanol, acid pyruvic sẽ bị biến đổi thành ethanol và
CO2 nhờ 2 enzyme pyruvate decarboxylase và alcohol dehydrogenase.

Hình 2.2 Quá trình lên men ethanol
(Lê Ngọc Chí Minh, 2018)


22

2.2.4.1 Các phương pháp lên men
a) Thủy phân và lên men riêng lẻ (SHF)
Cả 2 quá trình được thực hiện riêng lẻ ở điều kiện tối ưu của mỗi quá trình.
Tuy nhiên phương pháp này có một số nhược điểm nhất định: lượng đường tạo ra
ức chế hoạt động của enzyme phải bổ sung thêm enzyme gây tốn kém, quá trình kéo
dài mất nhiều thời gian và mẻ lên men dễ bị nhiễm các sinh vật khác

b) Thủy phân và lên men kết hợp (SSF)
Cả 2 quá trình được thực hiện đồng thời, so với SHF thì quy trình này có nhiều
ưu điểm hơn. Glucose được tạo thành trong quá trình thủy phân sẽ được nấm men
sử dụng ngay nên hạn chế được sự ức chế của glucose với enzyme, nhờ đó tốc độ
thủy phân nhanh hơn và lượng enzyme cần dùng cũng ít hơn SHF, ngồi ra cồn
được tạo ra trong suốt quá trình sẽ ức chế các vi sinh vật xâm nhiễm. Tuy nhiên
phương pháp này cũng gặp một số bất lợi do nhiệt độ thủy phân tốt nhất của
enzyme và nhiệt độ hoạt động tốt nhất của nấm men khác nhau nên không thể cùng
lúc tối ưu cả 2 quá trình.
2.2.4.2 Một số nấm men thường sử dụng
Bảng 2.2 Một số loại nấm men
Các loài nấm men

Đặc điểm

Hạn chế


23

Saccharomyces
cerevisiae

Có khả năng lên men các
loại đường đơn giản
(glucose, fructose,
saccharose, maltose,…).
Được ứng dụng rộng rãi
trong quy mơ cơng nghiệp.

Khơng có khả năng lên men
đường 5C như xylose,
arabinose,… Những loại
đường này cũng hiện diện
trong lignocellulose.

Pichia stipitis

Có thể lên men được Khơng phải nấm men chuyên
đường 5C như xylose, biệt để lên men ethanol.
arabinose,…

Hansennula
polymorpha

Lên men xylose ở nhiệt độ Chưa được kiểm tra trong quy
cao.
mơ cơng nghiệp. Điều kiện
lên men địi hỏi nhiệt độ cao.

Dekkera bruxellensis

Có thể lên men ethanol Chưa được thương mại hóa
trong điều kiện khắc hồn tồn, cịn đợi nghiên
nghiệt.
cứu thêm.

Candida krusei

Lên men mức độ thấp tạo Chưa được thương mại hóa

ra các hợp chất thứ cấp như hồn tồn, cịn đợi nghiên
acid succinic
cứu thêm trước khi mở rộng
ra quy mô công nghiệp.
(Nguồn:Walker, 2010)

2.2.4.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Phân loại khoa học:
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Phân ngành: Saccharomycotina
Lớp: Saccharomycetes
Bộ: Saccharomycetales
Họ: Saccharomycetaceae

Hình .6 Saccharomyces cerevisiae
(Walker, 2010)


24

Chi: Saccharomyces
Loài: Cerevisiae

Nấm men là vi sinh vật nhân thực, đơn bào, sinh sản vơ tính bằng nảy chồi
hoặc hữu tính bằng cách tạo bào tử, sống dị dưỡng, sinh trưởng và phát triển trong
điều kiện có hoặc khơng có oxy khơng khí. Có khả năng lên men nhiều loại đường
khác nhau ở nhiệt độ tương đối cao, chịu được mơi trường có nồng độ cồn và độ
acid cao.
Saccharomyces cerevisiae thuộc chi Saccharomyces lớp Saccharomycetes, là

loài được sử dụng nhiều nhất trong các quá trình lên men thực phẩm, bia, rượu,…
có dạng hình cầu hay hình elip, đường kính lớn 5–10 µm, đường kính nhỏ 1–7 µm
sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử [23].
Saccharomyces cerevisiae và E.coli là 2 loài vi sinh vật nhân thực thường
được sử dụng để nghiên cứu nhất hiện nay.

Trong bài khóa luận này, sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae để lên
men ethanol nguyên liệu sau khi tiền xử lý. Saccharomyces cerevisiae chỉ có khả
năng sử dụng nguồn đường 6C (trong trường hợp này là glucose) để lên men vì
chúng khơng có 2 enzyme D-xylose reductase và xylitol dehydrogenase để chuyển
hóa đường 5C.
2.2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men
a) Nồng độ oxy
Nấm men có thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện có hoặc khơng có
oxy khơng khí, nên nồng độ oxy ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Khi mơi
trường có oxy, nấm men sẽ sinh trưởng mạnh mẽ tạo nhiều sinh khối, khi oxy cạn
kiệt chúng sẽ chuyển sang lên men tạo ethanol. Do đó, khi lên men cần cung cấp
một lượng nhỏ oxy để nấm men tổng hợp một số thành phần cần thiết cho tế bào.


25

Nếu cung cấp quá nhiều oxy, nấm men sẽ chỉ sinh trưởng mà không lên men sẽ ảnh
hưởng đến lượng ethanol tạo ra.
b) Nhiệt độ
Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men, mỗi loại nấm men khác nhau
sẽ có một nhiệt độ tối ưu khác nhau. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối
ưu nằm trong khoảng 28 - 320C [23]. Nếu nhiệt độ quá cao, nấm men sẽ chết làm
cho lượng cồn tạo ra ít đi, lượng đường sót lại nhiều tạo điều kiện cho các vi sinh
vật khác phát triển, xảy ra các phản ứng lên men khơng mong muốn (lên men

lactic). Ngồi ra ở nhiệt độ cao cịn dễ hình thành các sản phẩm phụ như: aldehyde,
rượu bậc cao, este,…ảnh hưởng đến chất lượng cồn.
c) pH
pH làm thay đổi điện tích tế bào, ảnh hưởng đến khả năng thẩm thấu các chất
dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men nên ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình lên
men, pH tối ưu để tạo ethanol là 4,5 đến 5,5 [23], tuy nhiên nấm men vẫn có thể tồn
tại được ở pH từ 3 đến 4, người ta thường sử dụng pH 4 để lên men, vì ở pH này sẽ
ức chế được một số vi sinh vật tạp nhiễm, hạn chế sản phẩm phụ không mong
muốn.
d) Thành phần dinh dưỡng
Môi trường dinh dưỡng phải đảm bảo đủ các yếu tố Carbon (chủ yếu là
monosaccharide và disaccharide), Nito (acid amin), vitamin, muối khoáng…
e) Hàm lượng giống nấm men
Nấm men là nhân tố tạo ra sản phẩm trong lên men, chuyển hóa đường thành
ethanol và khí carbonic. Cùng loài nấm men, nhưng ở điều kiện lên men khác nhau
thì khả năng lên mên men khác nhau và sản phẩm tạo ra cũng khác nhau. Thông
thường lượng men giống cấy vào là 109 tế bào/mL dịch lên men [23].
2.3 Giới thiệu về cây cao su
2.3.1 Phân loại khoa học
Hình .7 Cây cao su
(ANRPC)