KHẢO sát ẢNH HƯỞNG của môi TRƯỜNG và CHẤT điều hòa SINH TRƯỞNG lên LAN NGỌC điểm (RHYNCHOSTYLIS GIGANTEA)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.13 MB, 100 trang )
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
-----o0o-----
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG VÀ
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN LAN
NGỌC ĐIỂM (RHYNCHOSTYLIS GIGANTEA
NUÔI CẤY IN VITRO
Người hướng dẫn: TS. PHAN TƯỜNG LỘC
Người thực hiện: TRƯƠNG NGỌC THIỆN ÂN
Lớp: 14060302
Khoá: 18
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
-----o0o-----
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG VÀ
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN LAN
NGỌC ĐIỂM (RHYNCHOSTYLIS GIGANTEA)
NUÔI CẤY IN VITRO
Người hướng dẫn: TS. PHAN TƯỜNG LỘC
Người thực hiện: TRƯƠNG NGỌC THIỆN ÂN
Lớp: 14060302
Khoá: 18
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018
3
LỜI CẢM ƠN
Để có thể thuận lợi học tập và hoàn thành tốt bài khóa luận đầu tiên, em xin gửi lời
cảm ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng, các thầy cô trong khoa
Khoa Học Ứng Dụng đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt những năm
qua.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến thầy Phan Tường Lộc. Nhờ có thầy hướng
dẫn, chỉ bảo, dẫn dắt và giải đáp các thắc mắc giúp em có thể hoàn thành tốt bài khóa
luận này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo công ty TNHH Nông Vinh để tạo mọi
điều kiện giúp em hoàn thành thí nghiệm của mình.
Cảm ơn các bạn Dương, Toản, Chăm, Trinh… đã giúp đỡ, động viên mình những lúc
khó khăn. Cảm ơn tập thể lớp 14060302 đã cho mình thêm động lực để làm tốt công
việc được giao.
Cuối cùng, con xin gửi đến lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình. Ba, mẹ người đã luôn
ủng hộ và tiếp sức cho con. Dù cho phía trước có khó khăn cách mấy, ba mẹ vẫn luôn
là hậu phương vững chắc phía sau, luôn lắng nghe, tin tưởng và làm cho con những
điều tốt đẹp nhất.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng năm 2019.
Trương Ngọc Thiện Ân
4
LỜI CAM ĐOAN
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn
khoa học của TS. PHAN TƯỜNG LỘC. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài
này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu
trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả
thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo.
Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của
các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội
dung khóa luận của mình. Trường đại học Tôn Đức Thắng không liên quan đến
những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có).
TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019
Trương Ngọc Thiện Ân
5
TÓM TẮT
TRƯƠNG NGỌC THIỆN ÂN, Đại học Tôn Đức Thắng, tháng 01/2019.
“ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG VÀ CHẤT ĐIỀU HÒA
SINH TRƯỞNG LÊN LAN NGỌC ĐIỂM (Rhynchostylis gigantea) BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO ”
Giảng viên hướng dẫn TS. PHAN TƯỜNG LỘC
Đề tài được thực hiện tại công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn Nông Vinh TP. HCM
Nội dung nghiên cứu gồm 4 thí nghiệm về ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy lên
khả năng sinh trưởng của lan Ngọc Điểm in vitro (môi trường MS, ½ MS, ¼ MS, VW,
KC), ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP và nước dừa lên khả năng nhân
chồi của lan Ngọc Điểm, ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ; đồng thời
tiến hành giai đoạn khảo sát nồng độ phân bón khi đưa cây ra vườn ươm để khảo sát
nồng độ thích hợp nhất dùng cho cây ở giai đoạn này.
Các kết quả đạt được:
Môi trường MS là tốt nhất đối với sự sinh trưởng của lan Ngọc Điểm in vitro với kết
quả chiều cao chồi là 1,83 cm sau 60 ngày nuôi cấy.
Môi trường MS có bổ sung 150 mL/L nước dừa kết hợp với 1,0 mg/L BAP rất thích
hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea)
vàng lưỡi đỏ in vitro với kết quả tốt nhất là 6,59 chồi/mẫu cấy sau 60 ngày nuôi cấy.
Môi trường MS kết hợp với NAA ở nồng độ 0,5 mg/L là tốt nhất đến khả năng tạo rễ
của chồi lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) in vitro với kết quả là 3,81 rễ/mẫu
cấy sau 60 ngày nuôi cấy.
6
Ở giai đoạn vườn ươm, tỷ lệ sống của lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) vàng
lưỡi đỏ là 100% , nồng độ phân bón Hyponex liquid 6-10-5 thích hợp sử dụng cho hiệu
quả tốt nhất là 8 mL/L với kết quả: 5,33 rễ/NT; 5,13 lá/NT và chiều cao cây là 5,47 cm
sau 60 ngày.
7
MỤC LỤC
BAP
: 6-benzylaminopurine
NAA
: Naphthaleneacetic
MS
: Murashige-Skoog
VW
: Vacin Went
KC
: Knudson C
8
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng
sinh trưởng của lan Ngọc Điểm in vitro.............................................................................
30
Bảng 3.2 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước dừa và BAP lên khả
năng nhân chồi của lan Ngọc Điểm in vitro.......................................................................
31
Bảng 3.3 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ
của lan Ngọc Điểm in vitro................................................................................................
32
Bảng 3.4 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng phân bón Hyponex 610-5 đến tỉ lệ sống và sinh trưởng của lan Ngọc Điểm in vitro ở giai đoạn vườn ươm......
33
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của cây lan
Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) in vitro sau 60 ngày nuôi cấy..................................
35
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa và BAP lên khả năng nhân chồi của cây
lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) in vitro sau 60 ngày...........................................
38
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của lan Ngọc Điểm
(Rhynchostylis gigantea) in vitro sau 60 ngày nuôi cấy......................................................
42
9
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của hàm lượng phân Hyponex 6-10-5 đến tỉ lệ sống và sinh
trưởng của lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) in vitro ở giai đoạn vườn ươm sau
60 ngày...............................................................................................................................
46
10
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của cây
lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) in vitro sau 60 ngày nuôi cấy ...........................
36
Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa và BAP lên khả năng nhân chồi của cây
lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) in vitro..............................................................
39
Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của lan Ngọc Điểm
(Rhynchostylis gigantea) in vitro sau 60 ngày nuôi cấy......................................................
43
Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng của hàm lượng phân Hyponex 6-10-5 đến tỉ lệ sống và sinh
trưởng của lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) in vitro ở giai đoạn vườn ươm sau
60 ngày...............................................................................................................................
47
11
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Lan đuôi cáo........................................................................................................
4
Hình 2.2 Các màu hoa của lan Ngọc Điểm........................................................................
5
Hình 2.3 Lan Hải Yến........................................................................................................
6
Hình 2.4 Hoa Ngọc Điểm vàng lưỡi đỏ..............................................................................
7
Hình 2.5 Công thức cấu tạo BAP.......................................................................................
22
Hình 2.6 Công thức cấu tạo NAA......................................................................................
23
Hình 2.7 Phân bón Hyponex liquid 6-10-5........................................................................
25
Hình 4.1 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của cây lan
Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) in vitro sau 60 ngày................................................
37
Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa và BAP lên khả năng nhân chồi của cây lan
Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) in vitro sau 60 ngày................................................
41
12
Hình 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của lan Ngọc Điểm
(Rhynchostylis gigantea) in vitro sau 60 ngày nuôi cấy......................................................
45
Hình 4.4 Ảnh hưởng của hàm lượng phân Hyponex 6-10-5 đến tỉ lệ sống và sinh
trưởng của lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) in vitro ở giai đoạn vườn ươm sau
60 ngày...............................................................................................................................
50
13
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hoa lan từ trước đến nay luôn rất được ưa chuộng vì có hình dạng đẹp, nhiều màu sắc,
lâu tàn và có hương thơm. Chính vì những lí do đó, càng ngày càng có nhiều người
chơi lan, quý lan làm cho lan có giá trị cao về mặt kinh tế.
Hoa lan đa dạng về chủng loài, riêng ở Việt Nam có trên 800 loài lan khác nhau. Trong
số đó, lan Ngọc Điểm hay còn gọi là lan Đai Châu, lan Nghinh Xuân là giống lan đẹp
được nhiều người biết đến. Loài lan này thường nở hoa vào dịp Tết Nguyên Đán.
Không như những loài lan khác, Ngọc Điểm không những nở cả chùm hoa lớn, màu
sắc đẹp đẽ, lâu phai mà còn có mùi thơm đặc trưng. Thông thường hoa lan chỉ nở đẹp,
lâu tàn mà rất ít loài có mùi thơm. Do đó số lượng lan Ngọc Điểm trong tự nhiên ngày
càng suy giảm trầm trọng. Một số loài chỉ còn lại rất ít cá thể, nếu không có biện pháp
can thiệp thì chúng có thể sẽ tuyệt chủng.
Ngày nay, khi khoa học công nghệ càng lúc càng phát triển thì việc chiết cành, giâm
cành không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường cho những người chơi lan. Thông thường có
2 cách để bảo tồn nguồn gen lan là lưu trữ thông qua nhân giống In vivo và In vitro.
Phương pháp nhân giống In vivo thường không đạt hiệu quả cao trên lan do đặc điểm
sinh thái đặc biệt, chịu sự chi phối của các yếu tố tự nhiên, gây khó khăn cho vấn đề
quản lý và chăm sóc. Trái lại, việc nhân giống In vitro phát huy được nhiều ưu điểm
như không phụ thuộc vào các yếu tố tự nhiên, dễ dàng kiểm soát, chăm sóc và sử dụng
được cho nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau. Ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy In
vitro đã được bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng từ giữa những năm 70 của thế kỷ XX.
Những kết quả bước đầu trong nghiên cứu và ứng dụng đã đạt kết quả khả quan đối với
một số đối tượng cây trồng như chuối, khoai tây, mía, lúa…, đặc biệt là phong lan. Các
14
phương pháp nhân giống in vitro đem lại nhiều sản phẩm độc đáo, bảo toàn nguồn gen
tốt của cây mẹ, góp phần bảo tồn giống quý hiếm.
Song song với việc sưu tập, nhập nội các giống lan Ngọc Điểm thì việc nghiên cứu,
hoàn thiện các biện pháp kỹ thuật để tạo điều kiện nâng cao năng suất, chất lượng là
thực sự cần thiết. Ngọc Điểm vàng lưỡi đỏ là một giống nhập nội mới từ Thái Lan có
giá trị kinh tế cao và là giống mới lạ lấy lòng những người yêu thích loài lan này.
Chính vì vậy, việc nhân giống in vitro giống lan này rất có ý nghĩa giúp tăng số lượng
và bảo tồn nguồn gen. Từ đó, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và
chất điều hòa sinh trưởng lên lan Ngọc Điểm bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro” được
thực hiện.
1.2. Mục tiêu
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro lan Ngọc Điểm vàng lưỡi đỏ với hiệu quả cao
và lượng phân bón phù hợp ở giai đoạn vườn ươm.
1.3. Ý nghĩa
Giúp nhân nhanh lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis gigantea) vàng lưỡi đỏ tạo ra nguồn
cây giống lớn phục vụ nhu cầu thị trường và bảo tồn giống.
15
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về lan Ngọc Điểm
Lan ngọc điểm hay lan đai châu, lan nghinh xuân, lan lưỡi bò, lan đuôi rồng lớn (danh
pháp hai phần: Rhynchostylis gigantea) là một loài phong lan có khả năng chống chịu
bệnh rất cao, chống lại hầu hết các loài sâu bệnh. Ngọc Điểm nở hoa có mùi thơm và
hay nở vào dịp tết Nguyên Đán nên rất được ưa chuộng.
Hiện nay, lan Ngọc Điểm có nhiều loại và nhiều màu sắc như: hồng chấm tím, trắng
tuyền, đỏ thẫm và đỏ khoang trắng….Ngọc Điểm vàng lưỡi đỏ là một loại trong số đó.
Ở Việt Nam, Ngọc Điểm được chia làm 3 loại: Rhynchostylis retusa, Rhynchostylis
gigantea, Rhynchostylis coelestis.
Giới:
Plantae
Bộ:
Asparagales
Họ:
Orchidaceae
Chi:
Rhynchostylis
Loài:
Rhynchostylis gigante
Hình 2.1 Một số màu sắc khác nhau của lan Ngọc Điểm
16
2.2. Một số loài lan Ngọc Điểm rừng của Việt Nam
2.2.1. Rhynchostylis retusa: [24]
Còn được gọi.là lan Đuôi cáo (Phạm Hoàng Hộ), Ngọc điểm đuôi cáo (Trần Hợp). Lê
Trung Tín.đề nghị tên “Ngọc điểm vỹ hồ”. Một số nhà sưu tập lan tại Việt Nam.còn đặt
thêm những tên như: Sóc ta, Đuôi chồn.
Theo Lan rừng VN: A-Z “Phong lan.thân đơn, cao 20-40 cm, lá dầy và cứng, dài 30-40
cm rộng 3.5 cm. Chùm hoa.rủ xuống.dài 30-60 cm. Hoa mọc dầy.và nhiều, to 1.5-2
cm, nở vào mùa Đông Xuân”. Nơi mọc.Sơn La, Nghĩa Lộ, Yên Bái, Hòa Bình, Tây
nguyên, Lâm Đồng.
Flora of China ghi thêm nhiều chi tiết: Chồi thân dạng ống.mọc thẳng đứng, 3–10 cm,
đường kính 1–2 cm, bọc trong lớp mỏng. Lá không cuống, thuôn dài, đỉnh chia 2 thùy
không đều, phiến lá dài. Hoa nhiều.mọc dầy đặc, không thơm. Cánh đai.và cánh hoa
17
màu trắng có những đốm hồng hay tím nhạt, cánh môi màu hồng–tím, đỉnh trắng.
Hình 2.2 Lan đuôi cáo
2.2.2. Rhynchostylis gigantea: [24]
“Rhynchostylis gigantea, thường được gọi là.Lan đuôi chồn, lan me (vì thường mọc
trên thân cây me tại Sài Gòn). Văn vẻ hơn được gọi là Ngọc điểm.vì hoa màu trắng
hồng, có những chấm tím đỏ, hay Ngọc điểm đai châu nghĩa là chuỗi hạt châu, nguời
bình dân gọi thành “tai trâu”. Cây lan này lá lớn, chùm hoa cong và dài chừng 20 phân,
hoa to ngang chừng 3 phân, thơm ngát và.có khi cả tháng mới tàn, hơn nữa lại nở vào
mùa Xuân.nên còn đuợc gọi là lan Nghinh Xuân.
Flora of China ghi thêm: Thân hình ống đường kính 2 cm mọc cao trên 20 cm, mang
nhiều lá. Phiến lá rộng, mọng, đỉnh tù và chia thùy không đều. Chùm hoa cong.vòng
18
cung, cây có thể có 2–4 cần hoa dài 14–30 cm, hoa dầy đặc. Hoa màu trắng.điểm các
chấm đỏ–tím, môi đỏ–tím xậm hơn. Quả nang hình trứng cỡ 4 cm.
R.gigantea hiện đuợc giới sưu tập lan trên thế giới rất ưa thích, hoa được giới trồng lan
cải biến.thành nhiều màu khác nhau, thay đổi genes.để tạo những loài có cần hoa ngắn
dài tùy thích.
Hình 2.3 Lan Đuôi chồn
2.2.3. Rhynchostylis coelestis: [24]
Còn được gọi là Cờ lau, Ngọc điểm hải âu, lan Hải yến.
Mô tả: “Phong lan nhỏ, thân đơn cao 20-30 cm. Lá mọc hai bên. Chùm hoa lên thẳng,
cao 15-20 cm. Hoa 15-20 chiếc, cánh dày, to 2cm. Hoa màu xanh dương. Nở vào mùa
Hè-Thu. Nơi mọc Lâm Đồng, Lộc Ninh, Sông Bé.”
American Orchid Society ghi thêm: Thân hình ống, hóa gỗ nơi phần gốc, cao chừng 20
cm mang 10–12 lá hình mui giáo. Lá dày, dai và mọng 10–20 cm, đỉnh lá chia 2 thùy
không đều. Chùm hoa.mọc dày đặc (có thể đến 50 chiếc) trên cần hoa ngắn. Hoa bóng,
có mùi thơm, cỡ 2 cm, cánh hoa màu trắng , phần đỉnh cánh.màu lam–tím, Cánh đai và
cánh hoa dạng thuôn – trứng cỡ 0.7 cm, hai cánh bên hơi to hơn. Cánh môi .cũng dạng
trứng, dày và mọng.hơi cong xuống.
19
Rhynchostylis coelestis được chọn làm cây dùng lai giống.với các loài tương cận trong
“Liên hiệp Vanda” để tạo những cây lai có kích thuớc.lớn hơn, đồng thời cần hoa thẳng
(không cong vòng như các Rhychostylis khác).
Hình 2.4 Lan Hải Yến
2.3. Ngọc Điểm vàng lưỡi đỏ:
Hình 2.5 Hoa Ngọc Điểm vàng lưỡi đỏ
20
2.3.1. Đặc điểm hình thái [21]
-
Thân lá:
Ngọc Điểm là loài phong lan thân đơn cao 70-80 cm, lá to bản dài 30-40 cm.
Thân hình ống đường kính 2 cm mọc cao trên 20 cm, mang nhiều lá. Phiến lá
-
rộng, mọng, đỉnh tù và chia thùy không đều.
Hoa:
Chùm hoa dài 20-40 cm. Hoa 40-60 chiếc, to 2.5 cm, có nhiều màu, thơm. Nở
vào mùa Xuân. Chùm hoa cong.và dài chừng 20 phân, hoa to ngang.chừng 3
phân, thơm ngát và có khi cả tháng mới tàn. Chùm hoa cong.vòng cung, cây có
thể có 2-4 cần hoa dài 14-30 cm, hoa dầy đặc.
2.3.2. Đặc điểm sinh thái [22]
-
Ánh sáng:
Lan Ngọc Điểm là loài lan không ưa nhiều ánh nắng, nếu quá nhiều nắng sẽ
khiến cây bị vàng lá, sức sống kém, thiếu độ ẩm. Do đó, phải trồng cây ở mát
-
mẻ, thoáng gió, rộng rãi và tránh ánh nắng trực tiếp.
Nhiệt độ:
Đây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa
của cây. Khi trồng cần phải bảo đảm nhiệt độ ở mức 29 0C -320C trong mùa hè.
Để ra hoa nên tách biệt nhiệt độ giữa ngày và đêm, khoảng cách tốt nhất là
-
100C.
Độ ẩm:
Cần phải bảo đảm độ ẩm của cây từ 70-80% để lan có thể sống tốt.
Tưới nước:
Lượng nước tưới dành cho lan cần phải phù hợp, vừa đủ để cây có thể phát
triển tốt. Nếu trồng trên thân gỗ.thì mỗi ngày tưới nước khoảng 2-3 lần vào mùa
hè, còn trồng trong chậu với giá thể là vỏ cây hoặc than thì mỗi tuần tưới nước
2-3 lần. Cần phải quan sát kỹ bộ rễ của cây, không được để chúng quá khô hoặc
bị ngập úng sẽ khiến cây bị chết.
Mùa đông là thời điểm mà lan Ngọc điểm cần phải được nghỉ ngơi, có như
vậy cây mới có thể ra hoa đúng dịp. Nhiệt độ ban ngày.phải ở mức 20 – 23 độ
21
C, ban đêm không dưới.16 độ C, độ ẩm là 50 – 60%, chúng ta có thể phun nước
vào sáng sớm nếu như độ ẩm quá thấp. Khi đông về nên ngưng việc bón phân
-
cho cây.để không kích thích cây phát triển quá nhanh.
Bón phân:
Khi thấy cây bắt đầu mọc lá, rễ có màu xanh.chính là thời điểm thích hợp để
sử dụng phân bón cho cây. Mỗi tuần sử dụng khoảng ½ - ¼ muỗng café phân
bón, pha với 4 lít nước để bón cho cây. Trong mùa xuân, mùa hè.nên sử dụng
phân 30:10:10 để bón cho cây, cuối mùa hè.sẽ chuyển sang sử dụng 10:20:30.
Ngoài ra, có thể sử dụng 20:20:20 cho lan trong suốt năm.
2.4. Kỹ thuật nhân giống in vitro
2.4.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật:
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy
mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh.hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có
trong tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới.giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ
thể mẹ, làm rút ngắn thời gian.đưa một giống mới vào sản xuất.
2.4.2. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật: [10]
-
Năm 1983, hai nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwan đã đề xướng thuyết tế
bào.và nêu rõ mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ.các tế bào hợp
thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó
là trứng sau khi thụ tinh.và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ
-
cơ thể.
Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwan
vào thực nghiệm. Ông viết trong một tác phẩm như sau: “Để kết luận, tôi tin tưởng
rằng tôi không đưa ra một tiên đoán táo bạo nếu cho rằng bằng nuôi cấy người ta có
khả năng tạo ra các phôi nhân tạo bằng tế bào soma”. Haberlandt đã gặp thất bại trong
nuôi cấy một số cây một lá mầm.
22
-
Năm 1922, Kotte, học trò của Haberlandt và Robin người Mỹ lập lại thí nghiệm của
Haberlandt với đỉnh sinh trưởng.tách từ đầu rễ của cây hòa thảo.trong môi trường lỏng
gồm có muối khoáng và glucose. Đầu rễ.sinh trưởng khá mạnh, tạo nên.một hệ rễ có cả
rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy.chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và
-
dừng lại mặc dù các tác giả.đã chuyển sang môi trường mới.
Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công.rễ của cây cà chua (Lycopersicum
esculentum) trên môi trường lỏng.chứa nhiều muối khoáng, glucose và dịch chiết nấm
men trong thời gian dài. Trong khoảng thời gian này, Went và Thimann tìm ra chất điều
-
hòa sinh trưởng đầu tiên ở thực vật: acid β-indolacetic (IAA).
Năm 1939, Gautheret và Nobercourt thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng vô
thời hạn.của mô sẹo cà rốt Daucus carola trên môi trường thạch.bằng cách cấy chuyền
-
6 tuần một lần.
Năm 1941, Overbeck chứng tỏ khả năng kích thích sự sinh trưởng phôi.ở cây thuộc họ
-
cà (Datura) của nước dừa.trong quá trình nuôi cấy.
Năm 1948, Steward xác định tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa.lên mô sẹo
cà rốt. Cũng trong thời gian này người ta nghiên cứu và tổng hợp thành công các chất
điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin.như α-naphthylacetic (NAA) và 2,4-
-
dichlorophenoxyacetic (2,4-D).
Năm 1954, Skoog tình cờ thấy.nếu cho một ít chế phẩm đã để lâu của DNA trích từ
tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô thân cây.thì tách dụng kích thích
-
sinh trưởng trở nên rõ rệt.
Năm 1955, Skoog tìm thấy kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào.
Năm 1957, Skoog và Miller ghi nhận thành công sự hình thành cơ quan.từ mô sẹo
-
thuốc lá.chịu sự ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy.
Từ năm 1954-1959, bắt đầu tiến hành các kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn.
Năm 1960, Cooking công bố có thể dùng enzyme cellulase.để phân hủy vách cellulose
của tế bào thực vật và thu được kết quả là các tế bào không có vách.mà có mang
-
nguyên sinh chất bao quanh, gọi là tế bào trần.
Năm 1962, Murashige và Skoog cải tiến thành.công môi trường nuôi cấy (môi trường
-
MS).
Năm 1966, bắt đầu chú ý tới nuôi cấy túi phấn.
23
-
Từ năm 1980-1992, hàng loạt thành công mới trên lĩnh vực công nghệ gen.thực vật
được công bố: chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium, sử dụng điện, vi tiêm, siêu
âm, súng bắn gen đã và đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới áp dụng.và đạt
hiệu quả cao.
2.4.3. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro: [8]
-
Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật:
Theo Dương Công Kiên (2002), có một số phương pháp như sau:
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chồi bất định:
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:
Một trong những phương pháp thuận lợi.để đạt mục tiêu trong nuôi cấy tế bào mô
thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Sau
khi vô trùng mẫu.sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh
dưỡng. Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định.mẫu phát
triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để
trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi.và phát triển
bình thường.
Nuôi cấy chồi bất định:
Hệ thống nuôi cấy này.có những yêu cầu tương tự như nuôi cấy mô phân sinh
đỉnh, chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới. Đỉnh chồi
bất định mới.có thể phát triển trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp trên mô callus, mà
mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật.
Nuôi cấy mô sẹo:
Trong điều kiện môi trường nuôi cấy chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình thành.
Mô sẹo là 1 khối tế bào phát triển không có định hướng. Trong môi trường phù hợp,
mô sẹo có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện.với
những loài thực vật không có khả năng nhân giống đỉnh sinh trưởng.hoặc đối với
những mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành chồi. Cây tái sinh từ mô sẹo.có đặc
tính giống như cây mẹ.và từ 1 cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho
24
nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất
cao.trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo.
Nuôi cấy bằng cắt đốt giâm cành:
Thường áp dụng ở các đối tượng khó tạo cụm chồi, hệ số nhân thấp. Cần kiểm
soát lượng hormone tăng trưởng để chặn đứng sự phát triển của chồi để tạo cụm chồi.
Khả năng tái nhân chồi còn phụ thuộc kích thước mẫu cấy. Mẫu cấy quá nhỏ có thể
không đáp ứng được với các điều kiện nuôi cấy và sẽ hóa nâu.
Nuôi cấy tăng sinh chồi nách:
Chồi nách ở vị trí nách lá mang đỉnh sinh trưởng phụ, được cảm ứng giảm ưu thế
ngọn, tạo ra một số lượng lớn cụm chồi hoặc chồi con có thể tách ra cấy chuyền.
Chồi nách nhô ra ở vị trí bình thường.trong nách lá mang đỉnh sinh trưởng phụ.có
khả năng mọc thành chồi.giống như thân chính. Khi các mẫu cấy là chồi.được giảm ưu
thế ngọn sẽ dẫn tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay cả nách lá.
Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy vào sự cung cấp cytokinin,
chồi nách thường xuất hiện sớm.và phát triển thành chồi bậc hai, bậc ba… khi các cụm
chồi này phát triển có thể phân tách để cấy chuyền trong môi trường mới.
Nuôi cấy tế bào lớp mỏng:
Tế bào lớp mỏng là những mẫu cấy nhỏ, được cắt dọc hoặc cắt ngang các cơ quan
khác nhau, từ những bộ phận của hoa đến rễ hoặc thân của cây trồng.
Nuôi cấy tế bào lớp mỏng là những kỹ thuật cho phép kiểm soát điều kiện nuôi
cấy một cách dễ dàng.do nồng độ hormone nội sinh của mẫu thấp. Sự phân cực của các
tế bào.trong lớp mỏng tế bào giảm, tạo được nhiều chồi hơn, do đó hệ số nhân chồi
cao. Ngoài ra, mức độ biến dị thấp và tạo điều kiện nhân nhanh giống cây trồng.
2.4.4. Các giai đoạn trong nuôi cấy in vitro: [6]
Quá trình nuôi cấy in vitro có 5 giai đoạn chính, mỗi giai đoạn có yêu cầu và
điều kiện riêng:
-
Giai đoạn 1: chọn lọc cây mẹ và khử trùng mô nuôi cấy
25
Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus.và đang ở giai đoạn sinh
trưởng mạnh. Chọn cơ quan để lấy mẫu, thường sử dụng là chồi non, đoạn thân chứa
chồi ngủ, lá non, hoa non…
Mô chọn nuôi cấy thường là mô khỏe, có khả năng tái sinh cao, giữ được các
đặc tính sinh học quý từ cây mẹ. Tùy điều kiện.mà giai đoạn này có thể kéo dài từ 3-6
tháng.
- Giai đoạn 2: thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng.
Khử trùng bề mặt mẫu cấy và chuẩn bị môi trường để nuôi cấy.
Cấy mẫu vô trùng vào trong ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường nuôi cấy đã
được khử trùng. Giai đoạn này gọi là cấy mẫu in vitro.
Các mẫu cấy không bị nhiễm khuẩn, nấm, mốc sẽ được chuyển vào trong phòng
với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một khoảng thời gian, các mẫu cấy xuất
hiện cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, rễ, lá).
- Giai đoạn 3: nhân nhanh chồi
Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Ở giai đoạn này
gồm nhiều lần cấy chuyền.mô lên môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan
phụ hoặc cấu trúc khác.mà từ đó cây hòan chỉnh có thể tái sinh. Để tăng hệ số nhân, ta
thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng
(Auxin, Cytokinin, Gibberellin,…) các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết
nấm men….kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.
Tuy nhiên cần xác định số lần cấy chuyền hợp lí. Bởi vì nếu số lần cấy chuyền
quá lớn thì sẽ dẫn tới mẫu bị thoái hóa và sinh trưởng kém, có thể mất đi những đặc
tính ban đầu của cây bố mẹ.
- Giai đoạn 4: tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2-3 tuần từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện
rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi
trường các auxin là nhóm hormone thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ từ mô nuôi
cấy.
-
Giai đoạn 5: chuyển cây ra đất
