KHẢO sát KHẢ NĂNG KHÁNG OXY hóa của các PROTEIN THỦY PHÂN BẰNG ENZYME từ NHUNG hươu

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN/ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY
HÓA CỦA CÁC PROTEIN THỦY PHÂN
BẰNG ENZYME TỪ NHUNG HƯƠU

Người hướng dẫn: Ths. NGUYỄN THỊ HỒNG NƠ
Người thực hiện: NGUYỄN DUY
Lớp

: 14060302

Khoá

:

18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019


TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN/ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY
HÓA CỦA CÁC PROTEIN THỦY PHÂN
BẰNG ENZYME TỪ NHUNG HƯƠU

Người hướng dẫn: Ths. NGUYỄN THỊ HỒNG NƠ
Người thực hiện: NGUYỄN DUY
Lớp

: 14060302

Khoá

:

18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH


DANH MỤC VIẾT TẮT
AU/g

BSA
DNA
DPPH
EDTA
IC
LDL
MW
RNS
ROS
SGI
UV/Vis

Anson Units per gram
Bovine serum albumin
Deoxyribonucleic acid
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
Ethylenediaminetetraacetic acid
Inhibitory concentration
Low density lipoprotein
Molecular weight
Reactive nitrogen species
Reactive oxygen species
Simulated gastrointestinal digestion
Ultraviolet–visible spectroscopy


7

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, bởi những tác dụng phụ mà tân dược mang lại sự nhận
thức về việc sử dụng các sản phẩm, dược phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên đang được
nâng cao. Tuy nhiên, các nghiên cứu được công bố chủ yếu là về thực vật, những
nghiên cứu về thuốc chữa bệnh, thực phẩm chức năng từ động vật còn khá hạn chế.
Mặc dù các dược liệu từ động vật đã được chứng minh là có chứa nhiều chất dinh
dưỡng quan trọng khác nhau như: các protein, các phân đoạn peptide, acid béo,
glycosaminoglycan, prostaglandin, vitamin, chất khoáng, chất xơ, tinh dầu và
carotenoid [1, 2], những chất có thể sử dụng để phòng và chữa nhiều loại bệnh.
Trong đó, nhung hươu, một loại dược liệu đã được dùng từ hơn 2000 năm trước,
có tác dụng hỗ trợ khả năng miễn dịch, thể lực và tăng cường sinh lý [3, 4] và đã được
sử dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Úc, Nga.
Theo ước tính sản lượng nhung hươu toàn cầu thu được khoảng 1300 tấn/năm, và vẫn
đang tiếp tục tăng để đáp ứng nhu cầu thị trường [3, 5]. Những năm gần đây, để phát
huy khả năng chữa bệnh của nhung hươu một cách triệt để, các nhà khoa học trên thế
đã nghiên cứu để chiếc tách hợp chất có hoạt tính sinh học trong nhung hươu bằng
nhiều phương pháp khác nhau.
Tại Việt Nam, nhung hươu được xem là một loại dược liệu quý, theo các kết quả
nghiên cứu nhung hươu đứng thứ hai trong tứ đại bảo dược “Sâm-Nhung-Quế-Phụ”
của y học cổ truyền, có chứa khoảng 19 loại amino acid bào gồm cả 9 loại amino acid
không thay thế [6], trong đó các đoạn peptide và protein được xem là thành phần có
hoạt tính sinh học nổi bật nhất. Tuy nhiên chúng ta chỉ mới dùng nhung hươu theo kinh
nghiệm dân gian. Do đó, việc chiếc xuất nhằm phân lập các thành phần có hoạt tính


8

trong nhung hươu là rất cần thiết để tăng cường hiệu quả sử dụng của nó trong y học.

Trong các phương pháp phân lập, việc sử dụng enzyme để thuỷ phân đã được nghiên
cứu trong những năm gần đây nhưng vẫn còn khá hạn chế, do đó nghiên cứu này được
thực hiện để khảo sát hoạt tính của protein thuỷ phân từ nhung hươu bằng các loại
enzyme khác nhau.
1.2.

Mục đích đề tài

Tìm hiểu tổng quan về các loại enzyme, thuỷ phân protein từ nhung hươu bằng
enzyme.
Thủy phân nhung hươu bằng các hệ enzyme đơn và kết hợp hai enzyme.
Xác định khả năng thủy phân.
Xác định khả năng kháng oxy hoá của các đoạn peptide thuỷ phân bằng các
phương pháp khác nhau.
Xác định nguyên nhân gây vị đắng trong dịch thuỷ phân và phương pháp khử
đắng.
1.3.

Ý nghĩa

Kết quả của đề tài nghiên cứu có giá trị tham khảo về mức độ thuỷ phân của
protein thuỷ phân từ Nhung hươu, khả năng kháng oxy hoá của các dịch thuỷ phân, là
tiền đề để phân tích và thu nhận được các đoạn peptide có hoạt tính sinh học có thể
dùng để ứng dụng trong lĩnh vực y học, thực phẩm chức năng và dùng làm dược liệu.


9

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
2.1.

Sơ lược về nguyên liệu
2.1.1. Khái quát về lịch sử và tình hình nuôi hươu sao ở Việt Nam

Theo một số tài liệu ghi nhận được hươu sao ban đầu được nuôi tự phát ở các hộ
gia đình ở vùng Nghệ An, Hà Tĩnh bằng cách bắt hươu rừng về nuôi thuần hoá từ năm
1929. Vì nhận thấy tiềm năng và giá trị kinh tế cao nên việc nuôi hươu phát triển mạnh
vào những năm từ 1945-1949, sau đó số lượng hươu nuôi bị giảm mạnh do những trận
lụt lớn những năm 1950 và 1960.
Năn 1964, ngành Lâm Nghiệp đã triển khai nuôi hươu sao ở Vường Quốc gia
Cúc Phương. Từ năm 1967, ngành Nông Nghiệp đã xây dựng trại chăn nuôi hươu
giống tại Hương Sơn, Hà Tĩnh. Do có nhiều điều kiện thuận lợi cho việc chăn nuôi nên
nghề nuôi hươu được phát triển mạnh ở hai tỉnh Nghệ An và Hà Tĩnh trong những năm
1980-1995, tổng số hươu nuôi đã đạt được hơn 15.000 con. Trong giai đoạn từ 19961998, lượng hươu nuôi ở vùng Nghệ An và Hà Tĩnh bị giảm số lượng do những biến
động về giá cả.
Đến nay, nghề nuôi hươu đang trên đà phát triển ổn định và mở rộng thêm ở một
số địa phương trên cả nước, vì có điều kiện tốt để phát triển nghề nuôi hươu sao nên
nghề nuôi hươu phát triển mạnh ở các tỉnh thành như: Đồng Nai, Nghệ An, Hà Tĩnh.
Là vùng nuôi hươu được sử dụng làm nguyên liệu chính, huyện Vĩnh Cửu tỉnh Đồng
Nai theo thông tin cập nhật vào tháng 01/2018 số lượng hươu nuôi tại đây đạt khoảng
gần 3000 con.


10

2.1.2. Phân loại và danh pháp
 Phân loại:

Giới: Animalia
Ngành: Chordata

Lớp: Mammalia
Bộ: Artiodactyla
Họ: Cervidae
Phân họ: Cervinae
Chi: Cervus
Loài: Cervus nippon
 Danh pháp:

Tên tiếng anh: Sika Deer

Hình 2.1: Ảnh chụp hươu sao

Tên khoa học: Cervus nippon
2.1.3. Thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng của nhung hươu
Nhung hươu rất giàu các acid amin, polipeptide và protein, được coi là các thành
phần có hoạt tính sinh học nổi bật nhất. Đến nay, có khoảng 19 loại amino acid đã được
phân lập trong đó bao gồm cả 9 loại amino acid không thay thế (Isoleucine, Leucine,
Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan, Valine và Histidine). Trong
đó, các amino acid như: Aspartic acid, Aspartic acid, Proline, Glycine và Arginine
chiếm khoảng 32.5-37.2% trong tổng số các amino acid [8].
Những nghiên cứu Khoa học đã chứng minh rằng nhung gạc có nhiều chức năng,
chẳng hạn như điều hòa miễn dịch, chống ung thư, chống mệt mỏi, chống loãng xương,
chống viêm, chống oxy hóa, chữa bệnh và hỗ trợ điều hoà cơ thể. Nhung hươu có thể
được sử dụng như một loại thuốc bổ sức khỏe quan trọng với giá trị dinh dưỡng và
dược liệu tuyệt vời, sản phẩm nhung hươu hiện đang được nghiên cứu sâu hơn nhằm
đưa vào ứng dụng trong thuốc chữa bệnh[7].


11

Bảng 2.1: Tóm tắt một số thành phần hoá học có trong nhung hươu [7]
Khoáng vi lượng
Calcium (Ca)
Phosphorus (P)
Sodium (Na)
Potassium (K)
Magnesium (Mg)
Ion (Fe)
Zinc (Zn)
Copper (Cu)
Chromium (Cr)
Strontium (Sr)
Nickel (Ni)
Cobalt (Co)
Manganese (Mn)
Vanadium (V)
Tin (Sn)

2.2

Các amino acid
Arginine (Arg)
Histidine (His)
Glutamic acid (Glu)
Proline (Pro)
Aspartic acid (Asp)
Serine (Ser)
Threonine (Thr)
Glycine (Gly)
Alanine (Ala)

Isoleucine (Ile)
Leucine (Leu)
Phenylalanine (Phe)
Methionine (Met)
Lysine (Lys)
Tyrosine (Tyr)
Valine (Val)
Cysteine (Cys)
Hydroxyproline (Hyp)
Tryptophan (Trp)

Một số nghiên cứu đáng chú ý về Nhung hươu
2.2.1. Nghiên cứu trong nước

Từ năm 1992, Nguyễn Quỳnh Anh và cộng sự thuộc trung tâm khoa học và công
nghệ tỉnh Nghệ An đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định các biện pháp khoa học
nhằm nâng cao số lượng, chất lượng giống và sản phẩm hươu sao Việt Nam” đề tài
nghiên cứu về đặc điểm sinh học của hươu sao Việt Nam: phân loại, tập tính sinh học,
ngoại hình thể chất, sinh lý, sinh sản, sinh trưởng và phát triển, quá trình phát triển
nhung. Tiến hành công tác giống hươu sao để xây dựng phương pháp nhân giống hươu
sao .
Năm 2005, Nguyễn Huy Lợi cùng Nguyễn Huy Nam, Võ Thị Ninh, Nguyễn Khắc
Thứ, Trần Cẩm Tú hoàn thiện dự án “Công nghệ enzyme để chế biến các sản phẩm có


12

giá trị bổ dưỡng cao từ nhung hươu”. Dự án đã đưa ra những kết quả về Trình bày qui
trình kỹ thuật thu hoạch lấy mẫu, xử lý mẫu tươi và sơ chế bảo quản. Hoàn thiện các
định mức công nghệ, chỉ tiêu kỹ thuật của qui trình công nghệ chế biến nhung hươu.

Giới thiệu kết quả nghiên cứu tác dụng của viên nang Biogra từ nhung hươu và, tác
dụng của rượu bổ nhung hươu và tác dụng của viên cao nhung hươu Hương Sơn.
Năm 2012, Đặng Việt Hùng thực hiện nghiên cứu về tác dụng dược lý của nhung
hươu, đề tài đã đề xuất nghiên cứu về hỗn hợp có nguồn gốc tự nhiên giúp tiết yếu tố
tăng trưởng giống insulin 1 (IFG- 1), kích thích phát triển xương dùng làm nguyên liệu
để sản xuất thuốc hoặc thực phẩm chứa bột nhung hươu sấy khô và một trong hai loại
cao khô thảo dược là Dipsaci radix và Phlomis umbrosa.
Năm 2015, ở huyện Hương Sơn (Hà Tĩnh), Tổng Công ty Khoáng sản và Thương
mại Hà Tĩnh tổ chức buổi lễ khởi công Trung tâm Giống hươu Việt Nam. Dự án Trung
tâm Giống hươu Việt Nam được xây dựng sẽ tập trung vào việc nghiên cứu, bảo tồn
các giống hươu có chất lượng, phát triển, nhân rộng đàn hươu giống, nuôi hươu lấy
nhung, nuôi hươu lấy thịt và xương để chế biến thực phẩm chức năng, cao nhung và
các loại sản phẩm làm đẹp cao cấp chiết xuất từ hươu. Cùng với đó, trung tâm này sẽ
thực hiện nhiệm vụ nghiên cứu, bảo tồn quỹ gene giống hươu Hương Sơn, xây dựng
quan hệ hợp tác quốc tế với Hiệp hội Nuôi hươu thế giới.
Năm 2018, dự án “Hoàn thiện quy trình tạo vật liệu nanocellulose kết hợp với
chiết xuất nhung hươu định hướng ứng dụng trong quá trình làm lành vết thương” được
thực hiện bởi Trung tâm Nghiên cứu triển khai Khu Công nghệ cao TPHCM
(SHTPLabs) kết hợp với Công ty TNHH Thế Giới Gen thực hiện nhằm tạo thêm các
dạng băng vết thương thế hệ mới.
2.2.2. Nghiên cứu ngoài nước
Năm 2011, Zhao L, Lou YC, Wang CT, Ji thực hiện đề tài nghiên cứu “Hoạt tính
chống oxy hóa của dịch thủy phân protein của nhung hươu (Cervus elaphus) khác nhau
của trọng lượng phân tử và enzyme thuỷ phân.” Kết quả cho thấy rằng dịch thủy phân


13

nhung hươu bởi enzyme mô phỏng sự thuỷ phân trong đường tiêu hoá (simulated
gastrointestinal digestion SGI, pepsin-pancreatin) thuỷ phân có mức độ thủy phân thấp,

được cải thiện đáng kể với các protease bị thay đổi, chẳng hạn như Neutrase và
Alcalase. Hoạt động chống oxy hóa của các phân đoạn peptide thay đổi theo trọng
lượng phân tử (MW) và enzyme được sử dụng. Nhìn chung, các phân đoạn peptide có
trọng lượng phân tử thấp có hoạt động quét gốc ABTS + và hoạt tính khử cao hơn, trong
khi đó các phân đoạn peptide có trọng lượng phân tử cao có hiệu quả hơn trong khả
năng bắt gốc DPPH.
Năm 2014, Nagai T., Tanoue, Y., Kai, N. and Suzuki. N nghiên cứu thu nhận
collagen từ quy trình thủy phân nhung hươu (Cervus nippon yesoensis) bằng 6 loại
protease (pepsin, trypsin, papain, pronase E, chymotrypsin và thermolysin). Hàm lượng
protein thu được khoảng 69 – 96% (w/w) và khoảng 185,7 đến 260,6 μg / mg đối với
bột đông khô. Khả năng kháng oxi hóa ở mức trung bình. Các chất thủy phân bằng
pepsin, trypsin, chymotrypsin và pronase E cho thấy các khả năng kháng oxi hóa tương
tự như acid ascorbic 1 mM. Mặt khác, thủy phân bằng thermolysin ức chế mạnh hoạt
động của ACE. Từ nghiên cứu, cho thấy nhung hươu có thể được sử dụng như một
nguồn cung cấp chất chống oxy hóa tự nhiên, chất ức chế ACE và có thể bổ sung vào
thực phẩm hoặc trong lĩnh vực y sinh và dược phẩm.
Năm 2015, Tạp chí Dược phẩm và Phân tích y sinh, các tác giả Zhigang Sui,
Lihua Zhang, Yushu Huo và Yukui Zhang cho biết nhung là một trong những loại thuốc
quý và quan trọng nhất và đã được sử dụng với nhiều công dụng khác nhau, chẳng hạn
như chống mệt mỏi, tái tạo mô và tăng cường sức khỏe. Trong vài năm qua, nghiên cứu
về thành phần hóa học, thành phần hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý đã được thực
hiện, các tác giả đã ghi nhận những tiến bộ gần đây trong nghiên cứu các thành phần
hoạt tính sinh học của nhung hươu.
Năm 2017, Yang Yu, Yang Yin, Fangjun Wang, Jiaze Yan, Yanxia Qi, Mingliang
Ye đã thực hiện đề tài nghiên cứu “Phân tích tiêu hóa protein cho thấy hoạt tính sinh


14

học của nhung hươu trong tiêu hóa mô phỏng”. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu

về sự tiêu hoá nhung hươu trong đường tiêu hóa bằng công nghệ peptidomics. Kết quả
peptide của LC-MS/MS cho thấy rằng càng nhiều peptide được giải phóng dưới sự
hoạt động của các enzyme tiêu hóa và collagen là nguồn protein chính giải phóng các
đoạn peptide. Các hoạt tính sinh học của các peptide được giải phóng trong đường tiêu
hóa phù hợp với kết quả của những nghiên cứu trước đây trên cơ thể.
2.3.

Sơ lược về một số enzyme dùng trong thuỷ phân


Alcalase

Alcalase, được mua tại Sigma-Aldrich, thuộc nhóm serine endopeptidase thường
được sử dụng để thuỷ phân protein. Có vùng pH tối ưu khoảng từ 6.5-8.5, nhiệt độ
phản ứng tuỳ thuộc vào các loại cơ chất khác nhau sẽ có nhiệt dộ tối ưu khác nhau.
 Flavourzyme

Flavourzyme là chế phẩm protease thương mại được mua từ hãng Novo Nordisk
Đan mạch được sản xuất từ chủng Aspergillus oryzae. Flavourzyme là một hỗn hợp
peptidase, vừa có hoạt tính của endoprotease lại vừa có hoạt tính của exoprotease.
Có thể thuỷ phân trên 70% mối liên kết peptide, sản phẩm thuỷ phân của
flavourzyme thơm ngon, không có vị đắng khi thuỷ phân ở mức độ vừa phải. Sản phẩm
không sinh ra các chất độc hại, hàm lượng muối thấp.
Nhiệt độ tối ưu cho thuỷ phân protein là 40-60°C. Thuỷ phân trong điều kiện axit
nhẹ hoặc trong điều kiện trung tính; pH tối ưu cho exopeptidase 7.0. Flavourzyme bị
vô hoạt ở nhiệt độ 85°C trong 5 phút hoặc ở 75°C trong 15 phút.


15

 Neutrase

Neutrase là một protease trung tính, trong khi hầu hết các chế phẩm thương mại
khác đều chứa cả phần proteinase kiềm tính. Dải pH hoạt động 5,5 – 7,5; dải nhiệt độ
hoạt động 45 - 55°C. Chế phẩm này không chứa amylase, chứa một lượng β-glucanase
không xác định. Cần ion kẽm cho hoạt động của nó, ion Ca 2+ có tác dụng làm bền
enzyme, enzym bị ức chế bởi EDTA.
Neutrase bị vô hoạt ở 85°C trong 2 phút. Sự ổn định của neutrase ở nhiệt độ nhất
định phụ thuộc vào loại và nồng độ cơ chất. Neutrase 0.8L có màu nâu sáng, trạng thái
lỏng.
Nhiệt độ bảo quản từ 0-10°C, bảo quản trong bao bì khô, kín, tránh ánh sáng mặt
trời trực tiếp. Neutrase 0.8L có hoạt độ là 0.8AU/g (Anson Units per gram). Các thành
phần của enzym neutrase dễ dàng hoà tan trong nước.
 Pepsin
Pepsin được mua tại sigma-Aldrich. Pepsin là một aspartic endoproteinase phân
lập từ niêm mạc dạ dày lợn. Nó chủ yếu được sử dụng để thủy phân không đặc hiệu
của protein và peptide trong môi trường axit. Nó cũng cung cấp một sự thủy phân giới
hạn các globulin miễn dịch bản địa để tạo ra các mảnh hoạt tính sinh học.
 Protamex
Protamex được mua tại công ty Novozyme (Đan Mạch), Thành phố Hồ Chí Minh.
Protamex thuộc nhóm endopeptidase, được thu nhận từ chủng vi khuẩn Bacillus, được
tổ chức FAO/WHO cho phép sử dụng.
Protamex có hoạt độ ghi trên bao bì là 1.5 AU/g, hoạt động thích hợp trong
khoảng pH= 5.5-7.5 và nhiệt độ khoảng từ 45 ÷ 65°C. Protamex có thể bị mất hoạt tính
trong 30 phút tại 55°C (122°F) khi pH bằng 4 và trong 10 phút tại 85°C (185°F) khi pH
bằng 8. Nhiệt độ bảo quản tốt nhất của Protamex là 0 ÷ 5°C.


16

 Pepsin

Pepsin được mua tại sigma-Aldrich. Pepsin là một aspartic endoproteinase phân
lập từ niêm mạc dạ dày lợn. Pepsin hoạt động mạnh nhất trong môi trường acid).
Pepsin có hoạt độ ở pH khoảng pH 1,5 – 2 và không hoạt động ở pH 6,5 và cao hơn.
Nhiệt độ hoạt động trong khoảng từ 37°C đến 42°C. Pepsin nên được bảo quản ở nhiệt
độ thấp để tránh tự hủy.
 α-Amylase.
α-Amylase được mua tại sigma-Aldrich. α-Amylase phân lập từ tuyến tụy lợn là một
glycoprotein. Ion clo là cần thiết cho hoạt động và sự ổn định. Khoảng pH hoạt động
tối ưu là từ 5.5 đến 8 nhiệt độ từ 45-65°C.
 Cellulase
Cellulast được mua tại sigma-Aldrich. Được sản xuất bằng quá trình lên men ngập
nước của một chủng nấm Trichoderma reesei chọn lọc và xúc tác sự phân hủy của
cellulose thành glucose, cellobiose và các chất polime glucose cao hơn. Khoảng pH
hoạt động tối ưu là 4.5 – 6.0, và nhiệt độ tối ưu là 50-60°C.
2.4.

Sơ lược về gốc tự do
2.4.1. Khái niệm

Các gốc tự do là các nguyên tử hoặc phân tử có một hoặc nhiều electron độc thân
ở lớp ngoài cùng [7]. Những nguyên tử không bị thiếu electron sẽ bền vững, ngược lại
các gốc tự do không ổn định nên sẽ chiếm lấy các electron của các chất khác để tạo
trạng thái ổn định. Từ đó, vô tình tạo ra thêm các gốc tự do mới, kết quả là hình thành
các phản ứng mất cân bằng theo dây truyền dẫn đến bệnh tật, lão hoá [7].


17

Bảng 2.2: Một số các ROS và RNS được tạo ra trong quá trình trao đổi chất
ROS/RNS
•−

O2
OH•
RO•
ROO•
1
O2
H2O2
NO•
NO2•
ONOO−

Gốc Superoxyde
Gốc Hydroxyl
Gốc Alkoxyl
Gốc Peroxyl
Oxy đơn
Hydrogen peroxyde
Nitric oxide
Nitrogen dioxide
Peroxynitrite

Các gốc ROS và RNS trong cơ thể sinh học thường gặp gồm: oxygen, superoxyde
anion, peroxyde, hydrogen peroxyde, hydroxyl radical, hydroxyl ion, acid
hypochlorique, peroxynitrite, oxyde nitrite [7, 8]. Đây là những gốc có khả năng phản
ứng cao, có thể tác động lên nhân và trong màng của các tế bào gây tổn hại các phân tử
có liên quan đến sinh học như DNA, protein, carbohydrate và lipid. [9] Các gốc tự do

tấn công các đại phân tử quan trọng trong cơ thể dẫn đến tổn thương tế bào và phá vỡ
cân bằng nội môi. Các gốc tự do có thể ảnh hưởng đến tất cả các phân tử trong cơ thể.
Trong số đó, lipit, acid nucleic và protein là các mục tiêu chính[10].


18

2.4.2. Tác nhân sinh ra gốc tự do
Các gốc tự do có thể được sinh ra những quá trình trao đổi chất thiết yếu thông
thường sinh ra trong cơ thể con người như: sử dụng chất kích thích rượu, bia, thuốc lá,
lười vận động, chấn thương do thiếu máu cục bộ hoặc từ các tác nhân bên ngoài như
tiếp xúc với tia UV, ozone, hút thuốc lá, một số loại thuốc, thuốc trừ sâu, chất ô nhiễm
trong không khí và hóa chất công nghiệp [9]. Sự hình thành gốc tự do xảy ra liên tục
trong các tế bào do hậu quả của cả hai phản ứng enzyme và cả phản ứng không
enzyme. Các phản ứng có mặt enzyme, đóng vai trò là nguồn sinh ra gốc tự do, bao
gồm những chất tham gia vào chuỗi hô hấp của tế bào, diệt khuẩn quá trình thực bào,
cơ chế giải độc gan [11]. Các gốc tự do cũng có thể được hình thành trong các phản
ứng không enzyme của oxy với các hợp chất hữu cơ cũng như các gốc được hình thành
bởi các phản ứng ion hóa.
2.4.3. Cơ chế tác động
Các gốc tự do được tạo thành một cách tất yếu, có vai trò quan trọng đối với cơ
thể trong quá trình trao đổi chất. Tuỳ thuộc vào nồng độ các chất tự do mà chúng có tác
động tích cự hoặc tiêu cực lên cơ thể [12].
Ở nồng độ vừa phải, các gốc tự do có các nhiệm vụ như: điều hoà biểu hiện
những gene mã hoá cho các enzyme kháng oxy hoá, điều hoà sự chết theo chương trình
của tế bào (apotosis), kích hoạt những yếu tố phiên mã cho các gene tham gia vào quá
trình miễn dịch, kháng viêm, điều hoà biểu hiện gene mã hoá cho các enzyme chống
oxy hoá [13].
Ở nồng độ cao, các gốc tự do có thể oxy hoá các phân tử sinh học gây nên các
hiện tượng như: oxy hoá lipid, đột biến DNA, biến tính protein [13].

19

2.4.4. Một số tác hại đáng chú ý chủa gốc tự do
Bệnh về tim mạch được xem là nguyên nhân chủ yếu gây tử vong, liên quan đến
khoảng một nữa số ca tử vong trên thế giới. Nguyên nhân chính gây ra các bệnh về tim
mạch là do sự oxy hoá các low density lipoprotein (LDL) trong máu, quá trình hình
thành các LDL trong mạch máu là nguyên nhân chính gây ra xơ vữa động mạch [14].
Thêm vào đó, các gốc tự do có thể tấn công phospholipide màng tế bào gây ra sự
thay đổi tính mềm dẻo và chức năng của thụ thể nằm trên màng tế bào [6], từ đó ảnh
hưởng đến sự thẩm thấu của các chất qua màng cũng như sự trao đổi thông tin giữa
màng tế bào và môi trường, nhiều enzyme vận chuyển trong tế bào cũng bị ảnh hưởng
bởi các gốc tự do.

Hình 2.2: Cơ chế tác động của gốc hydroxyl lên phân tử đường của DNA
Sự oxy hoá các DNA bởi các gốc tự do gây nên biến dị di truyền là một trong
những nguy cơ phát triển ung thư [15, 16]Stress oxy hóa gây ra bởi ROS dẫn đến tăng
nguy cơ mắc nhiều bệnh như bệnh viêm, bệnh tim mạch, ung thư, tiểu đường, bệnh
Alzheimer, bệnh đục thủy tinh thể, tự kỷ và lão hóa [17].


20

2.5.

Sơ lược về chất kháng oxy hoá
2.5.1. Định nghĩa

Chất chống oxy hóa là hóa chất có khả năng làm giảm hoặc ngăn chặn tác động

của các gốc tự do. Các chất này có thể nhường một electron cho các gốc tự do, mà
không tự biến mình thành gốc tự do, do đó làm giảm khả năng phản ứng của các gốc tự
do [8, 18].
2.5.2. Nguồn gốc chất chống oxy hoá
Các chất kháng oxy hoá có thể được cung cấp từ cả hai nguồn: nội sinh và ngoại sinh
(qua đường ăn uống), được xem như là cơ chế bảo vệ tự nhiên của cơ thể.
Các chất chống oxy hóa nội sinh bao gồm enzyme và các tiểu phân tử như
glutathione peroxidase và glutathione, trong khi đó vitamin, carotenoids và polyphenol
là những đại diện của chất chống oxy hóa có trong chế độ ăn uống [19]. Nói chung, các
chất chống oxy hóa bao gồm một số loại, chúng là:
•
•
•
•

Enzyme (superoxide effutase, glutathione peroxidase và catalase)
Hormone (melatonin)
Protein (albumin, ferritin)
Các phân tử nhỏ (hợp chất phenolic, carotenoids, glutathione, axit uric,
tocopherol)
2.5.3. Cơ chế chống oxy hoá

Chất chống oxy hóa có thể phản ứng trực tiếp với các gốc tự do để tiêu diệt chúng bằng
cách làm ổn định hoặc cho electron nhằm loại bỏ tình trạng bất ổn định của các gốc tự
do hoặc chúng có thể gián tiếp làm giảm sự hình thành các gốc tự do bằng cách ức chế
các hoạt động hoặc biểu hiện của các enzyme tạo gốc tự do hoặc bằng cách tăng cường
các hoạt động và biểu hiện của các enzyme chống oxy hóa khác [20].
Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành bằng các phương pháp hóa học và sinh học để
nghiên cứu cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa nhằm tìm ra các chất chống

21

oxy hóa mới, đặc biệt là từ các hợp chất tự nhiên.

Hình 2.3:
Cơ2.4
chế: Cơ
bắt chế
gốc bắt
tự do
A3
Hình
gốccủa
tự vitamin
do của vitamin
C

Hình 2.5 : Cơ chế bắt gốc tự do của vitamin E


22


23

CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
3.1.

Thời gian, mục đích và địa điểm tiến hành

Thời gian
Đề tài được thực hiện từ ngày 01/10/2018 đến ngày 20/01/2019.
Mục đích
Tìm hiểu tổng quan về các loại enzyme, thuỷ phân protein từ nhung hươu bằng
các loại enzyme.
Địa điểm tiến hành
Các thí nghiệm, quá trình thuỷ phân và phân tích được thực hiện tại Viện Công
Nghệ Hoá Học.
3.2.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng
3.2.1. Vật liệu

Nguyên liệu sử dụng là nhung hươu được mua trực tiếp tại huyện Vĩnh Cửu, tỉnh
Đồng Nai. Nguyên liệu trước được sử dụng đã được xử lý sơ bộ một số bước như sau:
Xử lý sơ bộ: đầu tiên cần sơ chế nhung sau khi được cắt, nguyên tắc quan trọng
nhất là cần loại bỏ hết long nhung ra khỏi lộc nhung. Có thể dùng lửa hơ nhẹ hoặc
dùng dao cạo cạo sạch, không được để sót long nhung vì long nhung có thể gây ra tình
trạng viêm ruột, viêm đường tiêu hoá.
Sấy khô: giúp việc bảo quản trở nên dễ dàng, giữ được dưỡng chất và dược tính
bên trong nguyên liệu. Người ta thường xử lý theo hai cách:
Cách 1: nhung được thái thành từng lát mỏng đem sấy khô ở nhiệt độ 60-70°C
hoặc đem phơi dưới nắng nhẹ sau đó cho vào túi hút chân không bảo quản.
Cách 2: có thể sử dụng cát nóng vừa rang (khoảng 30-40°C) để sấy khô. Khi cát
nguội lấy ra thay mới cho đến khi khô hẳn.
Các enzyme sử dụng: Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, Pepsin, Protamex,
Cellulast, α-Amylase.
Bảng 3.1: Điều kiện được chọn của các enzyme thuỷ phân

24

STT

Enzyme sử dụng

Điều kiện thuỷ phân

1

Alcalase

Nhiệt độ: 56°C, pH=7, 2.5% enzyme

2

Flavourzyme

Nhiệt độ: 55°C, pH=7, 2% enzyme

3

Neutrase

Nhiệt độ: 52.5°C, pH=6.5, 2% enzyme

4

Pepsin

Nhiệt độ: 37°C, pH=3, 3% enzyme

5

Protamex

Nhiệt độ: 55°C, pH=7, 2.5% enzyme

6

α-Amylase

Nhiệt độ: 65°C, pH=4, 2% enzyme

7

Cellulase

Nhiệt độ: 55°C, pH=5.5, 2% enzyme

3.2.2. Hoá chất
3.2.3. Dụng cụ và thiết bị
Micropipette
Đầu tip các loại
Ống ly tâm thu mẫu
Máy ly tâm
Cân phân tích
Máy đo quang phổ UV/Vis

25

3.3.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Tổng quát nội dung và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu

Xây nhuyễn

Hoà vào nước

Thuỷ phân

Enzyme, điều chình pH, Nhiệt độ

Ly tâm

Kiểm tra protein hoà tan bằng phương pháp Nynhydrin và Lowry
Sấy đông khô
Kiểm tra hoạt tính kháng oxy hoá bằng DPPH, khử H2O2

Sản phẩm

Hình 3.1: Quy trình thủy phân enzyme đơn