Khảo sát sự ảnh hưởng của tia UV và tia xạ gamma co60 đến sự sinh tổng hợp astaxanthin của chủng nấm men đột biến rhodosporidium toruloides BE1 và b18

1

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: Khảo sát sự ảnh hưởng của tia UV và tia xạ gamma Co60
đến sự sinh tổng hợp astaxanthin của chủng nấm men đột biến
Rhodosporidium toruloides BE1 và B18


2

TÓM TẮT
Carotenoids bao gồm nhiều loại hợp chất tự nhiên, được ứng dụng rộng rãi trong
ngành y học và công nghiệp, đóng vai trò như thực phẩm chức năng . Trong tất
cả các hợp chất tự nhiên, astaxanthin ( 3,3 - dihydroxy - beta carotente - 4,4
dione ) là một keto - carotenoid, là hợp chất chính của carotenoid được thu nhận
phần lớn từ các loài vi tảo lục, sinh vật biển như cá hồi và chủ yếu từ các loài vi
sinh vật. Astaxanthin đóng vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa trong cơ thể
động vật như chuyển hóa thành vitamin A, thúc đẩy đáp ứng miễn dịch và giúp
kháng ung thư. Do có cấu trúc phân tử đặc biệt nên hoạt tính kháng oxy hóa của
astaxanthin cao vượt trội, cao gấp 10 lần zeaxanthin, lutein, canthaxanthin , betacarotene và đặc biệt cao gấp 100 lần vitamin E.
Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp astaxanthin của hai chủng
Rhodosporidium toruloides BE1 và B18 bằng tác nhân tia UV và tia xạ gamma
Co60, chọn lọc được 4 chủng đột biến sinh tổng hợp astaxanthin cao vượt trội là
chủng BEU108 tích lỹ astaxanthin 935,471 ± 0,061 (μg/g sinh khối khô), đạt
2826,67±1,15 (μg/L môi trường); cao gấp 1,05 lần so với chủng ban đầu BE1;
đặc biệt cao gấp 6 lần so với chủng hoang dại ban đầu, chủng BU102 tích lỹ
astaxanthin 1065,39±5,39 (μg/g sinh khối khô), đạt 2150,10±1,52 (μg/L môi
trường); cao gấp 3 lần so với chủng B18 ban đầu và 4,7 lần so với chủng WT,
chủng BEG4.21 tích lỹ astaxanthin 1123,50 ± 20,8 (μg/g sinh khối khô), đạt
3072,6 ± 46 (μg/L môi trường); cao gấp 1,2 lần so với chủng ban đầu BE1, đặc
biệt cao gấp 6,7 lần so với chủng hoang dại ban đầu, chủng BG1.21 tích lỹ

astaxanthin 1133,66 ± 0,01 (μg/g sinh khối khô), đạt 2924,85 ± 0,07 ( μg/L môi
trường); cao gấp 3 lần so với chủng B18, gấp 6,4 lần chủng WT ban đầu.
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp astaxanthin của 4 chủng đột biến khi nuôi cấy
trên môi trường YM, YPD và Hansen.Trong đó, môi trường YPD thích hợp cho
việc nuôi cấy hai chủng BEG4.21 và chủng BEU108, hàm lượng astaxanthin mà
2 chủng tích lũy lần lượt là 4570,4 ± 27,7 (µg/L dịch nuôi cấy) cao gấp 2 lần so
với BE1 và gấp 10 lần chủng WT ,4337,13 ± 0,56 (µg astaxanthin/L dịch nuôi
cấy) cao gấp 1,8 lần BE1 và gấp 9,5 lần WT. Đối với chủng BU102 sinh tổng hợp
astaxanthin cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường YM, đạt 3974,4 ± 36,2 (µg
astaxanthin/L dịch nuôi cấy); cao gấp 4,3 lần chủng B18 và gấp 8,7 lần chủng
hoang dại. Môi trường Hansen thích hợp khi nuôi cấy chủng BG1.21 đạt 2931,1
± 45,1(µg/L dịch nuôi cấy); cao gấp 3 lần chủng B18 và 6,4 lần so với WT.


3

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của 4 chủng đột biến chọn lọc thu nhận được
kết quả hoạt tính kháng oxy hóa so với chất chuẩn vit E được sắp xếp theo thứ tự
tăng dần: B18 < BU102 < BE1,BG1.21 < BEG4.21 < BEU108. Kết quả hoạt tính
kháng oxy hóa so với chất chuẩn vit C được sắp xếp theo thứ tự tăng dần: B18 <
BU102 < BE1,BG1.21 < WT

4

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Carotenoids là các hợp chất tự nhiên được tìm thấy trong tất cả các giới sinh vật
sống. Các hợp chất này rất dễ nhận biết nhờ vào màu sắc tươi sáng của chúng
như vàng, cam, đỏ và tím. Đến năm 1987, hơn 600 loại carotenoids tự nhiên đã

được phát hiện và phần lớn các cấu trúc hóa học của chúng đều đã được xác
định. Carotenoids là loại terpenoids được sinh tổng hợp chủ yếu trong cơ thể vi
sinh vật, tảo, nấm và thực vật [1].
Trong đó, astaxanthin là hợp chất màu đỏ cam, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh
và là hợp chất đầy tiềm năng được ứng dụng rộng rãi trong dinh dưỡng, mỹ
phẩm, thực phẩm và ngành công nghiệp chăn nuôi. Astaxanthin là sắc tố
carotenoid chính được tìm thấy trong thủy sản như cá hồi, rong biển đỏ, tôm;
trong các loài chim như chim hồng, chim cút; trong các loài tảo và một số loài
nấm men đỏ [2].
Nhóm nấm men như nấm men đỏ Rhodosporidium toruloides, tảo lục
Haematococcus pluvialis và một số vi khuẩn gram âm đều có khả năng sinh tổng
hợp astaxanthin [3].
Do mang lại nhiều lợi ích nên việc thương mại hóa astaxanthin đang là vấn đề
được quan tâm hàng đầu. Trong đó, các nguồn cung cấp astaxanthin chính hiện
nay là từ loài vi tảo Haematococcus pluvialis với hàm lượng astaxanthin mà vi
tảo tích lũy là 0,3 g astaxanthin / 21kg sinh khối khô [2] và từ các loài nấm men
đỏ với hàm lượng astaxanthin cao hơn 5 - 50 lần so với các loài giáp xác [4]. Với
khả năng sinh tổng hợp astaxanthin cao nhưng việc nuôi trồng vi tảo để thu nhận
astaxanthin còn rất nhiều khó khăn như điều kiện nuôi trồng phức tạp, thời gian
nuôi cấy lâu, công đoạn thu nhận hợp chất mất nhiều công sức. Do đó hướng
nghiên cứu về việc thu nhận astaxanthin từ loài nấm men đỏ đang rất được quan
tâm vì một số đặc điểm như sinh sản nhanh, tăng trưởng trong thời gian ngắn và
có khả năng sử dụng đa dạng các nguồn cơ chất với chi phí thấp để tạo một
lượng sinh khối lớn.


5

Hướng nghiên cứu gây đột biến cũng như tối ưu hóa môi trường để thu nhận tối
đa hàm lượng astaxanthin từ loài nấm men đỏ Rhodosporidium toruloides đang

là vấn đề trọng tâm [5].
Phương pháp gây đột biến lên vi sinh vật để tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp
astaxanthin là phương pháp đơn giản và hiệu quả. Một số tác nhân được sử dụng
để gây đột biến trên nấm men như tia gamma, tia uv, áp suất thủy tĩnh, benomyl,
antimycin…. với mục tiêu thay đổi cấu trúc gen vi sinh vật, chọn lọc các chủng
có khả năng sinh tồn cao cùng với khả năng sinh tổng hợp astaxanthin cao vượt
trội so với chủng ban đầu. Trong đó, phương pháp đột biến vật lý bằng tia UV và
tia xạ gamma Co60 trên chủng nấm men đỏ Rhodosporidium toruloides cho kết
quả ban đầu khả quan về việc sinh tổng hợp astaxanthin cao gấp 2,2-3,9 [41] lần
so với chủng ban đầu. Hai chủng nấm men đã qua đột biến kép bằng tác nhân
hóa học BE1 và B18 cho kết quả cao về việc sinh tổng hợp astaxanthin so với
chủng nấm men hoang dại ban đầu [42], nhưng theo một số nghiên cứu các
chủng nếu được tiếp tục gây đột biến bằng tác nhân vật lý sẽ cho kết quả sinh
tổng hợp cao vượt trội hơn. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Khảo
sát sự ảnh hưởng của tia UV và tia xạ gamma Co60 đến sự sinh tổng hợp
astaxanthin của chủng nấm men đột biến Rhodosporidium toruloides BE1 và
B18” nhằm mục đích chọn lọc và thu nhận các giống đột biến mới cho khả năng
sinh tổng hợp astaxanthin cao được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp.
1.2 Mục tiêu đề tài
Khảo sát sự ảnh hưởng của tia UV đến khả năng sinh tổng hợp astaxanthin của
chủng nấm men đột biến Rhodosporidium toruloides BE1 và B18.
Khảo sát sự ảnh hưởng của tia xạ gamma Co60 đến khả năng sinh tổng hợp
astaxanthin của chủng nấm men đột biến Rhodosporidium toruloides BE1 và
B18.
Tách chiết astaxanthin từ các chủng nấm men đột biến.
Xác định đường cong tăng trưởng và thời điểm tích lũy astaxanthin cao nhất của
các chủng nấm men đột biến.


6

Khảo sát môi trường tối ưu để nuôi cấy các chủng nấm men đột biến nhằm thu
nhận hàm lượng astaxanthin cao nhất.
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin được tách chiết từ các chủng
đột biến.
1.3 Ý nghĩa đề tài
Ý nghĩa khoa học: thu nhận các chủng nấm men đột biến mới cho khả năng sinh
tổng hợp astaxanthin cao vượt trội so với chủng ban đầu, mở rộng hướng nghiên
cứu trên nấm men nói chung và chủng Rhodosporidium toruloides nói riêng.
Ý nghĩa thực tiễn: góp phần cho sự phát triển trong ngành công nghiệp sản xuất
astaxanthin thương mại tại các nước có khí hậu nhiệt đới, đa dạng hóa các nguồn
thu nhận hợp chất astaxanthin – một hợp chất đa chức năng và đầy triển vọng.


7

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Một số đặc điểm về astaxanthin
Astaxanthin là một sắc tố thuộc về nhóm của xanthophylls, dẫn xuất oxy hóa của
carotenoid được tổng hợp trong thực vật và có nguồn gốc từ lycopene [13].
Giống như các sắc tố tự nhiên khác, astaxanthin thu hút rất nhiều sự chú ý của
các nhà khoa học ở thế kỷ 19 [10]. Chất màu astaxanthin được phân bố rộng rãi
trong tự nhiên, nơi chúng đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các tế
bào và sinh vật chống lại sự oxy hóa. Chúng là tác nhân chống lại tác động của
ánh sáng, oxy phân tử và các tác nhân có thể gây ra tổn thương oxy hóa cho tế
bào vào mô [11].
Theo như nghiên cứu, thị trường astaxanthin trong 2019/2020 được ước tính sẽ
đạt 1,5 – 1,8 tỷ đô la với tỷ lệ tăng trưởng hàng năm của hợp chất là 3,9%, hợp
chất này sẽ được thương mại hóa và công nghiệp hóa rộng rãi do nhu cầu tiêu
dùng ngày càng cao trong thực phẩm, mỹ phẩm, các ngành công nghiệp hóa chất

và dược phẩm [12]
Dù có rất nhiều nguồn thu nhận và nhiều phương pháp để sản xuất astaxanthin
nhưng nguồn thu nhận từ vi sinh vật là vấn đề nổi bật và đầy tiềm năng đang
được các nhà khoa học quan tâm. Một số lợi ích khi thu nhận astaxanthin từ
phương pháp nuôi cấy vi sinh vật như chi phí thấp, năng suất thu hoạch cao và
đặc biệt là không gây ô nhiễm môi trường. Các nhà khoa học đã công bố một số
loài vi khuẩn, tảo và nấm men như Rhodotorula, Phodosporidium,Sporolomyces
và Rhaffia có khả năng sinh tổng hợp hợp chất này.
2.1.1 Công thức cấu tạo
Astaxanthin ( 3,3 - dihydroxy - beta carotente - 4,4 dione ) là một keto carotenoid, công thức phân tử là C40H52O4. Astaxanthin được cấu tạo từ năm tiền
chất carbon, isopentenyl diphosphate và dimethylallyl diphosphate. Nó là một
chất chuyển hóa của zeaxanthin (hydroxyl (- OH)) và cathaxanthin(ketone (C =
O)), do đó astaxanthin có chức năng của cả hai nhóm này. [14]


8

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của astaxanthin
Tùy thuộc vào nguồn gốc, astaxanthin có thể ở dạng kết hợp với một số chất
khác. Đôi khi astaxanthin được đồng trùng hợp một hay cả hai nhóm hydroxyl
với các loại acid béo như palmitic, oleic, estearic hoặc linoleic, astaxanthin cũng
tồn tại ở dạng tự do (các nhóm hydroxyl nguyên vẹn) và astaxanthin cũng có thể
kết hợp với protein hình thành carotenoprotein hay kết hợp với lipid hình thành
carotenolipoprotein.[1]


9

Hình 2.2 Công thức các dạng đồng phân của astaxanthin.
2.1.2 Đặc tính sinh hóa của astaxanthin

Astaxanthin là một sắc tố tự nhiên, là một diketo carotenoid, là một hợp chất
không phân cực nên có khả năng tan trong chất béo nhưng không tan trong nước
và lipophilic [3]. Tinh thể astaxanthin ở dạng bột, màu tím đậm, có nhiệt độ nóng
chảy khoảng 2240C. Astaxanthin có thể hòa tan trong các dung môi hữu cơ như
carbon disulfide, aceton, benzen, chloroform và hòa tan ở nhiệt độ phòng trong
dicloromethan,dimethylsulfoxide. Chúng thường kém ổn định hơn so với các loài
isopyrenoids khác [3]. Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc: astaxanthin hấp thụ rất
mạnh bức xạ trong vùng 470 - 510 nm nên tạo màu đỏ cam rất đẹp. [38]
Bảng 2.1 Một số tính chất vật lý của astaxanthin. [15]
Công thức phân tử
Khối lượng phân tử
Nhiệt độ nóng chảy
Tính tan
Kết tinh ( trong ether dầu hỏa)

C40H52O4
M = 596,235
225 - 2350C
Trong dung môi phân cực thấp
Huỳnh kim màu đỏ


10

2.1.3 Chức năng sinh học của astaxanthin
Astaxanthin là một chất carotene đỏ tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa mạnh .
[18]

Hình 2.3 Chức năng sinh học của astaxanthin.
2.1.3.1 Astaxanthin được ứng dụng nhiều trong chăn nuôi và trong y học

Các yếu tố nội tại như di truyền, chuyển hóa tế bào, hormon, các quá trình trao
đổi chất và các quá trình ngoại sinh như tiếp xúc với ánh sáng, ô nhiễm, bức xạ
ion hóa, hóa chất và độc tố đều gây ra lão hóa da. [19]

Hình 2.4 Hình ảnh da lão hóa theo độ tuổi.


11

Astaxanthin được lựa chọn là tác nhân chống oxy hóa hiệu quả, nó có hoạt tính
cao hơn nhiều so với một số chất chống oxy hóa như carotenoid và vitamin E.
Do tác dụng chống oxy hoá mạnh mà astaxanthin được sử dụng như tác nhân
chống lão hóa. [19]
2.1.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa lipid
Astaxanthin có thể tồn tại trong gan và ngoài tế bào, nó giúp chống những tác hại
oxy hóa bởi các cơ chế khác nhau như kết hợp với oxy đơn phân tử, ngăn chặn
các gốc tự do, bảo vệ cấu trúc màng tế bào, tăng cường chức năng của hệ thống
miễn dịch và điều chỉnh biểu hiện gen. Astaxanthin ức chế sự peroxid hóa lipid
trong các mẫu sinh học khác nhau. [20]
2.1.3.3 Ngăn ngừa ung thư
Các chất oxy hóa được tạo ra trong sự trao đổi chất hiếu khí bình thường hay
trong quá trình oxy hóa chất béo đều góp phần vào các bệnh lão hóa, ung thư và
xơ vữa động mạch thông qua quá trình oxy hóa DNA, protein và chất béo. Các
hợp chất chống oxy hóa sẽ làm giảm đột biến và ung thư bằng cách ức chế tổn
thương oxy hóa cho tế bào. Theo nghiên cứu, astaxanthin cho thấy hoạt tính
chống ung thư đáng kể khi so sánh với các carotenoids khác như canthaxanthin
và β – carotene. Astaxanthin cũng ức chế sự tăng trưởng của xơ hóa, vú , các tế
bào ung thư tuyến tiền liệt và nguyên bào sợi phôi. Astaxanthin ức chế sự chết tế
bào, sự tăng sinh tế bào và các khối u vú ở chuột đực và chuột cái. Ngoài ra,
virus Epstein - Barr và chất gây ung thư trong u nhú da chuột bị ức chế đáng kể

bởi điều trị astaxanthin. [20]
2.1.3.4 Cải thiện chất lượng trứng gà và trong chăn nuôi thủy sản
Việc bổ sung astaxanthin vào thức ăn chăn nuôi gà sẽ làm tăng hàm lượng chất
dinh dưỡng cũng như màu sắc trong lòng đỏ trứng. Theo như nghiên cứu của
Akiba và Dike, đã kiểm tra sự thay đổi của màu sắc lòng đỏ trứng gà khi bổ sung


12

thêm astaxathin vào khẩu phần ăn của gà, kết quả cho rằng lòng đỏ trứng có màu
sậm hơn nhiều so với ở chế độ ăn bình thường. [21]
Bên cạnh đó, astaxanthin là một trong những sắc tố chính trong các loài giáp xác,
cá hồi với vai trò là cung cấp sắc tố đỏ cam trong những sinh vật này. [13]
2.1.3.5 Chất bảo vệ mắt và hệ thống thần kinh
Astaxanthin là chất chống oxy hóa có hiệu quả có thể đi qua màng não (Tso và
Lam,1996), lợi ích của astaxanthin đối với sức khỏe của mắt và hệ thống thần
kinh rất được hứa hẹn.
Nghiên cứu hiệu quả chống oxy hoá ở mắt chuột cho thấy rằng astaxanthin có thể
cải thiện các retinal bị tổn hại và astaxanthin cũng có hiệu quả tốt trong việc bảo
vệ tế bào nhận kích thích ánh sáng khỏi bị thoái hóa. [38]
2.1.4 Sản phẩm astaxanthin

Hình 2.5 Một số sản phẩm astaxanthin thương mại.


13

2.2 Con đường chuyển hóa thành hợp chất astaxanthin

14

Hình 2.6 Con đường chuyển hóa thành hợp chất astaxanthin . [17]

Astaxanthin được hình thành qua con đường mevalonate, khi acetyl-CoA thông
qua con đường mevalonate để hình thành isopentenylpyrophosphate (IPP) là tiền
chất chung của tất cả isoprenoid. Sau đó, 8 phân tử IPP ngưng tụ tạo thành
phytoene không màu. Phytoene sau khi qua 4 phản ứng khử hydro và 2 chu trình
phytoene được chuyển đổi thành L-carotene . Cuối cùng là quá trình oxy hóa Lcarotene để tạo ra astaxanthin.
2.3 Một số loài động vật, thực vật và vi sinh vật sinh tổng hợp astaxanthin
Nguồn thu nhận astaxanthin rất đa dạng như từ thủy hải sản, tảo và vi sinh vật.
Hiện nay, người ta sản xuất các dạng astaxanthin thương mại chủ yếu từ các
nguồn như nấm men Phaffia, vi tảo Haematococcuspluvialis và phương pháp
tổng hợp hóa học.


15

2.3.1 Vi tảo Haematococcus pluvialis
Giới: Eukaryote
Ngành: Chlorophyta
Lớp: Chloropyceae
Bộ: Volvocales
Họ: Heamatococcaceae
Chi: Heamatococcus
Loài: Pulvialis
Haematococcus pluvialis là một loài vi tảo lục, nước ngọt, đơn bào, sinh sản vô
tính bằng cách nhân đôi và có khả năng di chuyển.

Hình 2.7 Vi tảo Haematococcus pluvialis.

Hình thái tế bào của Haematococcus pluvialis có sự biến đổi khác nhau trong chu
trình sống của chúng. Tế bào có hai dạng gồm tế bào sinh dưỡng và nang bào tử.
Tế bào sinh dưỡng: màu xanh, dạng cầu hoặc elip. Trong điều kiện thuận lợi,
phần lớn các tế bào sinh dưỡng tổng hợp chlorophyll a, chlorophyll b và tiền
carotenoid trong điều kiện quang tự dưỡng khi có ánh sáng và quang dị dưỡng
khi trong bóng tối.
Nang bào tử: khi gặp điều kiện bất lợi (cạn kiệt dinh dưỡng, nhiệt độ cao), nang
bào tử hình thành và thay đổi thành dạng cyst. Ngay thời điểm đó tốc độ sinh
trưởng của tế bào giảm và tế bào tích lũy một lượng lớn astaxanthin. Ban đầu,
astaxanthin tập trung hình thành quanh nhân và quá trình được tiếp tục khi toàn
bộ tế bào chuyển sang màu đỏ.


16

Hình 2.8 Quá trình sinh tổng hợp astaxanthin.

Hình 2.9 Vòng đời của vi tảo Haematococcus pluvialis.
Ở Haematococcus pluvialis, astaxanthin được tổng hợp ở giai đoạn tạo bào nang,
là loại sắc tố đặc trưng và có giá trị kinh tế rất cao. Hàm lượng astaxanthin mà vi
tảo tích lũy là 0,3 g astaxanthin / 21kg sinh khối khô. [2]
Mặc dù hàm lượng astaxanthin từ tảo lục Haematococcus pluvialis cao nhưng
còn nhiều hạn chế khi áp dụng trong quy mô công nghiệp như phải chiếu sang
lên tục và sục khí CO 2 liên tục trong suốt quá trình nuôi cấy,canh tác tự dưỡng
kéo dài trong ao nước ngọt, khi thu nhận astaxanthin phải phá vỡ tế bào của nó.
[21]


17

Hình 2.2 Quy trình sản xuất astaxanthin thương mại từ vi tảo Haematococcus
pluvialis. [12]

Trong số các loài vi sinh vật, vi khuẩn, nấm men, nấm và tảo đều là những loài
tích lũy carotenoid – một loại sắc tố nội bào. Trong số các loại nấm men, nấm
men đỏ Phaffia rhodozyma là loài sản xuất astaxanthin được ứng dụng trong nuôi
trồng thủy sản nhiều nhất, điển hình là làm gia tăng giá trị dinh dưỡng trong chất
lượng thịt của cá hồi. [15]
Theo như nghiên cứu, nấm men đỏ Phaffia rhodozyma chứa hàm lượng
astaxanthin cao hơn 5 - 50 lần so với các loài giáp xác , chứa khoảng 30 - 800 g/
g astaxanthin tùy thuôc vào phương pháp nuôi cấy. Do đó, chúng thường được bổ
sung vào khẩu phần ăn trong nuôi trồng thủy sản. [4]


18

Hình 2.3 Một số nguồn sản sinh astaxanthin.
Đây là hướng nghiên cứu đầy tiềm năng nhằm đa dạng hóa các nguồn thu nhận
astaxanthin thương mại phục vụ cho các ngành công nghiệp, dược phẩm, mỹ
phẩm.
2.3.2 Thu nhận astaxanthin từ vỏ các loài thủy sản
Phương pháp hóa học dùng để thu nhận hợp chất astaxanthin chủ yếu từ các loại
vỏ tôm, vỏ cua – phế liệu từ ngành công nghiệp thủy sản:

Hình 2.4 Vỏ tôm hùm.
Vỏ tôm , rửa sạch, sấy khô (45 - 50 0C, 120 - 150 phút) , nghiền , rây ,trích ly
bằng dầu thực vật (dầu đậu nành, dầu mè, dầu hạt cải), ly tâm (3000 rpm / phút) ,


19

thu dịch nổi , pha loãng , đo phổ hấp thụ ở 487nm , xác định hàm lượng
astaxanthin.
Hiện nay, dạng astaxanthin được thu nhận bằng phương pháp hóa học thường bổ
sung vào thức ăn cho cá hồi như chất tạo màu nhằm làm tăng thành phần dinh
dưỡng trong khẩu phần ăn của chúng (New York Times, 17/8/1987). [38]
2.4 Nấm men Rhodosporidium toruloides
2.4.1 Đặc điểm hình thái của chủng nấm men Rhodosporidium toruloides
Nấm men Rhodotorula toruloides còn được gọi là Rhodosporidium toruloides, là
loài có màu đỏ đặc trưng của hợp chất carotenoid. Nấm men đỏ này là nguồn sản
xuất các hợp chất carotenoids (do bản thân nó chứa hợp chất này trong tế bào)
hay tiền chất vitamin A và đồng thời cung cấp đặc tính chống oxy hóa [12]. Tùy
vào điều kiện nuôi cấy khác nhau mà chúng có các kiểu hình khác nhau như hình
trứng, hình cầu tròn và hình gậy. Chúng là loài đơn bào với kích thước từ 2 – 5
µm chiều rộng ; 2,5 – 10 µm chiều dài và kích thước khuẩn lạc phụ thuộc vào
môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ nuôi cấy. [22]

Hình 2.5 Khuẩn lạc Rhodosporidium toruloides.
2.4.2 Một số loài nấm men Rhodosporidium sinh tổng hợp astaxanthin
Bảng 2.2 So sánh khả năng sinh tổng hợp carotenoid ở một số loài nấm men.


20

[12]
Vi sinh vật

Nguồn cơ chất

Tổng hàm lượng

carotenoids ( mg/g
sinh khối khô )

Tổng hàm lượng
carotenoids( mg/L)

Rhodotorula
glutinis

glucose

0,11

0,63

Rhodotorula
graminis

glucose

0,16

1,47

Rhodotorula
toruloides

glucose

0,12

1,31

Rhodotorula
toruloides

glucose

0,28

27,5

Rhodotorula
paludigenum

glycerol

0,40

2,99

Sporobolomyces
roseus

glucose

0,08

0,63

Sporidiobolus
salmonicolor

glucose

0,35

0,61

Phaffia
rhodozyma

glycerol

0,21

1,48

2.5 Các phương pháp gây đột biến nấm men
Hướng nghiên cứu gây đột biến trên đối tượng vi sinh vật nhằm mục đích thu
nhận các hợp chất thương mại cao là hướng nghiên cứu đang được rất nhiều sự
quan tâm của các nhà khoa học vì nó không đòi hỏi chi phí đầu tư cao – phù hợp
với điều kiện khoa học kỹ thuật tại Việt Nam. Trong đó, việc nghiên cứu tạo
chủng nấm men đột biến cho hàm lượng astaxanthin cao là vấn đề đầy triển
vọng.
Hiện nay, có nhiều phương pháp gây đột biến như là:
a) Đột biến bằng tác nhân hóa học: EMS (ethyl methanesulfonate), NTG (N
- Methyl - N′ - nitro - N - nitrosoguanidine), H2O2, β – ionone…

21

b) Đột biến bằng tác nhân vật lý: tia phóng xạ (tia X, tia gamma,. .), tia tử
ngoại, sốc nhiệt…
c) Đột biến bằng tác nhân sinh học: virus, vi khuẩn…
Đột biến là những biến đổi trong cấu trúc của gen (cấp độ phân tử) hay biến đổi
nhiễm sắc thể (cấp độ tế bào) tại một điểm nào đó trên phân tử DNA và có liên
quan đến sự thay đổi về số lượng, thành phần, trật tự các cặp nucleotide trong
gen. Người ta lựa chọn chủng đột biến dực trên kiểu hình khuẩn lạc, màu sắc
khuẩn lạc qua kết quả đột biến ngẫu nhiên trên vi sinh vật – đây là phương pháp
đột biến đơn giản. [24] [25] [26]
Trong các phương pháp gây đột biến, phương pháp sử dụng hóa chất cũng mang
lại nhiều kết quả tốt. Theo An và cộng sự, chủng nấm men đột biến P.
Rhodozyma từ tác nhân hóa học NTG cho hàm lượng carotenoid 1200 ug /g (cao
gấp 3 - 4 lần so với chủng hoang dại) [27].
Bên cạnh đó, có rất nhiều công bố về việc sử dụng tác nhân vật lý gây đột biến
lên nấm men nhằm thu được hàm lượng astaxanthin cao từ chủng hoang dại hoặc
chủng đã được gây đột biến. Simpson và cộng sự (1964) phân lập được chủng
đột biến 62-506, dưới điều kiện nhiệt ổn định chủng sinh tổng hợp hàm lượng
gamma-carotene tăng 65% so với chủng ban đầu [52].L eland H. Hartwell
( 1967) đã tạo dòng đột biến bằng phương pháp sốc nhiệt, kết quả thu nhận được
chủng đột biến sinh tổng hợp hàm lượng astaxanthin 48,08 mg/L , tăng 43%
chủng ban đầu. Jef D. Boeke và cộng sự ( 1984) đã phân lập được dòng đột biến
S. pombe ura4-294 ( dưới tác dụng tia UV) tích lũy hàm lượng astaxanthin cao
gấp 2 lần so với chủng hoang dại ban đầu[50]. Tương tự, Jang Houng Park và
cộng sự ( 2008) thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của chủng nấm men đột biến
ypt1-G80D, kết quả thu nhận được chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt cao
và khả năng sinh tổng hợp carotenoid cao, tăng 35% so với chủng bố mẹ[53]
Phương pháp gây đột biến bằng tác nhân vật lý lên các chủng nấm men đã qua
đột biến cũng cho các kết quả cao về khả năng sinh tổng hợp carotenoids cũng

như các hợp chất thuộc carotenoids như theo bài báo khoa học (2004), chủng
nấm men P. rhodozyma 2A2N (2A2N đã được đột biến với NTG) được chiếu xạ
gamma liều thấp dưới 10kGy và thu được chủng đột biến 3A4 – 8 cho hàm lượng


22

3,3mg carotenoid /g sinh khối khô (cao hơn 50% lần so với chủng 2A2N trước
khi chiếu xạ) [31] .
2.5.1 Cơ chế gây đột biến của tia UV [32]
Tia UV là sóng điện từ có bước sóng (100 - 400nm) ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy
và dài hơn tia X. Tia UV bao gồm 3 loại dựa vào bước sóng:
a) Tia UVA có bước sóng dài từ 320 - 400nm có năng lượng thấp hơn vùng tia
UVB và UVC. Tia UVA có lượng bức xạ cực tím nhiều nhất (chiếm tới 97%), do
đó chúng dễ dàng xuyên qua tầng ozone. Tia UVA có thể xuyên qua giác mạc, đi
vào thủy tinh thể hay võng mạc ở bên trong mắt, khi tiếp xúc dưới bức xạ UVA
quá lâu sẽ dẫn đến hiện tượng bị đục nhân mắt hay thoái hóa điểm vàng.
b) Tia UVB có bước sóng trung bình từ 280 - 320nm và có năng lượng thấp hơn
vùng tia UVC. Tia UVB kích thích quá trình chuyển hóa Melanin (một loại sắc
tố da) làm cho da trở nên tối đi, tạo ra sự rám nắng. Nếu với cường độ cao, tia
UVB sẽ gây nên hiện tượng cháy nắng, làm tăng các nguy cơ bị ung thư da. Tia
UVB cũng gây nên các hiện tượng bạc màu da, các nếp nhăn và các dấu hiệu
khác sớm trước tuổi. Hầu hết các bức xạ UVB chủ yếu gây nên các bệnh giác
mạc như viêm giác mạc, hạt kết giác mạc.


23

Hình 2.6 Ảnh hưởng của tia UVA, UVB lên cấu trúc da.
c) Tia UVC có bước sóng ngắn từ 100 - 280nm. Đây là vùng tia UV có năng

lượng cao nhất và có tính chất tiệt trùng. Tia UV tác dụng lên nucleoprotein của
vi sinh vật, chủ yếu gây ra đột biến gene và đột biến nhiễm sắc thể ở vi sinh vật.
Bảng 2.3 Phân loại tia tử ngoại theo ISO-21348 .[32]
Tên

Ký hiệu

Bước sóng

Năng lượng Ghi chú / Tên
photon (eV)
khác
3,10-12,4eV

Tử ngoại

UV

Tử ngoại

UVA

400nm100nm
400nm315nm

Tử ngoại

UVB

315nm280nm

3,94-4,43eV

Tử ngoại

UVC

280nm100nm

4,43-12,4eV

3,10-3,94eV

Sóng dài , ánh
sáng đen ,
không bị lớp
ozon hấp thụ
Sóng trung ,
bị lớp ozon
hấp thụ phần
lớn
Sóng ngắn ,
khử trùng , bị
lớp ozon và
khí quyển hấp
thụ hoàn toàn.

2.5.2 Cơ chế gây đột biến của tia gamma
Tia gamma thường sinh ra bởi sự phân rã gamma từ đồng vị phóng xạ tự nhiên
nguồn Coban60 (Co60) hoặc Cesium137 (137Cs) và bức xạ thứ cấp từ các tương

tác với các hạt trong tia vũ trụ. Cũng có những nguồn gamma tự nhiên khác
không có nguồn gốc hạt nhân, ví dụ như các tia sét. [10]


24

Hình 2.7 Ảnh hưởng của tia gamma lên các phân tử nước.
2.6 Khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin
Một số nghiên cứu cho thấy carotenoids là một chất kháng oxy hóa có khả năng
bất hoạt các gốc tự do và các oxy đơn phân tử . Trong đó, astaxanthin là hợp chất
chính của carotenoids, là hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất trong
số các chất thuộc nhóm carotenoids. Do astaxanthin trong phân tử chứa đồng thời
chuỗi polyene, nhóm hydroxyl và nhóm keto trên mỗi vòng ionone, các nhóm
này ức chế các gốc tự do bằng cách phản ứng với các gốc tự do để chấm dứt
phản ứng và chuyển đổi chúng thành các sản phẩm khác [41]. Theo như một số
báo cáo, hoạt tính kháng oxy hóa của astaxanthin cao gấp 10 lần so với các hợp
chất khác thuộc nhóm carotenoids như zeaxanthin, lutein, canthaxanthin và
alpha- carotene
Astaxanthin ngày càng khẳng định vai trò kháng oxy hóa cao qua một số nghiên
cứu như chúng được bổ sung vào chế độ ăn của chuột bị thiếu vitamin E giúp
tránh quá trình peroxid hóa chất béo, bảo vệ ty thể và hồng cầu ở chuột. Ngoài
ra, astaxanthin cũng được bổ sung vào chế độ ăn của gà giúp tránh quá trình oxy
hóa chất béo ở màng gan gà [42]. Không chỉ ở động vật, astaxanthin có thể ngăn


25

ngừa những tổn thương oxy hóa đến các tế bào cyst ở các loài vi tảo lục bằng
cách tương tác với các phân tử oxy đơn phân được tạo ra bởi chính các loải vi tảo
này [43].

Đối với người, khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin giúp ngăn ngừa và hạn
chế lan truyền ung thư do astaxanthin bất hoạt các gốc tự do và các oxy đơn phân
tử trong cơ thể [44]. Hơn thế nữa, astaxanthin có khả năng phân hủy các gốc
lipid và các chuỗi peroxid giúp bảo vệ các acid béo trong tế bào [45].
Không giống như beta-carotene, astaxanthin có thể dễ dàng vượt qua các hàng
rào võng mạc giúp chống quá trình oxy hóa, bảo vệ các tế bào thần kinh của
võng mạc cũng như hệ thần kinh trug ương, tủy sống khi bị gây tổn thương bởi
các gốc tự do [46] . Trong nguyên bào sợi ở thận chuột, astaxanthin giúp chống
lại quá trình oxy hóa do tia cực tím UVA gây ra hiệu quả hơn nhiều so với lutein
và beta-carotene [47]. Do đó, khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin mang lại
những lợi ích đầy hứa hẹn.