khảo sát một số đặc tính azospirillum sp. và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH




NGUYỄN THANH ĐÀO







KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH AZOSPIRILLUM SP.
VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG TRÊN VÀI DẠNG
CÂY TRỒNG NGẮN NGÀY








LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH – 2005


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến :
TS. Trònh Thò Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này.
Quý thầy cô Khoa Sinh nói chung và Bộ môn Vi sinh nói riêng của Trường
Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu
trong suốt khóa học và giúp đỡ nhiệt tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận
văn.
Quý thầy cô và các bạn trong Bộ môn Vi sinh, Sinh lý Thực vật, Sinh hóa,
Sinh học Phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên và Viện Khoa học Kỹ thuật
Nông nghiệp miền Nam đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực nghiệm.
Gia đình ông Võ Văn Giúp và ông Nguyễn Ngọc Yên đã hỗ trợ và giúp đỡ
tôi thực hiện các thí nghiệm thực tiễn.
Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh An Giang, Ban Giám hiệu Trường Trung học
Phổ thông Nguyễn Khuyến đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa
học.
Và thật hạnh phúc biết bao khi trong cuộc sống, trong lao động và học tập
luôn có sự chăm sóc, động viên, giúp đỡ của người thân, bạn bè. Tôi luôn biết ơn
vì những tấm chân tình đó và gửi lời cảm ơn chân thành đến những người thân
yêu của tôi – gia đình và bạn bè trong suốt thời gian qua.

Nguyễn Thanh Đào


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viếr tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Danh mục các đồ thò
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Vai trò của đạm và tầm quan trọng của quá trình cố đònh đạm 4
1.1.1 Đạm trong cây và vai trò của đạm đối với đời sống của cây
trồng 4
1.1.1.1 Tỷ lệ đạm và các dạng đạm trong cây 4
1.1.1.2 Vai trò của đạm đối với đời sống cây trồng 4
1.1.2 Tầm quan trọng của quá trình cố đònh đạm 7
1.1.2.1 Cố đònh đạm hóa học 7
1.1.2.2 Cố đònh đạm sinh học 9
1.2 Vi sinh vật cố đònh đạm và cơ chế của quá trình cố đònh đạm sinh
học 10
1.2.1 Các loài vi sinh vật cố đònh đạm 10
1.2.1.1 Vi khuẩn cố đònh nitơ sống tự do 10
1.2.1.2 Vi khuẩn cố đònh nitơ cộng sinh 10
1.2.1.3 Vi khuẩn cố đònh nitơ sống trên rễ hay trong rễ một
số loài cỏ nhiệt đới 11

1.2.1.4 Đạm do vi sinh vật cố đònh được 11
1.2.2 Cơ chế của quá trình cố đònh đạm 11
1.3 Vi khuẩn Azospirillum 14
1.3.1 Đặc tính hình thái 14
1.3.2 Sự phân bố của Azospirillum trong đất 17
1.3.3
Ảnh hưởng của Azospirillum đến sự sinh trưởng và phát triển
của thực vật 18
1.3.3.1
Ảnh hưởng nhiễm khuẩn đến sự phát triển bộ rễ 18
1.3.3.2
Sự hình thành khuẩn lạc Azospirillum ở rễ 19
1.3.4
Các cơ chế hoạt động của Azospirillum giúp tăng trưởng thực
vật 21
1.3.4.1
Sự cố đònh nitơ không khí của Azospirillum 21
1.3.4.2 Ảnh hưởng của hormon ngoại tiết Azospirillum lên
sinh trưởng và phát triển ở thực vật 22
1.3.4.3 Azospirillum kích thích sự hấp thu các chất dinh dưỡng
khoáng của thực vật 23
1.3.4.4
Quan hệ giữa nitratreductase của cây chủ và vi khuẩn
Azospirillum 24
1.4 Phân vi sinh vật 24
1.4.1 Đònh nghóa 24
1.4.2 Phân loại 25
1.4.3 Mục tiêu của việc sử dụng phân vi sinh vật 26
1.4.4 Quy trình chung để sản xuất phân vi sinh vật từ vi khuẩn 26
1.4.5 Phân vi sinh từ Azospirillum 30

Chương 2 - VẬT LIỆU-NỘI DUNG-PHƯƠNG PHÁP 34
2.1 Vật liệu 35


2.1.1 Thiết bò và dụng cụ 35
2.1.2 Hóa chất và môi trường 35
2.1.3 Vật liệu thí nghiệm 39
2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 40
2.2.1 Phân lập 40
2.2.2 Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố đònh đạm và
sinh IAA tốt 41
2.2.3 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng
được chọn 43
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn 46
2.2.4.1 Chuẩn bò 46
2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn trên
cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây
lúa ngoài ruộng 47
2.2.5 Tạo chế phẩm “phân vi sinh” 52
2.2.5.1 Chuẩn bò 52
2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên
cây lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày 54
Chương 3 – KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 57
3.1 Phân lập 58
3.2 Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố đònh đạm và sinh
IAA tốt 61
3.2.1 Khả năng cố đònh đạm của 5 chủng A
1
, A
2

, A
3
, A
4
và A
5
61
3.2.2
Khả năng sinh IAA của 5 chủng A
1
, A
2
, A
3
, A
4
và A
5
62
3.3 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng A
2
và
A
3
65


3.3.1 Đặc điểm hình thái 65
3.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 66
3.4 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn 69

3.4.1 Thời gian thích hợp nhiễm dòch nuôi cấy vi khuẩn đạt hiệu
quả 69
3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn trên cây mạ
trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngoài ruộng 71
3.4.2.1. Cây mạ trong ống nghiệm 71
3.4.2.2. Cây lúa trong chậu 76
3.4.2.3. Cây lúa ngoài ruộng 78
3.5 Tạo chế phẩm “phân vi sinh” 88
3.5.1 Chuẩn bò 88
3.5.1.1. Dòch nuôi cấy vi khuẩn 88
3.5.1.2. Chế phẩm “phân vi sinh” 95
3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên cây
lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày 97
3.5.2.1 Lúa trong chậu 97
3.5.2.2 Cải thìa 99
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 106
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc của 5 chủng trên môi trường NFb rắn có
bổ sung congo đỏ sau 5 ngày nuôi cấy 60
Bảng 3.2. Hàm lượng đạm của 5 chủng trong môi trường Dobereiner dòch
thể 61
Bảng 3.3. Hàm lượng IAA trong dòch nuôi cấy (μg/ ml) theo thời gian 64
Bảng 3.4. Chiều cao trung bình cây lúa (mm) sau 7 ngày theo thời gian
ngâm hạt 70
Bảng 3.5. Giá trò trung bình các lượng giá cây mạ sau 7 ngày cấy trong

ống nghiệm của chủng A
2
73
Bảng 3.6. Giá trò trung bình các lượng giá cây mạ sau 7 ngày cấy trong
ống nghiệm của chủng A
3
74
Bảng 3.7. Giá trò trung bình các lượng giá cây lúa trong chậu 77
Bảng 3.8. Chiều cao trung bình cây lúa ngoài ruộng (cm) của chủng A
2
80

Bảng 3.9. Chiều cao trung bình cây lúa ngoài ruộng (cm) của chủng A
3.
81
Bảng 3.10. Số nhánh trung bình của cây lúa ngoài ruộng (nhánh/cây) vào
thời điểm 45 ngày của chủng A
2
và A
3
83
Bảng 3.11
. Ảnh hưởng A
2
trên chỉ tiêu cây lúa vào thời điểm thu hoạch 85
Bảng 3.12. Ảnh hưởng A
3
trên chỉ tiêu cây lúa vào thời điểm thu hoạch 86
Bảng 3.13. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A
2

theo thời gian 88
Bảng 3.14. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A
3
theo thời gian 89
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3
dựa
vào giá trò OD
610nm
91


Bảng 3.16. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3
dựa vào
giá trò OD
610nm
93
Bảng 3.17. Mật độ tế bào A
2
và A
3
trong 1

gram chế phẩm theo thời
gian với sự thay đổi độ ẩm 95

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của NH
3
lên sự gia tăng số lượng tế bào 96
Bảng 3.19. Sự biến đổi mật độ tế bào A
2
và A
3
theo thời gian 96
Bảng 3.20. Giá trò trung bình các lượng giá cây lúa trong chậu 98
Bảng 3.21. Số lá trung bình của cây cải thìa (lá/cây) 100
Bảng 3.22. Chiều cao trung bình của cây cải thìa (cm/cây) 102
Bảng 3.23. Giá trò trung bình các lượng giá cây cải thìa vào thời điểm thu
hoạch 104
















DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 3.1. Phân lập Azospirillum từ đất vùng rễ lúa 58
Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc của các chủng sau 5 ngày nuôi cấy trên
môi trường NFb rắn có bổ sung congo đỏ 59
Hình 3.3. Đònh tính IAA của các chủng thông qua thuốc thử Salkowski 62
Hình 3.4. Phản ứng màu IAA với thuốc thử Salkowski của các chủng
nuôi cấy 5 ngày 65
Hình 3.5. Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dòch thể - NFb
của chủng A
2
và

A
3
67
Hình 3.6. Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dòch thể
Andrade của chủng A
2
và

A
3
68
Hình 3.7. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn (cây mạ 7 ngày tuổi trên môi
trường MS) 72
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3

dựa
vào chỉ thò màu bromothymol blue 92
Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3
dựa vào chỉ
thò màu bromothymol blue 94









DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Trang
Đồ thò 3.1. Đường tương quan tuyến tính giữa hàm lượng IAA chuẩn và
OD
530nm
63
Đồ thò 3.2. Hàm lượng IAA trong dòch nuôi cấy (μg/ml) theo thời gian 64
Đồ thò 3.3. Hiệu quả của thời gian ngâm hạt mầm thông qua chiều cao
cây (mm) sau 7 ngày trồng lúa trong ống nghiệm 71
Đồ thò 3.4. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn trên chiều cao cây lúa ngoài
ruộng (cm/cây) của chủng A
2
và A

3
……………………………… 79
Đồ thò 3.5. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn đến khả năng phân nhánh của
cây lúa ngoài ruộng (nhánh/cây) vào thời điểm 45 ngày của
chủng A
2
và A
3………
82
Đồ thò 3.6. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A
2
theo thời gian 89
Đồ thò 3.7. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A
3
theo thời gian 90
Đồ thò 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3
dựa
vào giá trò OD
610nm
91
Đồ thò 3.9. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A
2
và A
3
dựa vào
giá trò OD
610nm

………………………………………………93
Đồ thò 3.10. Ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” đến số lượng lá cải
thìa 101
Đồ thò 3.11. Ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên chiều cao cây
cải thìa (cm/cây) 103




DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ
VIẾT TẮT

A
2
: Chủng Azospirillum 2
A
3
: Chủng Azospirillum 3
CFU (colony forming unit) : Mật độ tế bào
CP : Chế phẩm
CV% (Coefficient of Variation) : hệ số đo lường chính xác của thí nghiệm
ĐC : Đối chứng
IAA : Indole-3-acetic acid
LSD (Least significant difference test) trắc nghiệm phân hạng các lô thí nghiệm
MT1 : Môi trường vô đạm NFb
MT2 : Môi trường vô đạm NFb rắn có bổ sung congo đỏ
MT3 : Môi trường Dobereiner và cộng sự
MT4 : Môi trường Andrade

MT5 : Môi trường nuôi cấy thử khả năng khử nitrate
MT6 : Môi trường MS
MS : Murashige & Skoog
N : Đạm
NFb : nitrogen-fixing broth
OD (Optical Density) : Mật độ quang
PL : Phân loại a, b, c, … trong xử lý thống kê
TN : Thí nghiệm

1

MỞ ĐẦU

Đồng Bằng Sông Cửu Long là nơi cung cấp gạo lớn nhất nước, góp phần
xuất khẩu gạo ra thế giới. Thế nhưng hàng năm lũ lụt kéo về đã gây thiệt hại về
người cũng như mùa màng. Nhằm chăm lo đời sống cho người dân vùng lũ đồng
thời vẫn đáp ứng đủ gạo cho nhu cầu tiêu dùng và xuất khẩu, chính quyền khu
vực chỉ đạo bao đê một số vùng ngập lũ. An Giang cũng không thuộc ngoại lệ.
Từ đó, đất không còn độ màu mỡ do phù sa mang lại. Chính vì vậy, để đáp ứng
nhu cầu dinh dưỡng cho cây trồng, đất phải thường xuyên được bón phân.
Việc sử dụng phân bón hóa học liên tục làm cho đất bò bạc màu và chua,
vai trò của vi sinh vật đất giảm, chất lượng nông sản kém thậm chí gây ô nhiễm
môi trường. Trong khi đó, phân vi sinh vật là loại sản phẩm chứa một hoặc nhiều
chủng vi sinh vật sống, có ích đã được tuyển chọn mà hoạt động của chúng tạo
nên trong đất trồng các chất dinh dưỡng hay các chất có hoạt tính kích thích sinh
trưởng, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất lượng nông sản, tăng độ màu
mỡ cho đất. Các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, vật nuôi,
môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. Hiện nay người ta đã nghiên cứu sản
xuất phân vi sinh vật bao gồm phân bón vi sinh vật cố đònh đạm, phân bón vi sinh
phân giải các hợp chất phospho khó tan, phân bón vi sinh vật phân giải cellulose,

phân bón vi sinh vật quang hợp.
Các loại phân đạm vi sinh hiện nay đều được sản xuất từ các loại vi khuẩn
cố đònh đạm như Azotobacter và Azospirillum. Các vi khuẩn này phân bố nhiều
trong đất và quanh vùng rễ. Ngoài khả năng cố đònh đạm chúng có thể tiết ra một
số hoạt chất có tác dụng kích thích sinh trưởng ở thực vật đưa vào môi trường đất.
Đáng chú ý là khả năng cố đònh đạm của Azospirillum được Beijerinck phát hiện

2

từ năm 1922, nhưng vai trò của nó trong hoạt động cố đònh đạm vùng rễ cây hòa
thảo chỉ được biết đến vào những năm đầu của thập niên 70 nhờ việc tìm ra nơi
cư trú của chúng.
Khi đánh giá những dữ liệu thu thập khắp thế giới hơn 30 năm qua ở đồng
ruộng thử nghiệm nhiễm Azospirillum trên các đối tượng cây trồng khác nhau,
người ta kết luận rằng các vi khuẩn này có khả năng làm tăng năng suất trên
những loại đất trồng khác nhau và ở những vùng khí hậu khác nhau.
Ở Việt Nam, trong thời gian qua, người ta đã đề cập tới sự tồn tại, phân
lập, xác đònh đặc điểm của Azospirillum trong đất và rễ lúa khu vực ngoại thành
Hà Nội và nghiên cứu khả năng cố đònh nitơ của một số chủng Azospirillum sp.
trong điều kiện hội sinh với mầm lúa [8].
Được sự động viên và giúp đỡ nhiệt tình của TS. Trònh Thò Hồng, tôi đã có
cơ hội thực hiện đề tài này với lòng mong mỏi đóng góp phần nào cho công cuộc
xây dựng quê hương An Giang giàu đẹp. Nội dung của đề tài bao gồm :
- Phân lập và tuyển chọn Azospirillum có khả năng cố đònh đạm và sinh
IAA tốt.
- Tìm hiểu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa.
- Bước đầu tạo chế phẩm “phân vi sinh” bằng cách cố đònh trên chất mang
là than bùn.
- Sơ bộ ứng dụng chế phẩâm “phân vi sinh” trên cây trồng ngắn ngày (lúa
nước và cải thìa) trong phòng thí nghiệm và ngoài thực tiễn với quy mô nhỏ.

3




CHÖÔNG 1


TOÅNG QUAN

TAØI LIEÄU






4

1.1. Vai trò của đạm và tầm quan trọng của quá trình cố đònh đạm
1.1.1. Đạm trong cây và vai trò của đạm đối với đời sống của cây trồng
1.1.1.1. Tỷ lệ đạm và các dạng đạm trong cây
Tỷ lệ đạm trong cây biểu hiện từ 1 - 6% trọng lượng chất khô. Tỷ lệ đạm
trong bộ phận non cao hơn bộ phận già. Trong thời kỳ hình thành quả, đạm tập

trung chủ yếu ở các cơ quan sinh sản.
Trong cây, đạm chủ yếu có trong thành phần protein và chiếm 15 - 17%.
Trong điều kiện bình thường, người ta tính được hàm lượng protein thô trong cây
thông qua đònh lượng nitơ tổng số.
Đạm trong cây còn tồn tại dưới dạng hợp chất đạm hữu cơ hòa tan (các
amin và amid). Một lượng rất nhỏ đạm và trong điều kiện dinh dưỡng đạm không
bình thường, đạm tồn tại trong cây dưới dạng NH
4
+
và NO
3
-
.
Tỷ lệ giữa đạm hữu cơ hòa tan và đạm vô cơ thể hiện tình trạng tổng hợp
hữu cơ trong cây. Thường khi thiếu glucid hoặc thiếu các điều kiện cần thiết cho
việc khử nitrate, cho quá trình amin hóa thì tỷ lệ trên giảm xuống.
Đạm vô cơ trong cây tồn tại chủ yếu dưới dạng NO
3
-
vì sự tích trữ lượng
NH
4
+
nhiều làm cho cây dễ bò ngộ độc.
1.1.1.2. Vai trò của đạm đối với đời sống cây trồng
Đạm là yếu tố quan trọng hàng đầu đối với cơ thể sống vì nó là thành
phần cơ bản của protein - chất cơ bản biểu hiện sự sống.
Đạm nằm trong nhiều hợp chất cơ bản cần thiết cho sự phát triển của cây
như diệp lục và các enzyme, các base A,T,G,X - thành phần cơ bản của các
nucleic acid, trong các DNA và RNA của tế bào - nơi cư trú của các thông tin di

truyền, đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp protein.
Do vậy đạm là yếu tố cơ bản của quá trình đồng hóa carbon, kích thích sự
phát triển của bộ rễ và kích thích việc hút các yếu tố dinh dưỡng khác.

5

Cây trồng được bón đủ đạm biểu hiện ở lá có màu xanh thẫm, sinh trưởng
khỏe mạnh, chồi búp phát triển nhanh, năng suất cao.
Bón thừa đạm, lá có màu xanh tối, thân mềm, tỷ lệ nước cao nên dễ bò sâu
bệnh. Tình hình lốp đổ của các giống lúa thân dài cũng là hậu quả của việc bón
thừa đạm. Ngoài ra, bón thừa đạm sinh trưởng của cây bò kéo dài, chín muộn,
chất lượng nông sản kém, nitrate bò kéo xuống làm ô nhiễm mạch nước ngầm.
Cây thiếu đạm, lá có màu vàng, sinh trưởng và phát triển kém, còi cọc có
khi bò thui chột thậm chí rút ngắn chu kỳ sống, năng suất thấp.
y Tác dụng của đạm đối với cây lúa [10]
Đạm là yếu tố dinh dưỡng chủ yếu, nó có ảnh hưởng nhiều đến thu hoạch
vì chỉ khi đủ đạm các chất khác mới phát huy tác dụng. Đạm kết hợp với các chất
đường, bột ở lá tạo ra amino acid rồi từ đó hình thành nên các loại protein cần
thiết cho đời sống cây lúa. Đạm là một thành phần cấu tạo của chất diệp lục thúc
đẩy quá trình quang hợp. Nếu thiếu đạm, trong cây sẽ có nhiều đạm tự do, cây
lúa sẽ có sức sống yếu dễ bò sâu bệnh phá hại.
Cây lúa hút đạm ở hai dạng : amôn (NH
4
+
) và nitrate (NO
3
-
). Trong ruộng
ngập nước lúa hút amôn nhiều hơn, còn trong ruộng cạn nước lúa hút nitrate
nhiều hơn.

Đạm amôn hút vào rễ có thể kết hợp ngay với các loại acid hữu cơ ở đó
tạo thành các dạng amino acid và sẽ được chuyển lên lá để tổng hợp protein.
Các giống lúa Indica thân cao hút đạm ít hơn so với giống lúa Japonica
thân thấp.
Yêu cầu về đạm của cây lúa thay đổi trong quá trình sinh trưởng của nó.
Lúa cần đạm nhiều trong thời kỳ đẻ nhánh, nhất là khi đẻ rộ và giảm dần khi lúa
đứng cái thôi đẻ nhánh. Lúa cũng cần nhiều đạm trong thời kỳ phân hóa đòng và
phát triển đòng thành bông, thời kỳ hình thành các bộ phận sinh sản. Các giống

6

lúa thân cao thường có hai đỉnh cao về nhu cầu đạm đó là lúc đẻ nhánh và lúc
sắp trổ bông. Còn các giống lúa thân thấp thì thường có nhu cầu về đạm tăng đều
suốt thời kỳ đẻ nhánh đến lúc trổ bông, chỉ sau khi trổ nhu cầu về đạm mới giảm
xuống.
Vì vậy trong kỹ thuật bón phân cần cung cấp đủ đạm cho lúa đẻ nhánh và
làm đòng, nhưng nếu thừa đạm cũng không tốt vì lúa thừa đạm dễ bò lốp đổ, giảm
sức chống chòu với sâu bệnh và các điều kiện không thuận lợi khác. Kết hợp bón
phân hữu cơ với phân đạm sẽ dễ thỏa mãn các yêu cầu về đạm. Bón phân đạm
viên một lần sau khi cấy cũng sẽ cung cấp, điều hòa đạm cho cây trong suốt thời
gian sinh trưởng mà không dẫn đến hiện tượng thừa đạm tạm thời rồi lại thiếu
đạm như hiện tượng bón vãi nhiều lần.
y Tác dụng của đạm đối với rau [25]
Cây trồng hấp thu một lượng lớn đạm từ đất thông qua hệ thống rễ. Đối
với dưỡng chất NH
4
+
, khi cây trồng hấp thu vượt trội NO
3
-

, dẫn đến sự phóng
thích H
+
từ rễ và sẽ tạo acid hóa môi trường bên ngoài. Ngược lại, đối với dưỡng
chất NO
3
-
, khi cây trồng hút NH
4
+
trội hơn sẽ làm cho môi trường kiềm hơn.
Nhiều nghiên cứu cho thấy cây trồng hấp thu NH
4
+
nhanh hơn NO
3
-
trong
giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, trong khi cây hấp thu NO
3
-
nhiều hơn NH
4
+
khi
cây ở giai đoạn sinh trưởng sinh thực. Khi NH
3
tự do tích lũy trong cây với lượng
lớn sẽ gây ngộ độc cho cây nên khi được hút vào thường bò đồng hóa ngay bằng
nhiều cách.

Trước hết NH
3
được đồng hóa bằng con đường amin hóa trực tiếp các
cetoacid để tạo thành các amino acid như : amin hóa α-cetoglutaric để tạo thành
glutamic acid, amin hóa oxaloacetic acid để tạo thành aspatic acid, amoniac cũng
có thể kết hợp ngay với pyruvic acid để tạo thành alanin … Các loại amino acid
tham gia vào các quá trình đồng hóa sơ cấp amoniac như α-cetoglutaric acid,

7

Mo Cu,Fe,Mn Cu,Fe,Mn Mg,Mn
pyruvic acid, fumaric acid … đều là những acid được tạo thành trong quá trình
chuyển hóa glucid.
Khác với amôn, nitrate không gây ngộ độc cho cây nên có thể tích tụ một
lượng khá lớn trong cây, chính sự tích tụ nitrate này nên khi sử dụng rau làm thức
ăn sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Dinh dưỡng nitrate cũng làm
tăng hàm lượng protein và các amid. Vì vậy người ta cho rằng nitrate vào trong
cây chòu sự chuyển hóa rất mạnh. Quá trình chuyển hóa nitrate ở trong cây trước
hết dẫn đến sự tạo thành NH
3
. Thực chất quá trình chuyển hóa này là một quá
trình khử :
HNO
3
HNO
2
(HNO)
2
HN
2

OH NH
3

Nitrate có thể bò khử hoàn toàn ở rễ thành dạng amôn, là dạng đạm tham
gia trực tiếp trong quá trình tạo amino acid. Nếu bón nhiều đạm mà thiếu lân hay
không bón lân, kali cân đối, đặc biệt là thiếu nguyên tố vi lượng Mo thì quá trình
khử nitrate sẽ bò chậm lại và dẫn đến tình trạng tồn dư nitrate trong cây. Lượng
nitrate tồn dư trong cây còn do bón cho cây cận ngày thu hoạch làm hàm lượng
nitrate không đủ thời gian để khử thành amôn, tạo thành amino acid và protid có
ích cho cây.
1.1.2. Tầm quan trọng của quá trình cố đònh đạm
1.1.2.1. Cố đònh đạm hóa học
Trong không khí, phân tử nitơ thường tồn tại ở trạng thái liên kết hai
nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ nối ba bền vững (N≡N). Năng lượng cần cho sự
phá vỡ liên kết này khoảng 225kcal nên cây trồng (cũng như các loài động vật)
không có khả năng đồng hóa nguồn nitơ này. Vì vậy việc nghiên cứu phá vỡ các
liên kết này để tạo ra dạng nitơ dễ hấp thu đối với cây xanh là hết sức cần thiết
[3].

8

Năm 1905 lần đầu tiên con người tìm được phương pháp phá vỡ và liên kết
với
CaC
2
để tạo ra một dạng phân đạm hóa học đầu tiên là CaCN
2
.
Muốn thực hiện phản ứng người ta duy trì một nhiệt độ cao từ 1000 –
1100

o
C :

Ít lâu sau các nhà khoa học Nauy lại tìm được cách liên kết N
2
với O
2
để
tạo thành một dạng phân đạm hóa học khác (nitrate) phản ứng này cũng đòi hỏi
nhiệt độ cao đến 4000
o
C :


Năm 1908 nhà khoa học Đức Ga-be đã tìm được phương pháp liên kết N
2

với H
2
để tạo thành NH
3
. Phản ứng này không những đòi hỏi nhiệt độ cao
(600
o
C), áp suất cao (1000atm) mà còn đòi hỏi có mặt một số chất xúc tác đắt
tiền (Os, Ru).
Từ đó đến nay ngành công nghiệp hóa học đã có những tiến bộ rất lớn.
Người ta sản xuất rộng rãi nhiều loại phân đạm hóa học khác nhau với sản lượng
ngày càng tăng. Nếu như năm 1913 toàn thế giới sản xuất được 0,51 triệu tấn
phân đạm thì đến năm 1964 con số này đã tăng lên 29 lần (14,5 triệu tấn) trong

khi đó phân kali chỉ tăng 8,4 lần, phân phospho tăng có 5,8 lần [3].
Dù sao thì phân đạm hóa học trên toàn thế giới cũng bù đắp được một
phần nhỏ số lượng đạm trong đất bò lấy đi hàng năm. Có một thống kê cho biết
hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 -
110 triệu tấn đạm, con số này vượt đến bảy lần so với phân đạm hóa học sản
xuất ra ở các nước gộp lại hàng năm. Phân đạm có tác dụng rất lớn đến mùa
màng, ví dụ : bón 1kg đạm thu hoạch thêm được khoảng 10 -20kg thóc, 15 - 20kg
ngô hoặc 15 - 40kg cỏ khô (G.Colarva P.Greenland, 1963).
1000
o
C
CaC
2
+ N
2
CaCN
2
+ C
H
2
O

N
2
+ O
2

4000
o
C

2NO
O
2
NO
2
O
2
HNO
3

9

Khó khăn chủ yếu làm cản trở việc mở rộng nhanh chóng hơn nữa việc
sản xuất phân đạm hóa học là vì điều kiện để phá vỡ các liên kết trong phân tử
nitơ không phải là đơn giản (cần nhiệt độ cao, áp suất cao, chất xúc tác đắt tiền).
1.1.2.2. Cố đònh đạm sinh học
Tương tự như quá trình cố đònh đạm hóa học, quá trình cố đònh đạm sinh
học cũng là quá trình phá vỡ các liên kết trong phân tử nitơ không khí để tạo
thành các dạng nitơ dễ hấp thu cho cây trồng. Nhưng ở quá trình này việc phá vỡ
các liên kết của phân tử nitơ xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường.
Chính vì vậy mà vai trò của quá trình cố đònh đạm sinh học có ý nghóa hết sức lớn
lao đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền công nghiệp phân đạm
chưa phát triển.
Quá trình cố đònh đạm sinh học là một giai đoạn của chu trình tuần hoàn
nitơ trong tự nhiên, được thực hiện bởi các nhóm vi sinh vật như là: vi khuẩn, tảo
lam, xạ khuẩn.
Các loại vi sinh vật này có thể sống độc lập như những vi sinh vật sống tự
do hoặc có thể quan hệ ở những mức độ khác nhau với vi khuẩn, thực vật và
động vật khác. Mối quan hệ này thay đổi từ quan hệ hội sinh kết hợp đến quan
hệ cộng sinh bắt buộc. Trong đó thực vật chủ là vi sinh vật quan hệ trên mức độ

phân tử và chức năng sinh lý chung. Trung tâm của cả hệ thống này là vi khuẩn
Procaryote cố đònh đạm chứa phức hợp enzyme nitrogenase (đảm nhiệm sự
chuyển hóa N
2
thành NH
3
) . Chỉ vài loài Procaryote xác đònh mới có khả năng cố
đònh đạm. Thực vật (ngoại trừ các loại tảo và các thực vật cộng sinh) không có
khả năng cố đònh đạm mà chỉ có những loài Procaryote sống chung với thực vật
mới có khả năng cố đònh đạm.
Quá trình cố đònh đạm sinh học hàng năm cung cấp cho đất từ 100 - 180
triệu tấn đạm và đóng góp 65% lượng nitơ được sử dụng trong nông nghiệp

10

(Burris và Robert, 1993). Phần lớn lượng nitơ này được tạo ra qua quá trình cố
đònh đạm cộng sinh, không cộng sinh và cố đònh đạm kết hợp.
1.2. Vi sinh vật cố đònh đạm và cơ chế của quá trình cố đònh đạm sinh học
1.2.1. Các loài vi sinh vật cố đònh đạm [3]
1.2.1.1. Vi khuẩn cố đònh nitơ sống tự do
Từ năm 1893 Winogradski đã phân lập được vi khuẩn kò khí cố đònh nitơ
Clostridium pasteurianum và tiếp đó năm 1901 Beijerink phân lập được 2 loài vi
khuẩn hiếu khí cố đònh nitơ là Azotobacter chroococum và A. agilis.
Cho đến nay người ta đã phát hiện được rất nhiều loài vi khuẩn cố đònh
nitơ sống tự do. Chúng có thể là hiếu khí (Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia,
Derxia), kò khí không bắt buộc (Aerobacter, Klebsiella, Bacillus polymyxa, B.
macerrans), kò khí bắt buộc (nhiều loài Clostridium, Desulphovibri,
Dsulphotomaculum ).
Một số loài vi khuẩn lam (như Aulosia fertilissima, Tolipothrix tenuis,
Nostoc sp.) cũng có khả năng cố đònh nitơ.

1.2.1.2. Vi khuẩn cố đònh nitơ cộng sinh
Năm 1866, H.Hellriegel và Hwilfath phát hiện ra khả năng cố đònh nitơ
của các cây họ Đậu. Năm 1888, M.W.Beijerinck phân lập được những vi khuẩn
nốt sần đầu tiên từ rễ các cây họ Đậu. Năm 1889, B.Frank đặt tên cho vi khuẩn
nốt sần là Rhizobium.
Trong nhiều năm qua người ta đã phát hiện thấy một số loài vi sinh vật cố
đònh nitơ có khả năng cộng sinh với rất nhiều loại cây không thuộc họ đậu. Các
cây này thuộc về các chi thực vật khác nhau. Các vi sinh vật này thuộc các nhóm
như xạ khuẩn (Frankia), vi khuẩn, vi khuẩn lam.



11

1.2.1.3. Vi khuẩn cố đònh nitơ sống trên rễ hay trong rễ một số loài cỏ
nhiệt đới
Gần đây, nhiều nghiên cứu cho biết có một số vi khuẩn cố đònh nitơ sống
trên bộ rễ hay trong vùng rễ (Rhizosphere) của một số loài cỏ nhiệt đới (Parker,
1957 ; Moore, 1963 ; Dobereiner, 1966 ; Rinaudo, 1970 ; Yoshida, 1971 ;
Dobereiner, 1975, 1980 ; Bohlool, 1981 ; Hill, 1981 ) [4]. Ngoài khả năng cố
đònh đạm, chúng có thể tiết ra môi trường đất một số hoạt chất có tác dụng kích
thích sinh trưởng ở thực vật [8].
Các loài vi khuẩn được phát hiện gồm có: Azotobacter, Beijerinckia,
Dexia, và một số vi khuẩn hình xoắn là Azospirillum [4].
1.2.1.4. Đạm do vi sinh vật cố đònh được
Đối với vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ đậu lượng đạm cố đònh được
phụ thuộc vào loài, vào cây chủ, biến động trong khoảng 30 - 50 kg/ha/năm (đối
với cây Phaseolus Vulgaris) [4]. Tổng số đạm hàng năm do vi khuẩn cộng sinh
cây bộ đậu cố đònh được vào khoảng 50 - 600kg/ha/năm [11].
Đối với một số loài vi khuẩn cộng sinh với cây không thuộc bộ đậu như

Azospirillum cộng sinh với cỏ Pangola cố đònh hàng năm từ 5 - 30kg đạm/ha. Các
vi sinh vật sống tự do trong đất (Azotobacter, Clostridium, Bluegreenalgae ) cũng
cung cấp hàng năm cho mỗi hecta đất khoảng 5 - 20kg đạm. Gặp điều kiện thuận
lợi tảo lam có thể cung cấp mỗi hecta đến 50kg đạm [19].
1.2.2. Cơ chế của quá trình cố đònh đạm
Cơ chế của quá trình cố đònh đạm được Winogradski và về sau được nhiều
tác giả nghiên cứu, nhưng cho tới nay vẫn còn có chỗ chưa giải quyết được hoàn
toàn. Cái khó nhất lúc đầu gặp phải là phân tử nitơ có sức “trơ” rất cao, lực “ì”
của nó là do hai nguyên tử nitơ (N≡N) được liên kết với nhau bằng 3 mối liên kết
bền vững. Trong công nghiệp phân đạm muốn phá vỡ các liên kết này để tạo ra

12

các dạng đạm cho cây hấp thu được cần phải dùng nhiệt độ cao, áp suất cao.
Theo tính toán, muốn tổng hợp ra một tấn NH
3
từ N
2
và H
2
cần năng lượng tương
đương với năng lượng sinh ra do đốt cháy 5 tấn than đá. Trong khi đó, ở tế bào vi
sinh vật, quá trình phá các lực “ì” diễn ra ở nhiệt độ và áp suất bình thường, đó là
vì tế bào vi sinh vật có hệ enzyme nitrogenase. Ở vi khuẩn đã biết khá rõ bản đồ
gen nif [3], [22]. Chính hệ enzyme này đã xúc tác làm cho nitơ của khí quyển
liên kết với hydro sinh ra trong quá trình trao đổi chất nội bào. Đây là một ưu
điểm của sản xuất phân vi sinh.
Lúc đầu khi người ta chưa biết rằng chỉ ở điều kiện áp suất khí nitơ rất cao
(10
51

atm) thì N
2
mới có khả năng kết hợp với nước, nên lưu hành giả thuyết “liên
kết thuỷ phân” để giải thích sự biến đổi N
2
thành hydroxylamin hoặc nitrite
amon:


Cơ chế của quá trình cố đònh đạm được tóm tắt bằng sơ đồ 1.1 :










N
2
+ 2H
2
O NH
4
NO
2
N
2

+ 3H
2
O NH
2
OH + NH(OH)
2

NH=NH
+2H
H
2
N – NH
2
+2H
2NH
3

-H
2
O
+H
2
O
+H
2
O
2H
N≡N
½ O
2

4H
NO
2
(HNO)
2
2NH
2
OH
Con đường khử Con đường Oxy hóa

13

Giả thuyết khác cho rằng trong tế bào Azotobacter đã thực hiện một phản
ứng, mà N
2
được khử bằng hydro hoạt tính để biến thành NH
3
. Giả thuyết này
dựa trên cơ sở khi nuôi cấy vi sinh vật cố đònh đạm người ta đã phát hiện NH
3

trong môi trường.
Có hai con đường chủ yếu (con đường oxy hoá và con đường khử) biến
nitơ phân tử thành NH
3
(Kretovich V.P.1964; 1971).
Trong thực nghiệm, người ta phát hiện những hợp chất loại khử trong môi
trường nuôi cấy và trong dòch chiết vô bào của vi khuẩn cố đònh đạm như phát
hiện NH
3

đánh dấu khi dùng N
18
và N
15
, thấy hydroxylamin (NH
2
OH) ở
Azotobacter vinelandii, nhờ phương pháp đồng vò phóng xạ, phát hiện thấy
hydrazin và hai hợp chất này có thể kết hợp với các ketoaxit để thành các amino
acid (Bem den A.A, 1966). Trong môi trường có vi sinh vật cố đònh đạm thế oxy
hoá khử ở mức thấp, hiệu suất năng lượng của quá trình cố đònh đạm ở điều kiện
kỵ khí cao hơn ở điều kiện hiếu khí. Tất cả những điều đó cho phép chúng ta kết
luận rằng con đường khử N
2
thành NH
3
ở vi sinh vật cố đònh đạm có nhiều cơ sở
vững chắc hơn.
Quá trình cố đònh nitơ phân tử là một quá trình khử liên tục N
2
, sản phẩm
đầu tiên có thể thu được là NH
3
nếu công nhận trong quá trình này có sự vận
chuyển 2 điện tử thì có thể dự đoán sản phẩm của quá trình này là diimit và
hydrazin.



Nitrogenase là tổ hợp nhiều enzyme chứa sắt không liên kết với các nhóm

-hem và nhóm -SH, nó không chỉ khử nitơ phân tử mà còn khử acetylen
N
2

N≡N
ATP
2[H]
HN=NH
diimit
ATP
22[H]
ATP
2[H]
H
2
N
–
NH
2
hydrazin
2NH
3
NH
3

14

(HC≡CH). Khả năng khử acetylen thấy ở nốt sần cây họ Đậu và ở những vi sinh
vật cố đònh nitơ kò khí sống tự do trong đất.
Dòch vô bào Clostridium có khả năng cố đònh nitơ phân tử, lại có khả năng

khử acetylen khi có ATP, feredoxin và ion Mg
+
. Điều đó, một mặt mở ra triển
vọng mới nghiên cứu quá trình cố đònh nitơ phân tử và các thành phần của nó,
mặt khác cho phép phát hiện những sản phẩm trung gian của các khâu cố đònh
nitơ.
1.3. Vi khuẩn Azospirillum
1.3.1. Đặc tính hình thái
Azospirillum được phân lập lần đầu tiên vào năm 1925 từ đất pha cát
nghèo nitơ ở Hà Lan. Sau đó vi khuẩn này cũng được phân lập từ nhiều nguồn
khác nhau : đất và rễ của nhiều loài cỏ nhiệt đới [17].
Hội nghò quốc tế lần thứ nhất về cố đònh nitơ năm 1974 tại Phần lan
Dobereiner và Day là những tác giả đầu tiên đã thông báo về sự hội sinh giữa
Azospirillum với rễ các cây Hòa thảo và những cây khác trồng ở vùng nhiệt đới.
Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này, trong đó có
nhiều thông tin về khả năng tăng năng suất các cây Hòa thảo do nhiễm
Azospirillum [1].
Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn dò dưỡng carbon, vi hiếu khí, tế bào hình
que hơi cong, kích thước tế bào (0,9 -1,2μm), tế bào di động nhờ tiên mao đơn ở
một đầu, trong tế bào có những chuỗi hạt poly-β-hydroxybutyrate (PHB) [23].
Trong môi trường dòch thể tế bào có một tiên mao đơn ở cực còn khi nuôi
một vài loài trên môi trường rắn ở 30
o
C có thêm vài tiên mao mọc ra bên cạnh
tiên mao đơn [23]. Các khuẩn lạc của Azospirillum tạo màu hồng nhạt hay màu
hồng đậm trên môi trường thạch khoai tây [11], [23]. Nhiệt độ tối ưu các loài
Azospirillum vào khoảng 34 - 37
o
C. Một vài chủng phát triển tốt ở pH 7, một vài