SO SÁNH hàm LƯỢNG TERPENOIDS và HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM in vitro của các CAO CHIẾT vỏ THÂN QUÝT GAI (atalantia buxifolia)

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SO SÁNH HÀM LƯỢNG TERPENOIDS
VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM in vitro
CỦA CÁC CAO CHIẾT VỎ THÂN
QUÝT GAI (Atalantia buxifolia)
Người hướng dẫn: TS. TRƯƠNG THỊ DIỆU HIỀN
Người thực hiện: TẠ NHẬT THÚY ANH
Lớp

: 14060302

Niên khóa: 2014 – 2019


2

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019


1

LỜI CAM ĐOAN
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự
hướng dẫn khoa học của TS. Trương Thị Diệu Hiền. Các nội dung nghiên cứu, kết

quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước
đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh
giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu
tham khảo.
Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số
liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn
gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về
nội dung luận văn của mình. Trường Đại học Tôn Đức Thắng không liên quan đến
những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện đề tài
(nếu có).
TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm
Tác giả
(ký tên và ghi rõ họ tên)


2

LỜI CẢM ƠN
Người xưa có câu: “Một cây làm chẳng nên non, ba cây chụm lại nên hòn núi
cao”, thật vậy, phía sau sự thành công đều cần có sự hợp tác và hỗ trợ từ nhiều phía
và mỗi một sự giúp đỡ ấy đều mang một ý nghĩa hết sức to lớn. Trong suốt quá trình
thực hiện khóa luận, em đã may mắn được rất nhiều anh, chị, bạn bè và các quí thầy
cô quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình.
Song, sự dìu dắt, chỉ bảo của người Thầy chính là chìa khóa quan trọng giúp
em định hướng và hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất. Với lòng kính trọng và
biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô Trương Thị Diệu Hiền đã luôn tận
tình chỉ dạy, truyền đạt cho em không chỉ những kiến thức bổ ích mà còn là những
kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện giúp em học hỏi, khắc phục và hoàn thiện đề tài
khóa luận này.

Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Quí thầy cô tại trường Đại học Tôn Đức
Thắng đã truyền đạt cho em những vốn kiến thức quý giá trong suốt thời gian học
tập và rèn luyện tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đặc biệt là các bạn tại phòng
nghiên cứu chuyên đề đã luôn hỗ trợ, động viên và quan tâm em trong thời gian
qua.
Do thời gian thực hiện khóa luận và vốn kiến thức còn hạn chế, vì thế, những
thiếu sót trong bài là không thể tránh khỏi. Em kính mong nhận được những nhận
xét, góp ý của quý thầy cô để bài khóa luận được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa em xin trân trọng cảm ơn!


3

TÓM TẮT
Từ xưa đến nay, các loài cây thuộc họ Citrus đã trở thành một phần quen
thuộc trong những bài thuốc Đông y, được lưu truyền rộng rãi trong dân gian. Trong
đó, cây Quýt gai (A. buxifolia) chính là một trong những loài tiêu biểu được ứng
dụng điều trị các bệnh viêm, hen, suyễn...Nhằm góp phần tăng cao dữ liệu khoa học
và giá trị dược liệu của cây Quýt gai, đề tài đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của
dung môi, nhiệt độ tách chiết, thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng terpenoids trong
các phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai cũng như khả năng kháng viêm in vitro của
các cao chiết này.
Đề tài đã khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết (hexane, ethyl acetate
(EtOAc), acetone (Me2CO), ethanol (EtOH),

hexane:ethyl acetate (1:1),

hexane:acetone (1:1), hexane:ethanol (1:1), nhiệt độ ngâm mẫu (6, 26, 46, 66 và 86
o

C), thời gian ngâm mẫu (0, 12, 24, 36 và 48 giờ), đến hàm lượng terpenoids ở các

phân lớp cao chiết PE, HE và cao tổng. Kết quả cho thấy, terpenoids được phát hiện
trong tất cả các phân đoạn dịch chiết của vỏ thân Quýt gai ở những điều kiện tách
chiết khác nhau bằng phương pháp chỉ thị màu đặc trưng. Hàm lượng terpenoids
trong phân lớp PE và HE thấp nhất khi chiết lỏng lỏng với dịch chiết hexane, lần
lượt là 0,185e ± 0,016 % và 0,324e ± 0,016 %. Hàm lượng terpenoids trong phân lớp
HE cao nhất khi chiết với dịch hexane:acetone (0,731 a ± 0,042%). Ở nhiệt độ tách
chiết 66 oC, hàm lượng terpenoids thu được cao nhất ở cả hai phân lớp cao chiết, lần
lượt là 1,102a ± 0,042 % ở phân lớp PE và 0,843a ± 0,042 % ở phân lớp HE. Với
thời gian ngâm 24 giờ cho kết quả lượng terpenoids cao nhất với 1,102a ± 0,042% ở
phân lớp PE và 0,843a ± 0,042 % ở phân lớp HE. Thành phần hóa học trong các
phân đoạn cao chiết vỏ thân Quýt gai (A. buxifolia) được xác định bằng kỹ thuật sắc
ký lớp mỏng (TLC) và HPLC với ursolic acid (Sigma, Singapore) làm chất chuẩn.
Kết quả cho thấy, giá trị R f của các spot ở các cao chiết tương ứng với R f của chất
chuẩn ursolic acid (Rf = 0,31).


4

Với thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro, thông qua các chỉ
tiêu: khả năng ức chế biên tính albumin, ức chế phân giải protein, ổn định màng tế
bào, kháng enzyme lipoxxygenase. Kết quả cho thấy phân lớp cao chiết HE và cao
tổng có khả năng kháng viêm tốt. Cụ thể, khả năng ức chế biến tính albumin ở nồng
độ 200 μg/mL cho thấy, cao tổng và cao HE cho kết quả ức chế biến tính albumin
cao nhất và không khác biệt về mặt thống kê, lần lượt là 69,114 a ± 1,989 % và
67,251a ± 1,976 %. Tương tự, đối với khả năng ức chế phân giải protein, phần trăm
ức chế phân giải protein của cao tổng đạt 65,272 a ± 0,396 %, chiếm ưu thế so với
phân lớp PE (57,932b ± 0,951), nhưng không khác biệt có nghĩa về mặt thống kê với

phân đoạn HE (64,167a ± 0,527 %). Với khả năng ức chế tan huyết, cao tổng và cao
HE cho kết quả ức chế lần lượt là 55,922a ± 0,329 % và 53,860a ± 0,917 %. Kết quả
khảo sát khả năng ổn định màng tế bào cũng cho thấy, ở nồng độ 200 μg/mL, phần
trăm ức chế tan huyết của cao chiết tổng đạt 55,922 a ± 0,329 %, cao hơn so với
phân lớp PE (48,556b ± 1,446), nhưng không khác biệt với phân đoạn HE (53,860a ±
0,917 %). Cao chiết tổng cho kết quả ức chế hoạt động enzyme lipoxygenase đạt
60,661a ± 0,537 %, cao hơn so với phân đoạn HE (59,265b ± 0,646 %). Tuy nhiên,
giá trị IC50 cho thấy, phân lớp HE có hoạt tính ức chế tối ưu với giá trị IC 50 thu được
thấp nhất (106,53 ± 9,224 μg/mL).
Tóm lại, đề tài đã chỉ ra được điều kiện tách chiết tối ưu để thu nhận
terpenoids từ vỏ thân Quýt gai: hỗn hợp dung môi hexane:acetone (1:1) ở 66 oC
trong 24 giờ ngâm mẫu. Cùng với khả năng kháng viêm in vitro của các phân đoạn
cao chiết, sẽ góp phần tăng thêm luận cứ khoa học cho các nghiên cứu về sau trên
cây Quýt gai (A. buxifolia).


5

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.....................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN..........................................................................................................ii
TÓM TẮT............................................................................................................... iii
MỤC LỤC................................................................................................................ v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.............................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH...........................................................................viii
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................ix
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU...........................................................................................1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................3
2.1. Giới thiệu về cây Quýt gai (Atalantia buxifolia).............................................3
2.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng để thu nhận hợp chất tự nhiên.....................6

2.3. Triệu chứng viêm và phương pháp điều trị....................................................8
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..................................................12
3.1. Địa điểm và thời gian thực hiện.....................................................................12
3.2. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................12
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất.........................................................................12
3.4. Phương pháp tiến hành..................................................................................12
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..........................................................19
4.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến sự hiện diện của nhóm
terpenoids trong dịch chiết vỏ thân Quýt gai (A. buxifolia)................................19


6

4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hàm lượng terpenoids
trong các phân lớp dịch chiết vỏ thân Quýt gai (A. buxifolia)............................21
4.3. Sắc ký lớp mỏng (TLC) và HPLC.................................................................25
4.4. Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết vỏ thân cây Quýt
gai (A. buxifolia)....................................................................................................28
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................36
5.1. Kết luận...........................................................................................................36
5.2. Kiến nghị.........................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................38
PHỤ LỤC...............................................................................................................42


7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Abs
CHCl3

cs
DMSO
EtOAc
EtOH
HPLC

: Khả năng hấp thu bức xạ (Absorbance)
: Chloroform
: cộng sự
: Dimethyl sulfoxide
: Ethyl acetate
: Ethanol
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
IC50
: Nồng độ ức chế 50% đối tượng khảo sát (Half maximal
inhibitory concentration)
Me2CO : Acetone
MeOH
: Nước cất
NMR
: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)
NSAIDs : Thuốc chống viêm không steroid (Nonsteroidal antiinflammatory drugs)
OD
: Optical density
RBCs
: Tế bào hồng cầu (Red blood cells)
Rf
: Hệ số lưu giữ (Retention factor)
SD

: Độ lệch chuẩn (Standard deviation)
TLC
: Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)
tR
: Thời gian lưu (retention time)


8

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 2.1: Cây quýt gai..............................................................................................3
Hình 3.1: Quy trình thu nhận cao chiết tổng vỏ thân Quýt gai (A. buxifolia)..........13
Hình 3.2: Quy trình thu nhận cao terpenoids vỏ thân Quýt gai (A. buxifolia).........14
Hình 4.1: Sắc ký lớp mỏng của các phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai (A.
buxifolia) soi ở bước sóng 254 nm (a) và hiện màu bằng chất phun (b)..................26
Hình 4.2: Phương trình đường chuẩn ursolic acid...................................................27
Hình 4.3: Khả năng ức chế sự biến tính albumin của các phân lớp cao chiết vỏ thân
Quýt gai (A. buxifolia).............................................................................................29
Hình 4.4: Khả năng ức chế sự phân giải protein của các phân lớp cao chiết vỏ thân
Quýt gai (A. buxifolia).............................................................................................31
Hình 4.5: Khả năng ổn định màng tế bào của các phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt
gai (A. buxifolia)......................................................................................................33
Hình 4.6: Khả năng kháng enzyme lipxygenase của các phân lớp cao chiết vỏ thân
Quýt gai (A. buxifolia).............................................................................................35


9

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1: Quy trình xác định hàm lượng terpenoids tổng trong cao chiết vỏ thân
Quýt gai (A. buxifolia).............................................................................................16
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của dung môi đến sự hiện diện terpenoids trong các cao chiết
vỏ thân Quýt gai (A. buxifolia)................................................................................19
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hiện diện terpenoids trong các cao chiết
vỏ thân Quýt gai (A. buxifolia)................................................................................20
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến sự hiện diện terpenoids trong các cao
chiết vỏ thân Quýt gai (A. buxifolia)........................................................................21
Bảng 4.4: Hàm lượng terpenoids trong các phân lớp cao chiết thu được từ dịch
chiết tổng của các loại dung môi khác nhau............................................................22
Bảng 4.5: Hàm lượng terpenoids trong các phân lớp cao chiết thu được từ dịch
chiết tổng ở nhiệt độ khác nhau...............................................................................23
Bảng 4.6: Hàm lượng terpenoids trong các phân lớp cao chiết thu được từ dịch
chiết tổng ở thời gian ngâm khác nhau....................................................................24
Bảng 4.7: Khả năng ức chế sự biến tính albumin của các phân lớp cao chiết vỏ thân
Quýt gai (A. buxifolia).............................................................................................28
Bảng 4.8: Khả năng ức chế sự phân giải protein của các phân lớp cao chiết vỏ thân
Quýt gai (A. buxifolia).............................................................................................30
Bảng 4.9: Khả năng ổn định màng tế bào của các phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt
gai (A. buxifolia)......................................................................................................32
Bảng 4.10: Khả năng kháng enzyme lipxygenase của các phân lớp cao chiết vỏ thân
Quýt gai (A. buxifolia).............................................................................................34


1

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
Dược liệu thiên nhiên từ lâu đã trở thành một phần không thể thiếu trong nền
Y học cổ truyền Việt Nam. Đặc biệt, với sự phong phú và đa dạng của các giống

dược liệu quý ở khắp các miền đất nước, nền Y học cổ truyền ngày nay đã phát triển
vượt bậc và được sử dụng như một liệu pháp điều trị thay thế các thuốc Tây y.
Trong đó, các loài cây thuộc họ cam thảo luôn đóng vai trò tiên phong trong hỗ trợ
điều trị các bệnh như: cảm cúm, nhức đầu, tiêu khát, chướng bụng, táo bón…[1].
Ngoài những loài nổi bật như cam, chanh, bưởi…thì phải kể đến cây Quýt gai (hay
còn gọi là Cây gai xanh, Atalantia buxifolia) được ứng dụng trong điều trị hen
suyễn, giảm ho, tiêu đờm, viêm khớp…Tuy nhiên, tác dụng chữa bệnh của loài cây
này chưa được hiểu rõ và chỉ được lưu truyền trong dân gian. Hiện nay, trên thế
giới, đã có một vài nghiên cứu phát hiện các nhóm hợp chất tồn tại trong cây Quýt
gai như phenolics, alkaloids, terpenoids…[3, 4] cũng như chứng minh được khả
năng kháng khuẩn, côn trùng…của loài này [5-7]. Qua đó, nhận thấy được cây Quýt
gai (A. buxifolia) là một dược liệu quý với thành phần hóa học đa dạng và hoạt tính
sinh học phong phú, nhưng vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi ở Việt Nam. Từ đó,
việc nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất tự nhiên và tác dụng dược lý ở cây Quýt
gai là rất quan trọng và cấp thiết với nền y học Việt Nam cũng như thế giới.
Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “So sánh hàm lượng terpenoids và
hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết vỏ thân quýt gai (Atalantia
buxifolia)” với mục đích làm sáng tỏ thành phần hóa học, đặc biệt là nhóm
terpenoids và khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro, góp phần cung cấp dữ liệu
khoa học và tăng cao giá trị sử dụng của loài cây này.
Khóa luận được thực hiện với các mục đích chính:
1. Khảo sát sự hiện diện của nhóm terpenoids đối với các dung môi chiết
(hexane, ethyl acetate (EtOAc), acetone (Me 2CO), ethanol (EtOH),
hexane:ethyl acetate (1:1), hexane:acetone (1:1), hexane:ethanol (1:1), nhiệt
độ ngâm mẫu (6, 26, 46, 66 và 86 oC), thời gian ngâm mẫu (0, 12, 24, 36 và
48 giờ).


2

2. So sánh hàm lượng terpenoids trong các phân đoạn cao chiết vỏ thân Quýt
gai ở những điều kiện tách chiết khác nhau.
3. So sánh hoạt tính kháng viêm in vitro của các phân đoạn cao chiết vỏ thân
Quýt gai.


3

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây Quýt gai (Atalantia buxifolia)
2.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái [1]
Giới (regnum)

: Plantae

Ngành (phylum)

: Magnoliophyta

Lớp (class)

: Magnoliopsida

Bộ (ordo)

: Sapindales

Họ (familia)

: Rutaceae

Chi (genus)

: Atalantia

Loài (species)

: Atalantia buxifolia

Hình 0.1: Cây quýt gai
(Nguồn:www.onlineplantguide.com)

Cây.Quýt gai (Atalantia buxifolia) là loài.cây nhỏ, cao chừng 1 m, thân mang
rất nhiều.cành, nhẵn, cành non có khi có lông mịn, gai dài tới 4.cm ở nách lá. Lá
nguyên, dai, hình.bầu.dục đầu.tròn, thuôn tròn ở phía cuống. Lá có nhiều điểm tinh
dầu khi để dưới ánh sáng. Hoa trắng, gần.như không.cuống mọc đơn độc hay tụ 2
hoặc.3 ở nách lá. Quả khi chín có.màu đen, hình cầu, đường kính 10 – 12 mm, chứa
2 hạt.
Quýt gai thường mọc.hoang khắp.nơi ở miền Bắc và miền.Trung nước ta,
thường gặp ở những bờ rào, lẫn với cây tre hay cây bụi khác.
2.1.2. Thành phần hóa thực vật
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng thành phần hóa.thực vật trong A. buxifolia bao
gồm các nhóm hợp.chất như alkaloids, phenolics, terpenoids có nhiều hoạt tính
sinh.học nổi bật và quan trọng [8-10].
2.1.2.1. Terpenoids
Terpenoids là nhóm hợp chất phổ.biến và đa dạng nhất trong các nhóm hợp
chất thứ.cấp với hơn 30,000 hợp chất đã được tìm thấy bao.gồm cả steroids.
Terpenoids được tạo thành bởi một.chuỗi các đơn.vị isoprene (C5) thu nhận từ
isopentenyl (3-methyl-3-en-1-yl) pyrophosphate. Tùy theo số.lượng các đơn vị
isoprene mà terpenoids được chia thành các.nhóm sau: monoterpenes (C10),

4

sesquiterpenes (C15), diterpenes (C20), sesterpenes (C25), triterpenes (C30),
tetraterpenes (C40) và polyterpenes [10]. Hai nhóm hợp.chất triterpenes và
sesquiterpenes hầu.hết được tìm.thấy nhiều trong.vỏ rễ và thân cây Quýt gai (A.
buxifolia). Năm 1986, mười một.hợp chất hóa học được phân.tách từ lá Quýt gai:
fridelin, lupeol, α-amyrin đã được định.danh bằng nhiều phương.pháp quang phổ
(UV, NMR, MS) bởi Wu.và cs [5]. Hai tetranorterpenoids từ.vỏ rễ A. buxifolia đã
được Wu và cs [11] phát hiện vào năm 2001 là 7-isovaleroylcycloseverinolide và 7isovaleroylcycloepiatalantin, sử dụng phương.pháp X-ray và phổ cộng.hưởng từ hạt
nhân (Nuclear Magnetic Resonance – NMR). Năm 2012, Yang và cs [12] đã
xác.định được một tetranortriterpenoid mới là 6-deacetyl-severinolide, cùng.với sáu
tetranortriterpenoid đã.biết khác là severinolide, acetyl-isoepiatalantin…từ dịch
chiết ethanol của rễ Quýt gai lấy từ Hainan bằng.phương pháp quang phổ 1D và 2D
NMR. Đến năm 2015, Guo và cs [13] đã phân.tách được một triterpene mới
có.khung apotirucallane từ dịch chiết ethanol của rễ Quýt gai (A. buxifolia). Cấu
trúc hoàn.thiện của triterpene.này được xác.định bằng phương pháp quang.phổ 1D,
2D.NMR kết.hợp với phân tích HR-ESI-MS. Bên cạnh đó, một số sesquiterpene
cũng.đã.được phân tách từ.vỏ.rễ Quýt.gai (A. buxifolia) như: α-santalene, αsantalen-11-one, dihydro-α-santalen-12-one, 12,13- epoxy-α-santalene… [5, 6].
2.1.2.2. Phenolics
Thành phần hóa.học của nhóm phenolics trong cây Quýt.gai (A. buxifolia)
chưa được nghiên cứu rộng rãi. Năm 2010, Bacher và cs [9] đã phát hiện
các.coumarin (seselin, isomeranzin, suberosin epoxide, bergaptene, imperatorine,
suberosine, bergamottin) trong dịch.chiết ethanol từ lá Quýt gai. Đồng thời,
bốn.coumarin mới (umbelliferone, 8-geranyl-7-hydroxycoumarin, auraptene and 7geranyl-6-methoxycoumarin) từ lá và.vỏ rễ Quýt.gai cũng đã được Chen và cs [6]
xác.định vào năm 2010.
2.1.2.3. Alkaloids
Nhiều nghiên cứu đã chỉ.ra rằng alkaloids hiện.diện nhiều trong rễ và vỏ thân
cây.Quýt gai (A. buxifolia). Guo-Ming [7] đã phân.tách thành.công hai acridone

5

alkaloids mới là atalafoline và atalafoline-B từ rễ của A. buxifolia. Cấu trúc của
tám.acridone alkaloid mới từ vỏ rễ A. buxifolia bằng các kĩ.thuật quang phổ khác
nhau [3]. Đến năm 2013, Yang và cs [4] đã phân tách thành.công thêm hai acridone
alkaloid.mới là 3-methoxy-1,4,5-trihydroxy-10-methylacridone và 2,3-dimethoxy1,4,5-trihydroxy-10-methylacridone.
2.1.3. Ứng dụng của cây Quýt gai trong y học cổ truyền
Dược tính của cây.Quýt gai (A. buxifolia) được lưu.truyền trong dân.gian và
chưa được nghiên.cứu nhiều ở Việt Nam. Tuy nhiên, trên thế.giới, đã có nhiều
nghiên cứu về.tác dụng dược học của loại.cây này như: khả.năng trị ho, diệt.côn
trùng, hoạt tính kháng.khuẩn, kháng viêm,…
Trị ho
Năm 2013, Yonggin và cs đã nghiên.cứu hiệu.quả giảm ho và tiêu.đờm của
các dịch chiết khác.nhau từ cây Quýt gai (A. buxifolia). Kết quả cho.thấy, dịch chiết
ethanol, chloroform và n-butanol của A. buxifolia có khả.năng giảm ho tốt nhất
so.với các dịch.chiết ethyl acetate, nước và petroleum ether [14].
Kháng khuẩn
Yang và cs [4] đã nghiên.cứu hoạt.tính kháng khuẩn của.hai acridone
alkaloid (3-methoxy-1,4,5-trihydroxy-10-methylacridone và 2,3-dimethoxy-1,4,5
trihydroxy-10-methylacridone) từ dịch.chiết cành Quýt gai (A. buxifolia) trên
Staphylococcus aureus. Bên cạnh đó, vào năm 2012, Ragasa và cs [15] đã đánh.giá
khả năng kháng khuẩn của triterpene từ.dịch chiết lá A. retusa trên Staphylococcus
aureus và B. subtilis. Các triterpene có hoạt.tính kháng khuẩn.tốt nhất trên B.
subtilis với đường.kính vòng.kháng là 55 mm. Mặt khác, hiệu.quả kháng của
các.nhóm chất này với S. aureus không.cao, đường kính.vòng kháng giảm,.khoảng
14 mm.
Diệt côn.trùng
Wu và cs (1997) [5] đã.nghiên cứu hiệu.quả diệt côn.trùng của hai hợp.chất

tetranorterpenoid (severinolide và cycloepiatalantin) từ dịch chiết rễ A. buxifolia
trên Plutella xylostella. Trong đó, kết.quả nghiên cứu cho.thấy severinolide có khả


6

năng ức chế sự phát triển của P. xylostella tốt hơn so với cycloepiatalantin, với
giá.trị ED50 tại nồng độ 0,0625 %.
Kháng.viêm
Raga và cs [16] đã dùng dịch.chiết từ lá cây A. retusa để ức.chế hoạt động
của

λ-carrageenan trên.chuột. Sau 1 giờ, mức độ.sưng tấy của chân.chuột đã

giảm hẳn với liều.dùng của dịch mẫu là 1,43 mg/Kg BW. Khả.năng giảm sưng của
dịch.chiết từ.lá không khác biệt khi.dùng Diclofenac với liều lượng 1,08 mg/Kg
BW. Từ đó, kết quả chứng.minh rằng, các hợp.chất trong.cây thuộc chi Atalantia có
khả năng kháng.viêm rất tốt.
2.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng để thu nhận hợp chất tự nhiên
Có rất nhiều phương.pháp để tách chiết các.hợp chất hữu cơ. Trong đó, các
kỹ thuật được sử dụng phổ biến là chiết rắn – lỏng và.chiết lỏng – lỏng. Phương
pháp chiết lỏng – lỏng được sử.dụng rộng.rãi bởi tính đơn.giản, thời gian ngắn và
hiệu.quả cao trong phân tách các nhóm chất [17].
2.2.1. Phương pháp chiết lỏng – lỏng [2]
Phương pháp này còn.được gọi là sự chiết bằng dung.môi (solvent
extraction). Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được dùng để phân.chia cao alcol thô
ban.đầu hoặc dung dịch ban.đầu thành những phân đoạn có.tính phân.cực khác
nhau.
Nguyên tắc cơ.bản của kỹ thuật chiết lỏng – lỏng: sự phân.bố của một chất
tan vào hai.pha lỏng và hai pha lỏng này không.hòa tan vào nhau. Hằng số phân.bố

của một chất tan cho.biết khả năng hòa.tan của chất này đối với hai pha lỏng tại
thời.điểm cân bằng, được.biểu diễn bằng hằng.số phân bố K.
Ca: Nồng độ của chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng
Cb: Nồng độ của chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng
Mục đích của phương.pháp này là để thu nhận một.cách chọn.lọc một nhóm
chất hoặc.các chất mục tiêu từ.dịch mẫu ban đầu. Ngoài ra, chiết lỏng – lỏng còn


7

loại bỏ sơ.bộ các tạp bẩn hoặc các nhóm.chất có hằng số phân bố.nhỏ hơn nhóm
chất mục tiêu.
2.2.2. Ảnh hưởng của phương pháp chiết lỏng – lỏng đến hiệu suất tách
chiết hợp chất tự nhiên
Hằng số phân bố của.các chất tan ít bị ảnh hưởng bởi.nhiệt độ hoặc nồng.độ
của chất tan đó có trong dung.dịch ban đầu. Tuy nhiên, hằng.số này thay đổi nhiều
tùy vào dung môi (độ phân.cực, đặc tính ái nước của.dung môi) và dung dịch-nước
(pH, lực.ion). Riêng với dung dịch nước, pH của dung.dịch có ảnh.hưởng rất quan
trọng, đặc.biệt là pH axít yếu và pH bazơ yếu [2].
Dung môi tách chiết, tỉ.lệ giữa mẫu và dung môi… là những yếu.tố quan
trọng ảnh.hưởng đến hiệu suất tách chiết các hợp.chất tự nhiên. Mỗi dung môi tách
chiết khác nhau sẽ cho hiệu.suất thu hồi, các nhóm.chất có độ phân.cực khác nhau
[18].
Vào năm 2006, Abdelouaheb.và cs [19] đã ứng dụng phương.pháp chiết
lỏng-lỏng để thu nhận alkaloids từ.ba loại thảo dược Hyoscyamus muticus, Datura
stramonium và Ruta graveolens. Hàm lượng alkaloids thu.được cao nhất (0,8g/100g
mẫu khô) khi chiết.với chloroform từ cây muticus. Năm 2014, sau khi.thu nhận
dịch chiết methanol từ.cây Alphitonia neocaledonica, Dima và cs [20] đã.phân tách
dịch mẫu này bằng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng và thu nhận hai phân lớp dịch chiết là
ethyl acetate và n-butanol. Phân lớp ethyl acetate chứa chủ yếu triterpene và

flavonoids. Mặt khác, phân lớp n-butanol chủ yếu là các chất thuộc nhóm phenolics.
Vì thế, phân lớp n-butanol có khả năng chống oxi hóa tốt hơn so với phân lớp còn
lại, với giá trị EC50 là 20 ppm. Kết quả chỉ ra rằng, mỗi loại hay hỗn hợp dung môi
có độ phân cực khác nhau sẽ có khả năng hòa tan các nhóm chất khác nhau. Liano
và cs [21] cũng đã tìm được điều kiện tách chiết phù hợp để ly trích phenolics từ
dịch thải trong sản xuất bột giấy bằng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng. Hàm lượng
phenolics khi chiết với diethyl ether đạt 3353 mg/L, cao nhất so với các dung môi
còn lại như: hexane, benzen, chloroform. Tỉ lệ (mẫu:dung môi) cho kết quả hàm
lượng phenolics vượt trội nhất là tỉ lệ 1:3. Bên cạnh đó, các phân đoạn trên cũng đã


8

được khảo sát hoạt tính chống oxi hóa. Kết quả cho thấy phân đoạn diethyl ether có
khả năng kháng oxi tốt nhất, chỉ số chống oxi hóa (antioxidant activity index-AAI)
vượt ngưỡng 4,87; tạo điều kiện cho việc nghiên cứu ứng dụng của dịch thải này
vào các sản phẩm trong đời sống.
2.3. Triệu chứng viêm và phương pháp điều trị
2.3.1. Triệu chứng viêm
Viêm là một đáp.ứng bảo vệ cơ thể của hệ miễn dịch trước sự tấn công của
một tác nhân bên ngoài (như vi sinh vật, tác.nhân vật lý hoặc hóa học) hoặc của tác
nhân bên.trong (như hoại tử do thiếu.máu cục bộ, bệnh tự miễn). Các triệu chứng
của bị.viêm như sưng, nóng, đỏ và đau, do các.mạch máu giãn nở, đưa.nhiều máu
đến nơi tổn thương. Các bạch cầu cũng theo.mạch máu xâm.nhập vào mô, tiết các
chất trung gian như histamine, prostaglandin, leukotrienes, cytokine nhằm tiêu.diệt
hoặc trung hòa các tác.nhân gây tổn thương [22].
Các giai đoạn chính diễn.ra trước và trong quá.trình gây viêm bên trong cơ
thể [23, 24]:
-

Các chất trung gian kích.thích hình thành các mạch.máu nhỏ trong mô tế
bào bị.tổn thương, nhằm cung.cấp một hàm lượng máu lớn.hơn cho

-

các.mô bị tổn thương. Do đó, khu.vực viêm sẽ nóng và đỏ hơn.
Các mao mạch giãn.nở, áp suất thẩm.thấu thay đổi, cho phép các tế.bào
miễn dịch, dịch.lỏng và protein xuyên.qua các mao mạch đến tế.bào tổn
thương nhiều hơn. Từ.đó, khu vực viêm bị.sưng tấy do tích.tụ một lượng

-

lớn các chất.
Bạch cầu trung.tính và các tế bào miễn.dịch khác không.chỉ tiêu diệt các
mô bị tổn.thương mà còn ảnh.hưởng đến các tế bào lành. Các tế bào tổn
thương do.viêm sẽ truyền tín.hiệu đến các neuron thần.kinh của não, gây
cho người bệnh cảm.giác đau nhức tại khu.vực viêm.


9

2.3.2. Phương pháp điều trị
2.3.2.1. Tây y
Hiện nay trên thị.trường, rất nhiều loại thuốc được sử dụng trong điều trị
viêm như aspirin, acetaminophen, celebrex, ... Chúng được chia thành hai nhóm
chính như sau [24]:
Non‐steroidal anti‐inflammatory drugs (NSAIDs):
Là dạng thuốc chống viêm không có steroid, thường được sử.dụng để điều trị
các triệu.chứng viêm nhẹ hoặc trung bình. Một số loại thuốc nổi.bật như:
acetaminophen, aspirin, ibuprofen, naproxen, diclofenac… Chúng có khả năng

ức.chế enzyme cyclooxygenase (COX) - enzyme quan.trọng trong con đường
sinh.tổng hợp prostaglandin. Prostaglandins (PG), prostacyclins, thromboxanes là
những.chất trung gian gây.nên sự viêm mô tế.bào và kích thích truyền tín.hiệu đến
cơ quan thần.kinh, làm tăng cảm giác đau nhức tại khu.vực viêm của bệnh nhân.
Nhóm thuốc này ngăn chặn quá.trình phân giải arachidonic.acid thành các chất
trung.gian (prostaglandins, prostacyclin và thromboxanes) bởi enzyme COX. Từ đó,
góp phần chống.viêm, giảm đau và giảm.sốt mạnh. Tuy nhiên, chúng cũng
đồng.thời ức chế sự cân.bằng nội môi trong dạ.dày và gây tổn thương các cơ.quan
khác như thận, tim… Vì vậy, sử.dụng NSAIDs có thể gây ra các triệu chứng dị.ứng
nghiêm trọng khác như: loét dạ.dày, suy hô hấp...[25].
Corticosteroids:
Là một nhóm trong hormone.steroids, có khả năng.ngăn chặn sự hình thành
các tác.nhân gây viêm mô tế bào. Một số loại thuốc nổi bật như: prednisone,
celestone, medrol…Corticosteroids giúp bổ sung hormone steroids trong cơ thể,
góp phần tăng cường hệ.miễn dịch. Bên cạnh đó, nhóm thuốc này cũng có tác dụng
điều hòa hoạt.động của hệ miễn dịch, góp.phần ngăn cản sự phân.giải phospholipid,
giảm tích.tụ arachidonic acid và các chất trung.gian khác (prostaglandins,
prostacyclin, thromboxanes và leukotrienes…). Tuy nhiên, các.tác dụng phụ khi sử
dụng chúng cũng.đang được các nhà nghiên cứu quan.tâm hàng đầu. Sử dụng loại


10

thuốc này trong thời.gian dài có thể gây béo phì, trầm cảm, cao.huyết áp, rối
loạn.lượng đường trong máu…[26].
Nguyên nhân gây viêm do ảnh.hưởng của một số yếu.tố như albumin; sự
phân giải các.chất bởi các enzyme (protease, lipoxydase…) và đặc.biệt là sự có.mặt
của tế bào hồng cầu tại mô bị tổn thương [27, 28].
2.3.2.2. Y học cổ truyền
Dược liệu tự.nhiên là những loại thực vật thông dụng hằng.ngày nhưng lại có

các hoạt.tính sinh học như diệt vi.khuẩn, vi nấm, bên cạnh đó những loại dược liệu
này còn.giúp hỗ trợ điều trị bệnh và được gọi là “kháng.sinh tự nhiên” [29]. Hiện
nay, thay vì sử.dụng các chất hóa.học để điều trị bệnh thì các nhà khoa học trên
thế.giới lại đang hướng đến nghiên.cứu sử dụng những thảo.dược từ thiên.nhiên.
Những thực phẩm, thảo.dược có tính kháng sinh tự.nhiên mạnh như:
Cây vuốt quỷ (Harpagophytum):
Một số nghiên cứu khẳng định vai trò của chất chiết xuất từ cây vuốt quỷ
như glycosides, có tác dụng ức chế và giảm tiết một số cytokine gây viêm, rõ nhất
là TNFα; IL-6; IL-1β; PG-E2 [30]. Đặc biệt là vai trò ức chế enzyme COX-2 của
chiết xuất cây vuốt qủy đã được rất nhiều nghiên cứu chứng minh hiệu quả [31].
Năm 2007, Aberham và cs [32] đã đánh giá trên lâm sàng và chứng minh hiệu quả
giảm đau và chống viêm đặc hiệu của vuốt quỷ với bệnh viêm khớp dạng thấp,
viêm khớp do bệnh Gout và thoái hóa khớp.
Tỏi (Allium sativum):
Trong suốt lịch.sử các nước phương Đông, tỏi được sử.dụng như một vị
thuốc trị bệnh thần.kì từ thiên nhiên. Chất allicin giúp tỏi có.mùi vị nồng đặc trưng
và có tác.dụng chữa bệnh, tăng.cường hệ miễn dịch và phòng.chống ung thư [33].
Năm 2007, Shukla.và cs [34] đã chứng.minh tỏi có tác dụng ức.chế sự phát triển
của khối u và kích thích chu trình apoptosis, góp phần hỗ trợ điều trị ung thư Ngoài
ra, tỏi còn có khả năng ức.chế kích hoạt NFκB - nhân tố truyền tín hiệu quan.trọng
nhằm khởi đầu quá trình viêm [35]. Các nghiên cứu cho thấy tỏi có thể giúp hạ
huyết.áp và giảm mức cholesterol. Bên cạnh đó, tỏi có hoạt.tính chống lao,


11

diệt.khuẩn, nấm như: Pseudomonos aeruginosa, Candida albicans, Streptococcus
spp, Salmonella spp; diệt virus viêm gan, cúm B...[36].
Trà xanh (Camellia sinensis) [37]:
Các hợp chất polyphenol chủ.yếu trong trà xanh như: catechin,

epigallocatechin-3-gallate (EGCG)…đã được chứng.minh có khả năng chống.lão
hóa, diệt.khuẩn và đặc.biệt có tác dụng kháng viêm rất tốt. Catechin cũng có tác
dụng ức chế kích hoạt NFκB và các chất trung gian gây nên sự viêm, giúp.giảm
đau, sốt nhanh chóng [38].
Quế (Cinnamomum) [39]:
Quế giúp kháng nấm và kháng khuẩn, đặc.tính chữa bệnh của.quế được tìm
thấy trong.lớp vỏ của chúng. Quế giúp chống.lại các bệnh viêm nhiễm trong cơ thể.
Hợp chất chính.trong quế có khả.năng chống viêm là cinnamaldehyde, có hiệu.quả
cao trong điều trị các triệu chứng viêm trên da [40].
Từ những công.dụng của các thảo dược tự nhiên, các công trình nghiên cứu
về hoạt.tính sinh học của các thành.phần hợp chất trong các loại dược.liệu đã được
hình thành và ngày.càng phát triển. Bên cạnh đó, nhiều nhà.khoa học đã nghiên cứu
và chỉ ra các hoạt.tính kháng viêm của các.loại dược liệu tự.nhiên trong phạm vi in
vitro và in vivo như: Sangita và cs [27] đã đánh giá khả năng ức chế biến.tính
protein của dịch chiết từ Coffea arabica. Dịch chiết MeOH từ cây cà.phê có khả
năng ổn định protein albumin cao với.giá trị IC50 là 40 ppm so với IC50 của
diclofenac là 625 ppm. Vào năm 2011, Leelaprakash và cs [28] đã nghiên.cứu hoạt
tính kháng viêm của dịch chiết methanol từ cây Enicostemma axillare với các
chỉ.tiêu đánh giá là ức chế biến tính albumin và hoạt động của enzyme lipoxydase.
Kết quả chỉ ra rằng, dịch chiết có khả năng ức.chế mạnh sự biến tính albumin tại
nồng độ 500 ppm với phần.trăm ức chế khoảng 71%. Bên cạnh đó, khả.năng ức chế
hoạt động của enzyme.lipoxydase của dịch chiết này ở nồng độ 500 ppm (75%) tốt
hơn so với đối chứng dương sử dụng là diclofenac. Raga và cs [16] đã dùng dịch
chiết hexane từ.lá cây A. retusa để ức chế hoạt.động của λ-carrageenan trên chuột
và khẳng.định được tiềm.năng kháng viêm của các hợp.chất trong cây này.


12

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
Đề tài khóa luận bắt đầu từ ngày 15 tháng 08 năm 2018 và kết thúc vào ngày
25 tháng 12 năm 2018 tại phòng.thí nghiệm chuyên đề, khoa Khoa học Ứng dụng,
Trường đại học Tôn Đức Thắng.
3.2. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là vỏ.thân cây quýt gai (A. buxifolia) có nguồn.gốc tại
huyện Phú Lộc, Thừa Thiên Huế, Việt Nam. Mẫu cây sau khi thu nhận được đóng
gói trong các túi chuyên dụng, giữ.lạnh bằng đá khô trong suốt.quá trình vận chuyển
về phòng thí.nghiệm phân tích.
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
3.3.1. Thiết bị, dụng cụ







Tủ sấy.
Tủ lạnh.
Máy khuấy từ gia nhiệt.
Cân phân tích.
Ống nghiệm, phễu chiết, becher, pipette, micropipette, …
Máy đo UV – Vis Jasco V-730.

3.3.2. Hóa chất

Bột vỏ thân thânmẫu
Hóa chất và các dung môi sửthân
dụng:

Hexane, Acetone, Ethyl acetate, Ethanol, Methanol, Chloroform,…
Acid sulfuric, Dimethyl sulfoxide (DMSO), Petroleum ether,…
Ngâm dầm tỉ lệ (1:20, v/v)
3.4. Phương pháp tiến hành



3.4.1. Xử lý nguyên liệu

Đồng nhất mẫu
Phần thân cây Quýt gai (A. buxifolia) được loại.bỏ gai nhọn, sau đó tách

riêng lõi và thu nhận vỏ. Phần vỏ sấy khô ở nhiệt độ 55 oC – 60 oC, nghiền
Bã
thành.bột, bảo quản ở 55 oC đến khi Lọc
phân tích.
3.4.2. Quy trình thu nhận
Thu cao
dịchchiết
chiếttổng
tổngvỏ thân Quýt gai

Cô cạn

Cao tổng


13

Cao tổng

Hòa tan cao chiết bằng ethanol 70%

Dịch mẫu
Hình 0.2: Quy trình thu nhận cao chiết tổng vỏ thân Quýt gai (A. buxifolia)
Chiết với Petroleum ether
Bột vỏ thân được chiết với các dung môi khác nhau: Hexane, ethyl acetate
(EtOAc), acetone (Me2CO), ethanol (EtOH),

hexane:ethyl acetate (1:1),

hexane:acetone (1:1), hexane:ethanol (1:1) với tỷ lệ 1:20 (v/v). Mẫu được lần lượt
Thu phân
lớp trên
dưới
ngâm
dầm trong
các(PE)
khoảng thời gian: 0, 12, 24, 36 vàThu
48 phân
giờ ởlớp
nhiệt
độ khác nhau:
6 oC, 26 oC, 46 oC, 66 oC và 86 oC. Sau đó, mẫu được đồng.nhất trong 5 giờ, lọc và
o
thu dịch chiết
tổng. Dịch chiết tổng được côChiết
cạn ởvới
60Hexane:Ethyl

C và thu nhậnacetate
cao tổng.
Cô cạn
(85:15)

Cao PE
3.4.3. Quy trình thu nhận cao terpenoids vỏ thân Quýt gai

Thu phân lớp
trên (HE)

Cô cạn

Cao HE
Hình 0.3: Quy trình thu nhận cao terpenoids vỏ thân Quýt gai (A. buxifolia)


14

Phân
lớp dưới

Cao tổng được hòa tan bằng ethanol 70%. Sau đó, dịch mẫu được chiết lỏng – lỏng
với petroleum ether với tỉ lệ (1:1, v/v) trong 1 giờ, thu phân lớp petroleum phía trên
(PE), cô cạn thành cao PE. Tiếp tục chiết dịch mẫu còn lại với hỗn hợp hexane:ethyl
acetate (85:15) với tỉ lệ (1:1, v/v) trong 1 giờ, thu phân lớp phía trên (HE) , cô cạn