So sánh sự khác biệt trong trình tự gen sinh tổng hợp astaxanthin ở chủng hoang dại và chủng đột biến, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy các chủng đột biến của nấm men rhodosporidium toruloides để thu

1
1

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: So sánh sự khác biệt trong trình tự gen sinh tổng hợp
astaxanthin ở chủng hoang dại và chủng đột biến, tối ưu hóa môi
trường nuôi cấy các chủng đột biến của nấm men Rhodosporidium
toruloides để thu nhận astaxanthin


2
2

MỤC LỤC


3
3

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ATP
BBD
BP
CCD
Contig
DNA
DNA sequencing
GB
Nanowell
NCBI
NGS

Read
RSM
Scaffold
TCA

Adenosine triphosphate
Box - Behnken Design
Base pair
Central Composite Design
Đoạn trình tự dài, được tạo ra từ nhiều đoạn reads
Deoxyribonucleic acid
Đọc trình tự DNA
Giga base pair
Giếng nano
National Center for Biotechnology Information
Next Generation Sequencing
Đoạn trình tự ngắn
Response surface methodology
Tạo ra từ nhiều đoạn contigs
Trichloroacetic acid


4
4

DANH MỤC HÌNH


5
5

DANH MỤC BẢNG


6
6

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Astaxanthin là một carotenoid màu đỏ cam có trong nhiều loài vi sinh vật và
động vật biển. Là chất có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất trong nhóm các hợp
chất thuộc carotenoid, hoạt tính kháng oxy hóa của astaxanthin gấp 10 lần
zeaxanthin, lutein, canthaxanthin, β-carotene và cao gấp 100 lần so với αtocopherol. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng astaxanthin ngoài tác dụng kháng oxy
hóa còn có khả năng làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch, ung thư, tăng cường khả
năng miễn dịch của cơ thể giúp chống lại virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng. Vì
có nhiều tác dụng có lợi tới sức khỏe con người nên ngày nay nhu cầu sử dụng
astaxanthin như một nguồn dinh dưỡng bổ sung hoặc thực phẩm chức năng ngày
càng tăng cao.
Ở Việt Nam, nấm men Rhodosporidium toruloides đã được phân lập và tiến
hành nhiều nghiên cứu về sự sinh tổng hợp astaxanthin trên chủng hoang dại. Năm
2017, các tác giả đã tiến hành gây đột biến ngẫu nhiên trên chủng hoang dại bằng
các tác nhân vật lý và hóa học như benomyl, ethyl methanesulfonate, ethidium
bromide, tia UV và tia Co-60, kết quả là đã thu được các chủng Rhodosporidium
toruloides đột biến cho hàm lượng carotenoid tổng và hàm lượng astaxanthin tăng
lên đáng kể so với chủng Rhodosporidium toruloides hoang dại. Tuy nhiên, các
nghiên cứu về các chủng đột biến này chỉ dừng lại ở việc làm tăng hàm lượng
carotenoid tổng và hàm lượng astaxanthin bằng đột biến ngẫu nhiên mà chưa
nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các yếu tố về môi trường dinh dưỡng, điều kiện
nuôi cấy lên sự phát triển và sinh tổng hợp astaxanthin. Ngoài ra, khi tiến hành các
phương pháp đột biến ngẫu nhiên thì các chủng đột biến tạo thành vẫn chưa xác

định được vị trí cũng như sự biến đổi trong kiểu gene.
Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “So sánh sự khác biệt trong
trình tự gen sinh tổng hợp astaxanthin ở chủng hoang dại và chủng đột biến, tối ưu


7
7

hóa môi trường nuôi cấy các chủng đột biến của nấm men Rhodosporidium
toruloides để thu nhận astaxanthin.”
1.2 Mục tiêu đề tài
Khảo sát và so sánh được sự khác biệt trong trình tự gen ảnh hưởng đến sinh
tổng hợp astaxanthin ở chủng hoang dại và một số chủng đột biến của nấm men
Rhodosporidium toruloides. Nghiên cứu lựa chọn được môi trường nuôi cấy thích
hợp cho nấm men Rhodosporidium toruloides sinh trưởng và sinh tổng hợp
astaxanthin, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bằng phương pháp đáp ứng bề mặt để
thu nhận astaxanthin.
1.3 Ý nghĩa đề tài
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
Tìm được sự khác biệt trong trình tự gen ảnh hưởng đến sinh tổng hợp
astaxanthin ở chủng nấm men Rhodosporidium toruloides hoang dại và đột biến để
làm cơ sở khoa học giải thích cho việc hàm lượng astaxanthin đã tăng lên ở chủng
đột biến. Lựa chọn được môi trường thích hợp và xác định được các nồng độ tối ưu
của thành phần môi trường cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp astaxanthin ở chủng
nấm men Rhodosporidium toruloides đột biến.
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Astaxanthin thu nhận từ chủng nấm men Rhodosporidium toruloides đột biến
trong nghiên cứu này sẽ được sử dụng để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo trong
các lĩnh vực công nghiệp thức ăn chăn nuôi, phụ gia thực phẩm, thực phẩm chức
năng và dược phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu hiện nay của thị trường.

8
8

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về astaxanthin
2.1.1 Giới thiệu
Astaxanthin là một xanthophyll carotenoid được tìm thấy trong nhiều loài vi
sinh vật và động vật biển. Astaxanthin có màu đỏ và tan hoàn toàn trong chất béo,
chúng không có hoạt tính của tiền vitamin A trong cơ thể con người nhưng lại có
hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn nhiều hợp chất khác thuộc nhóm carotenoid [1].
Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (USFDA) đã cấp phép cho việc sử
dụng astaxanthin làm chất màu phụ gia thực phẩm trong thức ăn chăn nuôi cho
động vật và thức ăn cho cá [2]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng astaxanthin có khả
năng làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch, ung thư, tăng cường khả năng miễn dịch
của cơ thể giúp chống lại virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng. Vì có nhiều tác
dụng có lợi tới sức khỏe con người nên ngày nay nhu cầu sử dụng astaxanthin như
một nguồn dinh dưỡng bổ sung hoặc thực phẩm chức năng ngày càng tăng cao [3].
2.1.2 Nguồn thu nhận
Trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy chủ yếu tảo, nấm men, các loài cá
hồi, tôm và một số loài vi sinh vật khác (Bảng 2.1). Astaxanthin sản xuất cho
thương mại hiện nay chủ yếu thu nhận từ nấm men đỏ Phaffia rhodozyma, vi tảo lục
Haematococcus pluvialis và thông qua tổng hợp hóa học, trong đó vi tảo lục
Haematococcus pluvialis là một trong những nguồn thu nhận tốt nhất của
astaxanthin tự nhiên [4]. Tôm, cua và cá hồi có thể là nguồn cung cấp astaxanthin tự
nhiên cho con người tốt nhất thông qua chế độ ăn hợp lý, trung bình một người có
thể ăn 165 gram cá hồi mỗi ngày để có được 3,6 mg astaxanthin, đây cũng là lượng
astaxanthin cần thiết tạo ra nhiều lợi ích sức khỏe cho con người theo báo cáo của
Iwamoto và cộng sự [5].

Bảng 2.1: Một số loài vi sinh vật cung cấp astaxanthin [3]
Nguồn thu nhận

Hàm lượng astaxanthin


9
9

Haematococcus pluvialis
Chlorococcum
Chlorella zofingiensis
Neochloris wimmeri
Enteromorpha intestinalis
Ulva lactuca
Catenella repens
Agrobacterium aurantiacum
Paracoccus carotinifaciens
Xanthophyllomyces dendrorhous
Thraustochytrium sp.
Pandalus borealis
Pandalus clarkia

(% sinh khối khô)
3,8
0,2
0,001
0,6
0,02
0,01

0,02
0,01
2,2
0,5
0,2
0,12
0,015

Hình 2.1: Vi tảo lục Haematococcus pluvialis [6]
2.1.3 Đặc tính hóa sinh
Astaxanthin có công thức phân tử là C40H52O4 và khối lượng phân tử là
596,84 g/mol. Astaxanthin có cấu trúc bao gồm hai vòng β-ionon được nối với nhau
bởi một chuỗi polyene, phân tử astaxanthin có hai carbon bất đối xứng nằm ở vị trí
3, 3 'của vòng β-ionon với nhóm hydroxyl (-OH) ở cả hai đầu của phân tử (hình 2.2)
[3]. Trong các nguồn tự nhiên, astaxanthin tồn tại ở các dạng đồng phân lập thể,


10
10

đồng phân hình học và ở dạng tự do hoặc đã bị este hóa. Astaxanthin có chứa liên
kết đôi liên hợp, các nhóm hydroxyl (-OH) và keto (C=O), có tính chất ưa béo tốt
và ưa nước kém. Loại liên kết đôi liên hợp này hoạt động như một chất chống oxy
hóa mạnh bằng cách góp các electron tự do của chúng vào phản ứng với các gốc tự
do sau đó chuyển đổi chúng thành sản phẩm ổn định hơn và chấm dứt phản ứng của
chuỗi gốc tự do trong rất nhiều sinh vật sống. Astaxanthin cho thấy hoạt tính sinh
học tốt hơn các chất chống oxy hoá khác vì nó có thể liên kết với màng tế bào từ
bên trong ra bên ngoài [3].
2.1.4 Hoạt tính sinh học
Astaxanthin là một hợp chất hòa tan trong chất béo, với sự hấp thu tăng lên

khi tiêu thụ cùng với các loại dầu ăn. Astaxanthin kết hợp với dầu cá đã làm tăng tác
dụng hạ lipid máu, hạ cholesterol trong huyết tương và tăng hoạt tính kích hoạt bạch
cầu trung tính khi so sánh riêng lẻ giữa astaxanthin và dầu cá. Astaxanthin được hấp
thu vào cơ thể như chất béo và vận chuyển qua hệ thống bạch huyết vào gan, sự hấp
thụ astaxanthin phụ thuộc vào các thành phần của chế độ ăn kèm theo, chế độ ăn có
nhiều chất béo có thể làm tăng hấp thu astaxanthin trong khi chế độ ăn ít chất béo
làm giảm sự hấp thụ của nó. Astaxanthin kết hợp với axit mật sau khi ăn và được
hấp thu một phần bởi các tế bào niêm mạc ruột. Trong số các carotenoid tự nhiên,
astaxanthin được coi là một trong những carotenoid tốt nhất có thể bảo vệ tế bào,
lipid và màng lipoprotein chống lại sự hư hỏng do oxy hoá gây ra. Nhiều hoạt tính
sinh học có lợi cho sức khỏe của astaxanthin đã được phát hiện và chứng minh [3].


11
11

Hình 2.2: Cấu trúc của trans-astaxanthin và cis-astaxanthin [7]
Kháng oxy hóa: Chất kháng oxy hoá là một phân tử có thể ức chế quá trình
oxy hóa. Tác hại do oxy hóa bắt nguồn từ các gốc tự do oxy hóa (Reactive Oxygen
Species-ROS), các phân tử này có khả năng phản ứng rất cao và được tạo ra bởi sự
chuyển hóa hiếu khí thông thường trong sinh vật. Các gốc tự do oxy hóa có thể
phản ứng với protein, chất béo và DNA tạo nên một chuỗi phản ứng dây chuyền,
gây ra quá trình oxy hóa protein và lipid và làm tổn thương DNA dẫn đến các rối
loạn khác nhau, loại phân tử oxy hóa này có thể bị ức chế bởi các chất chống oxy
hoá ngoại sinh và nội sinh như carotenoid [3]. Carotenoid chứa chuỗi polyene, liên
kết đôi liên hợp và hoạt động chống oxy hoá bằng cách góp các electron vào phản
ứng với các gốc tự do để chấm dứt phản ứng dây chuyền. Astaxanthin có hoạt tính
chống oxy hoá cao hơn so với các loại carotenoid khác theo báo cáo bởi Naguib và
cộng sự, astaxanthin có chứa cấu trúc phân tử độc đáo với sự có mặt của nhóm
hydroxy và keto trên mỗi vòng ionon, chúng chịu trách nhiệm cho tính chất chống

12
12

oxy hóa cao. Hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin gấp 10 lần zeaxanthin, lutein,
canthaxanthin, β carotene và cao gấp 100 lần so với α-tocopherol [8].
Hoạt tính bảo vệ màng lipid: Astaxanthin có cấu trúc độc đáo giúp nó có thể
liên kết với cả bên trong và bên ngoài lớp lipid màng tế bào giúp bảo vệ màng tế
bào được tốt hơn. Astaxanthin ở màng tế bào ngăn chặn các gốc tự do dẫn đến ức
chế sự oxy hóa lipid. Nghiên cứu đã chỉ ra astaxanthin ức chế 80% sự peroxide hóa
xảy ra ở dạ dày chuột do ethanol gây ra [9, 10].
Kháng viêm: Astaxanthin là một chất chống oxy hóa mạnh để làm chấm dứt
sự kích thích viêm trong cơ thể động vật [3]. Astaxanthin là một phân tử có triển
vọng để điều trị viêm mắt ở mắt do các nhà nghiên cứu Nhật Bản báo cáo và
astaxanthin cũng có thể ngăn ngừa sự dày lên của da và giảm sự giảm collagen đối
với tổn thương da do UV gây ra [11, 12].
Ngăn ngừa các biến chứng của bệnh tiểu đường: Phản ứng oxy hóa xảy ra rất
cao ở bệnh nhân bệnh tiểu đường, nó được gây ra bởi sự tăng đường huyết, do rối
loạn chức năng của các tế bào β tuyến tụy và các mô hoại tử ở bệnh nhân.
Astaxanthin có thể làm giảm các stress oxy hoá gây ra bởi tăng đường huyết trong
tế bào β tuyến tụy và cũng cải thiện mức glucose và insulin huyết thanh theo hướng
tích cực. Astaxanthin có thể bảo vệ tế bào β tuyến tụy chống lại độc tính của
glucose. Trong một nghiên cứu, các stress oxy hoá ở chuột mắc bệnh tiểu đường đã
bị ức chế bởi sự kết hợp của astaxanthin với α-tocopherol. Một số nghiên cứu khác
đã chứng minh rằng astaxanthin ngăn ngừa suy thận ở bệnh nhân tiểu đường bằng
cách giảm stress oxy hóa và tổn thương tế bào thận [13, 14].
Ngăn ngừa bệnh tim mạch: Các chất oxy hóa góp phần vào sự lão hóa và gây
xơ vữa ở động mạch thông qua việc oxy hóa protein và lipid, astaxanthin có đặc
tính kháng oxy hóa mạnh nên nó có tác dụng lớn trong việc làm giảm nguy cơ xơ

vữa động mạch. Astaxanthin đã được tìm thấy trong các mô cơ tim của chuột và có
tác dụng hạ huyết áp ở chuột nhắt sau khi điều trị bằng astaxanthin ở liều 150 và
500 mg/kg/ngày trong bảy ngày [15].


13
13

Chống ung thư: Các loại gốc tự do oxy hóa như superoxide (O 2-), hydrogen
peroxide (H2O2) và gốc hydroxyl được tạo ra trong quá trình trao đổi hiếu khí bình
thường. Oxy đơn phân tử được tạo ra bởi các điều kiện quang hóa, trong khi các gốc
peroxyl được tạo ra bởi quá trình peroxide hóa lipid. Các chất oxy hóa này góp phần
vào sự lão hóa và các bệnh thoái hóa như ung thư và xơ vữa động mạch thông qua
quá trình oxy hóa DNA, protein và lipid. Các hợp chất chống oxy hoá làm giảm sự
đột biến và sự hình thành ung thư bằng cách ức chế sự hư hỏng của tế bào. Sự
truyền tín hiệu tế bào thông qua các nút giao thoa tăng lên giúp tế bào phục hồi và
có xu hướng làm giảm sự gia tăng tế bào khối u. Astaxanthin cho thấy hoạt động
chống khối u đáng kể khi so sánh với các carotenoid khác như canthaxanthin và β
carotene, nó cũng ức chế sự phát triển của tế bào u xơ ở vú, tuyến tiền liệt và các
nguyên bào sợi phôi. Chiết xuất astaxanthin từ tảo H. pluvialis ức chế sự phát triển
của tế bào ung thư ruột kết ở người bằng cách bắt kiểm soát quá trình nhân đôi tế
bào và thúc đẩy quá trình tự chết theo chu kỳ, theo Palozza và cộng sự đã báo cáo
[16].
Tăng cường miễn dịch: Các tế bào hệ miễn dịch rất nhạy cảm với các tổn
thương gây ra bởi các gốc tự do, các chất chống oxy hoá như astaxanthin đặc biệt
giúp tế bào chống lại các tổn thương do gốc tự do gây ra để bảo vệ hệ thống miễn
dịch. Đã có nhiều báo cáo về astaxanthin và ảnh hưởng của nó đối với miễn dịch ở
động vật trong điều kiện phòng thí nghiệm tuy nhiên vẫn còn ít nghiên cứu lâm
sàng ở người. Astaxanthin cho thấy hiệu quả tăng cường miễn dịch cao hơn ở chuột
khi so sánh với β carotene, giúp tăng cường sản xuất kháng thể và giảm đáp ứng

miễn dịch hài hòa ở động vật lớn tuổi sau khi bổ sung astaxanthin trong chế độ ăn
uống [17]. Tám tuần bổ sung astaxanthin ở người đã làm tăng mức astaxanthin
trong máu và cải thiện hoạt động của các tế bào NK (Natural Killer) nhằm phát hiện
và phá huỷ các tế bào bị nhiễm virus [18].
2.1.5 Ứng dụng
Trên thị trường hiện nay, sản xuất astaxanthin từ các nguồn tự nhiên đã trở
thành một trong những hoạt động thành công nhất trong công nghệ sinh học.


14
14

Astaxanthin hiện đang có nhu cầu lớn để phục vụ cho các ngành công nghiệp thực
phẩm, thức ăn chăn nuôi, thực phẩm chức năng và dược phẩm. Điều này đã thúc
đẩy những nỗ lực lớn để cải thiện sản xuất astaxanthin từ các nguồn sinh học thay vì
thông qua con đường tổng hợp hóa học. Các sản phẩm của astaxanthin trên thị
trường có ở dạng viên nén, gel mềm, viên nang, bột rắn, sinh khối khô, dạng lỏng
và dạng kết hợp với một số loại dầu. Một số sản phẩm của astaxanthin được sản
xuất với sự kết hợp của các carotenoid khác, vitamin tổng hợp, chiết xuất từ thảo
mộc và các axit béo omega-3, omega-6. Nhiều ứng dụng đã được cấp bằng sáng chế
về việc sử dụng astaxanthin để ngăn ngừa nhiễm khuẩn, viêm, suy mạch, ung thư,
các bệnh tim mạch, ức chế sự peroxide hóa lipid, làm giảm tổn thương tế bào và
giảm mỡ trên cơ thể, cải thiện chức năng não và độ dầy da. Astaxanthin từ nguồn vi
sinh vật hoặc động vật có nhiều ứng dụng trong một loạt các hoạt động thương mại,
đó là lý do mà astaxanthin sản xuất từ vi tảo có thể cung cấp lợi nhuận hấp dẫn hơn
[3].

Hình 2.3: Sản phẩm BioAstin Hawaiian Astaxanthin
2.2 Tổng quan về chủng nấm men Rhodosporidium
2.2.1 Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Chủng nấm men đỏ Rhodosporidium được Banno phân lập vào năm 1967,
chủng nấm men này còn được gọi là nấm men sinh sắc tố carotenoid bởi vì chúng


15
15

có khả năng tổng hợp và tích luỹ một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ
yếu là beta – carotene, torulene và torularhodin [19]. Hiện nay, chi Rhodosporidium
được phát hiện gồm chín loài, trong đó các loài R. babjevae, R. diobovatum, R.
kratochvilovae, R. lusitaniae, R. paludigenum, R. sphaerocarpum và R. toruloides là
được biết đến nhiều hơn; một số loài của chi Rhodosporidium được các tác giả khác
nhau phân loại thành một số chi khác như Cystofilobasidium (Oberwinkler 1983),
Kondoa (Yamada 1989) và Sakaguchia (Yamada 1994) [20].
Tế bào nấm men Rhodosporidium có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc
vào từng loài và từng thời điểm sinh trưởng, hình dạng tế bào có thể thay đổi từ
hình cầu đến hình oval đa số có quầng sáng xung quanh tế bào. Tế bào ở dạng đơn
bào, kích thước tế bào dao động trong khoảng 2 – 3 µm chiều rộng và 5 – 10 µm
chiều dài. Khuẩn lạc của Rhodosporidium phát triển nhanh, bề mặt trơn mịn, sáng
bóng hoặc có khi hơi mờ đục, ít khi ghồ ghề hoặc nhớt, mép khuẩn lạc phẳng đều,
không có răng cưa. Màu sắc khuẩn lạc thay đổi từ màu cam nhạt, hồng nhạt đến đỏ
cam. Kích thước khuẩn lạc tùy thuộc vào môi trường dinh dưỡng và thời gian phát
triển khuẩn lạc. Quan sát dưới kính hiển vi không thấy có sự hình thành khuẩn ty,
một số loài có sinh khuẩn ty giả trên môi trường PDA nhưng rất kém phát triển,
hình thành nang bào tử trên môi trường acetate agar, nang bào tử hình cầu, mỗi túi
bào tử gồm một đến hai nang [21].
Đa số các loài nấm men thuộc chủng Rhodosporidium sinh sản vô tính bằng
hình thức nẩy chồi: Đầu tiên, nhân tế bào mẹ bắt đầu kéo dài ra và sau đó co lại ở
giữa, tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con, một phần nhân chuyển vào chồi con
và một phần ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con, khi chồi con

gần bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập, đang số các vị trí nẩy chồi
không cố định trên tế bào mẹ (nảy chồi đa hướng). Đây là phương pháp sinh sản vô
tính chủ yếu nhất ở nấm men, ngoài ra trong một số trường hợp vẫn phát hiện hình
thức sinh sản hữu tính bằng cách tiếp hợp ở chủng nấm men Rhodosporidium. Tốc
độ sinh sản của Rhodosporidium khá nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi
thường từ 2 đến 6 giờ. Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm bốn


16
16

giai đoạn: Giai đoạn tiềm sinh, giai đoạn phát triển hàm mũ, giai đoạn cân bằng và
giai đoạn suy vong. Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodosporidium trong
khoảng 24 – 96 giờ tùy loài, tùy thuộc vào thành phần môi trường dinh dưỡng và
điều kiện nuôi cấy [20].
Chủng nấm men Rhodosporidium có các đặc điểm sinh hóa như sau: Không
có khả năng lên men glucose, sucrose, maltose, lactose và galactose. Có khả năng
sử dụng các nguồn carbon khác nhau như glucose, sucrose, lactose, mannitol,
galactose, maltose, arabinose, sorbitol, inositol, glycerol, tinh bột, acid lactic và acid
citric. Có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau như NaNO 3, KNO3, NH4Cl
và (NH4)2SO4. Phát triển tốt ở nhiệt độ trong khoảng 25oC tới 30oC [23].

Hình 2.4: Khuẩn lạc Rhodosporidium toruloides trên môi trường thạch Hansen


17
17

Hình 2.5: Tế bào Rhodosporidium toruloides quan sát dưới kính hiển vi
2.2.2 Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở nấm men Rhodosporidium

Simpson và cộng sự (1964), sau đó là Goodwin đã đưa ra con đường chung
cho quá trình sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men và kết luận rằng quá trình này
thường liên quan chính đến ba bước:
Bước 1: Chuyển hóa acetyl-CoA thành 3-hydroxy-3-methyl glutaryl-CoA
(HMG-CoA), xúc tác bởi HMG-CoA synthase. HMG-CoA sau đó được chuyển hóa
thành một hợp chất 6 carbon là mevalonic acid (MVA), đây là tiền chất đầu tiên
quan trọng nhất của con đường sinh tổng hợp terpenoid. Sau đó mevalonic acid
(MVA) được chuyển hóa thành isopentenyl pyrophosphate (IPP) bằng một chuỗi
các phản ứng liên quan đến quá trình phosphoryl hóa bằng MVA kinase theo sau bởi
phản ứng khử carbon (decarboxylation) [19].
Bước 2: IPP được đồng phân hóa thành dimethylallyl pyrophosphate
(DMAPP) cùng với việc gắn thêm 3 phân tử IPP tạo thành DMAPP. Phản ứng này
được xúc tác bằng prenyl transferase để tạo thành hợp chất 20 carbon geranyl
geranyl pyrophosphate (GGPP). Sự kết hợp hai phân tử GGPP hình thành phytoene


18
18

(là carotene 40 carbon đầu tiên của con đường), sau đó được khử bão hòa để tạo
thành lycopene [19].
Bước 3: Do lycopene là một hợp chất mạch thẳng, quá trình đồng phân hóa
nối đôi thứ nhất và thứ hai của phytoene phải xảy ra đồng thời trong quá trình khử
bão hòa. Lycopene có vai trò như là tiền chất của carotenoid mạch vòng và trải qua
một số quá trình chuyển hóa (như phản ứng tạo vòng) để hình thành β-carotene, γcarotene, torulene, torularhodin và astaxanthin. γ-carotene có vai trò như là tiền chất
của β-carotene và torulene [19].
Andrewes và cộng sự (1976) đã đề xuất quá trình sinh tổng hợp astaxanthin,
theo hướng qua nhiều giai đoạn và các chất trung gian như lycopene, β-carotene và
echinenone để hình thành astaxanthin. Sau đó các chất trung gian khác được phát
hiện gồm

β-zeacarotene,

3,3’-dihydroxy-β,γ-carotene-4,4’-dione

(DCD)

và

torulene, chỉ ra con đường thay thế thông qua β-zeacarotene  torulene  3hydroxy-3’,4’-didehydro- β,φ-carotene-4-one (HDCO)  3,3’-dihydroxy- β,γcarotene-4,4’-dione (DCD) thành trans-astaxanthin [19].


19
19

Hình 2.6: Quá trình sinh tổng hợp từ acetyl-CoA thành β-carotene, torulene và
torularhodin ở chủng nấm men Rhodosporidium [19]


20
20

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp astaxanthin ở nấm men
Rhodosporidium
2.2.3.1 Môi trường dinh dưỡng
Nguồn carbon và nguồn nitơ là những yếu tố quan trọng đã được nghiên cứu
nhiều về sự ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid. Carbon và nitơ là
những nguyên tố quan trọng cho việc cấu tạo nên tế bào và cũng như hình thành các
hợp chất thứ cấp ở vi sinh vật. Khi nuôi cấy nấm men Rhodosporidium với nguồn
carbon là sucrose sẽ cho hàm lượng torularhodin và β-carotene cao hơn khi nuôi

bằng nguồn glucose. Ngược lại, nếu nuôi cấy với nguồn carbon là glycerol thì hàm
lượng torulene tổng hợp được lại kém hơn khi nuôi bằng glucose. Sự ảnh hưởng của
nguồn nitơ đến quá trình hình thành carotenoid ở nấm men tùy thuộc vào khả năng
sử dụng các nguồn nitơ của từng loài. Nitơ sử dụng dưới dạng NH 4+ có tác dụng
kích thích quá trình tích lũy sinh khối và nitơ ở dạng NO 3- sẽ cho hiệu suất thu hồi
sinh khối chỉ ở mức trung bình nhưng hàm lượng carotenoid tổng tăng lên rất lớn
[19].
Một số nguồn nguyên liệu phế phẩm công nghiệp như mật rỉ, bã đậu nành và
syrup bắp cũng được sử dụng để nuôi cấy nấm men nhằm giảm giá thành sản xuất
phục vụ cho thương mại. Khi nuôi cấy Rhodosporidium glutinis ở môi trường sử
dụng glucose tổng hợp và môi trường sử dụng mật rỉ thu được nồng độ carotenoid
cao nhất lần lượt là 129,0 mg/L và 183,0 mg/L. Trong môi trường nuôi cấy sử dụng
mật rỉ, các carotene là các hợp chất chính tạo ra sắc tố (87% hàm lượng carotenoid
tổng), với một lượng nhỏ torulene (10% hàm lượng carotenoid tổng), tiếp theo là
torcalhodin (3% hàm lượng carotenoid tổng). Hàm lượng astaxanthin thu được cao
nhất là 516,0 mg/L ở quá trình nuôi cấy chủng nấm men đột biến P. rhodozyma trên
nguồn dinh dưỡng là syrup bắp [19].
2.2.3.2 Ánh sáng và nhiệt độ
Sự sinh tổng hợp carotenoid trong nhiều loài sinh vật bị ảnh hưởng rất lớn
bởi ánh sáng, bất kể tăng hay giảm thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng hoặc
cách thức chiếu sáng đều dẫn đến sự thay đổi về hàm lượng carotenoid sinh tổng


21
21

hợp được ở các loài sinh vật đó. Nhiều loài vi sinh vật cần phải tránh một số bước
sóng ánh sáng gây hại đến nó và sự hình thành carotenoid là một trong những cơ
chế tự bảo vệ của các loài vi sinh vật đó, vì vậy, trong đa số các trường hợp được
chiếu sáng đều làm tăng hàm lượng carotenoid. Sự chiếu sáng không chỉ ảnh hưởng

tới hàm lượng carotenoid mà còn ảnh hưởng tới việc hình thành các loại carotenoid
khác nhau và làm tăng khối lượng sinh khối của nhiều loài vi sinh vật. Trong nghiên
cứu nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous, hàm lượng carotenoid và
astaxanthin thu được khi có chiếu sáng lần lượt là 2,45 mg/L và 2,13 mg/L, còn khi
nuôi cấy trong tối thì hàm lượng carotenoid và astaxanthin thu được lần lượt là 1,72
mg/L và 1,38 mg/L [19].
Nhiệt độ là một nhân tố quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả của quá
trình phát triển và hình thành các hợp chất thứ cấp ở vi sinh vật, nó ảnh hưởng lớn
đến quá trình nhân đôi tế bào và sự chuyển hóa sinh học bên trong tế bào, bao gồm
cả quá trình tổng hợp carotenoid. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh tổng
hợp carotenoid ở vi sinh vật tùy thuộc vào đặc tính của từng loài vi sinh vật và các
điều kiện nuôi cấy khác nhau. Ở nhiều loài nấm men, nhận thấy có sự thay đổi tỷ lệ
giữa các sắc tố tạo thành carotenoid tổng (turulene, torularhodin, α-carotene và
astaxanthin) khi thay đổi nhiệt độ nuôi cấy. Mức nhiệt độ thấp từ 15 oC – 25oC cho
thấy ảnh hưởng tích cực đến sự sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men, nghiên cứu
cho thấy khi nuôi cấy Rhodosporidium glutinis ở 20oC cho nồng độ các carotene là
19% so với lượng carotenoid tổng và nồng độ này chỉ đạt 9,6% khi nuôi cấy ở 35 oC
[19].
2.2.3.2 Sự sục khí
Sinh tổng hợp carotenoid là một quá trình hiếu khí, sự sục khí sẽ cung cấp
thêm nhiều oxy hòa tan cho môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Vì vậy ở nấm men, sục
khí trong quá trình nuôi cấy là một yếu tố thiết yếu ảnh hưởng đến sự đồng hóa các
chất nền dinh dưỡng cũng như ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, tích lũy sinh
khối và sinh tổng hợp carotenoid. Ảnh hưởng của việc sục khí phụ thuộc vào đặc
điểm của từng loại vi sinh vật và cường độ của việc sục khí. Các giá trị tối ưu đã


22
22

được báo cáo khi nuôi cấy nấm men Rhodosporidium và Phaffia ở tốc độ lắc từ 180
vòng/phút đến 600 vòng/phút đã ảnh hưởng tích cực đến quá trình sinh tổng hợp
carotenoid. Ngoài ảnh hưởng tới hàm lượng carotenoid tổng, sự sục khí còn ảnh
hưởng tới tỷ lệ thành phần của các sắc tố tạo nên carotenoid tổng. Ở nấm men
Rhodosporidium rubra, tăng tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy đã dẫn đến tỷ lệ các
carotene thay đổi từ 42% lên 60%, tỷ lệ torcalhodin giảm từ 44% xuống 29%, trong
khi tỷ lệ torulene tăng nhẹ từ 9,5% lên 11% so với tổng hàm lượng carotenoid tổng
[19].
2.2.3.3 Các ion kim loại và một số loại dung môi
Các cation hóa trị hai (Ba, Fe, Mg, Ca, Zn và Co) đã được chứng minh là có
ảnh hưởng kích thích đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men
Rhodosporidium glutinis, Buzzini và cộng sự đã báo cáo rằng một số nguyên tố vi
lượng đã cho thấy có ảnh hưởng chọn lọc tới quá trình sinh tổng hợp carotenoid.
Nghiên cứu chỉ ra rằng ở nấm men Rhodosporidium graminis, Al3+ và Zn2+ có tác
dụng kích thích sản sinh β-carotene và γ-carotene, trong khi Zn 2+ và Mn2+ có tác
dụng ức chế torulene và sản sinh torcalhodin. Các tác động quan sát thấy được của
các yếu tố vi lượng đối với sinh tổng hợp carotenoid đặc trưng ở nấm men đỏ có thể
được giải thích bằng giả thuyết cơ chế kích hoạt hoặc ức chế của các ion kim loại
đến các enzyme liên quan chính tới quá trình sinh tổng hợp carotenoid [19].
Một số dung môi đã được nghiên cứu về ảnh hưởng của chúng đến sự sinh
tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật. Việc bổ sung ethanol (10 g/L) hoặc acid acetic (5
g/L) vào môi trường nuôi cấy nấm men Phaffia rhodozyma đã kích thích sự hình
thành astaxanthin, kết quả thu được hàm lượng astaxanthin lần lượt là 45,62 mg/L
và 43,87 mg/L, cao hơn khoảng 25% so với không bổ sung ethanol và acid acetic
theo báo cáo của Kim và cộng sự. Tương tự, Gu và cộng sự báo cáo rằng carotenoid
đã tăng từ 1,65 mg/g sinh khối lên 2,65 mg/g sinh khối khi bổ sung 2% ethanol vào
môi trường nuôi cấy nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous. Các nghiên cứu chi
tiết hơn cho thấy rằng ethanol kích hoạt quá trình trao đổi oxy với tạo ra enzyme
HMG-CoA reductase, từ đó thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp carotenoid [19].

23
23

2.3 Các phương pháp giải trình tự gene
2.3.1 Sự khác biệt trong trình tự gen tổng hợp astaxanthin
Đột biến là một trong các phương pháp cải tiến chủng nấm men
Rhodosporidium toruloides hoang dại với mục đích làm tăng khả năng sinh tổng
hợp astaxanthin. Các tác giả trước đã thực hiện đột biến trên nấm men
Rhodosporidium toruloides hoang dại mang tính ngẫu nhiên và có thể lựa chọn
chủng đột biến qua sự thay đổi màu sắc, kiểu hình khuẩn lạc. Các tác nhân đột biến
hóa học như etyl-methanesulfonate (EMS), benomyl, ethidium bromide hay tác
nhân vật lý như tia UV, tia Co-60 đã được sử dụng thành công trong đột biến vi sinh
vật nhằm cải thiện khả năng sinh tổng hợp carotenoids cũng như astaxanthin. Các
tác nhân trên đều là các tác nhân gây đột biến điểm, với mục đích khảo sát sự khác
biệt trong trình tự gen tổng hợp astaxanthin của chủng hoang dại với chủng đột biến
bởi các tác nhân trên, phương pháp giải trình tự gen quy định tổng hợp astaxanthin
đã được thực hiện để kiểm tra sự khác biệt.
2.3.2 Phương pháp giải trình tự DNA cổ điển
Giải trình tự DNA là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide
trong phân tử DNA. Có hai phương pháp chính để xác định trình tự các nucleotide
là phương pháp hóa học của Maxam và phương pháp enzyme của Sanger, ngày nay
hai phương pháp này đã không còn được sử dụng vì độ chính xác không cao và chỉ
giải trình tự được những đoạn ngắn DNA nhưng chúng vẫn là nguyên tắc để thiết kế
các phương pháp giải trình tự tự động hay phương pháp giải trình tự thế hệ mới
[22].
Phương pháp hóa học của Maxam và Gilberg: Phương pháp này dựa trên cơ
sở phân cắt hóa học tại vị trí đặc biệt của base. Đầu tiên, một mạch đơn nucleotide
có đánh dấu phóng xạ (32P) được chia thành bốn phản ứng để cắt ở những vị trí đặc
hiệu là G, G+A, T+C, C; Trong mỗi bốn phản ứng, mạch đơn có một đầu cố định

đánh dấu phóng xạ và một đầu có phân tử A, T, G, C; Sản phẩm của mỗi phản ứng
được điện di trên gel polyacrylamide biến tính; Vị trí của các mạch đơn trên gel
tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện nhờ đầu có đánh dấu phóng


24
24

xạ; Tập hợp kết quả ở các phản ứng, thu được các đoạn polynucleotide dài ngắn hơn
kém nhau một nucleotide, từ đó xác định được trình tự của mạch khuôn DNA [22].
Phương pháp enzyme của Sanger: Dựa trên sự tổng hợp mạch bổ sung cho
DNA mạch đơn cần xác định nhờ enzyme DNA polymerase, ngoài bốn loại
nucleotide, còn có thêm bốn loại dideoxynucleotide – ddNTP (là deoxynucleotide
trong đó nhóm 3’OH được thay bằng H dẫn đến mất khả năng hình thành nối
phosphodiester và làm ngừng quá trình tổng hợp). Thực hiện bốn phản ứng tổng
hợp DNA, mỗi phản ứng bổ sung vào một loại ddNTP. Trong quá trình tổng hợp
mạch mới, khi ddNTP gắn vào mạch khuôn sẽ làm ngừng quá trình kéo dài dẫn đến
trong hỗn hợp phản ứng sau cùng sẽ có nhiều phân tử DNA với các kích thước khác
nhau và tất cả đều cùng chấm dứt tại vị trí ddNTP đã bổ sung vào. Các sản phẩm
này sẽ được điện di trên gel polyacrylamide biến tính, tổng hợp các kết quả ở bốn
phản ứng ta sẽ xác định được trình tự của mạch khuôn DNA [22].

Hình 2.7: Phản ứng giải trình tự theo phương pháp của Sanger và kết quả điện di


25
25

2.3.3 Phương pháp giải trình tự DNA thế hệ mới (Next Generation Sequencing)
Công nghệ giải trình tự thế hệ mới với những đặc điểm như là hiệu suất cao,

giảm chi phí đã phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây và trở thành một
công cụ phân tích quan trọng cho nhiều nhà di truyền học. Hàng triệu hoặc hàng tỉ
phân tử DNA có thể được giải trình tự đồng thời. Do đó, hiệu suất của quá trình giải
trình tự được tăng lên một cách đáng kể và giảm thiểu việc phải tách dòng trình tự
đích giống như phương pháp Sanger trước đó.
2.3.3.1 Pyrosequencing
Pyrosequencing là một phương pháp giải trình tự DNA dựa trên nguyên lý
“đọc trình tự bằng tổng hợp”. Nó khác với giải trình tự Sanger ở chỗ: dựa trên sự

phát hiện sự giải phóng pyrophosphate (PPi) khi dNTP được thêm vào chuỗi, thay
vì kết thúc chuỗi bằng ddNTP [23].