TÁCH CHIẾT và xác ĐINH HOẠT độ PEPSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSSON

BÀI 3: TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐINH HOẠT DỘ PEPSIN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP ANSSON
I.


II.

MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Tách enzyme pepsin từ dạ dày heo
Xác định hoạt độ enzyme thô
NGUYÊN TẮC
Enzyme pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày động vật do sự tự phân
trong môi trường acid loãng. Dung dịch sau khi tự phân chứa pepsin dạng hòa tan và
các thành phần protein khác. Sự tinh sạch enzyme có thể được thực hiện sau khi đã thu
nhận được chế phẩm enzyme thô nhờ vào các tác nhân gây tủa.
Trong môi trường acid, pepsin (pepsin A, EC 3.423.1) phân giải được
Hemoglobin thành Tyrosine và Tryptophane hòa tan trong TCA. Xác định hàm lượng
Tyrosine và Tryptophane nhờ vào thuốc thử Folin – Ciocalteu.
III. TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM
1. Thu nhận enzyme từ dạ dày bò bằng muối
Dạ dày heo mới giết mổ, xử lý thô sau đó được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ
thấp với sự có mặt chloroform 5%. Thời gian tối đa cho quá trình bảo quản là 48 giờ.
Cân khối lượng niêm mạc m1 (g).
Tự phân enzyme:
Tách lớp niêm mạc thô từ dạ dày, xay nhỏ với máy xay sinh tố trong dung dịch
HCl 0.5% (tỉ lệ 1:2 theo khối lượng). Sau đó cho vào chậu thuỷ tinh lớn, đậy kín, để
yên ở nhiệt độ 40 – 42oC trong bể ổn nhiệt với thời gian 24 - 28 giờ. Tiến hành lọc
dung dịch qua vải lọc (từ 2- 4 lần), loại bỏ tạp chất bằng cách lọc qua bông. Thu được
dung dịch có enzyme thô được dùng tiến hành thử hoạt tính.
+ Thu chế phẩm pepsin thô:
Tiến hành thu kết tủa pepsin bằng dung dịch muối NaCl 25% với tỷ lệ 1:4, cho

từ từ dung dịch muối vào kết hợp với khuấy đảo liên tục để tránh sinh nhiệt trong hỗn
hợp. Thời gian từ 5 – 10 phút, nhiệt độ khoảng 5oC.
Tiến hành ly tâm với tốc độ 6000v/phút trong 15 phút.
Với tác nhân tủa là muối trung tính cần qua thẩm tích để giải phóng bớt lượng
muối trong hỗn hợp. Sau đó tiến hành sấy khô bằng máy sấy không khí, nhiệt độ 30 –
40oC khoảng 1 –2 giờ. Cân khối lượng chế phẩm m2 (g).


2. Lập đường chuẩn Tyrosine
Bảng 1: Lập đường chuẩn Tyrosine và kết quả đo OD
Ống

0

1

2

3

4

5

Tyrosine chuẩn 1mM (ml)
HCl 0,2 N (ml)
NaOH 0,5 N (ml)
Folin pha loãng 3 lần (ml)

0

5

0,2
4,8

0,4
4,6

0,6
4,4

0,8
4,2

1
4

10
3

Lượng tyrosine (mol )

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Lắc mạnh sau 5 – 10 phút
OD660nm

?
?
?
?
?
?
(1mol =103mmol = 106mol)
Ống 0 là ống kiểm chứng (KC). Các ống khác là ống thí nghiệm (TN)
3. Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) trong mẫu chế phẩm enzyme.
Bảng 2: Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) trong mẫu chế phẩm
enzyme và kết quả đo OD
Ống 1 (mẫu thí
Ống 2 (mẫu
Chất dùng
Hiện tượng
nghiệm)
kiểm chứng)
Hb 2% ở 25oC (ml)
5
Xuất hiện kết tủa
TCA 5% (ml)
0
10
nâu
Enzyme pepsin (ml)
0,1
Nước (ml)
0,9
Giữ 10 phút ở
Không cần giữ

Thời gian
o
35,5 C
10 phút
Ống 1 xuất hiện kết
TCA 5% (ml)
10
0
tủa nâu với lượng
lớn hơn ống 2
Sau 30 phút đem lọc lấy dung dịch
Hút 5ml dung dịch lọc từ hai ống nghiệm chuyển sang ống
Thu được dịch
nghiệm mới
trong hơi vàng
Ống nghiệm
1
2
NaOH 0,5 N (ml)
10
Lắc mạnh
Dung dịch bị đổi
Folin pha loãng 3 lần
sang màu xanh.
3
(ml)
Màu của ống 1 đậm
hơn màu của ống 2
Lắc đều, để yên sau 5-10phút
?

?
OD ở  = 660 nm

1


4. Xác định hoạt độ đông tụ sữa
Chuẩn bị 3 ống nghiệm: mẫu, PCN, PDD
Hút mỗi ống 1 ml sữa
Cho vào ống PCN và PDD tương ứng 0,1ml dịch chiết Enzyme Pepsin công nghiệp và
Enzyme Pepsin dạ dày.
Quan sát thời gian đông tụ
IV. GIẢI THÍCH THÍ NGHIỆM
Tác dụng của các chất cho vào trong quá trình xác định hoạt tính pepsin:
Khi cho TCA 5% vào ống nghiệm chứa Hb 2% ở 25 oC thì TCA sẽ làm Hb kết tủa do
đó trong ống 2 xuất hiện kết tủa nâu, ống 1 không có TCA nên không bị kết tủa. TCA
kết tủa Hb trong ống 2 để khi cho enzyme vào thì enzyme sẽ không còn cơ chất để
phân giải, khi đó trong ống 1 không có TCA thì khi cho enzyme vào thì enzyme sẽ
phân giải Hb tạo ra những chất tan trong TCA. Sau khi cho Enzyme pepsin và nước
vào hai ống như nhau để một lúc sau tiếp tục cho TCA vào ống 1 thì kết tủa nâu xuất
hiện. TCA cho vào lúc sau có tác dụng tủa các Hb và enzyme còn dư.
Dịch lọc từ hai ống được bổ sung NaOH và Folin để đo OD. Ta bổ sung môi
trường NaOH 0.5N vì Folin chỉ xảy ra phản ứng màu với Tyrosine trong môi trường
kiềm.
V. KẾT QUẢ
1. Thu nhận enzyme từ dạ dày bò bằng muối
Hiệu suất chiết tách được tính bằng công thức
Sau khi ly tâm không thu được tủa enzyme dạ dày
Nguyên nhân: có thể do enzyme tách chiết đã để quá lâu nên bị phân hủy, sau khi
ly tâm ta không thu được tủa của enzyme

Ta chỉ có khối lượng của m1 nên không thể tính được hiệu suất thu nhận enzyme
bằng muối.

2


2. Lập đường chuẩn Tyrosine

Hình 1: Mẫu Tyrosin đo OD
 Kết quả đo OD
Ống

0

1

2

3

4

5

Tyrosine chuẩn 1mM (ml)
OD660nm

0
0

0,2
0,051

0,4
0,113

0,6
0,156

0,8
0,229

1
0,310

Đường chuẩn của Tyrosin
0.35

OD 660nm

0.3
0.25

f(x) = 0.32x - 0.02
R² = 0.99

0.2
0.15
0.1
0.05

0
0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Tyrosin

3

0.7

0.8

0.9

1

1.1


3. Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) trong mẫu chế phẩm
enzyme.

Hình 2: Sau khi bổ sung các dung dịch
Hb 2%, TCA 5%, Pepsin, Nước

Hình 4: Dịch lọc từ 2 ống nghiệm
sau 30 phút
 Kết quả đo OD

Hình 3: Bổ sung TCA 5%
vào ống 1 sau 10 phút

Hình 5: Dịch lọc sau khi đã thêm
NaOH 0,5N và Folin để đo OD

Chất dùng

Ống 1 ODTN
(mẫu thí nghiệm)

Ống 2 ODKC
(mẫu kiểm chứng)

OD ở  = 660 nm

0,045

0

4

Dựa vào phương trình đường chuẩn của tyrosin y = 0,3039x – 0,0088
Và kết quả ODTN (mẫu thí nghiệm) = 0,045
Ta có lượng tyrosin x = (0,045+0,0088)/0.3039 = 0,177 (µmol)
a: Tỉ lệ thể tích mẫu thí nghiệm (16/5=3,2)
v: Thể tích dung dịch đem xác định (0,1ml)
t : Thời gian thuỷ phân 10 phút
1,82: hằng số giá trị cường độ màu ở 25OC.
4. Xác định hoạt độ đông tụ sữa

Ống mẫu

Ống
Ống
PCN
PDD
Hình 6: sữa đông tụ sau khi cho enzyme pepsin vào
Kết quả: sữa bị đông tụ sau thời gian t = 275 giây
Xác định hoạt độ đông tụ sữa của pepsin dựa vào thời gian cần thiết để làm đông
tụ dung dịch sữa đã loại béo có nồng độ xác định. Công thức tính:
F: hoạt độ đông tụ sữa
E: lượng enzyme tham gia (mg)
t: thời gian (phút hoặc giây).
Thời gian động tụ sữa của enzyme công nghiệp: t=6s
 Hoạt độ đông tụ sữa:
Thời gian đông tụ sữa của enzyme dạ dày :t = 9 phút 57s = 597s
 Hoạt độ đông tụ sữa:
VI.

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ

1.
Trả lời câu hỏi
1) Giải thích tại sao phải chiết pepsin trong môi trường acid ?
Pepsin hoạt động ổn định nhất trong môi trường axit giữa 37 - 42°C pH 1.5 – 2.0
Pepsin hoạt động tối đa ở pH 2.0 và không hoạt động ở pH 6.5 trở lên do đó để giữ
nguyên hoạt tính của enzyme sau khi tách chiết thì phải thực hiện ở môi trường acid.
Ngoài ra pepsin có trong dạ dày với pH acid nên cần giữ chúng trong môi trường acid
để enzyme không bị biến tính.

5


Pepsin được dạ dày tiết ra ở dạng tiền pepsin là pepsinogen trong môi trường
acid pepsinogen mới được chuyển thành pepsin và mới có hoạt tính phân giải protein.
2) Mô tả chế phẩm thu được.
Chế phẩm tự nhiên có dạng bột màu trắng hay hơi vàng, vô định hình và có mùi
nước thịt, vị hơi chua. Người ta có thể thêm vào chế phẩm chất nền như tinh bột hay
dextrin để bảo quản. Điều kiện giữ chế phẩm cần khô, kín (trong lọ màu) và ở nhiệt độ
5oC.
2.
Nhận xét:
Không thu được khối lượng enzyme khi tử bằng muối nên không tính được hiệu
suất thu hồi.
Hoạt độ đông tụ sữa của pepsin dạ dày thấp hơn nhiều so với enzyme công
nghiệp

6