Nghiên cứu ảnh hưởng của aslem trên hệ thống enzim CY p 450 ở gan động vật thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TR Ư Ờ N G Đ Ạ I HỌC

BỘ Y TÊ

Dược

H À NỘI

Đào Thị Mai Anh

Nghiên cứu ảnh hưởng của a slem
trên hệ thống enzym Cyt-P450 ở gan
của động vật thí nghiệm
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

Chuyên ngành: Dược lý ■Dược lâm sàng
Mã số: 60.73.05

Hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đào Kim Chi
2. PGS.TS. Nguyễn Thị Ngọc Dao

Hà nội -2003


MỜ3 <ẵcẢJn ơm.
~CrUcỷc kểí> em xi^ t^ân trang cảm ơn 13cm 0Ìám kiệw, Pkòng đao tạo
saw đạikọc, cá c pKòng bcm, B ộ môn

mọi

~ crư ờ n g

Đại kọc

T )

lìợc

H
—
ỉtN nội líiì fi'n.1

điều kiỆK cKo em t^ong quá ừìnk kọc tập và ỉU,ực kiện luận văn tại

ỉrường

.

xi*^ b à y t ổ lòrvg b i ê t ơ n s â u SQC tc^i P S Ỡ . X S
7\]gwyần ~nkị A)0ỌC Daoy

nguời tkầy

tíiak KucẶng dân và thuyền
Đ ào

K im C k i v à

đ ã lucm tkeo sáf> tận

CỊLiý báu t^otac) suô+ r|wn

IrMnk n g ị\ìê.Y \ cí
£m cũng xin ckân i KồkK cám ơn <^\S.XS. AJguyen

Tkắng, TS.

A^g^yên (2uôc Bínk CÙKV0 các thầy cô giáo, cô T-^kạm Xkat^h Pk^cMg và
các kỹ tkuật viên trcmg Bộ môn •f'loa sink/
giúp đơ, tạo ctìểu kiện thucm lợi

ịrường Đại Kọc Duợc flò nội aã

đ ê e-tn có ii\ề hoàn iKònK luận văn cua

mmk.
T^cmg CỊMQ+I*mk +Kực Kiện luận văn, em đã cíuợc sụ

u,ưáng dâK và giúp

đỡ nkiệt fmh của Tks Đổ ~Ckị Tuyên và các cán t>ộ pkò^g Ênzym KọcViẹK

cồng nghệ sink kọC/ PúÀS. ~ cs ]—ê ĐínK "Hoe cùng các cán bộ của

B ộ m ô n < ^iai pk<âw bệ^Ky ị ^ ư ờ n g Đ ạ i k ọ c

-1-1à K ọi.

7 \ ) k c m d ị p K\ày, e m xì^v c t a ợ c gt?i lời c á m ơ n c k â n t h à n h t ó i tc\T c Á t ậ p

+kế và cá nkốKv các cíơn vị
£ 3 u ô i c ù n g e m xii^ pi\é-Ọ đ ư ợ c d à n h lời c ả m ơ n c h o g i a c í ỉ n k / b ạ n b è /

người

\\\ấv\; nl\ữv\g ngiXỜi đa lucm luÔK đọng viên UKnyên kkíck và kê+ lổKg

g i ú p đ ỡ cf e e m i k ự c K i ệ n đ ư ợ c , l u ậ n v ă n n à y ,

à laọi/ t k á n a

I 1 n ă m 1200"?

D s. Đào Tkị Mnì ;Anl\


M Ụ C LỤC

Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chương 1 : TổN G QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Quá trình chuyển hoá thuốc ở gan

3

1.2.

Hệ thống enzym oxy hoá phụ thuộc Cytochrom P450.

12

1.3.

Vài nét về ASLEM

33

Chương 2 : NỘI DUNG, Đ ố i TUƠNG v à PHUƠNG p h á p
NGHIÊN c ú u
2.1.

Nghiên cứu ảnh hưởng của ASLEM lên hệ thống Cyt-

37

P450 và sơ bộ tinh sạch microsome từ gan thỏ.
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

37

2.1.2. Hoá chất và thiết bị

37

2.1.3. Phương pháp và các bước tiến hành nghiên cứu

38

2.1.4. Xử lý số liệu

46

2.2.

Nghiên cứu ảnh hưởng của ASLEM lên hệ thống CytP450

và khả

năng

tương

tác

giữa ASLEM

46

và

Cyclophosphamid trên mô hình gây suy giảm miễn dịch
ở chuột nhắt trắng.
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

46

2.2.2. Hoá chất và thiết bị

46

2.2.3. Phương pháp và các bước tiến hành nghiên cứu

47


2.2.4. Xử lý số liệu

50

Chương 3 : KÊT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.

Các kết quả nghiên cứu trên thỏ.

5!

3.1.1. Sự biến đổi trọng lượng cơ thể thỏ dưới ảnh hưởng của

51

ASLEM
3.1.2. Ảnh hưởng của ASLEM lên hệ thống Cyt-P450 ở gan

52

thỏ
3.1.2.1.

Sự biến đổi hàm lượng các Cytochrom

52

3.1.2.2.

Sự biến đổi hoạt tính các Cytochrom

54

3.1.3. Tách chiết microsom và tinh sạch Cyt-P450 từ gan thỏ
3.2.

Các kết quả nghiên cứu trên chuột nhắt trắng.

3.2.1. Số lượng và tỷ lệ sống sót của chuột ở các

57
60

nhóm

60

nghiên cứu
3.2.2. Sự biến đổi trọng lượng cơ thể chuột ở các nhóm

61

nghiên cứu
3.2.3. Ảnh hường của ASLEM lên hệ thống Cyt-P450 ở gan

62

chuột
3.2.3.1.
3.2.3.2.

Sự biến đổi hàm lượng các Cytochrom

62

Sự biến đổi hoạt tính các Cytochrom

67

3.2.4. Kết quả mô bệnh học của các nhóm chuột nghiên cứu

71

3.3.

Bàn luận chung

3.3.1. Về ảnh hưởng của ASLEM đối với hệ thống Cyt-P450

74
75

ở gan.
3.3.2. Về khả năng tương tác giữa ASLEM vàCY

80

3.3.3. Về kết quả tinh sạch microsom từ gan thỏ.

82

KẾT LUẬN

84

TÀI LỈỆƯ THAM KHẢO

85

PHỤ LỤC

95


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Đ ư ợ c s ử DỤNG TRONG LUẬN VẢN

AH

Anilin hydroxylase

AhR

Aryl hydrocarbon Receptor

AIDS

Acquired Immuno deficiency syndrome

BSA

Bovine serum albumin

CPR

Cytochrom P450 reductase

CY

Cyclophosphamid

Cyt

Cytochrom

DTE

Dithiothrietol

EDTA

Ethylen diamin tetra acetic

FAD

Flavin adenin dinucleotid

FMN

Flavin mono nucleotid

FMO

Flavin-containing monooxygenase

Hsp 90

Heat shock protein 90

LD 50

Median lethal dose (Liều chết 50%)

NAD+

Nicotinamid adenin dinucleotid

NADH

Nicotinamid adenin dinucleotid (dạng khử)

NADP+

Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat

NADPH

Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat (dạng khử)

NST

Nhiễm sắc thể

Pr

Protein

TCA

Tricloacetat


DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN.

Bảng số

Tên bảng

1.1

Các enzym pha I

1.2

Các enzym pha II

1.3

Các enzym Cyt-P450 tham gia chuyển hoá thuốc ở gan
người

1.4

Một số chất gây cảm ứng Cyt-P450 thường gặp trong lâm
sàng.

1.5

Một số ví dụ điển hình về tương tác thuốc liên quan đến
Cyt-P450

3.1

Sự thay đổi trọng lượng thỏ dưới ảnh hưởng của ASLEM

3.2

Hàm lượng Cyt-P450 ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.3

Hàm lượng Cyt-b5 ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.4

Hoạt độ AH ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.5

Hoạt độ CPR ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.6

Hàm lượng Cyt-P450 trong dịch nghiền và trong dịch
microsom gan của hai nhóm thỏ

3.7

Hoạt độ AH trong dịch nghiền và trong dịch microsom gan
của hai nhóm thỏ

3.8

Tỷ lệ sống sót của chuột ở các nhóm nghiên cứu

3.9

Sự thay đổi trọng lượng chuột trước và sau thí nghiệm

3.10

Hàm lượng Cyt-P450 ở gan của nhóm chuột tiêm ASLEM
so với nhóm chứng

3.11

Hàm lượng Cyt-P450 ở gan của các nhóm chuột tiêm đồng
thời cả CY và ASLEM so với nhóm chứng

3.12

Hàm lượng Cyt-b5 ở gan của nhóm chuột tiêm ASLEM so
với nhóm chứng

3.13

Hàm lượng Cyt-b5 ở gan của các nhóm chuột tiêm đồng
thời cả CY và ASLEM so với nhóm chứng

Trang


3.14

Hoạt độ AH ở gan của nhóm chuột tiêm ASLEM so với
nhóm chứng

3.15

Hoạt độ AH ở gan của các nhóm chuột tiêm đồng thời cả
CY và ASLEM so với nhóm chứng

3.16

Hoạt độ CPR ở gan của nhóm chuột tiêm ASLEM so với
nhóm chứng

3.17

Hoạt độ CPR ở gan của các nhóm chuột tiêm đồng thời cả
CY và ASLEM so với nhóm chứng

3.18

Kết quả mô bệnh học của các nhóm chuột

II


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ TRONG LUẬN VĂN.

1
Hình số

Tên hình

1.1

“Đại gia đình của Cyt-P450”

1.2

Mô hình hệ thống Cyt-P450 ở màng lưới nội sinh chất

1.3

Nhân Hem ở dạng Fe proporfirin IX của Cyt-P450

1.4

Cơ chế hoạt động của Cyt-P450.

1.5

Sơ đồ vận chuyển điện tử (e) trong phân tử CPR

1.6

Tương tác giữa CPR và Cyt-P450

1.7

Cơ chế cảm ứng CYP 1AI qua receptor Ah

1.8

Funtumin (3 oc-amino-5 a-pregnan-20on)

2.1

Đường chuẩn Lowry

2.2

Sơ đồ quy trình tinh sạch microsom và Cyt-P450

3.1

Hàm lượng Cyt-P450 ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.2

Hàm lượng Cyt-b5 ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.3

Hoạt độ AH ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.4

Hoạt độ CPR ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.5

Ảnh điện di SDS-PAGE (10% acrylamide) của các mẫu
protein (nhuộm Coomassie Brilliant Blue R 250)

3.6

Sự biến đổi trọng lượng chuột trong quá trình nghiên cứu

3.7

Hàm lượng Cyt-P450 gan chuột ở nhóm tiêm ASLEM và
nhóm chứng

3.8

Hàm lượng Cyt-P450 gan của các nhóm chuột được tiêm
đồng thời cả CY và ASLEM so với nhóm chứng

3.9

Hàm lượng Cyt-b5 ở gan của các nhóm chuột nghiên cứu

3.10

Hoạt độ AH ở gan của các nhóm chuột nghiên cứu

3.11

Hoạt độ CPR ở gan của các nhóm chuột nghiên cứu

1
Trang Ị

1

ĐẶT VẤN ĐỂ

Vài thập kỷ gần đây, các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm tới
một hệ thống enzym có vai trò vô cùng thiết yếu đối với đời sống con người,
đó là hệ thống enzym oxy hoá phụ thuộc Cytochrom P450 (Cytochrome P450
— dependent monooxygenase system) hay còn được gọi ngắn gọn là hệ thống
Cyt-P450. Sở dĩ hệ thống này được chú ý nhiều như vậy là vì đó chính là con
đường chuyển hoá chủ yếu của các chất nội sinh có đặc tính thân mỡ như
steroid, acid béo, prostaglandin, leucotrien, thromboxan... cũng như của nhiều
chất ngoại sinh (xenobiotics) có cấu trúc khác nhau, dáng lưu tâm hơn

cú là

các chất độc, chất gây ung thư (carcinogen) và thuốc [11]. Hệ thống này gồm
các thành phần: Cytochrom P450 (Cyt-P450), Cytochrom P450 reductase
(CPR), Cytochrom b5 và phospholipid, trong đó Cyt-P450 là thành phần quan
trọng nhất. Cyt-P450 là tên chung của một “đại gia đình” các enzym màng nội
bào chứa nhân Hem, có tính chất đặc biệt là khi kết hợp với c o sẽ tao phức
hợp có đỉnh hấp thụ tại bước sóng X = 450 nm [7|.
Cytochrom P450 cùng với hệ thống của nó cũng được chú ý nhiều trong
ngành Dược vì nó đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa của hầu
hết các thuốc đang được sử dụng trên lâm sàng hiện nay. Những tác động lên
hệ enzym này dù là ức chế hay cảm ứng đều có ảnh hưởng tới tác dụng cũng
như độc tính của thuốc. Đó chính là nguyên nhân của nhiều tương tác thuốc
gây hậu quả nghiêm trọng. Vì vậy, những hiểu biết về Cytochrom P450: cấu
trúc, chức năng, cơ chế hoạt động... là vô cùng quan trọng. Đặc biệt đối với
một chế phẩm thuốc mới thì nghiên cứu về tương tác của thuốc với hệ

Cytochrom P450 cũng góp một phần không nhỏ trong việc cung cấp những
thông tin cần thiết để có thể sử dụng thuốc “Hiệu quả - An toàn - Hợp lý”.
Hơn 30 năm nay, chế phẩm ASLEM (Glycyl Funtumin Hydroclorid
tổng hợp hoàn toàn), một chế phẩm có hoạt tính điều hòa miễn dịch, đã và
đang được sử dụng trong điều trị bổ trợ ung thư gan tiên phát, ung thư phổi,
ung thư đường tiêu hóa và một số trường hợp nhiễm trùng sau mổ. Các kết quả


2

lâm sàng thu được là rất khả quan. Các nghiên cứu về tác dụng sinh học, độc
tính của ASLEM đã được tiến hành khá đầy đủ. Tuy nhiên, ảnh hưởng của
thuốc đối với hệ Cytochrom P450 như thế nào, có tương tác nào xảy ra khi
dùng ASLEM với những thuốc khác không, đó là những vấn đề còn chưa được
sáng tỏ. Để góp phần sử dụng chế phẩm ASLEM trong điều trị một cách “Hợp
lý — An toàn - Hiệu quả”, chúng tôi tiến hành đề tài:
"Nghiên cứu ảnh hưởng của ASLEM trên hệ thống enzym oxy hoá
phụ thuộc Cytochrom P450 ở gan của động vật thí nghiệm" với những mục
tiêu sau:
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của ASLEM lên những biến đổi hóa sinh của hệ
enzym oxy hoá phụ thuộc Cytochrom P450 trên gan của thỏ và chuột nhai
trắng.
2. Nghiên cứu khả năng tương tác của ASLEM với Cyclophosphamid, một
loại thuốc đang được sử dụng trong điều trị ung thư.
3. Phân lập và tinh sạch microsom gan động vật thí nghiệm, phục vụ cho các
nghiên cứu sâu hơn về chuyển hóa ASLEM trong cơ thể.


3

Chương I

TỔNG QUAN
1.1. QUÁ TRÌNH CHUYỂN HOÁ THƯÔC Ở GAN.
Hầu hết các thuốc được sử dụng trong điều trị đều có một độ thân mỡ
(lipophilic) nhất định để có thể được hấp thu dễ dàng vào các tổ chức của cơ
thể. Trong hệ tuần hoàn những thuốc này được vận chuyển bàng cách liên hựp
với các protein huyết tương như albumin và được tích luỹ tại các mô mỡ với
một tỷ lệ nhất định phụ thuộc vào mức độ thân mỡ của chúng. Vì vậy, chúng
không dễ dàng được đào thải ra khỏi cơ thể. Do đó, một quá trình để biến đổi
những thuốc này thành những chất chuyển hoá có tính thân nước hơn, dễ dàng
đào thải ra ngoài hơn là vô cùng cần thiết. Hầu hết các mô và các cơ quan
trong cơ thể đều có khả năng tham gia vào quá trình chuyển hoá thuốc. Tuy
nhiên, gan được đánh giá là cơ quan quan trọng nhất trong quá trình chuyển
hoá thuốc của cơ thể vì những lý do sau [51]:
- Thứ nhất: Gan nằm ở cửa ngõ của hệ tuần hoàn, hầu hết các thuốc sau
khi hấp thu đều được vận chuyển đến gan trước khi vào vòng tuần hoàn chung
để đến nơi tác dụng.
- Thứ hai: Màng của các tế bào gan có các khe đủ rộng để các phức hợp
thuốc-protein có thể lọt qua vào trong tế bào thực hiện quá trình chuyển hoá.
Hệ thống kênh ion và các chất vận chuyển đa dạng ở màng tê bào cho phép
kiểm soát tích cưc sư ra vào tế bào của các chất.
- Thứ ba: Tế bào gan sở hữu một lượng lớn và hầu hết các en/ym tham
gia chuyển hoá thuốc.
1.1.1. Ảnh hưởng của chuyển hoá đến tác dụng và độc tính của thuốc.
Thông qua chuyển hoá, thuốc bị thay đổi về cấu trúc hoá học dãn đến
sự thay đổi về tác dụng sinh học cũng như độc tính của thuốc.
Nói chung, với nhiều thuốc sau khi chuyển hoá sẽ giảm hoặc mất lác
dụng và giảm hoặc mất độc tính. Mặt khác, như đã đề cập ở trên, thông qua
chuyển hoá thuốc trở nên phân cực hơn và dễ đào thải ra ngoài hơn. Do vậy

4

quá trình chuyển hoá thuốc còn được coi là quá trình tự bảo vệ của cơ thể
chống lại độc tính của các thuốc.
Tuy nhiên cũng có một số trường hợp đặc biệt:
- Có những thuốc qua chuyển hóa vẫn giữ được tác dụng.
Ví du:
+ Carbamazepin bị chuyển hoá ở gan tới 97-98% thành carbamazepin
epoxid cũng là một chất có tác dụng chống động kinh như carbamazepin.
+ Nor diazepam và Oxa diazepam là những chất chuyển hoá của
diazepam có tác dụng an thần gây ngủ.
+ Phenacetin bị chuyển hoá thành paracetamol có tác dụng giảm đau hạ
sốt hữu hiệu.
- Một số thuốc chỉ sau chuyển hoá mới có tác dụng. Những thuốc này dược
gọi là pro-drug.
Ví du:
+ Levodopa sau khi vào cơ thể được chuyển hoá thành dopamin, một
amin sinh học đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh đặc biệt, có tác dụng
điều trị các triệu chứng của bệnh Parkinson.
+

Vitamin D3 được chuyển hoá thành 1,25 dihydroxy calciferol, chất

chuyển hoá này có tác dụng tăng cường hấp thu calci ở ruột, tái hấp thu calci ở
ống thận, giúp cho sự tạo xương...
+ Cyclophosphamid được chuyển hoá ở gan tạo thành Aldophosphamid
có tác dụng chống ung thư.
- Có những thuốc qua chuyển hoá lại tăng độc tính

Ví du:
+ INH sau khi bị acetyl hoá tạo thành chất chuyển hoá có độc tính cao
đối với gan.
+ Primaquin bị chuyển hoá thành carboxyprimaquin có độc tính cao
hơn chất mẹ.


5

1.1.2. Các phản ứng chuyên hoá thuốc ở gan [12],[13],[19],[79].
Thông thường các thuốc chuyển hoá ở gan qua 2 pha (pha I và pha II)
theo sơ đồ sau:
Pha I
Thuốc -------------->
O xyhoá

Chất
Pha II
chuyển hoá ------------------- *. Chất liên hợp —>
trung gian Acid Acetic

Khử
Thuỷ phân

Thải trừ

Acid Glucuronic
Acid Sulfuric...

1.1.2.1. Các phản ứng pha I

Các phản ứng pha I, còn được gọi là những phản ứng giáng hoá, gồm:
phản ứng oxy hoá, phản ứng khử, phản ứng thuỷ phân. Vai trò của các phản
ứng pha I là tạo ra một số nhóm chức trong cấu trúc phân tử làm tăng tính
phân cực của thuốc, đồng thời các nhóm chức này cũng làm cho thuốc dễ
dàng liên hợp được với các chất khác tạo thành những chất mới thân nước hơn
và dễ dàng đào thải ra ngoài hơn.
a. Phản ứng oxy hoá
• Oxy hoá sử dụng một nguyên tử oxy (Monooxygenation): Là những phan
ứng được thực hiện chủ yếu ở microsom nằm trên lưới nội bào nhẵn (smoothsurface endoplasmic reticulum), bao gồm:
+ Oxy hoá ở nhân thơm

Acetanilid, phenobarbital, diphenylhydantoin (DPH), propanolol... được
chuyển hoá theo cách này.
+ Hydroxyl hoá nhân steroid


6

Đa số các thuốc cũng như các chất nội, ngoại sinh có bản chất steroid chuyển
hoá theo con đường này.
+ Oxy hoá chuỗi thẳng
RCH 3 -----------------► RCH2OH

Cơ chất thường thấy của phản ứng này là: toluen, hexobarbital, imipramin,
meprobamat, tolbutamid, pentobarbital...
+ Epoxy hoá (Epoxidation)
/°\

ỌH ỌH

/\

I I

R—C H = C H 2 ----------- ► HRC— CH2 ----------- ► HRC— CH2

Carbamazepin, protriplin... là cơ chất của phản ứng này.
+ Oxy hóa khử alkyl (Dealkylation)
r _ x _ CH3 ------------► R —X —CH 2O H ------------ ► R - X H

+ RCHO

Clopromazin, imipramin, erythromycin, diazepam, morphin, griseofulvin,
papaverin, codein... được chuyển hoá theo cách này.
Ngoài các phản ứng kể trên các thuốc còn có thể được chuyển hóa
bằng:
+ Oxy hóa khử amin

0H

R—CH—CH 3 ------------------------------------------------------- ► R—c _ c h 3 ------► R—
NH 2

NH,

+ N- Hydroxyl hoá
NHOH

NH-

+ N- Oxy hoá
r 3n

R3N

— ►o

+ s — Oxy hoá
R2S

+Khử sulfur (Desulfuration)
R2C = S

► R2c = 0


7

• Các phản ứng oxy hoá khác: Là các phản ứng không xảy ra ở microsom,
bao gồm:
+ Oxy hoá alcol và aldehyd:
CH 3CH 2OH ------------ ► CH 3C H = 0 ------------ ► CH 3CO OH

+ Oxy hoá các purin: Những dãn xuất của purin (cafein, theophvlin,
theobromin, 6-mercaptopurin) bị oxy hoá tạo acid uric.
+ Oxy hoá catechol
o

OH

o

„OH

b. Phản ứng khử
Gồm các phản ứng:
+ Khử ở nhân vòng: Ví dụ nicotin bị khử thành koniin.
+ Khử azo
R,— N = N - R 2

R,— N H 2 +

R2— N H 2

+ Khử các dẫn xuất nitro

Cloramphenicol, nitrofuran... là cơ chất của phản ứng này.
+ Khử các aldehyd: ví dụ khử cloral hydrat bị khử thành
tricloethanol
+ Khử loại halogen (Reductive dehalogenation)
CCLị

CHCI 3

+

HC1

c. Phản ứng thuỷ phân
Dưới tác dụng của các enzym esterase và amidase các ester hoặc amid

sẽ bị thuỷ phân. Các esterase có hoạt tính mạnh hơn amidase. Trường hợp


8

acetylcholin bị thuỷ phân bởi acetylcholinesterase thành cholin và acid acetic
là ví dụ điển hình của loại phản ứng này.
1.1.2.2. Các phản ứng pha II
Pha II còn được gọi là pha liên hợp. Sau khi chuyển hoá qua pha I các
chất chuyển hoá vừa tạo thành có một số nhóm chức phân cực hơn như — OH,
-NH2 ... có thể liên hợp được với một số chất như acid glucuronic, acid acetic,
acid sulfuric, acid mercaptopuric, glutathion, a

aminoacid, glutamin,

sulfocyanicL.trong cơ thể để cuối cùng tạo thành chất liên hợp có phân tử
lượng lớn hơn, thân nước hơn, do đó dễ thải ra ngoài qua thận hay mật. Tuy
nhiên cũng có chất sau khi acetyl hoá lại khó tan trong nước hơn chất mẹ nên
khó thải trừ hơn, sulfonamid là một ví dụ điển hình.
Các phản ứng pha II gồm:
a. Phản ứng liên hợp với acid acetic (acetyl hoá)

R—NH2 + Acetyl coenzym A --- ► R— N

+ Coezym A
COCH3

Các chất có chứa amin bậc nhất (như Histamin), các aminoacid không
phải là những aminoacid sinh lý, các hydrazin, hydrazid (như isoniazid),
sulfamid đều có thể bị acetyl hoá .

b. Phản ứng liên hợp với acid sulfuric (sulfur hoá)
R — OH

+

PAPS

-------------- ► R— SO4

+

PAP

H
Các chất có nhóm chức phenol hoặc alcol cua carbua hydro mạch
thẳng, mạch nhánh (như: cloramphenicol, oestron, butanol...) sẽ liên hợp với
PASP (3’-phosphoadenosin-5-phosphosulfat), dạng hữu cơ của acid sulfuric
trong bào tương của tế bào.
c. Phản ứng liên hợp với hợp chất mang nhóm thiol
Các hợp chất hữu cơ chứa halogen có thể liên hợp với những chất mang
nhóm thiol (-SH) như cystein, N-acetyl cystein, glutathion...


9

R,— CH2- X

+

r 2s h

R,— CH2- S R 2 +

HX

Bromsulfonphtalein (BSP), clorotoluen ... chuyển hoá như vậy ở gan.
d. Phản ứng liên hợp với glycocol (glycin)
Một số acid có nhân thơm tạo liên kết amid với nhóm am in của
glycocol, cho những amid tương ứng:
Ví dụ:
COOH

CO —N H —CH2

H2N - C H 2
+

I ’

COOH

COOH
OH

OH

Acid salicyluric

Acid salicylic
e. Phản ứng methyl hoá

Đây là quá trình phổ biến trong cơ thể động vật. Cơ chất sẽ kết hợp với
S-Adenosylmethionin, là chất mang nhóm methyl. Tuỳ theo nhóm chức trong
cấu trúc của cơ chất mà có thể N-methyl hoá (gắn nhóm methyl (CH3) vào
phân tử một chất qua nguyên tử nitơ) hoặc o - methyl hoá,

s - methyl hoá...Ví

dụ methyl hóa histamin cho 4- methyl histamin, methyl hóa nicotinamid cho
N- methyl nicotinamid, methyl hóa noradrenalin cho adrenalin...

Nor- adrenalin

hợp với acid glucuronic

Adrenalin

Nhiều chất có thể liên hợp với UDP-GA (Uridin 5 ’-diphospho-a-Dglucuronic acid), hay còn gọi là “acid glucuronic hoạt hoá” để tạo thành
glucuronid. Có rất nhiều chất có thể liên hợp với acid glucuronic như:
+ Các rượu và phenol (morphin, phenol, steroid...), tạo thành dẫn xuất
este.


10

4- Các acid mạch thẳng hoặc acid có nhân thơm (acid salicylic, acid
nicotinic), tạo thành ete.
+ Các amin mạch thẳng, amin thơm (sulfamid...), tạo dẫn xuất Nglucuronid.
+ Các chất có chứa lưu huỳnh, tạo dẫn xuất S-glucuronid.
Trong thực tế người ta thấy phản ứng liên hợp glucuronic thường đi cùng với

liên hợp sulfuric, và đây là con đường chủ yếu của chuyển hoá cơ chất.
1.1.3. Các enzym tham gia chuyên hoá thuốc ở gan.
1.1.3.1. Các enzym pha I [51], [79].
Tên, vị trí khư trú trong tế bào, loại phản ứng xúc tác của các enzym
chủ yếu tham gia xúc tác cho các phản ứng chuyển hoá thuốc ở pha I được
tóm tắt trong bảng 1.1:
Bảng 1.1. Các enzym pha 1
Enzym
Cytochrome P450 (CYP)

Loại phản ứng xúc tác Vị trí khư trú trong tế bào
Oxy hoá sử dụng một

Microsom

nguyên tử oxy
(Monooxygenation)
Flavin monooxygenation

N- (hoặc S-) Oxy hoá

Mierosom

Oxy hoá khử amin

Ty thể

(FMO)
Monoamine Oxidase
(MAO)

Semicarbazide sensitive

Oxy hoá khử amin

amine Oxidase (SSAO)
Alcohol dehydrogenase

Oxy hoá alcol

Bào tương

Aldehyd dehydrogenase

Oxy hoá aldehyd

Bào tương

Aldehyd oxidase

Oxy hoá aldehyd

Bào tương

Reductase

Khử

Bào tương, Microsom, Ty
thể

11

Trong số đó, Cytochrome P450 được đánh giá là hệ enzym quan trọng
nhất trong chuyển hoá thuốc vì theo thống kê 80% dược phẩm có mặt trên thị
trường hiện nay là cơ chất của hệ thống enzym này [33J, [71 ], [73J.
1.1.3. 2. Các enzym pha II [79].
Các enzym tham gia chuyển hoá thuốc ở pha II chủ yếu là các enzym
vận chuyển (transferase) xúc tác cho các phản ứng liên hợp. Các enzym chính
được tóm tắt trong bảng 1.2:
Bảng 1.2. Các enzym pha II
Enzym

Loại phản ứng xúc tác

Glutathione S-transferase (GST)

Liên hợp với các chất mang
nhóm thiol (- SH)

Sulfotransferase (ST)

Liên hợp với acid sulfuric

N-Acetyl transferase (NAT)

Liên hợp với acid acetic

UPD-glycosyltransferase (UDPGT)

Liên hợp với acid glucuronic

Nhiều loại Methyltransferase

Methyl hóa


12

1.2. HỆ THỐNG ENZYM OXY HOÁ PHỤ THUỘC CYTOCHROM P450.
1.2.1. Tóm lược lịch sử nghiên cứu
1.2.1.1. Trên thê giới.
Từ những năm 1940, Cytochrom P450 đã được phát hiện ra trong quá
trình nghiên cứu một hệ enzym xúc tác cho những phản ứng oxy hoá đặc biệt
(monooxygenation), xảy ra theo cơ chế chung sau: NAD(P)H + 0 2 + R(cơ
chất) -» NADP+ +HoO + RO. Cơ chất của phản ứng này gồm hàng ngàn chất
hóa học có cấu trúc khác nhau như : thuốc, steroid, thuốc trừ sâu... . Khi đó
người ta cũng đã biết rằng những phản ứng trên chỉ xảy ra trong microsom
(những túi nhỏ có nguồn gốc từ lưới nội sinh chất (endoplasmic reticulum) thu
được khi các tế bào bị nghiền đồng thể) của tế bào gan và tế bào của một số
mô nhất định.Tuy nhiên, thành phần nào trong microsom chịu trách nhiệm
xúc tác cho phản ứng thì vẫn chưa được biết rõ [41].
Mãi đến năm 1958, Garfinkel và Klingenberg khi nghiên cứu
microsom tế bào gan lợn và chuột đã tìm ra một loại enzym mà khi kết hợp
với oxyd carbon (CO) có đỉnh phổ hấp thụ ở bước sóng À, = 450

11111.

Sau đỏ

Omura và Sato (1964) phát hiện ra enzym này có bản chất hemoprotein và là
thành phần quan trọng nhất của hệ thống enzym chuyên xúc tác cho các phản
ứng monoxygenation nói trên. Sato đặt tên cho nó là Cyt-P450 để chỉ sự hấp
thụ không bình thường của hợp chất Enzym-CO tại bước sóng Ằ=450 nm và
tên gọi đó được dùng cho đến ngày nay [41].
Năm 1968, các thành phần khác của hệ thống Cyt-P450 đã được đồng
thời hai nhóm nghiên cứu độc lập tìm ra. Nhà nghiên cứu Gunsalus từ trường
đại học tổng hợp bang Illinois (Mỹ) chuyên nghiên cứu về loại vi khuẩn sống
trong môi trường có camphor, thấy rằng hệ thống Cyt-P450 ở vi khuẩn gồm ba
thành phần: NADH, một protein chứa sắt và lưu huỳnh gọi là putidaredoxin và


13

một loại Cyt-P450 mà Gunsalus đặt tên là Cyt-P450cam. Cùng thời gian đó hai
nhà nghiên cứu là Lu và Coon thuộc trường tổng hợp bang Michigan (Mỹ) đã
tiến hành nghiên cứu trên microsom gan thỏ và công bố ba cấu tử cần thiết
của hệ thống Cyt-P450 là: Cyt-P450, Cyt-P450-reductase (CPR) và
phospholipid. Các nghiên cứu sâu hơn sau đó đã chỉ ra rằng mô hình hệ thống
Cyt-P450 do Lu và Coon công bố là phổ biến đối với hầu hết các loài động vật
[33].
Năm 1979, Coon và cộng sự đã tìm ra và mô tá chi tiết cư chế hoạt
động của hệ thống Cyt-P450 [20].
Những năm sau đó những hiểu biết về Cyt-P450 được mở rộng, người ta
phát hiện ra rằng Cyt-P450 không phải là một phân tử protein duy nhất mà
gồm nhiều dạng isozym có cấu trúc khác nhau. Chính vì thế người ta coi CytP450 là một đại gia đình những protein chứa Hem xúc tác sự chuyển hóa
nhiều chất nội sinh có đặc tính thân mỡ như steroid, acid béo, vitamin tan
trong mỡ, prostaglandin, leucotrien, thromboxan...và các chất ngoại sinh
(xenobiotics) [51], [73], [82J.
Năm 1987 một hệ thống danh pháp thống nhất của Cyt-P45(J đã ra đời

trong đó các Cyt-P450 được phân loại và gọi tên dựa trên trình tự acid amin
trong phân tử mà trình tự này lại do trình tự của các cặp base nitơ trong gen
quy định . Để thống nhất và đơn giản về mặt thuật ngữ, người ta quy ước dùng
chữ CYP thay cho Cyt — P450. Ký hiệu tiếp theo gốc CYP bằng số Ả rập để
chỉ họ (family). Trình tự acid amin của các isozym trong cùng một họ khác
hơn 70% trình tự acid amin của các isozym thuộc họ khác. Trong một họ lại
chia thành các nhóm dưới họ (subfamily), ký hiệu bằng một chữ cái, biểu thị
nhóm gen có quan hệ huyết thống cao (hơn 70% thứ tự acid amin tương tự
nhau). Trong một nhóm dưới họ lại chia ra các Cyt-P450 riêng biệt, đánh số
tiếp theo. Ví dụ CYP 3A3, CYP 3A4 [22], [72J.


14

Họ (Families)

Dưới họ
(Subfamilies)

4

1A1
1A2
2A6
2A7

1B1

3A3
3A4

3A5
3A7

7

11 17

19

21

27

21A2
4A9 4B1 4F2 11A1 11B1
4A11
4F3
11B2

2B6 2< 8 2D6 2É1 2
2C9

2C10
2C17
2C18
2C19

//m/ỉ 7.7. “Đa/ gia

CMACyt-P450 [ 51 ]

Năm 1991, Nerbert đã xác định được một gen Cyt-P450 do tổ tiên
truyền lại đã tồn tại cách đây hơn 3,5 tỉ năm. Cho đến nay, người ta đã phát
hiện được 221 gen và 12 gen được coi là pseudogen cua Cyt-P450 trong 31
loại sinh vật có nhân thật (eukaryote) và 11 loại sinh vật tiền nhân
(prokaryote). Ở người, đã phát hiện được 32 gen và có 5 gen được coi là
pseudogen của Cyt-P450. Theo chức năng, các gen này được chia làm 2 loại:
- Những gen tổng hợp ra các enzym chuyển hoá steroid ở các tổ chức
đặc hiệu như tuyến thượng thận, tuyến sinh dục và nhau thai.
- Những gen tổng hợp ra các enzym tham gia vào chuyển hoá các
xenobiotic (thuốc, chất trừ sâu, hoá chất môi trường) [58], [51].
Năm 1993, một hội nghị về Cyt-P450 đã được tổ chức tại Bồ Đào Nha,
thu hút nhiều nhà nghiên cứu Cyt-P450 trên thế giới. Hơn 300 báo cáo về CytP450 đã được công bố xoay quanh nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu cơ bản đến
những nghiên cứu ứng dụng như: cấu trúc- chức năng của Cyt-P450; sự tương
tác của các thành phần trong hệ thống Cyt-P450, cơ chế vận chuyển điện tử và
hoạt tính oxy hoá; các tính chất sinh hoá, sinh lý và sinh học phân tử của hệ
Cyt-P450; sự tiến hoá, sự đa dạng loài của gen Cyt-P450; cơ chế kiểm soát
quá trình sinh tổng hợp Cyt-P450; Cyt-P450 trong ung thư và độc học miễn


15

dịch (immunotoxycology); công nghệ sinh học, các chức năng mới của CytP450 và khả năng ứng dụng trong thiết kế thuốc...[28] , [32], [34], [76].
Đến nay, các nghiên cứu về Cyt-P450 càng được mở rộng với sự trợ
giúp của nhiều phương tiện hiện đại. Hướng nghiên cứu ứng dụng đang dược
các nhà khoa học chú ý đặc biệt là các nhà Y và Dược học nhằm hiểu rõ cơ
chế tác dụng của thuốc để tìm ra những phương pháp và những loại thuốc
chữa bệnh mới có khả năng điều trị những căn bệnh nguy hiểm như ung thư
hay AIDS [47], [48], [28].
1.2.1.2. Ở Việt Nam.

Những kiến thức, thông tin về Cyt-P450 mặc dù mới được du nhập vào
Việt Nam cách đây chưa lâu (đầu những năm 80) nhưng thực sự đã gây chú ý
cho nhiều nhà khoa học.
Tiếp thu và kế thừa những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học
trên thế giới, những nghiên cứu về Cyt-P450 ở Việt nam chu yếu là những
nghiên cứu ứng dụng đặc biệt là trong lĩnh vực Y và Dược.
Năm 1985, TS Nguyễn Thị Ngọc Dao, phòng Enzym học Viện công
nghệ sinh học, đã nghiên cứu tách chiết và làm sạch một phần Cyt-P450. Kể
từ đó đến nay, TS Dao đã phối hợp với nhiều nhà khoa học ở nhiều nơi khác
nhau (Học viện quân Y, Trung tâm nhiệt đới Việt Nga...) để tiến hành nhiều
công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất độc khác nhau (nhiên liệu
lỏng tên lửa, yperit, CC14... và gần đây nhất là dioxin) lên hệ thống enzym CytP450 để từ đó tìm ra các loại thuốc có nguồn gốc từ dược liệu Việt nam có tác
dụng phòng và chống các chất độc đó [5], [6], [7], [20].
Trịnh Thị Hồng Duyên (Khoa Dược, đại học Y, Dược thành phô Hồ Chí
Minh), Nguyễn Thái Biềng (Bộ môn Dược lý, Học viện quân y) đã nghiên cứu
ảnh hưởng của một số dược liệu (thuốc phiện, tam thất, rotundin từ củ bình
vôi) lên hệ thống Cyt-P450 để có những nhận định trong bào chế dạng thuốc
mới cũng như đưa ra những tư vấn về sử dụng thuốc trong lâm sàng [ 1], [8].


16

Gần đây, Phòng Hoá sinh protein- Viện Công nghệ Sinh học đã tách
dòng và biểu hiện đoạn gen exon 7- CYP1A1 từ máu nguyên của người Việt
Nam ở E. Coli. Đây là một bước tiến mới trong việc ứng dụng những thiết bị
và phương pháp hiện đại trong nghiên cứu về Cyt-P450 ở Việt Nam [20].
Tuy những công trình nghiên cứu về Cyt-P450 ở Việt Nam hiện còn
khiêm tốn nhưng trong tương lai không xa lĩnh vực nghiên cứu về Cyt-P450
chắc chắn sẽ phát triển được do các nhà khoa học ngày càng nhận thức được
vai trò và khả năng ứng dụng to lớn của những nghiên cứu về Cyt-P450 trong

nhiều lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực Y và Dược học.
1.2.2. Cytochrom P450 (EC.1.14.14.1)
I.2.2.I. Phân bô
Cyt-P450 là một enzym gắn màng nằm chủ yếu ở microsom trên lưới
nội sinh chất và màng phía trong ty thể. Ở đây Cyt-P450 nằm cùng với hai
thành phần khác trong hệ thống của mình là CPR và phospholipid theo tỷ lệ:
1CPR / 20-40 Cyt-P450 / 3.500 phospholipid [1], [41].

NADPH

9,99,9.99,^ 9^ 9:

Hình 1.2. Mô hình hệ thống Cyt-P450 ở màng lưới nội sinh chất [41 ]


17

Ớ người, Cyt-P450 tập trung nhiều nhất và được nghiên cứu nhiều nhất
là ở tế bào gan. Tuy nhiên người ta cũng tìm thấy sự có mặt của chúng ở nhiều
loại tế bào khác như : tế bào phổi, thận, vỏ thượng thận, niêm mạc ruột, tinh
hoàn, buồng trứng... .
Trong tự nhiên, Cyt- P450 phân bố rất rộng rãi. Nó được tìm thấy ớ
trong tế bào của người và nhiều loài động vật có vú khác, trong tế bào của
chim, rắn, ếch nhái, cá, trong nhiều loài thực vật, vi sinh vật, côn trùng và cả ở
nấm men, nấm mốc...Vì thế, cũng có lý khi nói rằng: “Cyt-P450 có mặt trong
tất cả các loài sinh vật sống trên trái đất” [13], [22], [32], [34], [57], [67].
I.2.2.2. Cấu trúc [1], [20], [37], [72], [23], [79]
Cyt-P450 là tên chung của một

“đại gia đình” enzym gồm nhiều

isozym có trọng lượng phân tử khoảng từ 45-60 kDa, trong phân tử có chứa
một nhân Hem ở dạng Fe protoporfirin IX và một chuỗi polypeptid.

H

h 3c

h 3c

ho2

Hình 1.3. Nhân Hem ở dạng Fe protoporfirin IX của Cyt-P450 [79]
Cấu trúc của các Cyt-P450 được xác định bằng nhiều kỹ thuật khác
nhau. Các nghiên cứu về cấu trúc bậc một của Cyt-P450 đã chỉ ra ràng trình tự
acid amin trong phân tử của mỗi isozym thường có thể khác nhau rất nhiều (có
trường hợp khác đến 70%), hơn nữa đoạn acid amin ở đầu N tận thường là
không giống nhau giữa các Cyt-P450. So sánh về trình
isozym trong cùng một loài, người ta thấy rằng sự khái