Nghiên cứu tinh chế thiết lập chất chuẩn vinblastin sulfats và vincristin sulfat
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.1 MB, 89 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ðẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
MAI THANH HÀ
NGHIÊN CỨU TINH CHẾ, THIẾT LẬP
CHẤT CHUẨN VINBLASTIN SULFAT
VÀ VINCRISTIN SULFAT
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ðẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
MAI THANH HÀ
NGHIÊN CỨU TINH CHẾ, THIẾT LẬP
CHẤT CHUẨN VINBLASTIN SULFAT
VÀ VINCRISTIN SULFAT
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC – ðỘC CHẤT
MÃ SỐ : 60 73 15
Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Tường Vy
2. PGS. TS. Trịnh Văn Lẩu
HÀ NỘI 2012
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:
- PGS.TS. Trịnh Văn Lẩu – Chủ tịch Hội ñồng Dược ñiển Việt Nam,
nguyên Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương.
- TS. Nguyễn Tường Vy – Phòng Sau ñại học – Trường ðại học Dược
Hà Nội.
Những người thầy ñã trực tiếp hướng dẫn tôi tận tình trong suốt quá trình thực
hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành ñến Ban giám hiệu, Phòng Sau
ñại học, Bộ môn Hóa phân tích và các thầy cô giáo trường ðại học Dược Hà
Nội ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình
thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ñốc, Ths. Lê Thị Thu - Phó
trưởng Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất ñối chiếu và các bạn ñồng nghiệp
Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất ñối chiếu - Viện kiểm nghiệm thuốc Trung
ương ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện và san sẻ công việc trong thời gian qua ñể tôi
hoàn thành tốt khóa học và luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia ñình và bạn bè ñã luôn ñộng viên, quan
tâm, chia sẻ và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn
này.
Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2012
Ds. Mai Thanh Hà
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng và các hình
ðẶT VẤN ðỀ…………………………………………………………………
1
Chương 1. TỔNG QUAN…………………………………………………..
3
1.1. Tổng quan về ñối tượng nghiên cứu…………………………………
3
1.1.1. Vinblastin sulfat………………………………………………............
3
1.1.2. Vincristin sulfat………………………………………………………..
4
1.1.3. Các nghiên cứu trên thế giới…………………………………………
5
1.1.4. Các nghiên cứu trong nước…………………………………………..
5
1.1.5. Tổng quan về phương pháp phân tích Vinblastin sulfat và
Vincristin sulfat………………………………………………………
1.2. Tổng quan về tinh chế………………………………………………….
6
8
1.3. Tổng quan một số phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên
cứu ñề tài…………………………………………………………............
8
1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao…………………………...
8
1.3.2. Phương pháp ño phổ hồng ngoại……………………………………
9
1.3.3. Phổ tử ngoại khả kiến…………………………………………………
9
1.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân…………………………………………
9
1.3.5. Phương pháp phân tích khối phổ……………………………………
11
1.3.6. Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng…………………………
11
1.4. Phương pháp thiết lập chất ñối chiếu………………………………
13
1.4.1. Xây dựng quy trình thiết lập chất ñối chiếu………………………..
13
1.4.2. ðánh giá nguyên liệu…………………………………………...........
14
1.4.3. Sản xuất chất ñối chiếu……………………………………………….
14
1.4.4. Kiểm tra ñộ ñồng nhất của quá trình ñóng gói………………......
14
1.4.5. Kiểm tra bán thành phẩm…………………………………………….
14
1.4.6. Lập hồ sơ, chứng chỉ, cấp phát………………………………………
14
1.4.7. Kiểm tra ñịnh kỳ……………………………………………………….
15
1.4.8. Lưu hồ sơ………………………………………………………...........
15
1.5. Tính mới, sáng tạo của ñề tài…………………………………………
15
Chương 2. ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…..
17
2.1. ðối tượng nghiên cứu…………………………………………………..
17
2.2. Phương tiện nghiên cứu……………………………………………….
17
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………….
17
2.2.2. Hóa chất, dung môi, chất ñối chiếu………………………………….
17
2.3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………….........
17
2.3.1. Kiểm tra nguyên liệu trước khi tinh chế…………………………….
17
2.3.2. Tinh chế………………………………………………………………….
18
2.3.3. Xác ñịnh cấu trúc, nhận dạng và ñánh giá nguyên liệu sau khi
tinh chế………………………………………………………………………….
18
2.3.4. Thiết lập chất ñối chiếu……………………………………………….
18
2.4. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………
18
2.4.1. Phương pháp tinh chế Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat……..
18
2.4.2. Xác ñịnh cấu trúc, nhận dạng và ñánh giá nguyên liệu
Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat sau khi tinh chế…………………….
19
2.4.3. Thiết lập chất ñối chiếu……………………………………………….
19
2.4.3.1. Xây dựng quy trình thiết lập chất ñối chiếu……………………
19
2.4.3.2. ðánh giá nguyên liệu theo quy trình ñã xây dựng……………
20
2.4.3.3. ðóng gói………………………………………………….................
20
2.4.3.4. ðánh giá ñộ ñồng nhất của quá trình ñóng gói………………..
20
2.4.3.5. ðánh giá liên phòng…………………………………………………
20
2.4.3.6. Phương pháp xử lý số liệu………………………………………….
20
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
21
3.1. Lựa chọn ñiều kiện phân tích………………………………………..
21
3.2. Kiểm tra nguyên liệu trước khi tinh chế…………………………..
22
3.3. Quy trình tinh chế………………………………………………...........
22
3.3.1. Vinblastin sulfat……………………………………………………….
22
3.3.2. Vincristin sulfat………………………………………………………..
26
3.4. Xác ñịnh cấu trúc, nhận dạng chất sau khi tinh chế………….....
29
3.4.1. Vinblastin sulfat……………………………………………………….
29
3.4.1.1. Tính chất………………………………………………………………
29
3.4.1.2. Phổ tử ngoại khả kiến………………………………………………
29
3.4.1.3. Phổ hồng ngoại……………………………………………………….
30
3.4.1.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân……………………………………..
31
3.4.1.5. Phổ khối lượng……………………………………………………….
31
3.4.2. Vincristin sulfat……………………………………………………….
32
3.4.2.1. Tính chất………………………………………………………………
32
3.4.2.2. Phổ tử ngoại khả kiến……………………………………………….
32
3.4.2.3. Phổ hồng ngoại………………………………………………………
32
3.4.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân……………………………………..
33
3.4.2.5. Phổ khối lượng……………………………………………………….
34
3.5. Thiết lập chất ñối chiếu………………………………………………..
34
3.5.1. Vinblastin sulfat………………………………………………………..
34
3.5.1.1. Xây dựng quy trình thiết lập chất ñối chiếu Vinblastin sulfat
34
3.5.1.2. ðánh giá nguyên liệu……………………………………………….
42
3.5.1.3. ðóng gói………………………………………………………………
47
3.5.1.4. ðánh giá ñồng nhất quá trình ñóng gói…………………………
47
3.5.1.5. So sánh liên phòng thí nghiệm……………………………………
48
3.5.1.6. Xử lý kết quả…………………………………………………………
48
3.5.2. Vinblastin sulfat………………………………………………………..
51
3.5.2.1. Xây dựng quy trình thiết lập chất ñối chiếu Vincristin sulfat
51
3.5.2.2. ðánh giá nguyên liệu……………………………………………….
59
3.5.2.3. ðóng gói………………………………………………………………
63
3.5.2.4. ðánh giá ñồng nhất quá trình ñóng gói…………………………
64
3.5.2.5. So sánh liên phòng thí nghiệm……………………………………
65
3.5.1.6. Xử lý kết quả…………………………………………………………
65
Chương 4. BÀN LUẬN……………………………………………………...
68
4.1. Tính mới và hiệu quả kinh tế…………………………………………
68
4.2. Về quy trình tinh chế…………………………………………………
68
4.3. Về xác ñịnh cấu trúc, nhận dạng chất và kiểm tra nguyên liệu
sau khi tinh chế……………………………………………………………….
68
4.4. Về ñánh giá sự phù hợp của phương pháp xác ñịnh tạp chất
liên quan và ñịnh lượng.........................................................................
69
4.5. Về thiết lập chất ñối chiếu……………………………………………
70
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………..
71
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ACN
: Acetonitril
ANOVA
: Analysis of variance
Phân tích phương sai
13
C-NMR
COSY
: 13-Carbon nuclear magnetic resonance
: Chemical Shift Correlation Spectrometry
Liên hệ dịch chuyển hóa học
CRS
: Chemical reference standard
Chất ñói chiếu hóa học
DAD
: Diode array detector
DðVN
: Dược ñiển Việt Nam
DEPT
: Distotionless enhancement by polarization transfer
Chuyển ñổi phân cực biến ñổi dạng (phổ)
ðKSK
: ðiều kiện sắc ký
HMBC
: Heteronuclear Multiple Bond Coherence
Liên hệ ña lượng tử dị nhân
1
H-NMR
HPLC
: Proton nuclear magnetic resonance
: High performance liquid chromatoghraphy
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HSQC
: Heteronuclear Singular Quantum Coherence
Liên hệ ñơn lượng tử dị nhân
IR
: Infrared
Hồng ngoại
ICRS
: International chemical reference standard
JCRS
: Japan chemical reference standard
LOD
: Limit of detection
Giới hạn phát hiện
MeOH
: Methanol
MS
: Mass spectrometry
Phổ khối lượng
N
: Số ñĩa lý thuyết
NMR
: Nuclear magnetic resonance
Cộng hưởng từ hạt nhân
PA
: Pure analysis
PTN
: Phòng thí nghiệm
R
: ðộ phân giải
RSD
: Relative standard deviation
ðộ lệch chuẩn tương ñối
Spic
: Diện tích pic
SKð
: Sắc ký ñồ
TB
: Trung bình
TGA
: Thermogravimetric analysis
Phân tích nhiệt trọng lượng
TLCC & CðC
: Khoa Thiết lập chất chuẩn và chất ñối chiếu
tR
: Thời gian lưu
WHO
: World health organization
Tổ chức y tế thế giới
UV – VIS
: Ultraviolet - Visible
Tử ngoại - khả kiến
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
TT bảng
Bảng 1.1
Tên bảng
Trang
Chương trình sắc ký phân tích Vinblastin sulfat của một số
13
dược ñiển
Bảng 1.2
Chương trình sắc ký phân tích Vincristin sulfat của một số
13
dược ñiển
Bảng 3.1
ðiều kiện phân tích Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat
21
Bảng 3.2
Kết quả ñánh giá nguyên liệu Vinblastin sulfat và
22
Vincristin sulfat trước khi tinh chế
Bảng 3.3
So sánh kết quả trước và sau khi tinh chế Vinblastin sulfat
25
Bảng 3.4
So sánh kết quả trước và sau khi tinh chế Vincristin sulfat
28
Bảng 3.5
Kết quả xác ñịnh giới hạn phát hiện tạp chất liên quan của
37
Vinblastin sulfat
Bảng 3.6
Kết quả ñánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc ký
38
Bảng 3.7
Kết quả xác ñịnh khoảng tuyến tính ñịnh lượng Vinblastin
39
sulfat
Bảng 3.8
Kết quả ñánh giá ñộ lặp lại ñịnh lượng Vinblastin sulfat
40
Bảng 3.9
Kết quả ñánh giá ñộ chính xác trung gian ñịnh lượng
40
Vinblastin sulfat
Bảng 3.10
Kết quả xác ñịnh ñộ ñúng ñịnh lượng Vinblastin sulfat
41
Bảng 3.11
Kết quả khoảng xác ñịnh ñịnh lượng Vinblastin sulfat
42
Bảng 3.12
Kết quả pH của nguyên liệu Vinblastin sulfat
44
Bảng 3.13
Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu
44
Vinblastin sulfat
Bảng 3.14
Kết quả tạp chất liên quan của nguyên liệu Vinblastin
sulfat
45
Bảng 3.15
Kết quả ñịnh lượng nguyên liệu Vinblastin sulfat
46
Bảng 3.16
ðộ ñồng nhất của mất khối lượng do làm khô Vinblastin
47
sulfat
Bảng 3.17
ðộ ñồng nhất hàm lượng Vinblastin sulfat
47
Bảng 3.18
Kết quả ñánh giá thành phẩm Vinblastin sulfat
48
Bảng 3.19
Kết quả ñánh giá ANOVA
48
Bảng 3.20
Kết quả xác ñịnh giá trị ấn ñịnh của thành phẩmVinblastin
49
sulfat
Bảng 3.21
Kết quả xác ñịnh giá trị Z
50
Bảng 3.22
Kết quả xác ñịnh giới hạn phát hiện tạp chất liên quan của
54
Vincristin sulfat
Bảng 3.23
Kết quả ñánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc ký
54
Bảng 3.24
Kết quả xác ñịnh khoảng tuyến tính ñịnh lượng Vincristin
55
sulfat
Bảng 3.25
Kết quả ñánh giá ñộ lặp lại ñịnh lượng Vincristin sulfat
56
Bảng 3.26
Kết quả ñánh giá ñộ chính xác trung gian ñịnh lượng
57
Vincristin sulfat
Bảng 3.27
Kết quả xác ñịnh ñộ ñúng ñịnh lượng Vincritin sulfat
57
Bảng 3.28
Kết quả khoảng xác ñịnh ñịnh lượng Vincristin sulfat
58
Bảng 3.29
Kết quả pH của nguyên liệu Vincristin sulfat
60
Bảng 3.30
Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu
61
Vincristin sulfat
Bảng 3.31
Kết quả tạp chất liên quan của nguyên liệu Vincristin sulfat
62
Bảng 3.32
Kết quả ñịnh lượng nguyên liệu Vincristin sulfat
63
Bảng 3.33
ðộ ñồng nhất của mất khối lượng do làm khô Vincristin
64
sulfat
Bảng 3.34
ðộ ñồng nhất hàm lượng Vincristin sulfat
64
Bảng 3.35
Kết quả ñánh giá thành phẩm Vinblastin sulfat
65
Bảng 3.36
Kết quả ñánh giá ANOVA
65
Bảng 3.37
Kết quả xác ñịnh giá trị ấn ñịnh của thành phẩmVincristin
66
sulfat
Bảng 3.38
Kết quả xác ñịnh giá trị Z
67
Bảng 4.1
Số liệu kiểm tra sự phù hợp của phương pháp HPLC xác
69
ñịnh tạp chất liên quan và ñịnh lượng của Vinblastin sulfat
Bảng 4.2
Số liệu kiểm tra sự phù hợp của phương pháp HPLC xác
70
ñịnh tạp chất liên quan và ñịnh lượng của Vincristin sulfat
Bảng 4.3
Các chỉ tiêu ñã ñánh giá Vinblastin sulfat và Vincristin
sulfat
70
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ
TT hình
Tên hình
Trang
Hình 3.1
Sơ ñồ quy trình tinh chế Vinblastin sulfat
24
Hình 3.2
SKð tạp chất liên quan trong nguyên liệu Vinblastin sulfat
25
trước và sau khi tinh chế
Hình 3.3
SKð ñịnh lượng nguyên liệu Vinblastin sulfat trước và sau
26
khi tinh chế
Hình 3.4
Sơ ñồ quy trình tinh chế Vincristin sulfat
27
Hình 3.5
SKð tạp chất liên quan trong nguyên liệu Vincristin sulfat
28
trước và sau khi tinh chế
Hình 3.6
SKð ñịnh lượng nguyên liệu Vinblastin sulfat trước và sau
28
khi tinh chế
Hình 3.7
Phổ tử ngoại khả kiến của Vinblastin sulfat
29
Hình 3.8
Phổ hồng ngoại của Vinblastin sulfat
30
Hình 3.9
Công thức cấu tạo của Vinblastin sulfat
31
Hình 3.10
Phổ khối lượng của Vinblastin sulfat
31
Hình 3.11
Phổ tử ngoại khả kiến của Vincristin sulfat
32
Hình 3.12
Phổ hồng ngoại của Vincristin sulfat
33
Hình 3.13
Công thức cấu tạo của Vincristin sulfat
33
Hình 3.14
Phổ khối lượng của Vincristin sulfat
34
Hình 3.15
SKð mẫu thử Vinblastin sulfat không phân hủy
35
Hình 3.16
SKð mẫu thử Vinblastin sulfat ñể ngoài ánh sáng
35
Hình 3.17
SKð mẫu thử Vinblastin sulfat phân hủy ở 100oC
36
Hình 3.18
SKð mẫu thử Vinblastin sulfat phân hủy trong dung dịch
36
H2O2 3%
Hình 3.19
Tính ñặc hiệu ñịnh lượng Vinblastin sulfat
38
Hình 3.20
ðồ thị biểu diễn ñộ tuyến tính ñịnh lượng Vinblastin sulfat
39
Hình 3.21
Phổ hồng ngoại của Vinblastin chuẩn
43
Hình 3.22
Phổ hồng ngoại của nguyên liệu Vinblastin sulfat
43
Hình 3.23
ðồ thị mất khối lượng do làm khô của Vinblastin sulfat
44
Hình 3.24
SKð tạp chất liên quan trong nguyên liệu Vinblastin sulfat
45
Hình 3.25
SKð ñịnh lượng Vinblastin sulfat
46
Hình 3.26
SKð mẫu thử Vincristin sulfat không phân hủy
51
Hình 3.27
SKð mẫu thử Vincristin sulfat ñể ngoài ánh sáng
52
Hình 3.28
SKð mẫu thử Vincristin sulfat phân hủy ở 100oC
52
Hình 3.29
SKð mẫu thử Vincristin sulfat phân hủy trong dung dịch
53
H2O2 3%
Hình 3.30
Tính ñặc hiệu ñịnh lượng Vincristin sulfat
55
Hình 3.31
ðồ thị biểu diễn ñộ tuyến tính ñịnh lượng Vincristin sulfat
56
Hình 3.32
Phổ hồng ngoại của Vincristin chuẩn
59
Hình 3.33
Phổ hồng ngoại của nguyên liệu Vincristin sulfat
60
Hình 3.34
ðồ thị mất khối lượng do làm khô của Vincristin sulfat
61
Hình 3.35
SKð tạp chất liên quan trong nguyên liệu Vincristin sulfat
62
Hình 3.36
SKð ñịnh lượng Vincristin sulfat
63
ðẶT VẤN ðỀ
ðể ñảm bảo hiệu quả ñiều trị bệnh, thuốc ñòi hỏi phải ñạt chất lượng tốt và ñộ ổn
ñịnh cao. Muốn như vậy thuốc cần ñược kiểm tra chất lượng từ nguyên liệu ñến
thành phẩm thì mới có thể ñạt ñược chất lượng từ khâu sản xuất ñến người sử
dụng. Một trong những yếu tố góp phần quan trọng trong công tác kiểm tra chất
lượng thuốc ñó là chất chuẩn dùng trong phân tích kiểm nghiệm thuốc. Vì vậy,
sau khi chiết xuất, tổng hợp hoạt chất ñể làm thuốc thì song song phải nghiên
cứu thiết lập chất chuẩn từ hoạt chất ñó.
Trong các phác ñồ ñiều trị một số loại ung thư ở các bệnh viện ung bướu hiện
nay có mặt hoạt chất là Vincristin sulfat và Vinblastin sulfat. Từ thực tế ñó sẽ có
rất nhiều nguyên liệu Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat cũng như chế phẩm
chứa hai hoạt chất này ñược nhập khẩu về Việt Nam hoặc ñược tổng hợp ở Việt
nam ñể ñáp ứng nhu cầu sử dụng.
Các ñề tài thuộc chương trình “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ
trọng ñiểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược ñến năm 2020”, ñã nghiên
cứu tổng hợp hoặc chiết xuất ñược 28 hoạt chất trong ñó có Vincistin sulfat và
Vinblastin sulfat. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay chưa có chất chuẩn Vincristin
sulfat và Vinblastin sulfat phục vụ cho kiểm tra chất lượng các sản phẩm của ñề
tài cũng như ñánh giá chất lượng chế phẩm trên thị trường. Trong khi ñó nếu
mua chất chuẩn từ nước ngoài gặp rất nhiều khó khăn do giá rất cao và thủ tục
hải quan phức tạp.
Thêm vào ñó, Dược ñiển Việt Nam IV và các Dược ñiển nước ngoài (Dược ñiển
Anh, Mỹ, Châu Âu, Quốc tế, Trung Quốc) ñã có chuyên luận về Vinblastin
sulfat và Vincristin sulfat, ñều áp dụng các phương pháp phân tích sử dụng các
thiết bị hiện ñại yêu cầu phải có chất ñối chiếu Vinblastin sulfat và Vincristin
sulfat.
Xuất phát từ các lý do trên và nhằm chủ ñộng cho việc kiểm tra chất lượng
nguyên liệu và chế phẩm Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat của ñề tài, tiết
kiệm ngoại tệ nên việc thiết lập hai chất chuẩn này trở nên cấp thiết.
ðề tài “Nghiên cứu tinh chế, thiết lập chất chuẩn Vincristin sulfat và
Vinblastin sulfat” ñược thực hiện với 2 mục tiêu:
1
- Tinh chế nguyên liệu Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat ñạt tiêu chuẩn ñể
làm chất chuẩn.
- Thiết lập chất chuẩn Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat phục vụ công tác
kiểm nghiệm.
Với mong muốn, ñề tài hoàn thành sẽ góp thêm vào danh mục chất ñối chiếu của
Việt Nam và ñảm bảo ñược chất lượng nguyên liệu, chế phẩm thuốc Vinblastin
sulfat và Vincristin sulfat ñiều trị ung thư trên thị trường dược phẩm.
2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về ñối tượng nghiên cứu [20,22,31,32,33,34]
1.1.1. Vinblastin sulfat
Công thức phân tử: C46H58N4O9.H2SO4
Phân tử lượng: 909,07
Tên khoa học: Methyl (3aR,4R,5S,5aR,10bR,13aR)-4-(acetyloxy)-3a-ethyl-9[(5S,7R,9S)-5-ethyl-5-hydroxy-9-(methoxycarbonyl)-1,4,5,6,7,8,9,10-octahydro2H-3,7-methanoazacycloundecino[5,4-b]indol-9-yl]-5-hydroxy-8-methoxy-6methyl-3a,4,5,5a,6,11,12,13a-octahydro-1H-indolizino[8,1-cd]carbazole-5carboxylate sulphate.
Vinblastin sulfat có cấu trúc hóa học như sau:
Vinblastin sulfat là một alkaloid ñược chiết xuất, phân lập từ cây Dừa cạn
(Catharanthus roseus Apocyaceae), có tác dụng chống ung thư.
Vinblastin sulfat có nhiệt ñộ nóng chảy 284 - 2850C, góc quay cực [α]26D = - 280
(trong methanol) [30].
Vinblastin sulfat thường ñược bào chế dưới dạng thuốc tiêm hàm lượng 10 mg/ml.
Vinblastin là thuốc ñược lựa chọn ñể ñiều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, rau thai,
ung thư biểu mô tế bào có vảy ở ñầu và cổ, ung thư cổ và ung thư biểu mô tế bào
thận, ung thư vú. Các nghiên cứu cho thấy Vinblastin gây ñộc tế bào bằng cách
ức chế sự tạo thành các vi ống trên thời gián phân dẫn tới ngừng phân chia tế bào
ở pha giữa. Ở nồng ñộ cao Vinblastin còn thể hiện nhiều tác dụng phức tạp trên
tổng hợp acid nucleic và protein. Vinblastin hấp thu và phân bố nhanh vào các
3
mô của cơ thể, thuốc liên kết với protein huyết tương khoảng 75%, ít qua hàng
rào máu não và không ñạt nồng ñộ ñiều trị trong dịch não tủy. Vinblastin chuyển
hóa chủ yếu ở gan thành Deacetyl Vinblastin là chất có hoạt tính mạnh hơn.
Thuốc ñược thải trừ qua mật và nước tiểu, một số ñào thải dưới dạng không biến ñổi.
1.1.2. Vincristin sulfat
Công thức phân tử: C46H56N4O10.H2SO4
Phân tử lượng: 923,05
Tên khoa học: Methyl(3aR,4R,5S,5aR,10bR,13aR)-4-(acetyloxy)-3a-ethyl-9[(5S,7R,9S)-5-ethyl-5-hydroxy-9-(methoxycarbonyl)-1,4,5,6,7,8,9,10-octahydro
2H-3,7-methanoazacycloundecino[5,4-b]indol-9-yl]-6-formyl-5-hydroxy-8
methoxy-3a,4,5,5a,6,11,12,13a-octahydro-1H-indolizino[8,1-cd]carbazole-5carboxylate sulphate.
Vincristin sulfat có cấu trúc hóa học như sau:
Vincristin sulfat là một alkaloid ñược chiết xuất, phân lập từ cây Dừa cạn
(Catharanthus roseus Apocyaceae), có tác dụng chống ung thư.
Vincristin sulfat có nhiệt ñộ nóng chảy ở 2730 – 2810C, góc quay cực [α]26D =
+8,50, phổ tử ngoại khả kiến cho hấp thụ cực ñại ở λmax = 218, 252, 285, 293 nm
trong methanol.
Cũng giống như Vinblastin sulfat, Vincristin sulfat thường ñược bào chế dưới
dạng thuốc tiêm hàm lượng 0,5 – 1,0 mg/ml, lọ 1mg, 2 mg, 5 mg bột ñông khô.
Vincristin ñược chỉ ñịnh ñiều trị các bệnh leukemia, bệnh Hodgkin, u lympho,
sarcom cơ vân, u sùi dạng nấm, ung thư vú, ung thư tử cung và một số bệnh ung
thư khác. Vincristin là chất ức chế mạnh tế bào, liên kết ñặc hiệu với tubulin là
protein ống vi thể, phong bế sự tạo thành các thoi phân bào cần thiết cho sự phân
4
chia tế bào ở kỳ giữa. Ở nồng ñộ cao thuốc diệt ñược tế bào, nồng ñộ thấp làm
ngừng phân chia tế bào. Vincristin hấp thu kém qua ñường tiêu hóa, sau khi tiêm
tĩnh mạch thuốc ñược phân bố khắp cơ thể trừ dịch não tủy. Vincristin bị chuyển
hóa ở gan, thải trừ qua mật 40 -70% và 10% qua nước tiểu.
1.1.3. Các nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, ñi tiên phong và thành công trong việc triển khai sản xuất thuốc
chống ung thư từ các ancaloid Dừa cạn và phải kể ñến các công ty như:
- Công ty Eli Lilly - Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VELBAN® có hoạt chất chính
là Vinblastin sunfat chỉ ñịnh ñiều trị các bệnh Hodgkin, ung thư máu, ung thư
biểu mô tinh hoàn, u Kaposi, ung thư dạ con.
- Công ty Pharmacia Corporation Kalamazoo - Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm
VINCASAR PSF có hoạt chất chính là Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat
ñược chỉ ñịnh ñặc hiệu ñiều trị bệnh bạch cầu ác tính.
Ngày nay các quốc gia và vùng lãnh thổ có thể trồng ñược Dừa cạn ñều ñã chủ
ñộng nghiên cứu và triển khai sản xuất Vinblastin và các dẫn xuất như Trung
Quốc, Ấn ðộ, Pakistan, Hàn Quốc, Nhật Bản và các nước Trung Á, Bắc Phi,...
Có thể nêu một vài con số theo thống kê năm 2002 của FAO làm ví dụ:
Madagasca xuất khẩu 1000 tấn (khô) lá và hoa Dừa cạn hàng năm; Ở Hungari,
năng suất lá và hoa Dừa cạn ñạt tới 1,5 - 2 tấn lá khô/ha/năm; Ở Ấn ðộ, riêng tập
ñoàn Cipla hàng năm sản xuất khoảng 15 - 25 kg Vinblastin sulfat và Vincristin
sulfat.
Do ñộc tính cao, nên Vincristin ñược sử dụng trong ñiều trị ung thư máu ít hơn
so với Vinblastin, vậy mà ở khu vực Bắc Mỹ và châu Âu, chỉ tính riêng lượng
tiêu thụ Vincristin sulfat ñã ñạt tới 40 triệu USD hàng năm.
1.1.4. Các nghiên cứu trong nước
- Nhóm tác giả thuộc Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam - Tổng công ty Hóa
chất Việt nam ñang thực hiện ñề tài thuộc chương trình khoa học công nghệ
quốc gia về hóa dược (2009 - 2011). “Nghiên cứu qui trình tổng hợp Vincristin
sulfat và Vinblastin sulfat từ Vindolin và Catharanthin làm thuốc chống ung
thư máu” [13].
5
- Từ những năm 1980 - 1990, Trường ðại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu và
Xí nghiệp Dược phẩm Trung Ương II ñã thực hiện các ñề tài nghiên cứu chiết
xuất Vinblastin và các Ancaloid khác từ Dừa cạn Việt Nam ñể phục vụ sản
xuất thuốc chống ung thư và thuốc hỗ trợ tuần hoàn não. Các tác giả ñã nghiên
cứu chiết ancaloid mô phỏng theo các quy trình của Noble và Svoboda [12].
- Trong nỗ lực tổng hợp toàn phần các Vinca ancaloid, năm 1990, các tác giả
Phan ðình Châu (ðại học Dược Hà Nội), Csaba Szántay (ðại học kỹ thuật
Budapest - Hungary) và các cộng sự ñã ñiều chế thành công các dẫn xuất
Vinca ancaloid monomeric như vincadifformin, (+/-)-3-oxominovine và
tabersonin. Tuy nhiên, ngoài tabersonin thể hiện hoạt tính làm giảm nhẹ huyết
áp (khoảng 25 % khi so sánh với reserpin), các chất này ñều chưa tìm ñược ứng
dụng trong ñiều trị lâm sàng [5].
- Cũng trong những năm 1990, các tác giả Mai Ngọc Tâm (Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam), Bogomil Pyuskyulev (Viện Hàn lâm khoa học Bungari)
và các cộng sự ñã sử dụng HPLC phân tích xác ñịnh sự biến ñổi hàm lượng
vindolin, catharanthin và vinblastin trong lá Dừa cạn vào các thời kỳ sinh
trưởng khác nhau. ðóng góp vào các hiểu biết về bán tổng hợp, chuyển hóa và
cấu trúc của các Vinca ancaloid kiểu Vinblastin, tác giả Mai Ngọc Tâm cùng
các cộng sự cũng ñã thực hiện những biến cải hóa học ở các vị trí C-16, C-17
và C-20’ của vinblastin tạo ra dẫn xuất mới 15(16)-17-deaxetoxy-20’-deoxyvinblastin và dẫn xuất tri-O-axetylguanosin ở C-17 của hợp chất này [10].
- Cho tới nay, việc tiếp thu các kỹ thuật phân lập hiện ñại và nghiên cứu hoàn
thiện công nghệ ñiều chế Vinblastin từ Dừa cạn Vinca rosea L. ở Việt Nam
còn chưa ñược quan tâm ñúng mức và chưa ñược tổ chức triển khai nghiêm
túc. Với một nguồn nguyên liệu Dừa cạn ñạt vượt tiêu chuẩn của châu Âu ñã
ñược tổ chức canh tác rất quy mô, sản lượng xuất khẩu sang thị trường Pháp và
châu Âu ñạt hàng trăm tấn một năm, mà chúng ta vẫn phải nhập khẩu
Vinblastin sulfat.
1.1.5. Tổng quan về phương pháp phân tích Vinblastin sulfat và Vincristin
sulfat [4,29,31]
- Hiện nay các dược ñiển (DðVN, Mỹ, Anh, Trung Quốc, Quốc tế, Châu Âu)
ñều ñưa ra chuyên luận Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat. Một trong những
6
phương pháp ñược sử dụng phổ biến hiện nay là phương pháp HPLC-DAD.
ðây là kỹ thuật phân tích cho phép phân tích Vinblastin sulfat và Vincristin
sulfat chính xác, lượng mẫu phân tích không cần nhiều và ñặc biệt có thể áp
dụng ở hầu hết các phòng thí nghiệm.
- Sau ñây là một số chương trình sắc ký phân tích Vinblastin sulfat và Vincristin
sulfat ñã có trong một số Dược ñiển:
Bảng 1.1. Chương trình sắc ký phân tích Vinblastin sulfat của một số dược ñiển
-
Dược ñiển
USP 34
BP 2010 – EP 2010
ðKSK
Cột sắc ký
C18 150x4,6 mm,5µm C8 250x4,6 mm,5µm
Pha ñộng
PðA: 14ml diethylamin +
986ml nước (pH 7,5): 38
PðB: (Acetonitril –
Methanol = 20 – 80): 62
DðVN IV
C8 250x4,6 mm,5µm
Dung dịch diethylamin Dung dịch diethylamin
1,5% (pH 7,5)
: 38 1,5% (pH 7,5)
: 38
Acetonitril
: 12 Methanol
: 50
Methanol
: 50
Acetonitril
: 12
Tốc ñộ dòng
(ml/phút)
Detector (nm)
2,0
1,0
1,0
262
262
262
Loop (µl)
20
10
10
Nồng ñộ thử
(mg/ml nước)
0,4
1,0
1,0
Bảng 1.2. Chương trình sắc ký phân tích Vincristin sulfat của một số dược ñiển
Dược ñiển
ðKSK
Cột sắc ký
Pha ñộng
USP 34
C8 250x4,6mm, 5µm
BP 2010 – EP 2010
DðVN IV
C8 250x4,6 mm, 5µm C8 250x4,6 mm,5µm
5 ml diethylamin + 295 Dung dịch diethylamin Dung dịch diethylamin
ml nước (pH 7,5) : 30 1,5% (pH 7,5) : 30
1,5% (pH 7,5) : 30
Methanol
: 70 Methanol
: 70 Methanol
: 70
Tốc ñộ dòng
(ml/phút)
Detector (nm)
1,5
1,0
1,0
297
297
297
Loop (µl)
10
20
20
Nồng ñộ thử
(mg/ml)
1,0
1,0
1,0
7
1.2. Tinh chế [3,8]
Thông thường sau khi phân lập, ñộ tinh khiết của hoạt chất thường ñạt ñược trên
80%. Quá trình tinh chế nhằm loại tiếp các tạp ñể làm tăng ñộ tinh khiết của hoạt chất.
Có thể dùng các phương pháp sau:
- Sử dụng các dung môi và nhiệt ñộ thích hợp ñể hòa tan chọn lọc và loại tạp, lọc
lấy hoạt chất và kết tinh lại. ðây là kỹ thuật cơ bản thường ñược áp dụng.
- Tiến hành sắc ký cột như giai ñoạn phân lập nhưng thay ñổi ñiều kiện sắc ký
như chuyển pha, cột, dung môi rửa giải,…..
- Dùng kỹ thuật sắc ký bán ñiều chế/ñiều chế tự ñộng. Kỹ thuật này hiện nay
chưa thật phổ biến do ñầu tư trang thiết bị ñắt tiền.
1.3. Tổng quan một số phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu ñề tài
1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [1,4,6,8]
HPLC là một kỹ thuật tách trong ñó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa
các hạt pha tĩnh dưới tác ñộng của pha ñộng lỏng. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên
cơ chế hấp phụ, phân bố, trao ñổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ. Tùy theo bản
chất của chất phân tích mà sử dụng detetor thích hợp. Hiện nay có nhiều loại
detector như: UV-VIS, huỳnh quang, tán xạ bay hơi, ñộ dẫn, MS,...nhưng sử
dụng nhiều nhất vẫn là detector UV-VIS. Ứng dụng:
• ðịnh tính
Trên các máy HPLC hiện ñại với DAD (diod array detector) ta có thể vẽ phổ
UV-VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng 2 phổ lên nhau và ñánh giá tương
ñồng thông qua hệ số Match.
Với detector khối phổ, nhờ thư viện phổ mà không cần chất chuẩn cũng có thể
ñịnh tính nếu như chất thử có mặt trong thư viện phổ này.
• ðịnh lượng:
So sánh ñộ lớn tín hiệu thu ñược từ pic chuẩn và pic thử (diện tích pic hoặc chiều
cao pic) trong cùng ñiều kiện sắc ký xác ñịnh là cơ sở của phép ñịnh lượng.
• Tạp chất liên quan:
ðối với phép thử tạp chất liên quan khi không biết tên tạp chất hoặc không có
tạp chuẩn thì có thể tính % tạp chất dựa vào % diện tích pic của tạp ñó so với
tổng diện tích các pic (gồm các pic tạp và pic chính) hoặc có thể tính dựa vào
diện tích pic của dung dịch so sánh.
8
1.3.2. Phương pháp ño phổ hồng ngoại (IR) [1,2,4,8]
1.3.2.1. Nguyên tắc
Phổ hồng ngoại ño sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó ñi qua một lớp chất
cần thử ở các số sóng khác nhau. Xác ñịnh sự có mặt của các nhóm chức trong
phân tử dựa vào phổ IR ñể ñịnh tính các chất. Trong kiểm nghiệm thuốc hầu hết
các dược ñiển chủ yếu sử dụng IR vào việc ñịnh tính, ít ñược dùng trong ñịnh
lượng.
1.3.2.2. Ứng dụng phổ hồng ngoại trong ñịnh tính
- ðịnh tính sử dụng chất chuẩn:
Chuẩn bị mẫu chuẩn so sánh và mẫu thử rồi ño phổ của chúng từ 4000 ñến 670
cm-1 trong cùng ñiều kiện.
Cực ñại hấp thụ ở phổ của mẫu thử phải tương ứng với phổ của chất chuẩn về vị
trí và trị số.
- ðịnh tính dùng phổ chuẩn trong atlas hoặc thư viện phổ:
ðể có thể so sánh phổ của chất thử với phổ chuẩn tra cứu trong atlas hoặc thư
viện phổ thì ta phải chuẩn hóa máy quang phổ. Tất cả các dược ñiển ñều chuẩn
hóa 2 thông số cơ bản của máy là ñộ phân giải và thang số sóng.
1.3.3. Phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) [1,2,4,8]
- Các hợp chất hóa học có ñặc trưng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại khả
kiến. Phổ hấp thụ của các chất khác nhau ñặc trưng riêng cho chất ñó. Trên mỗi
phổ có các cực trị hấp thụ khác nhau (λmax, λmin).
- Ứng dụng trong kiểm nghiệm thuốc:
+ ðịnh tính và thử tinh khiết
+ ðịnh lượng: phương pháp ño phổ trực tiếp, gián tiếp, phương pháp so
sánh, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp ñường chuẩn, phương pháp thêm
ñường chuẩn, phương pháp ñịnh lượng hỗn hợp, phương pháp phổ ñạo hàm.
1.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR ) [2,8]
ðây là phương pháp phổ hiện ñại và ñược dùng nhiều trong xác ñịnh cấu trúc
hóa học của các hợp chất hữu cơ nói chung. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ
thuật phổ NMR một chiều và hai chiều có thể xác ñịnh chính xác cấu trúc của
hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của phương pháp
9
phổ NMR là sự cộng hưởng của các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1H,
13
C) dưới tác dụng của từ trường. Các tần số cộng hưởng khác nhau ñược biểu
diễn bằng ñộ dịch chuyển hóa học. Ngoài ra ñặc trưng của phân tử còn ñược xác
ñịnh dựa vào các tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau.
1.3.4.1. Các ñại lượng ñặc trưng
- ðộ dịch chuyển hóa học δ: là sự khác nhau giữa vị trí hấp thụ của hạt nhân
hydro trên phổ NMR của mẫu phân tích và của chất chuẩn.
- Sự tương tác spin - spin: sự tương tác từ của các nhóm proton khác nhau cho biết:
+ Số lượng H ở nguyên tử C bên cạnh.
+ Mối tương quan lập thể của các nguyên tử H với nhau.
1.3.4.2. Ứng dụng:
- Phổ proton (1H-NMR): xác ñịnh sự có mặt của các nhóm có proton, bộ khung
của hợp chất, số lượng proton ở C láng giềng, số lượng tương ñối của proton cho
tín hiệu cộng hưởng, phân biệt các dạng ñồng phân, tính ñồng nhất và sự có mặt
của tạp chất.
- Phổ carbon, 13C-NMR: cho tín hiệu của vạch phổ carbon, mỗi nguyên tử carbon
sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau.
- Phổ chuyển ñổi phân cực biến dạng (DEPT): phổ này cho những tín hiệu phổ
phân loại các loại carbon khác nhau. Trên phổ DEPT 135o, tín hiệu của carbon
bậc 4 biến mất, tín hiệu phổ carbon bậc 3 và carbon bậc 1 nằm về một phía còn
carbon bậc 3 nằm về phía ñối diện. Còn trên phổ DEPT 90o thì chỉ xuất hiện tín
hiệu phổ của carbon bậc 3.
- Phổ cộng hưởng từ hai chiều (2D-NMR):
+ Phổ liên hệ dịch chuyển hóa học (1H-1H COSY): biểu diễn tương tác H-H
chủ yếu của các proton ñính với carbon liền kề nhau. Phổ này nối ghép các phần
của phân tử lại với nhau.
+ Phổ liên hệ ña liên kết dị nhân (HMBC): biểu diễn các tương tác xa của
carbon và H trong phân tử. Phổ này cho phép xác ñịnh cấu trúc từng phần cũng
như toàn bộ phân tử chất.
- Phổ liên hệ ñơn lượng tử dị nhân (HSQC): tương tác trực tiếp C-H ñược xác
ñịnh nhờ vào các pic giao nhau trên phổ HSQC. Trên phổ này, một trục là phổ
1
H-NMR còn trục kia là 13C-NMR.
10
1.3.5. Phương pháp phân tích khối phổ (MS) [1,2,8]
Khối phổ là một kỹ thuật ño trực tiếp tỷ số khối lượng và ñiện tích của ion (m/z)
ñược tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
1.3.5.1. Nguyên tắc:
Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này là dùng chùm ñiện tử có năng
lượng trung bình ñể bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao. Trong quá trình
ñó chất hữu cơ bị ion hóa và bị vỡ ra thành mảnh. Ngoài ion phân tử, phổ MS
còn có các pic ion mảnh khác, dựa vào ñó người ta có thể xác ñịnh ñược cơ chế
phân mảnh và dựng lại cấu trúc hóa học các hợp chất. Tín hiệu tương ứng với
các ion sẽ ñược thể hiện bằng một số vạch có cường ñộ khác nhau tập hợp thành
một khối phổ ñồ hoặc phổ khối.
1.3.5.2. Ứng dụng:
- Xác ñịnh ñồng vị: các nguyên tử ñồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số
ñiện tích hạt nhân chỉ khác nhau số neutron nên khối lượng nguyên tử khác
nhau. Có thể dùng MS ñể xác ñịnh thành phần ñồng vị của các nguyên tố trong
mẫu.
- ðịnh tính: phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng của các phân
tử M+, (M+1)+, (M+2)+. Bên cạnh ñó xem xét thêm các pic ñồng vị, tỷ số
cường ñộ của chúng cùng với khối lượng của vài mảnh ion có thể xác ñịnh
ñược công thức của chất phân tích. Trong ngành dược thường sử dụng GC-MS,
LC-MS so sánh với thư viện phổ hoặc phổ chất ñối chiếu ñể ñịnh tính mẫu.
- Xác ñịnh công thức cấu tạo: dùng kỹ thuật ion hóa thích hợp phân tách chất
nghiên cứu thành nhiều mảnh ion ñể làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc
biện giải phổ nên kết hợp với phổ NMR và IR.
- ðịnh lượng: thường dùng kết nối LC-MS hoặc GC-MS, CE-MS ñể tăng tính
chọn lọc, giới hạn ñịnh lượng cho phương pháp phân tích. ðiểm nổi bật của
phân tích khối phổ là tính chọn lọc và ñộ nhạy. Nên thường dùng kỹ thuật này
ñể phân tích hàm lượng vết trong mẫu phức tạp.
1.3.6. Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) [20,34]
- Phân tích nhiệt là phương pháp phân tích mà trong ñó các tính chất vật lý, hóa
học của mẫu ño một cách liên tục như là những hàm của nhiệt ñộ (nhiệt ñộ ñược
11
