Nghiên cứu phương pháp sản xuất và kiểm nghiệm nguyên liệu cho chế phẩm probiotics có chứa lactobacllus acidophilus

Bộ giáo dục và đào tạo

Bộ y tế

Bộ giáo dtụrcưvờànđ
gàđoạti ạ
hoọc dược hà nội
--ạ
--i--h
--ọ
c
---d
--ư
--ợ
-- c hà nội
trường -đ

Bộ y tế

------------------

Nguyễn thị vĩnh hồng
Nguyễn thị vĩnh hồng

Nghiên cứu phương pháp sản xuất
vg
àhkiê
iểnmcn
ệư
mơn
ện

ux
cu
hấ
ot
N
ứg
uhpih
ng
gupyhêánplsiả
ch
hẩ
io
cê
sncó
hứ
và
kế
iểpm
nm
ghpir
ệo
mbn
gtuiy
lic
ệu
ca
ho
la
acpir
ll

dsoc
ph
lh
us
ch
ếcpthoẩbm
ou
bsioatciic
óic
ứa
lactobacillus acidophilus

Chuyên ngành : Kiểm nghiệm thuốc - độc chất
Mã số :

60 73 15

luận văn thạc sĩ dược học

luận văn thạc sĩ dược học

Người hướng dẫn : TS. Đàm Thanh Xuân

------- Hà nội - 2008 ------------- Hà nội - 2008 -------


Lời cảm ơn
Luận văn này được thực hiện và hoàn thành tại Khoa Vi sinh - Viện Kiểm
nghiệm Thuốc Trung Ương - Bộ Y tế, dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Đàm
Thanh Xuân - Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà

Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn sự chỉ bảo tận tình của TS. Đàm Thanh Xuân.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS. TS. Từ Minh Koóng, các
thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Hoá phân
tích, Bộ môn Công nghiệp Dược và các Bộ môn khác của Trường Đại học Dược
Hà nội đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường
cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung
Ương và các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua để tôi hoàn
thành tốt khoá học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã
luôn động viên quan tâm chia sẻ cùng tôi trong cuộc sống và sự nghiệp.

Hà nội, ngày 24 tháng 12 năm 2008.


MỤC LỤC
Trang
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

3

1.1. Vi sinh vật sinh acid lactic

3

1.1.1. Đặc điểm chung

3

1.1.2. Phân loại

3

1.1.3. Khả năng chuyển hóa

4

1.2. Lactobacillus acidophilus

6

1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý

6

1.2.2. Khả năng chuyển hóa carbon hydrat

7

1.3. Probiotics

8

1.3.1. Khái niệm

8

1.3.2. Các vi sinh vật thường được sử dụng trong chế

9

phẩm Probiotics
1.3.3. Ứng dụng của Probiotics trong ngành Dược

9

1.3.4. Một số chế phẩm Probiotics thông dụng trên thị

10

trường dược phẩm Việt Nam hiện nay
1.4. Phương pháp kiểm nghiệm L. acidophilus trong chế

12

phẩm Probiotics
1.4.1. Phương pháp định danh

12

1.4.2. Phương pháp định lượng

14

1.5. Phương pháp đông khô

14

1.5.1. Qui trình đông khô

15

1.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống của vi

15

sinh vật sau đông khô
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG TIỆN, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

18

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Phương tiện dùng trong nghiên cứu

18

2.2. Đối tượng nghiên cứu

22

2.3. Nội dung nghiên cứu

22

2.4. Phương pháp nghiên cứu

23

2.4.1. Phương pháp định lượng L. acidophilus trong

23

chế phẩm
2.4.2. Phương pháp định danh vi sinh vật bằng kit

24

API 50 CH
2.4.3. Phương pháp "in vitro" nghiên cứu khả năng

26

sống của L. acidophilus trong dịch dạ dày hoặc dịch
ruột nhân tạo
2.4.4. Phương pháp phân lập và bảo quản L.

28

acidophilus
2.4.5. Phương pháp lựa chọn L. acidophilus từ chế

28

phẩm để sản xuất sinh khối
2.4.6. Phương pháp sản xuất sinh khối

28

2.4.7. Phương pháp đông khô L. acidophilus

29

2.4.8. Phương pháp đánh giá tỷ lệ sống của L.

30

acidophilus trước đông khô, ngay sau đông khô và
trong quá trình bảo quản


CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Xác định số lượng vi sinh vật trong chế phẩm

31
31

Probiotics
3.2. Định danh vi sinh vật bằng kit API 50 CH

32

3.3. Khảo sát sự thay đổi pH dịch nghiên cứu trước và sau

41

khi tiếp xúc với chế phẩm
3.4. Khảo sát khả năng sống của vi sinh vật sau khi tiếp xúc

43

với dịch dạ dày và dịch ruột nhân tạo
3.5. Lựa chọn L. acidophilus từ chế phẩm để sản xuất sinh

49

khối
3.6. Kết quả đông khô L. acidophilus
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Định danh vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus bằng kit

50
54
54

API 50 CH
4.2. Khảo sát khả năng sống của vi sinh vật sau khi tiếp xúc

55

với dịch dạ dày nhân tạo pH 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và dịch ruột
nhân tạo pH 6,8
4.3. Phương pháp đông khô

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

56
57

KẾT LUẬN

57

KIẾN NGHỊ

58

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

59


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN:

Acid deoxyribonucleic

ARN:

Acid ribonucleic

ATCC:

American Type Culture Collection (Ngân hàng chủng
Mỹ)

BCP:

Bromocresol purple medium (Môi trường BCP)

B. longum:

Bifidobacterium longum

B. subtilis:

Bacillus subtilis

C. butyricum:

Clostridium butyricum

CFU:

Colony forming unit (Đơn vị tạo thành khuẩn lạc)

E. coli:

Escherichia coli

H. pylori:

Helicobacter pylori

L. acidophilus:

Lactobacillus acidophilus

L. brevis:

Lactobacillus brevis

L. bulgaricus:

Lactobacillus bulgaricus

L. casei:

Lactobacillus casei

L. delbruckii:

Lactobacillus delbruckii

L. fermenti:

Lactobacillus fermenti

L. helveticus:

Lactobacillus helveticus

L. lactis:

Lactobacillus lactis

L. paracasei:

Lactobacillus paracasei

L. plantarum:

Lactobacillus plantarum

L. reuteri:

Lactobacillus reuteri

L. rhamnosus:

Lactobacillus rhamnosus

L. sporogenes:

Lactobacillus sporogenes


MRS:

deMan, Rogossa and Sharpe medium (Môi trường
MRS)

NBRC:

NITE Biological Resource Center (Trung tâm sinh học
NITE)

PCR:

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi
polymerase)

S. bovis:

Streptococcus bovis

S. cremoris:

Streptococcus cremoris

S. faecalis:

Streptococcus faecalis

ttn:

giá trị t thực nghiệm

tlt:

giá trị t lý thuyết

USP:

United State's Pharmacopeia (Dược điển Mỹ)

VSV:

Vi sinh vật

VTCC:

Vietnam Type Culture Collection (Ngân hàng chủng
Việt Nam)


DANH MỤC BẢNG
Trang
5

Bảng 1.1

Một số bacteriocin do Lactobacilli sinh ra

Bảng 1.2

Đặc tính đối kháng của vi sinh vật sinh acid lactic

6

Bảng 1.3

Một số chế phẩm Probiotics thông dụng trên thị trường

11

Việt Nam
Bảng 3.1

Số lượng vi sinh vật trong chế phẩm

31

Bảng 3.2

Theo dõi phản ứng định danh vi sinh vật bằng kit API 50

37

CH
Bảng 3.3

Kết quả định danh vi sinh vật bằng phần mềm Apiweb

39

Bảng 3.4

pH của nước cất trước và sau khi tiếp xúc với chế phẩm

41

Bảng 3.5

pH của dịch nghiên cứu trước và sau khi tiếp xúc với chế

42

phẩm
Bảng 3.6

Tỷ lệ L. acidophilus trong ANTIBIO còn sống sau khi

44

tiếp xúc với dịch dạ dày và dịch ruột nhân tạo
Bảng 3.7

Giá trị ttn thu được khi so sánh tỷ lệ VSV trung bình trong

45

chế phẩm Antibio còn sống sau thời gian tiếp xúc khác
nhau
Bảng 3.8

Tỷ lệ L. acidophilus trong PROBIO còn sống sau khi tiếp

46

xúc với dịch dạ dày và dịch ruột nhân tạo
Bảng 3.9

Giá trị ttn thu được khi so sánh tỷ lệ VSV trung bình trong

47

chế phẩm Probio còn sống sau thời gian tiếp xúc khác
nhau
Bảng 3.10

Số lượng vi sinh vật còn sống trung bình trong chế phẩm
Antibio và Probio sau khi tiếp xúc với dịch nghiên cứu
khác nhau

48


Bảng 3.11

Độ truyền qua của hỗn dịch L. acidophilus có nguồn gốc

49

khác nhau trên môi trường MRS lỏng
Bảng 3.12

Số lượng L. acidophilus còn sống trước và sau quá trình

51

đông khô trên các tá dược khác nhau
Bảng 3.13

Kết quả kiểm nghiệm nguyên liệu L. acidophilus

53


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1

Hình ảnh Lactobacillus acidophilus trên kính hiển vi điện

7

tử
Hình 3.1

Định danh L. acidophilus VTCC-B-791 bằng kit API 50

33

CH
Hình 3.2

Định danh vi sinh vật trong chế phẩm ABIO bằng kit API

34

50 CH
Hình 3.3

Định danh vi sinh vật trong chế phẩm ANTIBIO bằng kit

35

API 50 CH
Hình 3.4

Định danh vi sinh vật trong chế phẩm PROBIO bằng kit

36

API 50 CH
Hình 3.5

Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi số lượng vi sinh vật trước,
ngay sau đông khô và trong quá trình bảo quản

52


-1-

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hàng ngàn năm trước, con người đã biết sử dụng sữa lên men để tăng
cường sức đề kháng cho cơ thể. Ngày nay, công nghệ lên men nói riêng hay
công nghệ sinh học nói chung ngày càng phát triển, mà đỉnh cao là công nghệ
gen, đã, đang và sẽ góp phần tích cực cho sự phát triển nhiều mặt đời sống xã
hội con người. Công nghệ sinh học đã mang lại những hiệu quả to lớn trong
các lĩnh vực khoa học và đặc biệt trong ngành y tế, nó đã mang đến những

công nghệ mới, những phương pháp chữa bệnh mới, vacxin cho người và vật
nuôi, dược phẩm, chip sinh học... Có thể nói chúng ta chưa thể hình dung hết
những gì mà công nghệ sinh học có thể mang lại cho con người trong những
thập niên tới.
Probiotics là một sản phẩm của công nghệ sinh học truyền thống.
Probiotics là một hay nhiều vi sinh vật sống có tác dụng cải thiện và hỗ trợ hệ
tiêu hóa đường ruột. Probiotics giúp phục hồi và cân bằng số lượng vi sinh vật
có ích trong ruột mà do nhiều nguyên nhân khác nhau sự cân bằng vi sinh vật
đường ruột này đã bị thay đổi.
Vi sinh vật hay được sử dụng nhất trong các chế phẩm Probiotics là
nhóm vi sinh vật sinh acid lactic mà trong đó điển hình là Lactobacillus
acidophilus nhờ có nhiều đặc điểm có lợi cho đường tiêu hoá.
Hiện nay, trên thị trường Việt Nam ngày càng xuất hiện nhiều biệt
dược là các chế phẩm Probiotics như: Biofidin, Biolacto (Mỹ), Biobaby,
Lactomin plus, Antibio, Abio (Hàn Quốc), Probio, Biosubtyl-II (Việt Nam)…
Trong đó, chiếm lĩnh thị trường dược phẩm Probiotics vẫn là các chế phẩm
thuốc ngoại. Probiotics được sản xuất trong nước ít về mặt số lượng, chất
lượng lại chưa ổn định, đặc biệt nguồn nguyên liệu ban đầu chủ yếu vẫn phải
nhập khẩu. Ngoài ra, trong tiêu chuẩn chất lượng của các chế phẩm này, việc


-2-

định danh vi sinh vật được tiến hành dựa trên một vài đặc điểm đơn giản, vì
vậy, không thể kết luận chính xác tên của vi sinh vật có trong chế phẩm. Một
điều đáng quan tâm nữa đối với các chế phẩm Probiotics là liệu vi sinh vật có
sống được khi đi qua cơ quan tiêu hóa của con người để đến ruột, cơ quan
đích có tác dụng hay không và tỷ lệ này là bao nhiêu?
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
"Nghiên cứu phương pháp sản xuất và kiểm nghiệm nguyên liệu

cho chế phẩm Probiotics có chứa Lactobacillus acidophilus "
Với các mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp định danh và phương pháp "invitro" xác
định khả năng sống của vi sinh vật trong chế phẩm Probiotics sau khi tiếp xúc
với dịch dạ dày và dịch ruột.
2. Nghiên cứu một số thông số của quá trình đông khô để sản xuất
nguyên liệu L. acidophilus có tỷ lệ sống cao và lâu dài.
-----------------------------


-3-

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. VI SINH VẬT SINH ACID LACTIC
1.1.1. Đặc điểm chung
Vi sinh vật sinh acid lactic (Lactobacilli) có đặc điểm chung là sinh
acid lactic thông qua quá trình đồng hóa, gọi chung là quá trình lên men
đường [6]. Đại diện chính của nhóm vi sinh vật này là chi Lactobacillus,
Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. Phân loại vi sinh vật sinh acid
lactic có thể dựa trên phản ứng nhuộm Gram và khả năng sinh acid lactic từ
quá trình lên men carbon hydrat khác nhau.
Lactobacilli thuộc nhóm vi sinh vật Gram dương, có thể là trực khuẩn
dài, mảnh hoặc cầu khuẩn ngắn, thường tạo chuỗi, có khả năng lên men
carbon hydrat khác nhau. Một số loài có khả năng dung nạp oxy và sử dụng
oxy thông qua enzym flavoprotein oxidase. Một số loài khác kị khí hoàn toàn.
Lactobacilli phát triển tối ưu ở môi trường có pH 5,5 - 5,8 và cần các amino
acid, peptid, base nucleotid, các vitamin, khoáng chất, acid béo và carbon
hydrat cho quá trình phát triển [5], [6], [15], [31].
1.1.2. Phân loại
Vi sinh vật sinh acid lactic được chia làm 2 loại dựa trên đặc điểm lên

men của chúng.
1.1.2.1. Loại lên men đồng nhất: Sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose,
ngoài ra, còn một lượng rất nhỏ acid acetic, acid formic, ethanol và một số
sản phẩm phụ khác. Đại diện cho nhóm này là chi Diplococcus,
Streptococcus,

Pediococcus,

Microbacterium,

1

số

loài

thuộc

Lactobacillus như L. casei, L. acidophilus, L. delbrueckii...
C6H12O6

2 CH3 CHOH COOH + X(kcal)

chi


-4-

1.1.2.2. Loại lên men không đồng nhất: Sản xuất khoảng 50% acid lactic và
một lượng đáng kể ethanol, acid acetic, glycerin và carbonic... Đại diện cho

nhóm này là chi Leuconostoc, Bifidobacterium, 1 số loài thuộc chi
Lactobacillus như L. brevis, L. fermenti...[5], [6], [17], [31].
2 C6H12O6

2 CH3 CHOH COOH + CH3COOH + CH3CH2OH
+ CH2OH CHOH CH2OH + CO2

1.1.3. Khả năng chuyển hoá
1.1.3.1. Phân giải protein
Protein được phân giải thành các polypeptid dễ đồng hóa.
Protein + H2O

Proteinase
Từ Lactobacilli

Polypeptid

Nhờ đặc tính phân giải protein này mà vi sinh vật sinh acid lactic giúp
cơ thể vật chủ tiêu hóa protein dễ dàng hơn. Điều này đặc biệt có lợi cho hệ
tiêu hoá của trẻ em, người già hay người đang mắc bệnh [31].
1.1.3.2. Phân giải lipid
Các chất béo phức tạp được phân giải thành các acid béo dễ đồng hoá.
Triglycerid béo

Lipase
từ Lactobacilli

Acid béo + Glycerol

Đặc điểm này giúp ích trong việc thiết kế công thức môi trường dinh

dưỡng cho đối tượng là trẻ em, người già hay người đang mắc bệnh.
Các chứng minh về mặt lâm sàng và tiền lâm sàng cho thấy vi sinh vật
sinh acid lactic có thể phá vỡ cholesterol trong lipid huyết thanh, trợ giúp cho
quá trình tiêu hoá của muối mật [7], [11], [31].
1.1.3.3. Chuyển hóa lactose
Vi sinh vật sinh acid lactic có các enzym β-galactosidase, glycolase và
lactic dehydrogenase (LDH), các enzym này sẽ chuyển hóa lactose thành acid
lactic. Acid lactic có một số lợi ích sinh lý như:


-5-

- tăng khả năng tiêu hóa protein trong sữa bằng cách kết tủa protein
thành các tiểu phân sữa mịn.
- tăng khả năng sử dụng calci, phospho và sắt.
- thúc đẩy quá trình tiết dịch dạ dày.
- tăng nhu động dạ dày về phía trước.
Đặc điểm này của vi sinh vật sinh acid được sử dụng hữu hiệu trong
điều trị bệnh không dung nạp lactose. Ngoài ra, bằng cách hạ pH của môi
trường ruột non xuống khoảng 4,0 - 5,0, acid lactic sẽ ức chế sự phát triển của
vi sinh vật gây thối và E. coli, do những vi sinh vật này cần pH tối ưu ở
khoảng 6,0 - 7,0 [7], [31].
1.1.3.4. Sinh bacteriocin
Bacteriocin là protein hay hỗn hợp protein có hoạt tính kháng khuẩn
chống lại với các vi sinh vật có đặc điểm gần giống với vi sinh vật sinh ra
bacteriocin đó. Đặc tính kháng khuẩn của các Lactobacilli chống lại các vi
sinh vật gây thối phụ thuộc mật thiết vào loại bacteriocin mà nó sinh ra. Một
số bacteriocin do Lactobacilli sinh ra được liệt kê ở bảng 1.1 [31].
Bảng 1.1. Một số bacteriocin do Lactobacilli sinh ra
Tên chất

Vi sinh vật

Acidolin, Acidophilin, Lactacin B, Lactacin F

L. acidophilus

Bulgarin

L. bulgaricus

Plantaricin SIK-83, Plantaricin A, Plantaricin B,
Lactolin

L. plantarum

Lactolin 27, Helveticin J

L. helveticus

Reuterin

L. reuteri

Lactobrevin, Lactobacillin

L. brevis


-6-

1.1.3.5. Sinh chất đối kháng
Vi sinh vật sinh acid lactic có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh
vật gây thối có hại nhờ một số sản phẩm chuyển hóa của chúng như hydrogen
peroxid, carbonic và diacetyl. Các sản phẩm chuyển hóa và cơ chế tác dụng
được tóm tắt ở bảng 1.2 [11], [31].
Bảng 1.2. Đặc tính đối kháng của vi sinh vật sinh acid lactic
Sản phẩm chuyển hóa

Cơ chế tác dụng

Carbonic

Ức chế quá trình khử carboxy. Làm
giảm tính thấm của màng.

Diacetyl

Phản ứng với protein gắn arginine.

Hydrogen peroxide/Lactoperoxidase

Oxy hóa protein cơ bản.

Acid lactic

Acid lactic không phân ly đi qua
màng, giảm pH nội bào.

Bacteriocin

Ảnh hưởng lên màng, lên quá trình
tổng hợp ADN và protein.

1.1.3.6. Tổng hợp vitamin nhóm B
Một số tác giả cho rằng thành phần vitamin B trong các chế phẩm sữa
lên men được sinh ra bởi vi sinh vật sinh acid lactic. Tương tự, các vitamin
nhóm B cũng được tổng hợp bởi vi sinh vật sinh acid lactic trong hệ vi sinh
vật đường ruột [31].
1.2. LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý
L. acidophilus thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic, là trực khuẩn
Gram dương, kích thước từ 0,6-0,9 × 1,5-6,0 µm, mọc đơn hoặc đôi hoặc tạo
chuỗi ngắn, không có bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng


-7-

catalase âm tính, phát triển tối ưu ở 37oC, không phát triển ở 20 - 22o hoặc ở
nhiệt độ cao hơn 48oC [5], [15], [17].

Hình 1.1. Hình ảnh Lactobacillus acidophilus trên kính hiển vi điện tử
1.2.2. Khả năng chuyển hóa carbon hydrat
- Chuyển hoá sinh acid lactic: D-galactose, glucose, D-fructose, Dmannose, N-acetyl-glucosamin, amygdaline, arbutine, esculin, salicin, Dcellobiose, D-maltose, lactose, D-saccharose, D-trehalose, gentiobiose, Dtagatose, sucrose.
Trong đó, L. acidophilus chuyển hoá glucose, lactose, sucrose sinh acid
lactic, nhưng không sinh khí.
- Không chuyển hóa: glycerol, erythritol, D-arabinose, L-arabinose, Dribose, D-xylose, L-xylose, D-adonitol, methyl-βD-xylopyranoside, Lsorbose, L-rhamnose, dulcitol, inositol, D-mannitol, D-sorbitol, methyl-αDmannopyranoside, methyl-αD-glucopyranoside, D-melibiose, inuline, Dmelezitose, D-raffinose, amidon, glycogene, xylitol, D-turanose, D-lyxose, Dfucose, L-fucose, D-arabitol, L-arabitol, gluconat, 2 keto-gluconat, 5 ketogluconat [15], [17].


-8-

1.3. PROBIOTICS
1.3.1. Khái niệm
Hàng ngàn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa
lên men với mục đích tăng cường sức khoẻ. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỉ
19, nhà khoa học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu vấn đề
này trên cơ sở khoa học. Ông cho rằng vi sinh vật sinh acid lactic trong các
chế phẩm sữa lên men đã ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối cư trú
trong ruột non. Đồng thời ông đã phân lập vi sinh vật trong sữa lên men mà
những nông dân Bulgari sử dụng và đặt tên chúng là "Bulgarian bacillus",
chúng chính là loài L. bulgaricus hiện nay [7], [11].
Năm 1974, Parker là người đầu tiên đưa ra khái niệm Probiotics. Theo
ông, "Probiotics là vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men được thêm vào thực
phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể vi sinh vật đường ruột của sinh vật
chủ" [7].
Năm 2000, Laurent, Verschaer và cộng sự đã đưa ra định nghĩa rộng
hơn "Probiotics là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt cho vật chủ nhờ
sự biến đổi vi sinh vật trên sinh vật chủ hay ở xung quanh vật chủ, từ đó cải
thiện khả năng sử dụng thức ăn, nâng cao sức đề kháng của vật chủ, cải thiện
chất lượng môi trường xung quanh". Với định nghĩa này thì Probiotics không
chỉ là dược phẩm dùng cho người và vật nuôi với mục đích hỗ trợ cho quá
trình tiêu hóa mà còn là sản phẩm làm sạch môi trường được ứng dụng nhiều
trong ngành thủy sản [10], [11].
Gần đây, năm 2002, tổ chức Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y
tế thế giới nêu rõ: " Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với
lượng phù hợp sẽ đem lại lợi ích cho sức khoẻ của sinh vật chủ". Hiện nay,
định nghĩa này đang được sử dụng phổ biến nhất [7].


-9-

1.3.2. Các vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm Probiotics
Nếu trước kia sự lựa chọn vi sinh vật cho chế phẩm Probiotics dùng
làm thuốc chủ yếu dựa trên kinh nghiệm thì hiện nay, các nhà khoa học đã
đưa ra những tiêu chí rất rõ ràng, đó là:
- có khả năng chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non
- có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa
- không gây bệnh, không sinh độc tố
- có khả năng sống và cư trú trong ruột.
Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm
Probiotics là Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus.
Ngoài ra, còn một số nhóm vi sinh vật khác được sử dụng như Bacillus,
Streptococcus [7], [11], [29]...
L. acidophilus là trực khuẩn chiếm tỉ lệ chủ yếu trong số các vi sinh vật
có ích cư trú ở đoạn trên của ống tiêu hóa. Nó có khả năng làm giảm số lượng
các vi sinh vật hoặc nấm có hại ở ruột non; có khả năng sinh lactase, một
enzym quan trọng trong quá trình chuyển hóa sữa; có liên quan đến quá trình
sản xuất một số vitamin nhóm B như niacin, acid folic, pyridoxin; tăng cường
chức năng của hệ thống miễn dịch; giảm sự tiêu diệt vi sinh vật có ích do sử
dụng kháng sinh dài ngày... [7], [25], [30]
Với những đặc điểm trên, L. acidophilus là vi sinh vật được lựa chọn
đầu tiên để sản xuất các chế phẩm Probiotics.
1.3.3. Ứng dụng của Probiotics trong ngành Dược
Probiotics có các tác dụng sau:
- Tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật có hại bằng
cách tiết ra các chất giống kháng sinh như acidolin, lactocidin và acidophilin.
- Sinh ra các vitamin bao gồm niacin, acid folic, biotin, vitamin B6...
- Hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa, điều chỉnh nồng độ enzym.

- 10 -

- Giảm pH bằng cách sinh ra acid lactic, hydrogen peroxyd... do đó ức
chế sự phát triển của các vi sinh vật và nấm có hại.
- Giải độc và bảo vệ niêm mạc ruột: Lactobacillus có khả năng liên kết
với các chất độc như kim loại nặng, tế bào ung thư, các vi sinh vật này sẽ chết
cùng với chất độc và được loại trừ ra khỏi cơ thể cùng với chất độc dưới dạng
chất thải rắn.
- Giảm nồng độ cholesterol.
- Hỗ trợ hấp thu các khoáng chất, đặc biệt là calci do tác dụng làm giảm
pH ruột của chúng.
- Giảm nguy cơ bị ung thư, khối u [7], [11].
Với những tác dụng trên, Probiotics được sử dụng với mục đích chính
là làm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột trong hoặc sau khi điều trị bằng
kháng sinh do kháng sinh đã làm thay đổi hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa,
giảm số lượng vi sinh vật có lợi và thường gây ỉa chảy, rối loạn tiêu hóa [30].
Ngoài ra, Probiotics còn được sử dụng để điều trị viêm đường tiêu hóa thường
gặp ở trẻ sơ sinh do bị nhiễm Rota virus, điều trị tiêu chảy, ung thư ruột kết,
đau dạ dày do nhiễm H. pylori, bệnh về dị ứng, ngăn cản nhiễm trùng âm đạo
do Candida albicans... [7], [11].
1.3.4. Một số chế phẩm Probiotics thông dụng trên thị trường dược phẩm
Việt Nam hiện nay
Chế phẩm Probiotics có thể là một hay một vài vi sinh vật được phối
hợp với nhau, trong đó, dễ dàng nhận thấy L. acidophilus được sử dụng nhiều
nhất trong các chế phẩm Probiotics trên thị trường hiện nay.


- 11 -

Bảng 1.3. Một số chế phẩm Probiotics thông dụng trên thị trường Việt Nam

Stt
1

2

3

4

5

6

7

8

9

Tên sản phẩm và công thức

Nhà sản xuất

Dae Han New Pharm Co.
Gói bột Abio
8
Ltd., Hàn Quốc
Công thức: Mỗi gói bột chứa 10 CFU
L. acidophilus
Han Wha Pharma Co. Ltd.,

Gói bột Antibio
Hàn Quốc
Công thức: Mỗi gói 1g bột chứa
8
10 CFU L. acidophilus.
Công ty Cổ phần Dược phẩm
Gói bột Bibactyl
6
8
Quận 10, Việt Nam
Công thức: 1 gói chứa 10 - 10 CFU B.
subtilis.
ILDONG Pharmaceutical
Thuốc cốm Biobaby
Co. Ltd., Hàn Quốc.
Công thức: 1g cốm chứa vitamin và
7
5,0 × 10 CFU L. sporogenes
1,0 × 107CFU C. butyricum
3,0 × 106CFU B. subtilis
Union Pharma INC, Mỹ
Viên nang Biolacto
Công thức: 1 viên nang chứa
108CFU L. acidophilus
108CFU L. bulgaricus.
RexGene Biotech Co. Ltd.,
Gói bột Lactomin Plus
Hàn Quốc
Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa
6

27x10 CFU các vi sinh vật sinh acid
lactic: L. acidophilus, B. longum, S.
faecalis.
Dong In Dang Pharm Co.,
Gói bột Lactophyl granules
8
Ltd, Hàn Quốc
Công thức: 1 gói chứa 10 CFU L.
acidophilus.
Công ty Dược phẩm
Gói bột Probio
9
Imexpharm, Việt Nam
Công thức: 1 gói chứa 10 CFU L.
acidophilus.
Công ty cổ phần Dược Hậu
Gói bột Y-bio
9
Giang, Việt Nam
Công thức: 1 gói chứa 10 CFU L.
acidophilus.


- 12 -

1.4. PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM L. ACIDOPHILUS TRONG CHẾ
PHẨM PROBIOTICS
1.4.1. Phương pháp định danh
1.4.1.1. Khoá phân loại được công nhân quốc tế
Vi sinh vật là L. acidophilus khi có các đặc điểm sau:

- Trực khuẩn Gram (+), thường mọc đơn, đôi hoặc tạo chuỗi.
- Vi hiếu khí.
- Lên men đồng nhất glucose, ngoài acid lactic, chỉ sinh ra một lượng
rất nhỏ các sản phẩm phụ.
- Lên men lactose tạo acid lactic.
- Nhiệt độ phát triển tối ưu là 37oC.
- Sản xuất D-acid lactic hoặc hỗn hợp racemic acid lactic [17].
1.4.1.2. Định danh vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus bằng sinh học phân
tử
Nguyên tắc
- Tách chiết ADN của vi sinh vật nghiên cứu: Thành tế bào vi sinh vật
được phá vỡ nhờ lysozyme và các chất tẩy rửa mạnh như SDS-trishydroclorid giúp giải phóng toàn bộ ADN của vi sinh vật. Protein và ARN
được tách khỏi ADN nhờ các enzym ARNase, protease và hỗn hợp dung môi
cloroform - phenol (1: 1). Cuối cùng ADN được tủa bằng ethanol tuyệt đối.
- Tiến hành phản ứng PCR: Với việc sử dụng ADNpolymerase và các
oligonucleotid tổng hợp nhân tạo, một đoạn ADN dùng làm khuôn được nhân
lên nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỉ lần mà không cần đến nhiều tế
bào vi sinh vật. Nhờ phản ứng này, một đoạn gen bất kì sẽ được khuếch đại
khi biết trình tự của hai điểm từ đầu 5’ đến đầu 3’ của sợi bổ sung và nhờ có
enzym ADNpolymerase mà ADN khuôn được tổng hợp khi đã có sẵn dNTP.


- 13 -

- Kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose. Phân tích trình tự
ADNr 16S theo phương pháp Sanger. Cuối cùng, chuỗi trình tự này được so
sánh với tất cả các chuỗi nucleotid ADNr 16S đã được công bố trên ngân
hàng gen quốc tế và từ đó đưa ra kết luận chính xác tên của vi sinh vật [8],
[9].
Phương pháp này có độ chính xác rất cao. Cho đến nay, các chuyên gia

phân loại vi sinh vật trên thế giới đều cho rằng phương pháp tốt nhất để định
danh vi sinh vật và thành lập cây phát sinh chủng là dựa trên trình tự ADNr
kết hợp với phương pháp phân loại kinh điển. Tuy nhiên, phương pháp này
đòi hỏi đầu tư trang thiết bị rất lớn mà không phải phòng thí nghiệm nào cũng
có khả năng trang bị được.
1.4.1.3. Định danh vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus theo tiêu chuẩn chất
lượng của chế phẩm Probiotics
Theo tiêu chuẩn chất lượng Probiotics chứa L. acidophilus, việc định
danh vi sinh vật được tiến hành dựa trên đặc điểm hình thái, phản ứng sinh
hoá sau:
- Hình thái: Trực khuẩn Gram dương, mọc đơn, đôi hay tạo chuỗi ngắn,
không tạo bào tử, không di động.
- Phản ứng catalase âm tính.
- Trên môi trường BCP đặc, khuẩn lạc có màu vàng do vi sinh vật lên
men glucose trong môi trường, sinh acid lactic, làm giảm pH của môi trường
và thay đổi màu của chất chỉ thị tía bromocresol có trong môi trường [3], [4],
[18], [20].
Nếu chỉ dựa vào những đặc điểm trên thì việc định danh vi sinh vật chỉ
dừng lại ở mức chi là Lactobacillus mà chưa định danh được đến mức loài là
acidophilus.


- 14 -

1.4.2. Phương pháp định lượng
1.4.2.1. Phương pháp đếm trên đĩa thạch
Phương pháp đếm trên đĩa thạch được sử dụng nhiều nhất để định
lượng L. acidophilus trong chế phẩm Probiotics do có độ chính xác cao. Vi
sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha loãng đến nồng độ thích hợp, sau
đó được cấy trộn vào môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri và nuôi cấy ở

nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc và tính
số lượng vi sinh vật có trong chế phẩm ban đầu [3], [4], [18], [20].
1.4.2.2. Phương pháp đếm dưới kính hiển vi
Vi sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha loãng đến nồng độ thích
hợp, sau đó được đưa vào buồng đếm. Đếm trực tiếp số vi sinh vật quan sát
được dưới kính hiển vi. Từ đó, tính số lượng vi sinh vật có trong chế phẩm
ban đầu. Phương pháp này có độ chính xác không cao.
1.4.2.3. Phương pháp đo độ truyền qua trên máy quang phổ tử ngoại khả
kiến
Vi sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha loãng đến nồng độ thích
hợp và sau đó được đo độ truyền qua bằng máy quang phổ tử ngoại khả kiến
ở bước sóng 530nm. Phương pháp này hay sử dụng để bán định lượng L.
acidophilus trong chế phẩm [22].
1.5. PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ
Đông khô là phương pháp thường được sử dụng để bảo quản và giữ
chủng vi sinh vật do sau quá trình đông khô, vi sinh vật tồn tại được trong
thời gian rất dài (hàng chục năm) mà vẫn giữ được đặc điểm hình thái và tính
chất sinh hóa ban đầu. Đông khô cũng được áp dụng trong công nghiệp bào
chế các dạng thuốc đông khô như thuốc tiêm, nhỏ mắt, bột vô khuẩn dùng
trong điều trị bệnh ở đường hô hấp, chế phẩm Probiotics.


- 15 -

1.5.1. Qui trình đông khô
Đông khô là quá trình làm khô các thuốc và chế phẩm sinh học ở nhiệt
độ thấp, dưới các điều kiện cho phép, để loại trừ nước bằng cách thăng hoa,
thay đổi trạng thái nước từ thể rắn sang thể hơi mà không qua thể lỏng [2],
[22], [27].
Quá trình đông khô thường chia làm ba giai đoạn: giai đoạn tiền đông,

giai đoạn làm khô sơ cấp và giai đoạn làm khô thứ cấp.
- Giai đoạn tiền đông: Nhiệt độ được hạ thấp đến mức thích hợp dưới
điểm Eutecti của hệ (điểm Eutecti là nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha rắn và
pha lỏng của hệ cùng tồn tại), nước được tách dần khỏi hệ và đóng băng thành
đá. Khi đó, phần dịch chứa chất cần đông khô (tế bào vi sinh vật và tá dược)
ngày càng trở nên đậm đặc cho đến khi chúng kết tinh và chuyển thành hệ rắn
vô định hình chỉ chứa khoảng 1% lượng nước có trong hệ ban đầu. Giai đoạn
tiền đông thường được tiến hành ở nhiệt độ -40oC hoặc thấp hơn.
- Giai đoạn làm khô sơ cấp: Áp suất buồng đông khô được giảm xuống
dưới áp suất hơi của đá, hệ được cung cấp đủ nhiệt để nước đá bắt đầu thăng
hoa. Nước đá sau khi tách khỏi sản phẩm sẽ tới buồng ngưng và kết tinh tại
đây. Giai đoạn này thường được tiến hành dưới áp suất vài mbar, nhiệt độ
buồng ngưng khoảng -50oC hoặc thấp hơn.
- Giai đoạn làm khô thứ cấp: nhiệt độ khay sấy được tăng lên cao hơn
một chút so với giai đoạn làm khô sơ cấp nhằm loại bỏ nước không đóng
băng. Mục tiêu của giai đoạn này là để giảm lượng nước có trong sản phẩm
một cách tối đa để đảm bảo độ ổn định của sản phẩm trong quá trình bảo quản.
1.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống của vi sinh vật sau đông
khô
Quá trình đông khô có thể làm tổn thương thành tế bào, màng tế bào và
acid ribonucleic của vi sinh vật. Có rất nhiều các công trình nghiên cứu về sự