Nghiên cứu xác định một số đặc trưng hóa lý của chitosan dạng nano làm polymer mang thuốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THƠ

Nghiên cứu xác định một số đặc trưng
hóa lý của chitosan dạng nano làm
polymer mang thuốc

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THƠ

Nghiên cứu xác định một số đặc trưng hóa
lý của chitosan dạng nano làm polymer
mang thuốc

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ 607315

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Việt Hùng

HÀ NỘI 2012


MỤC LỤC
ĐỀ MỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1. TỔNG QUAN VÈ CHITOSAN ........................................................................... 3
1.1.1.Nguồn gốc ........................................................................................................... 3
1.1.2. Công thức hóa học ............................................................................................. 3
1.1.3. Tính chất của chitin/chitosan ............................................................................. 3
1.1.4. Một số ứng dụng của chitosan ........................................................................... 5
1.2. TỔNG QUAN HỆ THỐNG MANG THUỐC NANO CHITOSAN .................... 5
1.2.1. Giới thiệu ............................................................................................................ 5
1.2.2. Một số phương pháp tạo hệ mang thuốc nano chitosan ..................................... 6
1.2.3. Các phương pháp đưa thuốc lên hệ mang thuốc nano ....................................... 7
1.3. TỔNG QUAN VỀ O-CARBOXYMETHYL CHITOSAN ................................ 11
1.3.1. Cấu trúc ............................................................................................................ 11
1.3.2. Tổng hợp .......................................................................................................... 12
1.3.3. Tính chất hóa lý ................................................................................................ 12
1.3.4. Đặc tính sinh học .............................................................................................. 14
1.3.5. Ứng dụng .......................................................................................................... 15
1.4. TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN ........................................................................ 15

1.4.1. Cấu trúc và tính chất ....................................................................................... 15
1.4.2. Sử dụng curcumin trong y học ......................................................................... 16
1.5. Tổng quan về giải phóng thuốc có kiểm soát 19
1.5.1. Hệ giải phóng thuốc có kiểm soát 19
1.5.2. Cơ chế giải phóng thuốc có kiểm soát từ hệ polymer mang thuốc 20
1.5.3. Mô hình nghiên cứu động học giải phóng thuốc 20
1.5.4. Một số phương pháp đánh giá độ giải phóng thuốc 21
1.6. TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM ........................... 22
1.6.1. Tổng quan về kính hiển vi điện tử quét ........................................................... 22
1.6.2. Tổng quan phương pháp đo thế zeta ............................................................... 25
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 28
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .......................................... 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 28
2.1.2. Phượng tiện nghiên cứu ................................................................................... 28
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 28
2.2.1. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu .......................................................................... 28
2.2.2. Lựa chọn điều kiện xác định kích thước hạt .................................................... 29


2.2.3. Xác định trạng thái bề mặt của O-CMC gắn curcumin ................................... 29
2.2.4. Xác định cấu trúc qua phổ FT-IR ..................................................................... 29
2.2.5. Xây dựng phương pháp định lượng curcumin bằng HPLC ............................. 29
2.2.6. Đánh giá hiệu suất gắn thuốc ........................................................................... 31
2.2.7. Khảo sát động học phân giải của curcumin trong 2 môi trường giả dịch tá tràng
(pH 4,5) và dịch ruột (pH 6,8) .................................................................................... 31
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 31
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................................... 33
3.1. GẮN CURCUMIN LÊN O-CMC ....................................................................... 33
3.2. XỬ LÝ MẪU ...................................................................................................... 33
3.3. XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH LÝ HÓA CỦA O-CMC, CURCUMIN VÀ O-CMC

GẮN CURCUMIN ..................................................................................................... 35
3.3.1. Đo kích thước hạt ............................................................................................. 35
3.3.2. Xác định trạng thái bề mặt của O-CMC gắn curcumin ................................... 36
3.3.3. Xác định cấu trúc qua phổ FT-IR ..................................................................... 37
3.4. XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT GẮN THUỐC ........................................................... 38
3.4.1. Lựa chọn điều kiện chạy HPLC ....................................................................... 40
3.4.2. Thẩm định phương pháp .................................................................................. 41
3.4.3. Tiến hành định lương ...................................................................................... 45
3.5. KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC PHÂN GIẢI TRONG 2 MÔI TRƯỜNG ................ 46
3.5.1. Chuẩn bị mẫu và tiến hành ............................................................................... 46
3.5.2 Kết quả .............................................................................................................. 46
Chương 4. BÀN LUẬN ............................................................................................. 49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 54
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 57



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
O-CMC: Oxy-carboxymethyl chitosan
DA: Deacetyl hóa
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
FT-IR: Quang phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier
RSD: Độ lệch chuẩn tương đối


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 3.1. Đánh giá tính thích hợp hệ thống định lượng curcumin
Bảng 3.2. Kết quả đáp ứng diện tích pic theo nồng độ curcumin
Bảng 3.3. Kết quả định lượng 6 mẫu trong ngày

Bảng 3.4. Kết quả định lượng 6 mẫu khác ngày
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá thống kê độ chính xác của phương pháp phân tích
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Bảng 3.7. Kết quả định lượng curcumin tự do
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ giải phóng


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan
Hình 1.2. Phức Ni(II)chitin và Ni(II)chitosan
Hình 1.3. Bốc hơi dung môi-nhũ tương hóa
Hình 1.4. Phương pháp chuyển dịch dung môi và kết tủa bề mặt
Hình 1.5. Khuếch tán dung môi – nhũ tương hóa
Hình 1.6. Phương pháp kết tinh muối
Hình 1.7. O - Carboxymethyl chitosan
Hình 1.8. Tổng hợp O - Carboxymethyl chitosan
Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của Curcumin dạng ceton và enol
Hình 1.10. Củ nghệ
Hình 1.11. Sơ đồ hệ thống HPLC
Hình 1.12. Sơ đồ khối kính hiển vi điện tử quét
Hình 1.13. Một số hình ảnh của phương pháp đo SEM
Hình 1.14. Sự xuất hiện thế zeta
Hình 3.1. Hình ảnh SEM của O-CMC gắn curcumin
Hình 3.2. Phổ FT-IR của O-CMC gắn curcumin
Hình 3.3. Sắc đồ mẫu trắng, placebo và thử
Hình 3.4. Phương trình hồi quy tuyến tính định lượng curcumin


ĐẶT VẤN ĐỀ
Công nghệ sản xuất thuốc dạng nano là một trong những công nghệ khá mới mẻ

tại Việt Nam và chứa đựng nhiều tiềm năng. Đi cùng với công nghệ bào chế hiện đại
này, việc kiểm soát các chỉ tiêu kỹ thuật từ nguyên liệu đến sản phẩm cuối cùng trở nên
rất quan trọng trong quá trình sản xuất.
Chitosan {poly b-(1-4)-D-glucosamin} từ lâu đã được biết đến là một polymer
có nhiều tác dụng sinh học giúp cải thiện sức khỏe con người. Tuy nhiên gần đây,
chitosan nổi lên như một chất mang sinh học (có nguồn gốc sinh học và có tính tương
thích sinh học), đặc biệt có thể chế tạo chất mang này ở kích thước nano trong các chế
phẩm thuốc nano, làm cải biến sinh khả dụng của thuốc. Chitosan được gắn lên các
phân tử thuốc có thể giúp chúng dễ dàng qua được màng sinh học đến đích tác dụng
hoặc làm làm thay đổi sinh khả dụng của thuốc (làm chậm, kéo dài hoặc khu trú nơi
giải phóng dược chất). Trong sản xuất, chitosan được điều chế bằng cách deacetyl hóa
một phần chitin. Chitin là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên như vỏ tôm cua, nấm,
vi nấm, côn trùng, động vật.
Như chúng ta đã biết, 2 hợp chất thiên nhiên được biết nhiều nhất trong điều trị
và hỗ trợ điều trị ung thư là taxon (chế phẩm Paclitaxel của Bristol-Myers Squibb, sáng
chế 03/03/1992, U.S. Patents) chiết từ cây thông đỏ và curcumin được chiết từ nghệ.
Gần đây tinh nghệ (gồm curcumin và các curcuminoid) đang được nghiên cứu trong
điều trị ung thư. Đã có trên một nghìn công trình nghiên cứu trên thế giới về curcumin
đối với bệnh ung thư, cho kết quả rất khả quan. Tuy vậy, curcumin là chất thực tế
không tan trong nước và có sinh khả dụng rất kém, một số nghiên cứu gần đây gợi ý
việc gắn curcumin lên chitosan có thể sẽ cải thiện sinh khả dụng của thuốc này.
Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu xác định một số đặc trưng
hóa lý của chitosan dạng nano làm polymer mang thuốc, với 2 mục tiêu chính sau:
- Phân tích xác định một số đặc trưng hóa lý của o-carboxymethyl chitosan gắn
curcumin.

-1-


- Xây dựng phương pháp định lượng curcumin, từ đó xác định hiệu suất gắn curcumin

và khảo sát động học phân giải của o-carboxymethyl chitosan gắn curcumin, góp phần
nghiên cứu cải biến sinh khả dụng in vitro của curcumin.

-2-


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1.

TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN [5]

1.1.1. Nguồn gốc
Chitosan là sản phẩm đã đề acetyl hóa (DA) của chitin, một polymer tự nhiên
chuỗi dài của N-acetylglucosamine và dẫn xuất đường glucose. Chitin là thành phần
chính của thành tế bào nấm, xương ngoài động vật chân đốt như tôm cua, côn trùng,
lưỡi bào ở động vật thân mềm, và vòi của động vật chân đầu bao gồm mực và bạch
tuộc. Chitosan có độ DA >50% và thực tế là một polymer chitin/chitosan, mức độ đề
acetyl hóa này có thể thay đổi và được xác định nhờ phương pháp cộng hưởng từ
NMR. Độ DA của chitosan dùng trong sản xuất thường từ 60-100%.
1.1.2. Công thức hóa học

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan
1.1.3. Tính chất của chitin/chitosan
1.1.3.1.

Tính chất vật lý/sinh học

Nhóm amino của chitosan có pka xấp xỉ 6.5. Chitosan mang điện tích dương, có
tính base yếu, thấm nước, tan trong hầu hết các dung dịch acid hữu cơ ở pH nhỏ hơn

6.5 như acid formic, acetic, tartaric và citric, nhưng không tan trong acid sulfuric và

-3-


phosphoric.
Tính chất tích điện dương giúp cho chitosan hoạt động như một chất bám dính
sinh học, có khả năng bám vào các bề mặt tích điện âm như màng nhầy. Chitosan tăng
vận chuyển các thuốc phân cực qua bề mặt biểu mô, có tính tương thích sinh học và
khả năng phân hủy sinh học.
Chitosan có rất nhiều loại khối lượng phân tử và mức độ đề acetyl hóa khác
nhau, đây là những yếu tố ảnh hưởng đến kích thước phân tử, sự hình thành và kết tập
phân tử.
1.1.3.2.

Tính chất hóa học

- Trong phân tử chitin/chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong
các mắt xích N-acetyl-D-glucosamin và nhóm –OH, -NH2 trong các mắt xích Dglucosamin có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amin, vừa là amid. Phản ứng hoá học có
thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế
O-, N.
- Mặt khác chitin/chitosan là những polymer mà các monomer được nối với
nhau bởi các liên kết b-(1-4)-glycozide; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất
hoá học như: acid, base, tác nhân oxy-hóa và các enzym thuỷ phân
• Các phản ứng của nhóm -OH
-Dẫn xuất sulfat.
-Dẫn xuất O-acyl cuả chitin/chitosan.
-Dẫn xuất O–tosyl hoá chitin/chitosan.
• Phản ứng ở vị trí N
-Phản ứng N-acetyl hoá chitosan.

-Dẫn xuất N-sulfat chitosan.
-Dẫn xuất N-glycochitosan (N-hydroxy-etylchitosan).
-Dẫn xuất acroleylen chitossan.
-Dẫn xuất acroleylchitosan

-4-


• Phản ứng xảy ra tại vị trí O, N
-Dẫn xuất O,N–carboxymetylchitosan.
-Dẫn xuất N,O-carboxychitosan.
-Phản ứng cắt đứt liên kết b-(1-4) glycozide.
• Khả năng hấp phụ tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp của chitin/chitosan:
-Trong phân tử chitin/chitosan và một số dẫn xuất của chitin có chứa các nhóm
chức mà trong đó các nguyên tử Oxy và Nitơ của nhóm chức còn cặp electron
chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim
loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+....
Tuỳ nhóm chức trên mạch polymer mà thành phần và cấu trúc của phức khác
nhau.
1.1.4. Một số ứng dụng của chitosan
Chitosan là loại polymer không độc thân thiện với môi trường, có hoạt tính sinh
học và có khả năng phân hủy sinh học, chống lại một số loại vi khuẩn và độ tương
thích sinh học cao nên chitosan từ lâu đã được sử dụng trong nhiều lĩnh vực: bảo quản
thực phẩm, lọc nước, làm phân bón, mỹ phẩm …Và đặc biệt ngày nay chitosan đang
được nghiên cứu ứng dụng rất rộng rãi trong dược học: làm thuốc điều trị vết thương,
giảm cholesterol trong máu, giảm cân cho người béo, ức chế khối u và ung thư, làm tá
dược trong thuốc viên, như một chất mang thuốc polymer để kiểm soát liều phân giải.
Một hướng mới ứng dụng chitosan trong dược học làm chất mang thuốc có kích
thước nano để mang các thuốc trị ung thư ít tan trong nước hoặc gắn các hệ gen nhạy
cảm... lĩnh vực này hứa hẹn có nhiều tiềm năng vì đồng thời làm tăng độ tan của các

thuốc khó tan trong nước, kiểm soát được liều phân giải, và giảm lượng thuốc đưa vào
trong điều trị.
1.2.

TỔNG QUAN HỆ THỐNG MANG THUỐC NANO CHITOSAN

1.2.1. Giới thiệu [18]
Hiệu quả của nhiều loại thuốc thường bị giới hạn bởi khả năng đến được đích

-5-


tác dụng của chúng. Trong hầu hết trường hợp (đối với các dạng bào chế truyền thống),
chỉ một phần nhỏ liều dùng tới được đích tác dụng, còn lại phần lớn thuốc được phân
bố khắp cơ thể tùy theo các đặc tính lý hóa và sinh hóa của thuốc. Do đó, việc phát
triển một hệ thống phân bố thuốc giúp tối ưu tác dụng điều trị, trong khi giảm các tác
dụng phụ có hại là một nhiệm vụ không hề đơn giản.
Một giải pháp là sử dụng các hệ mang thuốc dạng keo kết hợp khả năng vận
chuyển thuốc tới đích tác dụng và khả năng giải phóng thuốc tối ưu. Trong số đó, các
hệ liposome và hệ hạt nano/micro được nghiên cứu rộng rãi hơn cả. Trong khi các
liposome mang nhiều hạn chế về mặt kỹ thuật như khả năng tái sản xuất, độ ổn định và
hiệu quả bẫy thuốc thấp, các hạt nano dạng polymer lại có khả năng tái sản xuất và độ
ổn định cao hơn.
Các hạt nano là các hạt keo rắn có kích thước từ 10 nm đến 1000 nm. Chúng
bao gồm những vật liệu đại phân tử trong đó nhân tố chủ động (active principle) (sinh
học hay dược phẩm) được hoà tan, bao vỏ, kết bám hay đính kèm vào hạt nano. Các
hạt nano này có đặc tính quý như độ bền cao, khả năng cho phép thay đổi các đặc tính
bề mặt của chúng một cách dễ dàng. Về dược lực học, các hạt nano khi mang thuốc có
khả năng xúc tiến sự tiếp xúc sinh học, do đó tăng cường hiệu quả của thuốc, hơn thế
chúng còn khả năng thấm vào tế bào thông qua bộ phận tiếp nhận của tế bào hoặc đi

vào các mô sau đó nhả thuốc vào đúng tế bào đích mà không cần các thiết bị truyền
dẫn cồng kềnh.
Nhìn chung, các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phân tử nano của chitosan
bao gồm: kích cỡ hạt, điện tích bề mặt, khối lượng phân tử và mức độ đề acetyl hóa.
Hiệu quả mang thuốc phụ thuộc vào pKa và độ tan của thuốc được mang. Thuốc được
gắn với phân tử chitosan chủ yếu thông qua liên kết tĩnh điện, liên kết hydro và liên kết
kỵ nước.
1.2.2. Một số phương pháp tạo hệ mang thuốc nano chitosan [1], [4]
1.2.2.1. Gây biến tính kỵ nước

-6-


Dùng gossypol gây biến tính kỵ nước dẫn xuất glycol chitosan nhằm tạo nên các
hạt có cấu trúc nano dạng mixell có cấu trúc lõi vỏ có khả năng mang các thuốc ít tan
phân tán vào trong môi trường nước, gọi là các hạt GSG.
1.2.2.2. Tạo viên nang dạng nano
Đó là các hạt có kích thước nano của thuốc được bao bọc bên ngoài bởi polymer
phân huỷ sinh học chitosan. Phương pháp chung điều chế các viên nang nano này dựa
trên sự hoà tan của polymer và thuốc trong một dung môi thích hợp, và sự kết tủa của
chúng khi thêm dung dịch này một dung môi không hoà tan polymer.
Polymer được làm lắng trên mặt phân cách giữa pha dầu được phân tán với pha nước.
Viên nang dạng nano được điều chế theo phương pháp này có kích thước khoảng 200500 nm.
1.2.2.3. Tạo hạt nano Chitosan-TPP
Tripolyphosphat (TPP) tạo liên kết với chitosan và gây ra hiện tượng cắt mạch
polymer để tạo thành các hạt nano.
1.2.2.4. Tạo các dẫn xuất chitosan
Chitosan có thể tan trong dung dịch acid loãng, nhưng không thể tạo mixell
trong dung dịch. Do đó, hướng giải quyết chủ yếu là tổng hợp các dẫn xuất của
chitosan, rồi từ đó sử dụng để tạo các hệ mixell polymer làm chất mang thuốc. Qua

tham khảo một số tài liệu, có một số dẫn xuất của chitosan đã được tổng hợp ví dụ như:
Carboxymethyl chitosan, N-octyl-O-sulfate chitosan, N-mPEG-N-octyl chitosan,...
1.2.2.5. Tạo nano bạc
Nano bạc được tổng hợp bằng phương háp khử hóa, trong đó chitosan đóng vai
trò chất khử và chất ổn định. Tiến hành: Khử hóa Ag+ trong môi trường chitosan được
acid hóa (pH 3-4, không có chất khử nào khác), chitosan là chất khử, quá trình khử Ag+
đi đôi với oxi hóa nhóm hydroxyd của chitosan và/hoặc thủy phân chitosan. Khả năng
khử của chitosan phụ thuộc nồng độ và nhiệt độ phản ứng.
1.2.3. Các phương pháp đưa thuốc lên hệ mang thuốc nano [9]

-7-


1.2.3.1. Polymer hóa monomer
- Polymer hóa nhũ tương: Gồm 2 phương pháp.
Phương pháp 1: Phân tán monomer vào trong một nhũ tương hoặc vi nhũ tương
nghịch đảo, hoặc một nguyên liệu (không dung môi) nào đó mà monomer không tan.
Quá trình kết tập trong giai đoạn đầu của polymer hóa được ngăn chặn nhờ thêm vào
các chất hoạt động bề mặt. Phương pháp này hiện ít dùng do dung môi độc, phải thêm
các chất hoạt động bề mặt.
Phương pháp 2: Monomer được hòa tan vào một dung dịch mà không cần chất
hoạt động bề mặt hay chất tạo nhũ tương. Thay vào đó, các phân tử khởi đầu cho quá
trình polymer này có thể là một ion hoặc một gốc tự do. Ngoài ra, phân tử monomer có
thể được chuyển thành gốc nhờ tia xạ năng lượng cao như tia γ, tia tử ngoại hoặc ánh
sáng khả kiến mạnh. Theo cách này, chuỗi polymer được hình thành khi gốc hoặc ion
monomer va chạm với phân tử monomer theo cơ chế polymer hóa anionic. Việc tách
pha và hình thành các phân tử rắn có thể xảy ra trước hoặc sau khi kết thúc phản ứng
polymer hóa.
Trong 2 phương pháp này, thuốc được phân tán vào môi trường polymer hóa
nhờ đó được đưa lên hệ mang thuốc nano.

- Polymer hóa ở bề mặt phân cách:
Monomer và thuốc được hòa tan trong một hỗn hợp gồm dầu và ethanol tuyệt
đối. Sau đó nén chậm hỗn hợp qua một ống vào một dung dịch lỏng được khuấy kỹ, có
thể cho thêm hoặc không cho thêm một ít ethanol hoặc aceton chứa chất hoạt động bề
mặt. Phân tử nano mang thuốc được hình thành ngẫu nhiên do quá trình polymer hóa
monomer sau khi tiếp xúc với các ion khởi đầu có mặt trong dung dịch. Hỗn dịch keo
này có thể được cô đặc bằng cách bốc hơi chân không.
Ưu điểm của phương pháp là nhanh và hiệu quả bẫy thuốc cao. Nhược điểm là
sử dụng dung môi hữu cơ độc, tốn thời gian và khó làm.
Các thuốc sử dụng phương pháp này như insulin, calcitonin,…

-8-


1.2.3.2. Tạo phân tử nano từ polymer có sẵn
Nhược điểm của phương pháp polymer hóa monomer là có thể tạo ra các
polymer chậm phân hủy hoặc không có khả năng phân hủy sinh học, tồn lưu các chất
hoạt động bề mặt, monomer,… đòi hỏi phải loại bỏ. Do vậy, phương pháp dùng
polymer có sẵn ra đời.
- Bốc hơi dung môi-nhũ tương hóa:
Polymer và thuốc được phân tán vào một dung môi không đồng tan với nước,
sau đó hỗn hợp này được phân tán thành các vi giọt nhờ một chất phân tán và máy
khuấy trộn năng lượng cao, trong môi trường hỗn dịch hoặc dung môi như chloroform,
ethyl acetate. Các polymer kết tủa lại dạng nano và thuốc được phân tán đều vào mạng
lưới matrix của polymer đó. Cuối cùng dung môi được bốc hơi bằng nhiệt độ cao ở áp
lực lớn hoặc tiếp tục khuấy. Kích thước hạt nano phụ thuộc vào tốc độ khuấy, chất
phân tán, độ nhớt pha hữu cơ – pha nước và nhiệt độ.

Hình 1.2. Bốc hơi dung môi-nhũ tương hóa
- Phương pháp chuyển dịch dung môi và kết tủa bề mặt:

Hai phương pháp này tương tự nhau, khác nhau là phương pháp dịch chuyển
dung môi có thể tạo ra siêu vi cầu (nanospheres) hoặc siêu vi nang (nanocapsules), còn
phương pháp kết tủa bề mặt chỉ tạo ra siêu vi nang.
Thuốc và polymer được hòa vào một dung môi hữu cơ, sau đó hỗn hợp được
nhũ tương hóa vào pha lỏng tạo nên hiện tượng kết tủa các phân tử nano. Có thể sử
dụng hay không sử dụng chất hoạt động bề mặt.

-9-


Hình 1.3. Phương pháp chuyển dịch dung môi và kết tủa bề mặt
- Khuếch tán dung môi – nhũ tương hóa:
Trong phương pháp này, polymer được hòa tan trong một dung môi tan trong
nước một phần như propylene carbonate và bão hòa với nước để đạt cân bằng nhiệt
động ban đầu ở cả hai chất lỏng (nhằm kết tủa polymer và hình thành hạt nano, cần
phải thúc đẩy qua trình khuếch tán dung môi pha phân tán bằng cách pha loãng với
lượng thừa nước nếu dung môi hữu cơ pha phân tán tan trong nước một phần hoặc với
một dung môi hữu cơ khác trong trường hợp ngược lại). Sau đó, pha dung môi bão hòa
polymer-nước này được nhũ tương hóa trong một dung dịch lỏng chứa chất ổn định,
làm cho dung môi khuếch tán vào pha ngoại hình thành các siêu cầu hoặc siêu vi nang,
tùy theo tỷ lệ dầu/polymer. Cuối cùng dung môi được loại bỏ bằng cách bốc hơi hoặc
lọc, tùy theo điểm sôi.

Hình 1.4. Khuếch tán dung môi – nhũ tương hóa
Ưu điểm phương pháp này là hiệu quả bẫy thuốc cao (thường >70%), không cần
khuấy trộn, có thể sản suất quy mô lớn, đơn giản, phân bố kích thước hạt trong khoảng
hẹp. Nhược điểm là trong quá trình nhũ tương hóa, một lượng lớn nước bị loại khỏi

- 10 -

hỗn dịch và rò rỉ thuốc tan trong nước theo pha ngoại lỏng bão hòa, dẫn đến giảm hiệu
suất.
- Phương pháp kết tinh muối:
Cơ sở của phương pháp là tách dung môi tan trong nước khỏi dung dịch lỏng
thông qua hiệu ứng kết tinh muối. Ban đầu polymer và thuốc được hòa tan trong một
dung môi chẳng hạn aceton, sau đó được nhũ tương hóa vào một gel lỏng có chứa chất
tạo kết tinh (chất điện phân như muối calci, magnesi, hoặc chất không điện phân như
sacarose) và một chất ổn định keo như polyvinylpyrrolidon hoặc hydroxyethylcellulose. Nhũ tương dầu/nước này được pha loãng với một lượng nước hoặc dịch lỏng để
tăng khuếch tán aceton vào pha lỏng, hình thành nên các siêu vi cầu.

Hình 1.5. Phương pháp kết tinh muối
Ưu điểm của phương pháp là giảm thiểu áp lực với các chất bẫy thuốc bản chất
protein và không yêu cầu nhiệt độ cao nên phù hợp với các thuốc nhạy cảm với nhiệt
độ. Nhược điểm là chỉ áp dụng với các thuốc thân dầu và kéo dài thêm quy trình rửa
phân tử nano.
1.3. TỔNG QUAN VỀ O-CARBOXYMETHYL CHITOSAN (O-CMC) [17]
1.3.1. Cấu trúc

Hình 1.6. O - Carboxymethyl chitosan

- 11 -


1.3.2. Tổng hợp
Chitosan được ngâm vào dung dịch kiềm ở nhiệt độ từ 0-30oC trong khoảng thời gian
từ 2 – 24 giờ để hoạt hóa chitosan. Nồng độ chitosan sử dụng thường từ 4% - 20%
(khối lượng/thể tích) và dung dịch kiềm là NaOH 40 – 50% (khối lượng/thể tích). Sau
khi hoạt hóa chitosan, cho chitosan phản ứng với acid monochloroacetic pha trong
isopropanol hoặc ethanol với tỷ lệ acid/dung môi là 1:4 (theo khối lượng). Sản phẩm

sau đó được kết tủa bằng aceton hoặc ethanol và khử muối bằng cách điều chỉnh pH
hoặc thẩm phân.

Chitosan

O-CMC

Hình 1.7. Tổng hợp O - Carboxymethyl chitosan
1.3.3. Tính chất hóa lý
1.3.3.1. Độ hòa tan
O – Carboxymethyl chitosan tan trong nước, và tan tốt hơn chitosan do có các
nhóm carboxymethyl. Độ tan này phụ thuộc vào điều kiện phản ứng tổng hợp và mức
độ carboxymethyl hóa chitosan. Chẳng hạn, nhiệt độ phản ứng cao làm tăng đứt gãy
các nhóm carboxymethyl do đó giảm độ tan của O-CMC ở pH thấp. Trong khi đó, tăng
tỷ lệ nước/isopropanol trong phản ứng tổng hợp sẽ giảm đứt gãy carboxymethyl do đó
tăng độ tan ở pH cao.
1.3.3.2. Lưu giữ và hấp thụ ẩm
O-CMC lưu giữ ẩm tốt hơn các dẫn xuất khác của chitosan. Dung dịch CMC
0,25% có khả năng giữ ẩm tương đương với dung dịch propylen glycol 20%, và có độ
nhớt tương tự với acid hyaluronic, một hợp chất có đã biết có khả năng giữ ẩm rất tốt.

- 12 -


Có nghiên cứu cho rằng khả năng lưu giữ, hấp thụ ẩm của CMC có lien quan tới cấu
trúc polymer của chất này.
Khả năng lưu giữ ẩm được tính bằng phần trăm lượng nước còn lại của mẫu ẩm
được chuẩn bị bằng cách thêm 10% nước vào mẫu đã được làm khô trước với P2O5
trong bình hút ẩm trong 24 giờ:
Rh (%) = 100 x (Hn/Ho)

Trong đó, Ho và Hn là khối lượng nước trong mẫu trước và sau khi đặt mẫu
trong bình hút ẩm chứa K2CO3 bão hòa (độ ẩm tương đối 43%) và silicagel ở 20oC
trong 48 giờ.
Khả năng hấp thụ ẩm Ra được tính bằng phần trăm độ tăng khối lượng mẫu đã
được làm khô trước với P2O5 trong bình hút ẩm trong 24 giờ:
Ra (%) = 100 x (Wn – Wo)/Wo
Trong đó, Wo và Wn là khối lượng mẫu trước và sau khi đặt vào bình hút ẩm
chứa (NH4)2SO4 bão hòa (độ ẩm tương đối 81%) và bình hút ẩm chứa bão hòa (độ ẩm
tương đối 43%) ở 20oC trong 48 giờ.
Khả năng giữ và hấp thụ ẩm của CMC có liên quan đến cấu trúc và trọng lượng
phân tử. Nhóm 6-carboxymethyl giữ vai trò chính cho khả năng này. Trọng lượng phân
tử càng cao, khả năng giữ ẩm càng tốt.
1.3.3.3. Tạo phức chelat và khả năng hấp thụ
CMC có khả năng hấp thụ tốt là do:
- Độ thân nước cao do chứa nhiều nhóm hydroxyl
- Nhiếu nhóm amin bậc 1 giữ vai trò làm nơi hấp thụ
- Cấu trúc chuỗi polymer linh hoạt giúp tạo cấu hình phù hợp để tạo phức với
ion kim loại
Các nguyên tử N của CMC có chứa các cặp electron tự do có thể kết hợp với
cation kim loại và hấp thụ chúng theo cơ chế tạo phức. Tuy nhiên các nhóm amin này
dễ dàng bị proton hóa trong môi trường acid, tạo lực hút tĩnh điện với các anion, gồm

- 13 -


các anion kim loại (CrO2-4, SeO-4, VO3-4, SO2-4, MoO-4, HAsO-4,…).
1.3.4. Đặc tính sinh học
1.3.4.1. Điều chỉnh chức năng tế bào
Nguyên cứu chỉ ra rằng việc gắn chitosan vào thành phần proteoglycan dường
như sẽ làm thay đổi hình thái, sinh sản và biệt hóa tế bào. CMC vẫn giữ nguyên đặc

tính này của chitosan.
Chitosan được sử dụng trong kỹ thuật mô dưới dạng một matrix tổng hợp ngoài
tế bào, phát tín hiệu tới tế bào và điểu khiển sự tăng trưởng mô mới. Điều này đòi hỏi
tốc độ phân hủy của chitosan phải phù hợp với tốc độ hình thành mô mới. Tuy nhiên
tốc độ phân hủy thường là chậm và khó kiểm soát, do nó diễn ra theo quá trình hòa tan
chậm không thể đoán trước, chủ yếu do chitosan khó tan trong pH sinh lý. Nhược điểm
này có thể khắc phục được nhờ carboxymethyl hóa. Tốc độ phân hủy của CMC liên kết
ngang đồng hóa trị có thể được kiểm soát tốt hơn nhờ sự phân bố trọng lượng của
CMC (thay đổi tỷ lệ trọng lượng phân tử cao hay thấp).
1.3.4.2. Chống oxi hóa
Các nhóm hydroxyl và amin hoạt hóa của CMC có thể tham gia dọn dẹp các gốc
tự do nhờ đó có tác dụng chống oxi hóa. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng này của
CMC là thành phần các nhóm hydroxyl, amin, amid trong chuỗi và trọng lượng phân
tử.
1.3.4.3. Kháng khuẩn
Chitosan có tác dụng ức chế một lượng lớn vi khuẩn và nấm theo nhiều cơ chế
khác nhau. Chẳng hạn, cation của chitosan gắn vào ADN làm ức chế tổng hợp ARN,…
Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình này gồm trọng lượng phân tử, mức độ deacetyl hóa,
nồng độ dung dịch và pH môi trường. CMC bảo toàn đặc tính này của chitosan.
1.3.4.4. Ức chế quá trình tự hoại tử tế bào
CMC can thiệp vào quá trình tự hoại tử tế bào có thể bắt đầu bằng việc tương
tác với màng tế bào, có thể là bảo vệ chức năng của ty thể, giảm nồng độ nitric oxid và

- 14 -


các nhóm oxy hoạt tính.
1.3.5. Ứng dụng
CMC được ứng dụng rộng rãi trong y sinh học nhờ khả năng tự phân giải và
không có độc tính.

1.3.5.1. Vận chuyển thuốc có kiểm soát và vận chuyển thuốc phụ thuộc pH
Nhờ vào đặc tính độ tan và độ kết tập, CMC được dùng làm chất mang giúp
tăng độ tan và giải phóng có kiểm soát một số thuốc.
CMC trương nở ở pH < 2 và từ 4 – 13, ở pH từ 2 – 4, CMC mất trương nở. Lý
do cho điều này nằm ở các nhóm –NH2 và –COOH có thể ion hóa thành các nhóm tích
điện dương hay âm tùy theo pH môi trường, do đó làm thay đổi trạng thái tích điện của
phân tử. Sự thay đổi độ trương nở này sẽ ảnh hưởng lên quá trình giải phóng thuốc.
1.3.5.2. Vận chuyển AND
CMC có khả năng tương tác mạnh mẽ với DPPC, một thành phần quan trọng
của màng sinh học, do đó CMC còn được ứng dụng trong vận chuyển gen.
1.3.5.3. Vận chuyển thuốc tới đích tác dụng
Các phân tử nano CMC được dùng làm chất mang đưa thuốc tới đích tác dụng.
1.3.5.4. Tăng tính thấm
Chitosan làm tăng tính thấm của niêm mạc ruột, mũi, miệng, biểu mô trước giác
mạc bằng cách mở các khớp nối chặt chẽ giữa các tế bào, do vậy nó thường ứng dụng
cho vận chuyển thuốc cận bào. Trên phân tử CMC, một số phần monomer của chitosan
vẫn duy trì cấu trúc proton hóa, do vậy vẫn giữ được tác dụng tăng tính thấm của
chitosan.
1.3.5.5. Ứng dụng khác
Dùng trong hóa mỹ phẩm (do giữ ẩm), làm màng bao,….
1.4.

TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN

1.4.1. Cấu trúc và tính chất

- 15 -


<=>

Curcumin dạng enol

Curcumin dạng ceton

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của Curcumin dạng ceton và enol
Cảm quan

Bột màu vàng nghệ, thực tế không tan trong nước và
trong ether

IUPAC

(1E,6E)-1,7-bis
(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)
heptadiene-3,5-dione

Tên khác
Công thức phân tử
Phân tử gam
Điểm nóng chảy

Curcumin, diferuloylmethan; C.I.75300; Natural Yellow 3
C21H20O6
368,38 g/mol
183 °C (361 K)

-1,6-

Curcumin có thể tồn tại ít nhất ở 2 dạng đồng phân là ceton và enol. Cấu trúc

dạng enol ổn định hơn về mặt năng lượng ở pha rắn và dạng dung dịch [12]. Các hệ
thống vòng thơm, là các polyphenol được nối bởi 2 nhóm cacbonyl α,β-chưa bão hòa.
Hai nhóm cacbonyl tạo thành diceton. Diceton tạo thành các enol ổn định hay dễ dàng
khử proton và tạo thành các enolat, trong khi cacbonyl α,β-chưa bão hòa là tác nhân
nhận hydro tốt và có phản ứng cộng ái lực hạt nhân. Cấu trúc của curcumin được xác
định lần đầu tiên vào năm 1910 (Kazimierz Kostanecki, J. Miłobędzka and Wiktor
Lampe).
1.4.2. Sử dụng curcumin trong y học
Củ nghệ bắt đầu được sử dụng trong y học Ayurveda tại Ấn Độ từ khoảng năm
1900 TCN để chữa trị một loạt các loại bệnh tật. Nghiên cứu của các nhà khoa học vào
cuối thế kỷ 20 đã xác định curcumin đóng vai trò quan trọng trong các hoạt tính sinh
học của củ nghệ [6]. Dựa trên những nghiên cứu trong ống nghiệm (in vitro) và trên

- 16 -


động vật, các nhà khoa học đưa ra giả thuyết khả năng chữa bệnh hoặc ngăn ngừa bệnh
của curcumin. Hiện tại, các tác động này chưa được xác nhận trên người. Tuy nhiên,
cho tới năm 2008, rất nhiều thử nghiệm lâm sàng ở người đang được thử nghiệm để
nghiên cứu về tác dụng của curcumin trong việc điều trị các bệnh như: viêm tủy, ung
thư tụy, hội chứng loạn sản tủy, ung thư ruột kết, bệnh vẩy nến, bệnh Alzheimer [11].
Theo nghiên cứu cũng cho thấy curcumin có tính chất chống ung thư [7], [10],
chống ôxi hóa, chống viêm khớp, chống thoái hóa, chống thiếu máu cục bộ [14] và
kháng viêm [15]. Khả năng kháng viêm có thể là do sự ngăn chặn tổng hợp sinh học
của eicosanoit [16].
Curcumin làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn hình thành các tế bào
ung thư mới. Curcumin giúp cơ thể phòng ngừa và chống ung thư. Curcumin là một
chất có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan B, C và nhiễm HIV.
Rất nhiều bằng chứng cho thấy curcumin phát triển chức năng tinh thần, một
điều tra trên 1010 người châu Á ăn bột cari vàng ở độ tuổi 60-93 cho thấy những người

ăn ít nhất 1 lần trong 6 tháng cho kết quả MMSE cao hơn so với những người không
ăn. Theo quan điểm của các nhà khoa học, và một con số rất lớn các nghiên cứu cho
thấy curcumin có tác dụng tốt cho não, các notron, giảm stress, trầm cảm, trạng thái lo
âu.
Tác dụng chống ung thư
Khả năng chống ung thư do Curcumin làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn
chặn hình thành các tế bào ung thư mới mà không làm ảnh hưởng đến các tế bào lành
tính bên cạnh. Curcumin can thiệp vào hoạt động sao chép của NF-κB là liên kết các
bệnh viêm như ung thư. Một nghiên cứu về tác dụng của Curcumin đối với ung thư
năm 2009 cho thấy Curcumin điều chỉnh sự phát triển của các tế bào u, bướu thông qua
quá trình phân chia thường xuyên của tế bào.
Những nghiên cứu về curcumin bước đầu đã cho thấy:

- 17 -