SỬ DỤNG kỹ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE để PHÁT HIỆN CMV và HSV,HZV TRONG THỦY DỊCH của BỆNH NHÂN bị VIÊM MÀNG bồ đào TRƯỚC cấp TÍNH

B Y T
TRNG I HC Y H NI

H TRUNG KIấN

Sử DụNG Kỹ THUậT PHảN ứNG CHUỗI
POLYMERASE
Để PHáT HIệN cmv và hsv, hzv TRONG THủY
DịCH
CủA bệnh nhân bị viêm màng bồ đào trớc
cấp tính

CNG LUN VN BC S CHUYấN KHOA II


H NI - 2016
B Y T
TRNG I HC Y H NI

H TRUNG KIấN

Sử DụNG Kỹ THUậT PHảN ứNG CHUỗI
POLYMERASE
Để PHáT HIệN cmv và hsv, hzv TRONG THủY
DịCH
CủA bệnh nhân bị viêm màng bồ đào trớc
cấp tính
Chuyờn ngnh: Nhón khoa
Mó s: CK 62725601

CNG LUN VN BC S CHUYấN KHOA II

Ngi hng dn khoa hc:


1. PGS. TS Phạm Trọng Văn
2. TS Vũ Tuấn Anh

HÀ NỘI - 2016
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CMV

Cytomegalovirus

DNA

Deoxyribonucleic acid

HIV

Human Immunodeficiency virus

HSV

Herpes Simplex virus

HZV

Herpes Zoster virus

MBĐ

Màng bồ đào

PCR

Polymerase Chain Reaction


MỤC LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG


6

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm màng bồ đào là tình trạng viêm nhiễm một trong ba thành phần của
màng bồ đào, bao gồm: Viêm mống mắt thể mi (viêm màng bồ đào trước),
viêm pars plana và viêm hắc mạc. Những năm gần đây khái niệm về viêm
màng bồ đào (MBĐ) đã được mở rộng không chỉ giới hạn ở MBĐ mà còn là
viêm ở các tổ chức lân cận như: Dịch kính, võng mạc, mạch máu võng mạc,
củng mạc và thượng củng mạc [1]. Đây là một bệnh lý nặng trong nhãn khoa,
thường hay tái phát và có nhiều biến chứng, di chứng nặng nề, để lại hậu quả
nghiêm trọng làm ảnh hưởng đến chức năng thị giác và cấu trúc nhãn cầu của
người bệnh. Việc điều trị viêm MBĐ hầu hết mới chỉ dừng lại ở điều trị triệu
chứng và điều trị bao vây do không tìm được nguyên nhân gây bệnh rõ ràng.
Năm 2006, Schryver, F. Rozenberg, N. Casonx và cộng sự [2] khi nghiên

cứu tìm nguyên nhân trên 5 bệnh nhân bị viêm MBĐ trước bằng cách lấy thủy
dịch làm phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) thì cả 5 trường hợp đều dương
tính với Cytomegalovirus (CMV), không thấy có sự xuất hiện của các virus
khác như Herpes Simplex virus (HSV), Herpes Zoster virus (HZV) hay
Rubella trong thủy dịch của những bệnh nhân này.
Năm 2007, trong một báo cáo của mình, Soon Phaik Chee, Kristine Bacsal,
Aliza Jap, Su-yun se- Thoe, Chingli Cheng, Ban Hock Tan và cộng sự [3] đã
nghiên cứu trên 105 mắt bệnh nhân bị viêm MBĐ trước, bằng cách làm phản ứng
PCR dịch tiền phòng đã thấy có 24 bệnh nhân (22,8%) dương tính với CMV.
Hầu hết các tác giả sau khi nghiên cứu thủy dịch của bệnh nhân bị viêm
MBĐ bằng kỹ thuật PCR, thấy sự có mặt của CMV trong thủy dịch đã điều
trị kết hợp cho bệnh nhân bằng Valganciclovir hoặc Ganciclovir theo đường
uống cho kết quả khá tốt, tỷ lệ khỏi bệnh cao, tỷ lệ tái phát thấp [2],[4],[5],
[6],[7],[8],[9].


7

Tại Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có báo cáo nào đề cập đến việc lấy
dịch tiền phòng làm phản ứng PCR để tìm nguyên nhân cho bệnh nhân bị
viêm MBĐ trước cấp tính mà mới chỉ có một số tác giả đề cập đến việc điều
trị biến chứng và di chứng của viêm MBĐ trước [10],[11],[12].
Phòng khám của bệnh viện Mắt Trung Ương trong những năm gần đây
số người bệnh đến khám và tái khám với chẩn đoán viêm MBĐ trước cấp tính
ngày càng tăng. Tuy nhiên việc điều trị bệnh viêm MBĐ trước còn gặp nhiều
khó khăn do chưa xác định rõ được nguyên nhân gây bệnh, hầu như các phác
đồ điều trị đều là điều trị triệu chứng mà chưa có điều trị nguyên nhân cụ thể.
Tỉ lệ bệnh tái phát cao gây tổn hại chức năng thị giác và cấu trúc nhãn cầu,
gây nhiều lo lắng cũng như tốn kém tiền bạc, thời gian, công sức của người
bệnh. Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm lâm sàng, nguyên nhân

gây bệnh để từ đó đưa ra những tiêu chuẩn chẩn đoán xác định, hướng điều trị
nguyên nhân có hiệu quả với thể loại bệnh này có một ý nghĩa hết sức quan
trọng trong thực tế.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Sử dụng
kỹ thuật phản ứng chuỗi Polymerase để phát hiện Cytomegalovirus và
Herpes Simplex virus, Herpes Zoster virus trong thủy dịch của bệnh
nhân bị viêm màng bồ đào trước cấp tính”.
Với 2 mục tiêu nghiên cứu:
1.

Mô tả đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân viêm màng bồ đào trước
cấp tính.

2. Xác định mối liên quan giữa bệnh cảnh lâm sàng và kết quả xét nghiệm
thủy dịch của bệnh nhân bị viêm màng bồ đào trước cấp tính.


8

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Màng bồ đào
1.1.1. Giải phẫu, sinh lý màng bồ đào [13],[14],[15]
Màng bồ đào thuộc tổ chức trung bì, còn gọi là mạch mạc, bao gồm 3
phần: Mống mắt ở trước, thể mi ở giữa và hắc mạc ở sau. Màng bồ đào có
năm nhiệm vụ chính: điều chỉnh ánh sáng, dinh dưỡng, tiết thể dịch, điều tiết
và tạo buồng tối để ảnh hiện rõ trên võng mạc.
* Mống mắt:
- Mống mắt có hình đồng xu, có lỗ thủng ở trung tâm gọi là đồng tử.
Mống mắt nằm ngay ở trước thể thủy tinh, ngăn cách giữa tiền phòng ở phía

trước và hậu phòng ở phía sau. Chân mống mắt tiếp giáp với thể mi
- Từ trước ra sau mống mắt có 5 lớp tổ chức : lớp nội mô, lớp giới hạn
trước, lớp đệm và lớp màng sau, nhưng 4 lớp trước đều là một tổ chức liên kết
có cùng hệ thống mạch máu và thần kinh dày đặc.
- Đồng tử là một lỗ thủng ở trung tâm mống mắt. Bình thường đồng tử
hai mắt đều nhau, có hình tròn đường kính 2 - 4 mm. Đồng tử thay đổi kích
thước do tác động của nhiều yếu tố: ánh sáng, nhìn xa, nhìn gần, các kích
thích thần kinh cảm giác.
- Các mạch máu :
+ Các động mạch của mống mắt đều xuất phát từ vòng động mạch lớn
của mống mắt nằm trong thể mi. Các tiểu động mạch đi từ vòng động mạch
lớn theo hướng nan hoa về phía đồng tử và nối chắp chủ yếu ở chân mống
mắt và ở gần cơ vòng.
+ Các tĩnh mạch của mống mắt xuất phát từ vòng quanh đồng tử đi theo
hướng nan hoa qua vùng thể mi, cùng với các tĩnh mạch của thể mi đổ vào 4
tĩnh mạch trích trùng.


9

- Các dây thần kinh của mống mắt:
+ Dây thần kinh cảm giác: là các nhánh thần kinh mi dài thuộc dây VI
(dây thần kinh của Willis).
+ Các nhánh thần kinh vận động từ dây thần kinh mi ngắn đi từ hạch mi
(nhánh của dây III) chi phối cơ vòng của mống mắt làm co đồng tử.
+ Các nhánh thần kinh giao cảm đi từ hạch cổ trên chi phối cơ xòe của
mống mắt làm giãn đồng tử và vận mạch.
- Chức năng: mống mắt có nhiệm vụ như một màn chắn, để điều chỉnh
lượng ánh sáng vào trong nhãn cầu nhờ thay đổi đường kính đồng từ do hoạt
động của các cơ vòng và cơ xòe của mống mắt.

* Thể mi:
- Thể mi là phần nhô lên của MBĐ, nằm giữa mống mắt ở phía trước và
hắc mạc ở phía sau, có hai chức năng chính:
+ Điều tiết giúp nhìn rõ các vật ở gần.
+ Tiết ra thủy dịch nhờ các tế bào lập phương ở thể mi.
- Từ ngoài vào trong gồm 7 lớp: lớp trên thể mi, lớp cơ thể mi, mạch
máu thể mi, lá thủy tinh, lớp biểu mô sắc tố, lớp biểu mô thể mi và lớp giới
hạn trong.
- Các mạch máu:
+ Các động mạch chủ yếu của vùng thể mi đều xuất phát từ vòng động
mạch lớn của mống mắt. Vòng động mạch này nhận máu từ hai động mạch mi
dài sau và các động mạch mi ngắn trước.
+ Các tĩnh mạch của thể mi đều chạy về hắc mạc ở phía sau và được đưa
về tĩnh mạch mắt nhờ 4 tĩnh mạch trích trùng.
- Thần kinh: thể mi có một mạng thần kinh dày đặc xuất phát từ đám rối
thần kinh thể mi. Đám rối thần kinh mi được tạo thành từ các dây thần kinh
mi dài và các dây thần kinh mi ngắn xuất phát từ hạch mi.


10

* Hắc mạc:
- Hắc mạc là phần sau của MBĐ, có chứa nhiều mạch máu để nuôi nhãn
cầu và nhiều tế bào mang sắc tố đen hấp thụ các tia sáng từ ngoài vào làm
thành buồng tối trong mắt, tạo điều kiện ảnh hiện rõ trên võng mạc.
- Hắc mạc có 3 lớp từ ngoài vào trong: khoang thượng hắc mạc, lớp hắc
mạc chính danh, màng Bruch.
- Các mạch máu:
+ Có 20 động mạch mi ngắn bắt nguồn từ động mạch mắt xuyên qua
củng mạc ở quanh thị thần kinh. Các động mạch này chia nhánh chằng chịt

trong hắc mạc và nối nhánh quặt ngược của vòng động mạch lớn của mống
mắt ở phía trước. Trong vùng quanh đĩa thị, hai hoặc ba động mạch mi
ngắn sau cấp máu nuôi dưỡng hắc mạc và thị thần kinh tạo thành vòng
động mạch Zinn.
+ Các tĩnh mạch của hắc mạc đổ về bốn tĩnh mạch trích trùng để chảy về
các tĩnh mạch mắt.
- Thần kinh: Các dây thần kinh của hắc mạc đều xuất phát từ các dây
thần kinh mi ngắn và mi dài. Các nhánh thần kinh nối chắp nhau tạo thành
một mạng lưới thần kinh dày đặc, có các sợi thần kinh đi đến các mạch máu
và các sợi kéo dài tới tận lớp mao mạch hắc mạc tiếp xúc với cả màng Bruch.
1.2. Bệnh viêm màng bồ đào
1.2.1. Định nghĩa viêm màng bồ đào
Catalan R.A, Nelson L.B năm 1992 trong một nghiên cứu của mình đã
nêu ra định nghĩa về viêm màng bồ đào như sau [1]:
”Viêm MBĐ là một tên gọi chung về hình thái viêm nhiễm của MBĐ. Sự
viêm nhiễm không chỉ giới hạn trong cấu trúc của MBĐ mà còn bao gồm các
cấu trúc không phải của MBĐ như: dịch kính, võng mạc, mạch máu võng
mạc, trong mô sắc tố võng mạc, củng mạc và thượng củng mạc”.


11

1.2.2. Nguyên nhân viêm MBĐ
Theo Nussenbatt, Whitcup, Polestine [16],[17],[18]:
Nguyên nhân nhiễm trùng:
- Vi khuẩn: lao, giang mai, liên cầu, não mô cầu.
- Virus: HIV, Herper, CMV, Rubella.
- Nấm: Candida, Aspergillus.
- Ký sinh trùng: Toxoplasma, Giun toxocariasis.
Nguyên nhân không do nhiễm trùng:

Nhãn viêm đồng cảm, Vogt Koyanagi - Harada, Behset, sarcoidose, viêm
mạch võng mạc.
Các tác giả khác như Amer, Kanski, Wong cho rằng viêm cột sống dính
khớp hội chứng Reiter, bệnh viêm đường ruột, viêm khớp vảy nến, bệnh khớp
thanh thiếu niên đều là nguyên nhân gây viêm MBĐ trước và có tỷ lệ HBLA
B27 dương tính cao [18],[19],[20].
Theo Giles, Offret [21],[22]: Quá trình viêm nhiễm của MBĐ cho dù căn
nguyên là nội sinh hay ngoại sinh thì đều biểu hiện dưới hai bệnh cảnh lâm
sàng là viêm MBĐ làm mủ và viêm MBĐ không làm mủ
- Viêm MBĐ không làm mủ hay viêm MBĐ phản ứng là phản ứng viêm
không đặc hiệu của MBĐ và thường có vai trò của các yếu tố miễn dịch bệnh lí.
- Viêm MBĐ mủ: sự xuất hiện của một phản ứng viêm mủ trong MBĐ
hay dịch kính xảy ra do sự tỏa lan từ một ổ nhiễm trùng và thường ảnh hưởng
tới cấu trúc cạnh nhãn cầu. Nguồn gốc của nhiễm trùng có thể là ngoại sinh
(các vết thương sau phẫu thuật, dị vật xuyên nhãn cầu, loét giác mạc) hay nội
sinh (do vi khuẩn,nấm, ký sinh trùng hay virus) theo đường máu đến khu trú ở
mắt [17],[23],[24],[25].
Theo Nguyễn Xuân Nguyên, Hà Huy Tiến, Cù Nhẫn Nại [26], Kanski
[20], Hội nhãn khoa Mỹ [14] thì lại chia viêm MBĐ thành 2 hình thái:


12

- Viêm MBĐ ngoại sinh: Các yếu tố gây viêm MBĐ từ ngoài vào sau tổn
thương tại mắt: vi khuẩn, virus, nấm, viêm MBĐ sau chấn thương xuyên,
chấn thương đụng giập nhãn cầu, sau bỏng, viêm MBĐ sau phẫu thuật, viêm
MBĐ sau viêm loét giác mạc, viêm củng mạc.
- Viêm MBĐ nội sinh: Các yếu tố gây bệnh trong cơ thể đi vào mắt qua
đường máu hoặc bạch mạch. Các vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh trùng từ các ổ
nhiễm khuẩn như: viêm phổi, mũi họng, răng hàm mặt, viêm da, đường tiêu

hóa, thận, tủy xương. Các yếu tố dị ứng trong bệnh viêm khớp, đốt sống, một
số yếu tố gây rối loạn chuyển hóa trong bệnh gút, đái tháo đường, những
bệnh mãn tính [19],[26]. Ngoài ra một số lớn trường hợp không tìm thấy
nguyên nhân [18],[26].
1.2.3. Phân loại viêm MBĐ
Tùy theo từng tác giả hoặc nhóm tác giả mà có nhiều cách phân loại
viêm MBĐ khác nhau.
1.2.3.1. Phân loại theo cấu trúc giải phẫu
Theo Nguyễn Xuân Nguyên, Hà Huy Tiến, Cù Nhẫn Nại [26]:
- Viêm mống mắt.
- Viêm mống mắt thể mi.
- Viêm hắc mạc.
Theo Amer Acad Ophth, Kanski, Spencer N.A [19],[20],[27]:
- Viêm MBĐ trước: gồm viêm mống mắt và thể mi.
- Viêm MBĐ trung gian: là viêm phần giữa nhãn cầu trên Pars plana.
- Viêm MBĐ sau: viêm chỉ có thể ảnh hưởng đến hắc mạc, đến võng
mạc hoặc cả hai.
- Viêm MBĐ toàn bộ: gồm viêm cả mống mắt - thể mi và hắc mạc.
- Viêm nội nhãn: Viêm trong nhãn cầu chủ yếu là dịch kính và tiền phòng.


13

1.2.3.2. Phân loại theo tiến triển của bệnh
Theo Catalan, Nelson [1], Kanski [20]:
- Viêm cấp tính: bệnh tiến triển dưới 3 tháng.
- Viêm mạn tính: Bệnh tiến triển trên 3 tháng.
Một số tác giả phân các nguyên nhân hay gặp theo tiến triển của bệnh [28]:
- Cấp tính: Viêm MBĐ trước vô căn, viêm đốt sống cổ, hội chứng Reiter,
Fuchs, hội chứng Vogt - Koyanagi - Harada, Toxoplasma, hoại tử võng mạc

cấp, nhiễm khuẩn sau phẫu thuật, chấn thương.
- Mạn tính: Viêm khớp trẻ em, viêm MBĐ do lao, giang mai, sarcoidose,
viêm Pars plana.
1.2.3.3. Phân loại theo nguyên nhân
Viêm MBĐ do vi khuẩn, do virus, do nấm, do kí sinh trùng, do dị ứng
liên quan đến yếu tố miễn dịch.
1.2.3.4. Phân loại theo tổn thương giải phẫu bệnh
Theo Catalan [1], Kanski [20], Aubert, Baudet, Baudouin, Asbury [29]:
- Viêm MBĐ không u hạt.
- Viêm MBĐ có u hạt.
1.2.4. Cơ chế bệnh sinh viêm MBĐ
Sự thâm nhiễm dẫn đến mạch máu bị cương tụ, tiếp theo là giãn mạch,
nghẽn mạch, tăng tính thấm, rò protein, tế bào xuyên mạch gây nên đục thủy
dịch. Đó cũng là kết quả của quá trình phá vỡ hàng rào máu - thủy dịch. Tế
bào bạch cầu và các tế bào khác làm nên dấu hiệu Tyndall, tủa sau giác mạc,
máu tiền phòng, mủ tiền phòng, lắng đọng các tế bào sau thể thủy tinh và
trong dịch kính.
Các tế bào viêm, mảnh vụn tế bào, tổ chức thoái hóa lắng đọng mặt sau
giác mạc: theo các tác giả là sự nóng lên của thủy dịch khi đi qua mống mắt
và gặp giác mạc lạnh hơn nên gặp tủa loại này. Ngoài ra còn hình thành dính


14

trước và dính sau mống mắt. Các sắc tố xuất hiện mặt trước, sau thể thủy tinh
và dịch kính.
Viêm giai đoạn đầu kích thích thể mi tăng tiết do vậy nhãn áp cao tạm
thời. Khi gây viêm teo thể mi thì nhãn áp có thể thấp. Nhãn áp có thể tăng
nhanh nếu các mảnh vụn viêm bít tắc vùng bè và bít đồng tử [1],[16],[17],
[24],[26].

Sự thâm nhiễm có thể làm thể mi phù và kích thích xuất tiết protein vào
hậu phòng và dịch kính trước. Một màng xơ thể mi co kéo có gây bong Pars
plana và hắc mạc phía trước, cuối cùng thể mi teo, xơ hóa và thoái hóa hyalin.
Trong viêm hắc mạc, mạch máu giãn gây thoát mạch, mạch máu có viền bọc
trắng do các tế bào viêm và xuất tiết ở xung quanh mạch. Sự viêm nhiễm
phần sau thường kéo theo giảm thị lực, nhìn hình biến dạng to ra hoặc nhỏ lại
[1],[17],[24],[26].
1.2.5. Viêm MBĐ do cơ chế tự miễn
* Viêm MBĐ do phản vệ thể thủy tinh:
Do sự khác biệt giải phẫu của thể thủy tinh với phần còn lại của cơ thể ở
giai đoạn sớm của quá trình phát triển bào thai. Vì thế sự tiếp xúc với kháng
nguyên thể thủy tinh ở giai đoạn sau này có thể dẫn đến một đáp ứng miễn
dịch đối với mô được coi là lạ. Do đó lâm sàng được gọi là viêm MBĐ do thể
thủy tinh. Giác mạc có tủa dạng “mỡ cừu”, mạch máu mống mắt cương tụ, có
dính sau mống mắt, nhiều tế bào và Tyndall dày đặc.
* Nhãn viêm đồng cảm:
Bệnh căn của nhãn viêm đồng cảm chưa được biết rõ, những giả thuyết gồm
có mẫn cảm với sắc tố, tác nhân nhiễm trùng hoặc mẫn cảm với kháng nguyên S
của võng mạc hoặc các protein khác của võng mạc hoặc MBĐ [18],[19].
Trên lâm sàng viêm có thể xảy ra sớm ở mắt thứ 2 sau chấn thương mắt
thứ nhất 10 ngày muộn nhất là 50 năm. Thường sau 4 - 8 tuần, 80% xuất hiện


15

trong 3 tháng đầu. Mắt gây đồng cảm thường bị kích thích dai dẳng dẫn đến
một viêm MBĐ toàn bộ, âm ỉ, mắt bị đồng cảm có thể viêm MBĐ trước, viêm
MBĐ sau, viêm MBĐ toàn bộ, MBĐ dày lên, tủa sau giác mạc dạng ”mỡ
cừu”, nốt thâm nhiễm ở mống mắt, dính chân mống mắt, viêm gai thị, kèm
theo hội chứng thần kinh, biến đổi sắc tố da niêm mạc, rụng lông, tóc, tế bào

trong dịch não tủy, rối loạn thính giác là những triệu chứng hiếm gặp nhưng
có giá trị cho việc chẩn đoán [17],[18],[19].
* Hội chứng Vogt - Koyanagi - Harada:
Hội chứng Vogt - Koyanagi - Harada là một rối loạn liên quan đến nhiều
hệ thống tổ chức bao gồm: mắt, tai, da và màng não. Thường gặp ở người 30
-50 tuổi, không gặp ở trẻ em, ít gặp ở người già. Bệnh căn còn chưa biết rõ.
Người ta gợi ý cơ chế là một phản ứng miễn dịch đối với protein liên kết với
melalin, những hắc tố bào, hoặc biểu mô sắc tố [17],[18],[19]. Nhóm nghiên
cứu viêm MBĐ của Mỹ cho rằng trọng tâm của giả thuyết ban đầu là vai trò
của hắc tố như một kháng nguyên dẫn đến đáp ứng miễn dịch, nó đã được
chứng minh trong thực nghiệm invitro [18].
Biểu hiện lâm sàng: hội chứng não - màng não:
- Thay đổi da và lông tóc (30%), bao gồm rụng lông tóc, bạc lông, bạch
biến da.
- Những triệu chứng của thần kinh: đau đầu, cổ cứng, nôn.
- Triệu chứng thính giác: ù tai, chóng mặt và điếc.
Tăng lympho bào ở dịch não tủy.
- Biểu hiện ở mắt:
+ Viêm mống mắt thể mi u hạt mạn tính: Chỉ xuất hiện ở phần trước,
diễn biến kéo dài và thường dẫn đến dính sau.
+ Những dấu hiệu phần sau: Cương tụ, phù đĩa thị, viêm hắc mạc phù,
xuất tiết, đục dịch kính, bong võng mạc do xuất tiết [17],[18],[19].


16

1.3. Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR)
Năm 1983, Kary Mullis đã phát hiện ra các nguyên tắc cơ bản giúp ông
có thể phát triển và triển khai thành công kỹ thuật PCR [30].
Phương pháp PCR là phương pháp dùng khuếch đại đoạn gen đích, ưu

điểm lớn nhất của phương pháp này là có xác định được hàm lượng DNA rất
thấp trong mẫu, khoảng 102 copies/ml.
Nguyên lý của PCR là phản ứng hóa học tổng hợp DNA dựa trên sợi
DNA khuôn mẫu ban đầu nhờ hoạt động của enzym DNA-polymerase. Phản
ứng dựa trên sự thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ, ban đầu DNA khuôn được biến
tính từ sợi đôi thành sợi đơn ở nhiệt độ cao (khoảng 92 oC), tiếp theo nhiệt độ
được giảm xuống khoảng 55o đến 65oC để tạo điều kiện cho mồi gắn vào
DNA khuôn, sau bước này nhiệt độ lại tăng lên khoảng 72 oC cho enzym hoạt
động tổng hợp kéo dài chuỗi DNA từ trình tự mồi, sau 3 bước nhiệt độ, quá
trình được quay lại từ bước một đến bước 3, cứ như vậy quá trình lặp lại liên
tiếp khoảng 30 đến 35 chu kỳ. Kết thúc phản ứng, lượng DNA tạo ra là Ax2 n
(A là số DNA khuôn ban đầu trong mẫu, n là chu kỳ nhiệt)
Thành phần chính tham gia phản ứng PCR là:
o

DNA khuôn: là DNA của vius, vi khuẩn hay của tế bào sinh vật khác

o

Mồi: là 2 trình tự nucleotide ngắn, đặc trưng cho gen cần nhân lên

o

Enzym: Là emzym có hoạt tính DNA polymerase

o

dNTPs: là các nucleotide dùng làm nguyên vật liệu tổng hợp DNA

o

Đệm: là môi trường cho phản ứng, đệm chứa nước và một số ion
cần thiết


17

Hình 1.1: Sơ đồ minh họa các bước phản ứng PCR
(1 )Biến tính; (2) Gắn mồi; (3) Kéo dài chuỗi; (4) Sản phẩm
Trong một số kít thương mại như hãng Amplicor dùng một đoạn 104bp
trên vùng bảo tồn của gen pre-core. Ngoài ra PCR giúp phát hiện đột biến trên
gen pre-core hay core promoter cũng như định lượng cccDNA (covalently
closed circular DNA) trong quá trình điều trị với thuốc kháng vius và
interferon trên bệnh nhân.
Trong kỹ thuật PCR, sau khi hoàn tất khuyếch đại đoạn DNA đích, người
làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước thí nghiệm để đọc kết quả xác
định có sản phẩm khuyếch đại mong muốn trong ống phản ứng hay không.
Giai đoạn này được gọi là giai đoạn thí nghiệm sau PCR. Trong giai đoạn này
người làm thí nghiệm có thể thực hiện điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
để xem có vạch sản phẩm khuyếch đại đúng kích thước mong muốn hay
không, cũng có thể thực hiện thí nghiệm lại với các đoạn dò đặc hiệu (trên


18

màng, trên giếng hay phiến nhựa…) để xem sản phẩm khuyếch đại có trình tự
mong muốn hay không. Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai đoạn thí nghiệm để
đọc và phân tích sau khi hoàn tất phản ứng khuyếch đại được gọi là PCR cổ
điển (classical PCR).
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuyếch đại DNA đích hiển

thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi
là real-time. Do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí nghiệm
không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả để
xác định có sản phẩm khuyếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của
phản ứng khuyếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng
khuyếch đại.
*Nguyên lý phản ứng Real-time PCR:
Phản ứng Real-time sử dụng TaqMan probe được thiết kế gồm: Một bộ
mồi đặc hiệu và một chuỗi oligonucleotide (probe) có trình tự bổ sung với
đoạn trình tự khuôn nằm giữa hai mồi.
Mẫu dò oligonucleotide được thiết kế với đầu 5’ gắn chất phát tín hiệu
huỳnh quang (reporter) và đầu 3’ gắn một chất kìm hãm sự phát tín hiệu
huỳnh quang phát ra từ reporter được gọi chung là quencher. Mẫu dò này ở
trạng thái nguyên vẹn (không bị phân hủy). Ở trạng thái bình thường (không
bị kích hoạt) thì toàn bộ năng lượng phát ra từ reporter được truyền sang
quencher khiến cho reporter không phát được tín hiệu huỳnh quang mà chỉ có
quencher phát được, nhưng máy chủ sẽ không nhận được tín hiệu vì hệ thống
kính lọc không phù hợp với bước sóng phát ra từ quencher.
Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bắt cặp bổ sung vào DNA khuôn
sau đó bị phân cắt bởi 5’exonuclease của TaqDNA polymerase trong quá trình
tổng hợp chuỗi. Chính nhờ sự phân cắt này, reporter được giải phóng khỏi
quencher để phát tín hiệu huỳnh quang, đồng thời loại bỏ mẫu dò khỏi khuôn


19

DNA cho phép kéo dài tiếp sản phẩm PCR. Reporter bị phân cắt khỏi khuôn
DNA sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR có nghĩa là tín hiệu huỳnh quang thu
được tỷ lệ với sự nhân lên của sản phẩm PCR.

Hình 1.2. Nguyên lý phản ứng định lượng Real-time PCR sử dụng TaqMan probe
* Kỹ thuật PCR bao gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và được điều hòa bởi
nhiệt độ:
- Giai đoạn 1: chuỗi xoắn kép DNA khuôn bị biến tính, tách khỏi nhau
thành hai chuỗi đơn nhờ nhiệt độ tăng lên (khoảng 94 - 95°C).
- Giai đoạn 2: Nhiệt độ được hạ xuống về nhiệt độ gắn mồi (40 - 72°C,
thường là 55°C) cho phép các đoạn oligonucleotid gắn với sợi DNA khuôn.
Trong quá trình gắn mồi, enzym DNA polymerase bền với nhiệt sẽ được hoạt
hóa và bắt đầu giai đoạn kéo dài mồi.
- Giai đoạn 3: Nhiệt độ lại được nâng lên đến nhiệt độ tối ưu của enzyme
(khoảng 72°C), xúc tác cho quá trình kéo dài phân tử DNA bắt đầu từ hai
đoạn mồi.


20

Hình 1.3. Hình minh họa kỹ thuật PCR (P1 và P2: các đoạn mồi)
Chu kỳ nhiệt gồm ba giai đoạn trên được nhắc lại 25 - 40 lần. Số lượng
chu kỳ tùy thuộc vào từng mục đích ứng dụng cụ thể.
Cuối cùng sản phẩm của phản ứng được làm lạnh về nhiệt độ phòng hoặc
4°C, tùy theo mục đích ứng dụng và loại thiết bị tạo chu kỳ nhiệt được sử dụng.
* Vai trò của cặp mồi:
- Cặp mồi và đầu dò (probe) được thiết kế dựa trên chương trình Beacon
designer, trình tự mồi và đầu dò được thiết kế trên vùng bảo tồn đặc trưng cho
DNA genome của virus CMV và HSV, HZV.
-Tất cả các trình tự mồi và đầu dò đều được khảo sát các đặc tính về
trình tự nucleotide A,T,G,C; cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm Beacon
designer. Kết quả các thông số phải nằm trong giới hạn cho phép để đảm bảo
sự hoạt động tốt nhất của mồi và đầu dò. Các trình tự này cũng được BLAST
với các trình gen trên NCBI để kiểm tra độ tương đồng của chúng với các

trình tự gen đích của CMV và HSV, HZV và các trình tự gen khác. Mồi được
lựa chọn khi kết quả cho thấy các trình tự có độ tương đồng 100% với DNA
genome của CMV,HSV, HZV và không có sự tương đồng với các trình tự khác
hoặc nếu có thì rất thấp.


21

- Các đoạn mồi (primers) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có
chiều dài khoảng 20- 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với
trình tự của hai đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản. Ở giai đoạn 2 các đoạn mồi
tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích. Giai đoạn 3 dưới
hoạt tính của men Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi
đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên
mạch bổ sung. Như vậy qua một chu kỳ nhiệt một DNA đích đã được nhân
bản thành hai bản sao. Nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 25 đến 40
lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 225 đến 240 bản sao, tức là
đến hàng tỷ bản sao.
* Quy trình ly trích DNA:
Ly trích DNA bằng bộ kit ly trích QIAamp DNA Mini (QIAGEN-USA)
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hình 1.4: Kit QIAamp DNA Mini ly trích DNA
1. Đặt mẫu vào ống Axygen, thêm 200 µl PBS 1X vào từng ống. Ủ khoảng

2-5 phút ở trong máy real-time PCR.
2. Thêm 10 µl protease K và 200 µl dung dịch đệm AL. Trộn đều bằng cách

voltex 15 giây. Spin down 10 giây.
3. Ủ 56oC 10 phút. Spin down 10 giây.

4. Thêm 200 µl Ethanol 100% lạnh vào rồi lắc nhẹ. Spin down 10 giây.
5. Cho tất cả hỗn hợp này vào ống (1) có chứa QIAGEN (ống QIAGEN:

610µl). Đậy nắp ống (1) lại. Quay ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút.


22

6. Lấy các chất có trong ống (1) cho vào 1 ống mới (ống 2), bỏ ống (1) đi.
7. Cho 500 µl dung dịch rửa AW1 vào ống (2). Ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút.
8. Lại lấy các chất trong ống (2) cho vào 1 ống mới (ống 3), bỏ ống (2)
9. Cho 500 µl dung dịch rửa AW2 vào ống (3). Ly tâm 14.000 vòng 3 phút
10. Lấy các chất trong ống (3) cho vào 1 ống Axygen mới (ống 4), bỏ ống (3)

11. Ly tâm 14.000 vòng 1 phút. Lấy ống (4) cho vào 1 ống mới (ống 5), bỏ ống
(4). Cho 100 µl dung dịch hòa tan AE vào ống (5). Ủ khoảng 1 phút ở nhiệt
độ phòng, quay ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút để ly trích được DNA.
11. DNA sau tách chiết được kiểm tra bằng đo OD và điện di trên gel Agarose.

Độ tinh khiết của dung dịch DNA được xác định bằng tỷ lệ giữa độ hấp
thụ quang của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm và 280 nm (A260/A280).
Độ tinh khiết tốt nhất trong khoảng 1,8 – 2,0. Nếu độ tinh khiết <1,6 chứng tỏ
mẫu còn lẫn protein, dựa vào mục đích sử dụng DNA tách chiết được để xem
xét có thể sử dụng được hay phải tinh sạch lại.
Độ tinh khiết được kiểm tra song song bằng điện di dung dịch DNA trên
gel agarose 1%.
1.3.1. CytoMegalovirus (CMV) [31]
CMV thuộc họ Herpes Viridae có acid Nucleic là DNA hai sợi thẳng,
capsid có đối xứng hình khối bao gồm 162 capsome, có vỏ ngoài, virus được
lấy từ màng nhân tế bào, có dạng hình cầu, đường kính từ 120 - 200nm, lắp

ráp trong nhân tế bào, nhạy cảm Ether, gây nhiễm nhiều loài động vật và
người. Trên cơ thể người CMV nhân lên trong tế bào của nhiều cơ quan như
tế bào tuyến nước bọt, tế bào gan, thận, phổi. Gần đây virus này được xác
định trong tế bào lymphocyte ở máu người bệnh khỏe mạnh có phản ứng
huyết thanh dương tính.
Đặc điểm cơ bản của bệnh do CMV gây ra là những thể vùi khổng lồ
trong nhân tế bào bị nhiễm. CMV có ba hình thái nhiễm trùng là gây hủy hoại
tế bào (bệnh cấp tính), tiềm tàng và nhiễm virus thể ẩn.


23

Đa số người bị nhiễm CMV không có triệu chứng lâm sàng. Các cá thể
có biểu hiện lâm sàng thường là các đối tượng có nguy cơ cao nhất như bị
nhiễm ở thời kỳ chu sinh, điều trị ức chế miễn dịch, truyền máu hoặc ghép cơ
quan. Nhiễm CMV ở người lớn là khá phổ biến, tỉ lệ nhiễm CMV tăng dần từ
thời thơ ấu đến tuổi thành niên. Sự lây nhiễm virus dễ dàng do tiếp xúc gần
gũi với các cá thể. Người ta biết đến viêm võng mạc do CMV là một trong
những nhiễm trùng cơ hội hay gặp nhất trên các bệnh nhân AIDS, điển hình
đặc trưng là có CD4+ lymphocyte < 50 tế bào/ µL. Dù số lượng ca bệnh giảm
khi sử dụng phác đồ HAART nhưng các ca mới vẫn được ghi nhận. Các bệnh
nhân viêm võng mạc do CMV bị giảm thị lực, có thể dẫn đến mù nếu không
được điều trị. Bệnh có thể biểu hiện ở một mắt hoặc hai mắt. Điều trị viêm
võng mạc do CMV cần phải kéo dài để ngăn ngừa tái phát. Viêm mống mắt
do CMV có thể biểu hiện từng đợt, thường sợ ánh sáng, giảm thị lực, đau
nhãn cầu. Một số bệnh nhân có phù hoàng điểm dẫn đến mất thị lực hoặc
bệnh lý màng bồ đào và võng mạc tăng sinh, xuất huyết võng mạc tự phát và
bong võng mạc.

Hình 1.5. Hình ảnh viêm võng mạc do CMV

1.3.2. Herpes Simplex virus (HSV) [13],[31]
HSV gây nhiễm cho tế bào người bởi đặc trưng gây tổn thương lớp niêm
mạc và xuất hiện các tiểu thể nội bào. Sự xuất hiện của virus ở nhân và chất
nguyên sinh đã được chứng minh bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.


24

HSV có hai type huyết thanh là HSV1 và HSV2. Chúng có kháng
nguyên rất giống nhau nhưng vẫn tách biệt được bằng kỹ thuật trung hòa hoặc
huỳnh quang. Hai type này cũng gây nhiễm những cơ quan khác nhau:
- HSV1: Thường gây nhiễm phần trên thắt lưng như mắt, mồm, môi, da…
- HSV2: Thường gây nhiễm phần dưới thắt lưng, đặc biệt là nhiễm virus
đường sinh dục và tiết niệu.
Nhiễm HSV lần đầu thường nặng, biểu hiện toàn thân và có thể tử vong.
Sơ nhiễm thường xảy ra với người chưa bị nhiễm hoặc chưa có kháng thể
trung hòa. HSV gây sơ nhiễm thường không thể loại trừ ra khỏi cơ thể mà nó
tồn tại tiềm ẩn. Tái nhiễm HSV có thể với Serotype khác. Với các cá thể đã có
kháng thể trung hòa chỉ bị nhiễm HSV khu trú mà không bị nhiễm toàn thân.
Tại mắt HSV có thể gây ra viêm kết mạc - giác mạc, viêm màng bồ
đào... Viêm màng bồ đào do HSV có ba hình thái: viêm mống mắt- thể mi giác mạc, viêm mống mắt - thể mi không có viêm giác mạc, viêm hắc võng
mạc [32].
+ Viêm mống mắt - thể mi - giác mạc do HSV:
Hay gặp viêm mống mắt - thể mi nhẹ, thoáng qua và tự ổn định. Có ít tủa
giác mạc, ít tế bào trong thủy dịch. Tổn thương giác mạc thường là loét giác
mạc hình cành cây hoặc viêm giác mạc hình đĩa, cảm giác giác mạc giảm.
Có thể thấy viêm mống mắt - thể mi - giác mạc nặng: cương tụ rìa
nhiều, tủa giác mạc to và nhiều ở toàn bộ giác mạc, thủy dịch đục nhiều, có
thể xuất huyết hoặc mủ tiền phòng, dính sau. Thường có tăng nhãn áp do
nghẽn hoặc viêm vùng bè. Hình thái này có thể do virus xâm nhập trực tiếp

ở màng bồ đào.


25

Hình 1.6: Hình ảnh viêm giác mạc do HSV
+ Viêm mống mắt - thể mi không có viêm giác mạc do HSV:
Tổn thương do virus xâm nhập trực tiếp ở màng bồ đào, có thể kèm theo
tổn thương Herpes ở mặt hoặc ở đường sinh dục. Mắt đau đỏ, tủa giác mạc
nhiều, tyndal dương tính, tiền phòng có thể có mủ hoặc máu, dính sau, có thể
teo mống mắt từng mảng và thường teo mống mắt ở gần cơ vòng đồng tử.
Hay có tăng nhãn áp do viêm vùng bè hoặc nghẽn bè. Có thể có biến chứng
đục thủy tinh thể.

Hình 1.7: Hình ảnh viêm mống mắt thể mi do HSV
+ Viêm hắc võng mạc do HSV:
Tổn thương do virus xâm nhập vào hắc mạc hoặc do một quá trình miễn
dịch trong đợt nhiễm HSV toàn thân có thể có viêm não do HSV. Những ổ
viêm hắc võng mạc hoại tử ở cả hai mắt, xuất tiết màu vàng trắng, ranh giới