SỬ DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ ĐỂ XÁC ĐỊNH NẤM docx

1
SỬ DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ ĐỂ XÁC ĐỊNH NẤM

Trần Thanh Trăng
Phòng Nghiên cứu Bảo vệ Thực vật rừng
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
TÓM TẮT
ADN cung cấp rất nhiều các đặc điểm để xác định các loài nấm mà nhiều loài nấm không có
đầy đủ các đặc điểm về hình thái học hoặc chỉ có các đặc điểm có thể phân biệt được ở một
giai đoạn nhất định nào đó trong chu kỳ sống của chúng. Các phương pháp sử dụng kỹ thuật
ADN rất khác nhau, hiện nay các kỹ thuật dựa vào sự biến động của phương pháp PCR rất
phổ biến bởi tính nhạy của nó, khả năng xác định nhanh và chỉ cần sử dụng một lượng vật
liệu đầu vào rất ít. Một số phương pháp phổ biến đã được áp dụng một cách rộng rãi trong
các lĩnh vực khác nhau như xác định chất lượng thực phẩm, sinh thái rừng, con người, động
vật và bệnh thực vật được mô tả. Phương pháp xác định cụ thể áp dụng cho các trường hợp
phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm số lượng mẫu và số lượng loài cần xác định. Tất cả các
kỹ thuật sử dụng ADN đều phụ thuộc vào nguồn mẫu tiêu bản với những mô tả chi tiết về
mặt hình thái nhằm khảng định sự chính xác và tin cậy của kỹ thuật ADN.
Từ khoá: Kỹ thuật ADN, PCR, xác định trình tự chuỗi ADN
GIỚI THIỆU
Kỹ thuật phân tử (kỹ thuật ADN) là một công cụ rất quan trọng trong việc xác định nấm. Các
kỹ thật này rất hữu ích, được sử dụng như là một công cụ để xác định nấm đặc biệt khi nó
không sản sinh ra thể quả, hay bào tử, đó là các đặc điểm cơ bản để phân loại, mô tả loài bằng
phương pháp hình thái học. Trong khi một số loài nấm có thể dễ dàng phân lập và có thể sản
sinh ra các đặc điểm phân loại có thể sử dụng kính hiển vi để phân loại, một số loài khác lại
rất khó để phân lập hoặc thậm chí khi đã phân lập được rồi nhưng không sản sinh ra các đặc
điểm để phân loại. Nhu cầu xác định nấm bệnh nhanh như trong quá trình kiểm dịch tại các
cửa cảng, áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, cũng có thể sử dụng kỹ thuật ADN.
Việc xác định các loài nấm có liên quan đến thực vật sử dụng kỹ thuật ADN cũng có rất
nhiều ứng dụng, như là xác định các loài nấm rễ có ích, kiểm soát sự hiện diện của nấm cộng

sinh hoặc quản lý nuôi cấy sinh học và phát hiện, xác định sớm được các loài nấm gây bệnh
trên các cây chủ, từ đó có chiến lược quản lý bệnh hại.
Khái niệm cơ bản về ADN
ADN (Deoxyribo Nucleic Acid) là một phân tử dài, cấu tạo bởi một số lượng lớn các
Nucleotite, được gọi là các bazơ hoặc cặp bazơ (base paire - bp). Mỗi Nucleotite bao gồm
một phân tử đường 5 Các-bon, Deoxyribose với một nhóm Phốt-phát gắn ở vị trí Các-bon 5
và một trong bốn bazơ gắn ở vị trí Các-bon 1 (hình 1). Bốn bazơ là Adenine, Guanine,
Cytosine và Thymine, thường được viết tắt là A, G, C và T. Khi một chuỗi ADN được tổng
hợp, nhóm Phốt-phát của một Nucleotite được gắn vào vị trí số 3 của nhóm Hydroxyl của
Nucleotite sau trong chuỗi phản ứng.

2


Hình 1. Deoxyadenosine triphosphate (dATP) một trong 4 Deoxynucleotides (dNTPs) cần
thiết để tổng hợp ADN (Watson và cs, 1998).
ADN tồn tại trong tế bào dưới dạng sợi đôi, được gắn kết với nhau bởi các lực điện từ giữa
các bazơ của sợi 1 và sợi 2. Guanine được gắn với Cytosine, Adenine được gắn với Thymine
và các cặp này được gọi là “cặp bù”, sợi đôi này rất bền vững ở các điều kiện sinh lý của tế
bào.
Enzyme ADN là một loại enzyme, có chức năng tổng hợp ADN bằng việc copy chính xác
một sợi ADN có sẵn. Tuy nhiên, chúng không tạo ra một chuỗi sợi mới giống hệt chuỗi ban
đầu mà là một chuỗi sợi đối xứng ngược. Hai chuỗi sợi ADN được tách ra và một chuỗi đối
xứng ngược được tạo ra bởi mỗi sợi bởi vậy sợi 1 là bản mẫu cho sợi mới thứ 2 và ngược lại.
Chúng là thứ tự hoặc chuỗi của các bazơ A, C, G và T và đây chính là cơ sở cung cấp thông
tin di truyền và được truyền từ tế bào này sang tế bào khác, từ thế hệ này sang thế hệ khác và
việc xác định thứ tự các Nucleotite của chuỗi này được gọi là xác định trình tự ADN.
Phương pháp
Có rất nhiều phương pháp sử dụng kỹ thuật ADN để xác định nấm và sự lựa chọn phương
pháp phù hợp nhất sẽ phụ thuộc vào số lượng mẫu và số lượng loài cần xác định. Tuy nhiên,

tất cả các phương pháp được sử dụng đều dựa trên cơ sở khớp thông tin giữa một loài nấm
chưa biết với một loài nấm đã được xác định bằng các đặc điểm hình thái học từ các tiêu bản
mẫu. Do vậy việc xác định các loài nấm phụ thuộc vào các loài nấm đã được xác định từ
trước bởi các nhà phân loại học với các kỹ năng phù hợp, cơ bản. Các cơ sở dữ liệu về trình
tự chuỗi ADN công cộng có thể được sử dụng như là một nguồn thông tin quan trọng.
Các phương pháp sử dụng kỹ thuật ADN để xác định nấm bệnh bao gồm: (1) Southern blot,
(2) các kỹ thuật dựa trên PCR (PCR-based) như: PCR-RFLP (PCR Restriction Fragment
Length Polymorphism - Đa hình các đoạn cắt giới hạn), T-RFLP (Terminal restriction
fragment length polymorphism), và xác định trình tự chuỗi ADN (ADN sequencing). Bước
đầu tiên cho tất cả các phương pháp trên là việc tách ADN và tinh sạch chúng, hiện nay có rất
nhiều phương pháp và bộ kít được sử dụng để làm việc trên.
Phương pháp Southern blot bao gồm việc gắn các ADN cần xác định vào một màng mỏng,
sau đó tách các ADN đó ra và cho chúng gắn với một đoạn dò ADN (ADN-probe) đã được
xác định (Goodwin và cs, 1989). Đoạn dò này là một đoạn ADN ngắn (khoảng 20 bp) và nó
được thiết kế duy nhất cho một loài nấm. Bởi vì phương pháp này đòi hỏi phải có một số
Bazơ: adenosine
Đường, deoxyribose
Nhóm phốt-phát



3
lượng rất lớn các đoạn dò do vậy phương pháp này không được sử dụng một cách rộng rãi và
được thay thế bằng phương pháp PCR.
Phương pháp PCR được phát triển từ những năm 1980 với việc sử dụng một loại enzyme từ
một loài vi khuẩn chịu nhiệt (Thermus aquaticus) để tổng hợp ADN (Saiki và cs, 1988).
Phương pháp PCR dùng để nhân một đoạn rất nhỏ ADN, có thể là 1 kbp hoặc nhỏ hơn, của
bộ gen. Trong phản ứng PCR còn có thêm hai đoạn mồi (primer) là các đoạn oligonucleotite
ngắn có chiều dài khoảng 20 bp, các đoạn này được gắn vào các đoạn ADN mẫu trong quá
trình tổng hợp ADN. Ngoài ra còn có các chất hóa học khác cần thiết cho phản ứng PCR như

các dNTPs, muối MgCl
2
, BSA (Bovine Serum Albumin) và chất đệm (PCR buffer).
Quá trình nhân bản ADN bao gồm 3 bước cơ bản: Đầu tiên là tăng nhiệt trong phản ứng
(khoảng 95
o
C) để tách đôi hai sợi ADN mẫu; sau đó giảm nhiệt độ trong phản ứng (khoảng
55
o
C), lúc này các đoạn mồi sẽ gắn vào các đầu của mỗi sợi ADN mẫu; cuối cùng, nhiệt độ
phản ứng tiếp tục được tăng lên (khoảng 72
o
C) để các enzyme xúc tác cùng với các primer và
các chất hoá học khác trong phản ứng tổng hợp kéo dài sợi ADN. Ba bước tăng và giảm nhiệt
này được lặp lại 30 - 40 chu kỳ. Trong 30 chu kỳ, giả sử đạt hiệu suất là 100% thì sẽ có 230
(hay 109) bản copy của chuỗi ADN được tổng hợp, với số lượng ADN đó đủ để quan sát trên
bản gel khi được nhuộm màu (bằng chất Ethidium bromide).
Sử dụng phương pháp PCR để xác định nấm, đòi hỏi phải sử dụng cặp mồi được thiết kế đặc
hiệu cho từng loài nấm, với cặp mồi này, trong quá trình phản ứng chỉ khuyếch đại ADN từ
loài nấm cần xác định. Các cặp mồi đặc hiệu có thể được thiết kế cho các gen đặc hiệu như
calmodulin (Mulè và cs, 2004) hay cho sản phẩm của các chuỗi trình tự chưa biết như RAPD
(random amplified polymorphic ADN) hay AFLP (amplified fragment length polymorphism)
(Schmidt và cs, 2004; Vos và cs, 1995). Các primer cũng có thể được thiết kế cho vùng có
một đoạn copy như calmodulin (Mulè và cs, 2004) hay cho vùng có nhiều đoạn copy như
rADN ITS (ribosomal ADN internal transcribed spacers) với mục đích tăng tính nhạy
(Flowers và cs, 2003). Trong mỗi phản ứng cần phải sử dụng mẫu đối chứng (cả dương tính
và âm tính) để tăng độ tin cậy (Hoorfar và cs, 2004). Sử dụng phương pháp mồi đặc hiệu
PCR có thể thích ứng với nhiều loại thiết bị, cho phép chạy nhiều mẫu một lúc. Việc ứng
dụng phương pháp này bao gồm việc phát hiện và xác định được sớm các loài nấm bệnh, sẽ
kiểm soát được sự lan rộng sinh học của bệnh và kiểm soát được sự di chuyển của các mầm

bệnh từ vùng này sang vùng khác.
Phương pháp PCR-RFLP được bắt đầu với sản phẩm PCR, sử dụng các mồi đặc hiệu có phổ
kết hợp rộng như ITS1-F và ITS-4, các cặp mồi này sẽ khuyếch đại ADN của hầu hết các loài
nấm, trong khi đó không khuyếch đại ADN của thực vật, động vật hoặc vi khuẩn. Sản phẩm
PCR được cắt bằng các enzyme giới hạn, các enzyme này cắt các đoạn ADN ở các điểm nhận
biết đặc hiệu tuỳ thuộc vào từng loại enzyme. Ví dụ, vùng nhận biết của enzyme Hea III là
GGCC. Cắt một sản phẩm PCR có kích thước 1 kbp bằng enzyme giới hạn có vùng nhận biết
là 4 bp sẽ thành 2-8 đoạn với các kích cỡ nhỏ hơn và sẽ tạo ra phân đoạn đặc hiệu khi chúng
được điện di trên bản gel agarose hay poly-acrylamide (hình 2). Phương pháp này được sử
dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về nấm rễ (ectomycorrhiza) bởi vì nó phù hợp với các
mẫu chứa chỉ 1 loại nấm. Cắt với 2 hoặc 3 enzyme giới hạn khác nhau có thể phân biệt được
hầu hết các loài nấm. Trong khi rất nhiều loài nấm có thể phân biệt được bằng phương pháp
này, một số chi như Tomentella và Cortinarius có rất nhiều loài với các phân đoạn đặc hiệu
rất giống nhau, do đó rất khó hoặc không thể phân biệt được. PCR-RFLP cũng được sử dụng
để xác định nấm bệnh (Rolshausen và cs, 2004) tuy nhiên sự hiện diện của nhiều loài nấm
trong cùng một mẫu sẽ làm cho sự phân biệt nấm bằng phương pháp này không được chính
xác.

4
T-RFLP là phương pháp được biến đổi từ phương pháp PCR-RFLP, sử dụng một mồi huỳnh
quang (fluorescent) và một bản gel chuỗi để đạt được độ nhạy tốt hơn và kích cỡ các phân
đoạn chính xác. Phương pháp này chủ yếu được sử dụng trong nghiên cứu ectomycorrhiza
(Dickie và cs, 2002). Cả hai phương pháp PCR-RFLP và T-RFLP đều yêu cầu sự thiết lập cơ
sở dữ liệu tham khảo về kích cỡ các phân đoạn đặc hiệu từ các loài nấm đã được xác định với
các mẫu tiêu bản. Càng có nhiều các dữ liệu tham khảo, khả năng khớp giữa các mẫu càng
lớn và giảm được các lỗi về xác định tên nấm không đúng. Các phân đoạn đặc hiệu của loài
nấm cần xác định phải khớp chính xác 100% với loài nấm đã biết, nếu chỉ khớp một phần thì
cả 2 phương pháp PCR-RFLP và T-RFLP đều không cung cấp thông tin hữu ích trong xác
định loài.

Hình 2. Sản phẩm PCR – RFLP trên bản gel agarose. Làn 1: thang ADN, 200bp. Các làn
2 đến 14: sản phẩm PCR-RFLP được cắt bởi enzyme Taq I.
Phương pháp xác định trình tự chuỗi ADN (ADN sequencing) thường được bắt đầu với một
sản phẩm PCR, sản phẩm này cung cấp đầy đủ ADN mẫu cho phản ứng xác định trình tự
chuỗi, mặc dù phương pháp này có thể sử dụng các phân đoạn ADN được tách dòng từ
Plasmid hoặc Bacteriophage. Phản ứng xác định trình tự chuỗi ADN rất giống với phản ứng
PCR, mặc dù chỉ có một mồi được sử dụng trong mỗi phản ứng, bên cạnh đó trong mỗi phản
ứng còn dùng đến các Deoxynucleotite và di- Deoxynucleotite (ddNTPs). Những ddNTPs
này được đánh dấu với một trong bốn chất nhuộm màu huỳnh quang, đại diện mỗi màu sẽ
tương ứng với một trong bốn bazơ A, G, C và T. Sự phát triển của chuỗi này sẽ bị dừng lại
khi một ddNTP không kết hợp với phân tử tổng hợp mới, bởi vì ddNTP không có phân tử
ôxy, phân tử cần thiết cho sự gắn kết mới. Bởi vậy sản phẩm cuối cùng sẽ là một chuỗi các
phân đoạn ADN có kích cỡ từ 20 bp đến n bp, trong đó n là độ dài của sản phẩm PCR được
sử dụng như bản mẫu, mỗi phân đoạn chỉ được đánh dấu huỳnh quang một lần. Sản phẩm của
phản ứng được điện di trên một bản gel acrylamide dài, có độ phân giải cao hoặc các mao dẫn
để tách các phân đoạn ADN với với các độ dài khác nhau, chênh nhau chỉ một phân tử bazơ.
Khi các phân đoạn ADN di chuyển, chạy qua một máy quét, các phân đoạn sẽ di chuyển từ
các phân đoạn ngắn hơn cho đến dài hơn, các đuôi nhuộm huỳnh quang sẽ được nhận biết và
được chuyển đổi thành các bazơ A, C, G và T thông qua phần mềm chuyên biệt, và được thể
hiện trên màn hình máy tính như hình 3.

5

Hình 3. Sản phẩm của phản ứng xác định trình tự chuỗi với chất nhuộm màu huỳnh
quang được điện di trên bản gel có độ hòa tan cao và được chuyển hóa thành các bazơ
trên computer
Đối với việc xác định nấm, chuỗi trình tự ADN của một loài nấm chưa biết sẽ được tìm kiếm
và so sánh sự giống nhau với các chuỗi trình tự ADN của loài nấm đã biết tên trên các cơ sở

dữ liệu công cộng sẵn có như Genbank. Nếu các chuỗi trình tự không giống nhau đến 100%,
đủ để khẳng định tên loài, có thể sử dụng phương pháp phân tích tiến hóa loài - phylogenetic
analysis (Bruns và cs, 1998; Glen và cs, 2002). Bằng phương pháp này có thể xác định loài
hoặc chi của nấm trên cơ sở dữ liệu tham khảo. Phương pháp xác định này có thể được áp
dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt phù hợp cho xác định một số lượng lớn các
mẫu. Tuy nhiên không phải tất cả các loài nấm cần xác định đều có trên cơ sở dữ liệu tham
khảo công cộng. Đôi khi có nhiều loài nấm cùng xuất hiện trong một mẫu, đặc biệt là các
mẫu gỗ, rễ cây đã bị mục hoàn toàn, thì có thể sử dụng phương pháp tách dòng từ sản phẩm
PCR trước khi chạy phản ứng xác định trình tự chuỗi (Trăng, 2007b).
Ứng dụng trong xác định bệnh rỗng ruột, thối rễ Keo tai tượng Acacia mangium và
bệnh mục gỗ Bạch đàn Eucalyptus obliqua
Có rất nhiều loài nấm gây bệnh liên quan đến bệnh rỗng ruột và thối rễ Keo tai tượng Acacia
mangium cũng như bệnh mục gỗ Bạch đàn Eucalyptus obliqua. Hiện nay, phương pháp phù
hợp nhất để phát hiện và xác định các loài nấm gây bệnh này là phương pháp PCR và phương
pháp xác định trình tự chuỗi ADN (Glen và cs, 2002; Trăng, 2007a), bên cạnh đó, trong các
mẫu đã bị mục hoàn toàn, hoặc ở giai đoạn trung bình, cần thiết phải tách dòng (cloning) nấm
từ sản phẩm PCR trước khi chạy phản ứng xác định trình tự chuỗi để đạt được kết quả tốt
nhất (Trăng, 2007b) bởi vì các loại mồi đặc hiệu cho từng loài nấm bệnh mới chỉ được phát
triển với số lượng rất hạn chế trong số rất nhiều loài nấm bệnh gây bệnh rỗng ruột và bệnh
thối rễ (Lim và cs, 2005; Suhara và cs, 2005). Trong khi đó đã có rất nhiều chuỗi trình tự
ADN của các loài nấm gây bệnh phổ biến cho cả Keo tai tượng và Bạch đàn E. obliqua như
Ganoderma spp., Phellinus spp., Postia spp., Fomitopsis spp. trên các cơ sở dữ liệu công
cộng (như Genbank). Tuy nhiên cũng có rất nhiều loài nấm gây bệnh hiện chưa có chuỗi trình
tự ADN trên cơ sở dữ liệu công cộng, do vậy xu hướng ưu tiên hiện nay là phải thiết lập các
cơ sở dữ liệu cơ sở hay dữ liệu cá nhân (private database) với đầy đủ các thông tin mô tả về
loài với các đặc điểm hình thái học. Sự phân loại của các loài nấm lớn có liên quan đến các

6
loại bệnh rỗng ruột, thối rễ, thối gốc là điều cần thiết và các chuỗi trình tự ADN có thể được
sử dụng như một công cụ hữu ích trong giải quyết vấn đề này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bruns, T. D., Szaro, T. M., Gardes, M., Cullings, K. W., Pan, J. J., Taylor, D. L., Horton, T.
R., Kretzer, A., Garbelotto, M. and Li, Y, 1998. A sequence database for the identification of
ectomycorrhizal basidiomycetes by phylogenetic analysis. Molecular Ecology, 7: 257-272.
Dickie I. A., Xu B. and Koide R. T, 2002. Vertical niche differentiation of ectomycorrhizal
hyphae in soil as shown by T-RFLP analysis. New Phytologist, 156: 527-535.
Flowers, J., Hartman, J. and Vaillancourt, L, 2003. Detection of latent Sphaeropsis sapinea
infections in Austrian pine tissues using nested-polymerase chain reaction. Phytopathology,
93 (12): 1471-1477.
Glen, M., Tommerup, I. C., Bougher, N. L. and O’Brien, P. A, 2002. Are Sebacinaceae
common and widespread ectomycorrhizal associates of Eucalyptus species in Australian
forests? Mycorrhiza 12: 243-247.
Goodwin, P. H., Kirkpatrick, B. C. and Duniway, J. M, 1989. Cloned DNA probes for
identification of Phytophthora parasitica. Phytopathology, 79: 716-721.
Hoorfar J, Cook N, Malorny B, Wagner M, De Medici D, Abdulmawjood A, Fach P, 2004.
Diagnostic PCR: Making internal amplification control mandatory. Letters In: Applied
Microbiology, 38: 79-80.
Lim, Y. W., Yeung, Y. C. A., Sturrock, R., Leal, I. & Breuil, C, 2005. Differentiating the two
closely related species, Phellinus weirii and P. sulphurascens. Forest Pathology, 35: 305-314.
Mulè, G., Susca, A., Stea, G., and Moretti, A, 2004. Specific detection of the toxigenic
species Fusarium proliferatum and F. oxysporum from asparagus plants using primers based
on calmodulin gene sequences. FEMS Microbiology Letters, 230: 235-240.
Rolshausen, P. E., Trouillas, F. and Gubler, W. D, 2004. Identification of Eutypa lata by
PCR-RFLP. Plant Disease, 88: 925-929.
Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B.
and Erlich, H. A, 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable
DNA polymerase. Science, 239: 487-491.
Schmidt, H., Taniwaki, M. H., Vogel, R. F. & Niessen, L, 2004. Utilization of AFLP markers
for PCR-based identification of Aspergillus carbonarius and indication of its presence in
green coffee samples. Journal of Applied Microbiology, 97: 899-909.

Trần Thanh Trăng, 2007a. Resistance screening to fungal diseases for plantation Eucalypts in
Vietnam; Molecular tools to assist fungal detection and identification. MSc thesis, University
of Tasmania, Australia.
Trần Thanh Trăng, 2007b. Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện và xác định
nấm gây bệnh mục gỗ Bạch đàn Eucalyptus obliqua L. Her. Tạp chí Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn, 19: 59-64.
Suhara, H., Maekawa, N., Kubayashi, T. & Kondo, R, 2005. Specific detection of a
basidiomycete, Phlebia brevispora associated with butt rot of Chamaecyparis obtusa, by
PCR-based analysis. Journal of Wood Science, 51: 83-88.

7
Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Lee, T. van de, Hornes, M., Frijters, A., Pot, J.,
Peleman, J., Kuiper, M. and Zabeau, M, 1995. AFLP: a new technique for DNA
fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23: 4407-4414.
Watson. J. D, Gilman M. and Witkowski M, 1998. Recombinant DNA. W. H. Freeman and
Company, New York, USA.

THE USE OF MOLECULAR TECHNIQUES TO IDENTIFY
FUNGI
Tran Thanh Trang
Forest Plant Protection Research Division
Forest Science Institute of Vietnam

SUMMARY
DNA provides some characters of fungal identification where a lot of fungal species have
inadequate morphological characters or only possess distinguishing characters in a particular
stage of their life cycle. Methods of using DNA technique are varied, and the variations of
PCR based techniques are popular today because of their sensitivity, speed and using of only
very small throughput. Some popular methods are described that have been applied widely in
many areas including food, forest ecology, human, animal and plant pathology. The specific

method used for particular application will depend on some factors, including number of
samples and candidate species. All of the DNA based techniques depend on herbarium
resources with detail morphological descriptions to verify the DNA technique.
Keywords: DNA technique, DNA sequencing, PCR