NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT REALTIME PCR đa mồi TRONG PHÁT HIỆN ROTAVIRUS và NOROVIRUS gây TIÊU CHẢY cấp ở TRẺ EM

B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

V TH HO

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR
đa mồi trong phát hiện Rotavirus và
Norovirus
gây tiêu chảy cấp ở trẻ em

LUN VN THC S Y HC

H NI 2018


B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

V TH HO

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR
đa mồi trong phát hiện Rotavirus và
Norovirus
gây tiêu chảy cấp ở trẻ em
Chuyờn ngnh: Vi sinh

Mó s

: 60720115

LUN VN THC S Y HC

Ngi hng dn khoa hc:
1. PGS.TS. Lờ Vn Phng
2. TS. Phựng Th Bớch Thy


HÀ NỘI - 2018
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

(+) ssRNA : A positive-sense single-stranded RNA
AIDS

: Acquired Immune Deficiency Syndrome

DNA

: Deoxyribonucleic acid

ELISA

: Enzyme-linked immunosorbent assay

LAT

: Latex agglutination test

ORF

: Open reading frame

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RNA

: Ribonucleic acid

RT-PCR

: Reverse transcription Polymerase Chain Reaction

TCC

: Tiêu chảy cấp

TCC

: Viêm dạ dày ruột cấp


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................3
1.1. Tình hình tiêu chảy cấp do Rotavirus, Norovirus...................................3

1.1.1. Tình hình trên thế giới.......................................................................3
1.1.2. Tình hình tại Việt Nam......................................................................5
1.2. Đặc điểm tính chất hệ gen của Rotavirus, Norovirus.............................6
1.2.1. Đặc điểm của Rotavirus....................................................................6
1.2.2. Đặc điểm của Norovirus...................................................................8
1.3. Các kỹ thuật phát hiện Rotavirus, Norovirus.......................................10
1.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy............................................................................10
1.3.2. Phát hiện Rotavirus, Norovirus bằng kính hiển vi điện tử................10
1.3.3. Các kỹ thuật miễn dịch dùng để phát hiện Rotavirus, Norovirus.....12
1.3.4. Kỹ thuật sinh học phân tử...............................................................15
1.4. Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu........................................................19
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........21
2.1. Địa điểm nghiên cứu............................................................................21
2.2. Thời gian nghiên cứu............................................................................21
2.3. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................21
2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu....................................22
2.4.1. Dụng cụ, trang thiết bị.....................................................................22
2.4.2. Hóa chất.........................................................................................22
2.5. Phương pháp nghiên cứu......................................................................24
2.5.1. Thiết kế nghiên cứu:.......................................................................24
2.5.2. Phương pháp realtime PCR đa mồi phát hiện Norovirus và Rotavirus
.......................................................................................................25
2.5.3. Phản ứng Realtime RT- PCR xác định Norovirus và Rotavirus.......28
2.5.4. So sánh độ nhạy độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR đa mồi với


kit thương mại có chứng chỉ IVD...................................................30
2.6. Xử lý số liệu.........................................................................................30
2.7. Đạo đức trong nghiên cứu....................................................................30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.....................................................31

3.1. Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus và
Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em....................................................31
3.1.1. Kết quả xử lí bệnh phẩm và tách chiết RNA....................................31
3.1.2. Kết quả phản ứng Realtime PCR.....................................................32
3.1.3. So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime PCR đa mồi với
kit thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng chỉ IVD............33
3.2. Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus và
Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em....................................................35
3.2.1. Tỷ lệ phát hiện TCC do Rotavirus, Norovirus.................................35
3.2.2. Phân bố tỷ lệ TCC do Rotavirus, Norovirus theo giới......................36
3.2.3. Phân bố tỷ lệ phát hiện TCC do Rotavirus, Norovirus theo nhóm tuổi
.......................................................................................................38
3.2.4. So sánh các chỉ số xét nghiệm trong máu, trong phân......................41
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN.............................................................................46
4.1. Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus và
Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em....................................................46
4.1.1. Kết quả xử lí bệnh phẩm và tách chiết RNA....................................46
4.1.2. Phản ứng RealTime PCR đa mồi.....................................................48
4.2. Một số đặc điểm dịch tễ của Rotavirus, Norovirus.............................51
4.2.1. Tỷ lệ mắc tiêu chảy cấp do Rotavirus, Norovirus...........................51
4.2.2. Yếu tố giới của bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus................53
4.2.3. Yếu tố tuổi của bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus................53
4.2.4. Biến đổi các xét nghiệm..................................................................55
KẾT LUẬN.....................................................................................................59
KIẾN NGHỊ....................................................................................................61


TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.

Tỷ lệ tử vong của tiêu chảy cấp do Rotavirus ............................4

Hình 1.2.

Hình ảnh minh họa cấu trúc của Rotavirus........................... . 6

Hình 1.3.

Hình ảnh minh họa cấu trúc của Norovirus ............................. 8

Hình 1.4.

Hình ảnh Rotavirus dưới kính hiển vi điện tử ........................ 11

Hình 1.5.

Hình ảnh Norovirus dưới kính hiển vi điện tử. .......................12

Hình 1.6.

Nguyên lí của phương pháp ELISA........................................ 13

Hình 1.7.

Nguyên lí của kĩ thuật sắc kí miễn dịch .................................. 14

Hình 1.8.

Biểu đồ quan hệ giữa chu kỳ và tín hiệu huỳnh quang trong
phản ứng realtime PCR. ...........................................................16

Hình 1.9.

Cơ chế hoạt động của Taq Man Probe trong Realtime PCR 18

Hình 2.1.

Nguyên lí hoạt động của hệ thống tách chiết MagNA Pure LC 2.0
.....................................................................................................27


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các đoạn gen của Rotavirus..............................................................7
Bảng 1.2. Cấu trúc và protein của Rotavirus.....................................................7
Bảng 2.1. Trình tự Primer, Probe của gen Rotavirus, Norovirus....................24
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng......................................................................29
Bảng 3.1. Nồng độ RNA sau khi tiền xử lý mẫu và tách chiết nucleic acid.. .31
Bảng 3.2. Phân bố giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng phát hiện) của kỹ thuật realtime
PCR đơn mồi và kỹ thuật cải tiến phát hiện cả Norovirus và
Rotavirus.......................................................................................32
Bảng 3.3. Kêt quả giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng phát hiện) so sánh giữa kỹ thuật
realtime RT-PCR đa mồi và kit thương mại FTD viral
gastroenteritis có chứng chỉ IVD..................................................33
Bảng 3.4. Bảng phân bố các căn nguyên Norovirus và Rotavirus gây tiêu
chảy cấp ở trẻ em..........................................................................35
Bảng 3.5. Bảng phân bố tỷ lệ giới ở nhóm TCC do Rotavirus, TCC do
Norovirus, nhóm đồng nhiễm và nhóm âm tính............................36

Bảng 3.6. Tỷ lệ các nhóm tuổi trong nhóm bệnh nhân TCC do Rotavirus, TCC
do Norovirus, đồng nhiễm và âm tính...........................................38
Bảng 3.7. So sánh các chỉ số xét nghiệm máu của nhóm TCC do Rotavirus và
nhóm âm tính................................................................................41
Bảng 3.8. So sánh các chỉ số xét nghiệm của nhóm TCC do Norovirus và
nhóm âm tính................................................................................42
Bảng 3.9. Kết quả soi phân của nhóm TCC do Rotavirus, nhóm TCC do
Norovirus và nhóm âm tính..........................................................45


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ các căn nguyên Rotavirus, Norovirus gây TCC ở trẻ em 36
Biểu đồ3.2. Tỷ lệ bệnh nhân mắc TCC do Rotavirus theo giới tính............37
Biểu đồ 3.3. Phân bố tỷ lệ bệnh nhân TCC do Norovirus theo giới tính......38
Biểu đồ 3.4. Phân bố tỉ lệ TCC do Rotavirus theo nhóm tuổi.......................39
Biều đồ 3.5. Phân bố tỉ lệ tiêu chảy cấp do Norovirus theo nhóm tuổi.........40
Biểu đồ 3.6.So sánh sự thay đổi nồng độ Natri máu của nhómTCC do
Rotavirus, nhóm TCC do Norovirus và nhóm âm tính.............43
Biểu đồ 3.7. So sánh sự thay đổi nồng độ Kali máu của nhóm TCC Rotavirus,
nhóm TCC do Norovirus và nhóm âm tính...............................44


LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng của người học trò, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn
sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Phủng và TS Phùng Thị Bích Thủy đã hướng dẫn
tận tình, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình học
tập, và nghiên cứu để thực hiện đề tài này. Sự hướng dẫn tận tình và những
kiến thức quý báu của các thầy đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá
trình học tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn này.

Em xin gửi cám ơn toàn thể các anh chị nhân viên, kỹ thuật viên tại khoa
nghiên cứu sinh học phân tử bệnh truyền nhiễm Bệnh viện Nhi Trung ương đã
giúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện về mọi mặt trong quá trình thu thập, xử lí bệnh
phẩm, cho em những lời khuyên bổ ích trong quá trình thực hiện luận văn.
Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, các chị kỹ thuật viên, các bác sỹ nội trú
vi sinh khóa 39,40,41 đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, và động viên em trong
quá trình học tập và thực hiện luận văn này.
Em xin cám ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, các phòng
ban chức năng của Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện thuận
lợi cho em hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người than trong gia
đình và bạn bè đã luôn ủng hộ em trong suốt quá trình làm đề tài này.
Hà Nội, tháng 9 năm 2018
Vũ Thị Hảo


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Vũ Thị Hảo, bác sĩ nội trú khóa 41, trường đại học Y Hà Nội, chuyên
ngành Vi sinh. Tôi xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của PGS.TS Lê Văn Phủng và TS Phùng Thị Bích Thủy.
2. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung
thực và khách quan, đã được sự chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin cam đoan những điều trình bày ở trên là hoàn toàn trung thực và chính
xác.

Vũ Thị Hảo


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tiêu chảy là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 2 ở trẻ em dưới 5
tuổi trên toàn thế giới sau bệnh lí đường hô hấp. Trên thế giới, mỗi năm ước
tính có khoảng 2,5 tỉ trường hợp trẻ tiêu chảy; 1,5 triệu trẻ tử vong vì tiêu
chảy cấp (TCC), con số này nhiều hơn số trẻ tử vong do AIDS, sốt rét và sởi .
Bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ em do nhiều căn nguyên như virus, vi khuẩn, kí sinh
trùng, trong đó, Rotavirus, Norovirus là căn nguyên gây tử vong hàng đầu ở
trẻ dưới 5 tuổi trên toàn thế giới . Người ta ước tính khoảng 47% các trường
hợp TCC nhập viện được chẩn đoán là do Rotavirus . Tại Việt Nam, tỷ lệ
TCC do Rotavirus dao động từ 31%-60% ở trẻ dưới 5 tuổi nhập viện do
TCC ,,,. Trên thế giới, mỗi năm có trung bình khoảng 12% các trường hợp
TCC nhập viện ở trẻ em do căn nguyên Norovirus . Tại Việt Nam, tỷ lệ TCC
do Norovirus dao động từ 6,6%-33% ở trẻ dưới 5 tuổi nhập viện do TCC ,,.
Hiện nay, các phương pháp chẩn đoán Rotavirus, Norovirus trong phòng xét
nghiệm là phương pháp nuôi cấy, phương pháp miễn dịch và phương pháp
sinh học phân tử. Phương pháp nuôi cấy được xem là tiêu chuẩn vàng nhưng
khó thực hiện vì đòi hỏi kĩ thuật cao và trang thiết bị đầy đủ, thời gian nuôi
cấy kéo dài nhiều ngày. Phương pháp miễn dịch hiện đang được sử dụng phổ
biến tại bệnh viện do đơn giản, dễ thực hiện, nhưng độ nhạy của kỹ thuật còn
chưa cao, thường phát hiện sau 7-10 ngày khởi phát bệnh. Gần đây, phương
pháp sinh học phân tử đang phát triển mạnh mẽ do có độ nhạy và độ đặc hiệu
cao, thời gian trả kết quả nhanh. Trong đó, PCR là kỹ thuật phát hiện tác nhân
thông qua khuếch đại đặc hiệu đoạn gen của tác nhân đó. Cho đến nay,
Realtime PCR gần như thay thế kỹ thuật PCR thường làm tăng độ đặc hiệu
của phản ứng và rút ngắn các bước đọc kết quả, tiết kiệm thời gian trả kết quả.
Trong khi kỹ thuật Realtime PCR thông thường là phát hiện một tác nhân


2

trong một phản ứng thì kỹ thuật Realtime PCR đa mồi đang là một hướng đi
mới nhằm phát hiện nhiều tác nhân đồng thời trong một phản ứng giúp tiết
kiệm được thời gian, hóa chất, đồng thời vẫn đảm bảo độ nhạy, độ đặc hiệu
của phản ứng. Vì vậy, để ứng dụng sớm trong sàng lọc tại bệnh viện, chúng
tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi
trong phát hiện Rotavirus và Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em” với
hai mục tiêu:
1. Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus và
Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em.
2. Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus và
Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình tiêu chảy cấp do Rotavirus, Norovirus
1.1.1. Tình hình trên thế giới
Tiêu chảy cấp là nguyên nhân thứ hai gây tử vong của trẻ em trên toàn
thế giới. Trong các tác nhân gây tiêu chảy cấp ở trẻ em, Rotavirus, Norovirus
là hai tác nhân quan trọng chiếm tỷ lệ tử vong hàng đầu. Mỗi năm, Rotavirus
gây ra trung bình 440.000 trường hợp tử vong, ở trẻ dưới 5 tuổi, chủ yếu tập
trung ở các nước đang phát triển . Rotavirus có phạm vi lưu hành trên khắp
các châu lục. Ở Châu Á, Rotavirus gây ra 37,5% các trường hợp tiêu chảy
cấp, trong đó Bangladesh, Hàn Quốc, Taiwan, Thái Lan, Việt Nam là các quốc
gia có tỷ lệ cao nhất . Trong khi ở các quốc gia Châu Âu, tỷ lệ này dao động
từ 25,3% đến 63,5% . Người ta nhận thấy tỷ lệ TCC do Rotavirus ở các nước
phát triển cao hơn các nước đang phát triển, điều này cho thấy điều kiện về vệ
sinh môi trường không làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc Rotavirus .

Những nghiên cứu gần đây nhất của WHO như nghiên cứu tại
Azerbaijan, trên 3159 trẻ TCC dưới 5 tuổi từ năm 2011 đến năm 2016, tỷ lệ
TCC do Rotavirus dao động từ 13%-21%, xảy ra chủ yếu từ tháng 12 đến
tháng 5, trong đó 58% là trẻ từ 6 đến 23 tháng tuổi . Một nghiên cứu khác trên
7562 trẻ TCC dưới 5 tuổi ở Bangladesh, từ năm 2012 đến năm 2017, tỷ lệ
TCC do Rotavirus là 64%, trong đó 57% là bệnh nhân dưới 12 tháng tuổi .
Cùng với sự ra đời của nhiều vắc xin Rotavirus đơn giá, đa giá và những nỗ
lực không ngừng của WHO trong giảm thiều gánh nặng bệnh tật do TCC ở trẻ
em thì cho đến nay Rotavirus vẫn là tác nhân phổ biến, chiếm tỷ lệ cao ở trẻ
em trên toàn thế giới.


4

Hình 1.1. Tỷ lệ tử vong của tiêu chảy cấp do Rotavirus
( />Rotavirus/en/)
Cùng với Rotavirus, Norovirus đang được xem là một trong những
nguyên nhân phổ biến hàng đầu gây tiêu chảy cấp ở trẻ em dưới 5 tuổi trên
toàn thế giới. Theo nghiên cứu công bố năm 2008, người ta ước tính mỗi năm
Norovirus gây ra 64.000 trường hợp tiêu chảy nhập viện, 900.000 lượt khám
bệnh, trên 1 triệu trường hợp nhập viện ở trẻ dưới 5 tuổi tại các nước công
nghiệp hóa và 1.1 triệu trẻ nhập viện và 218.000 trường hợp tử vong ở trẻ
dưới 5 tuổi tại các nước đang phát triển, virus này chiếm 12% trong số các
căn nguyên gây tiêu chảy nhập viện ở trẻ em tại các quốc gia này. Ở Mỹ, mỗi
năm có khoảng trên 235.000 lượt khám bệnh, 23.000 trường hợp nhập viện vì
TCC do Norovirus . Một thống kê gần đây trên 48 quốc gia công bố năm
2014 cho thấy Norovirus chiếm 18% trong các căn nguyên gây TCC trẻ em,
cao hơn tỷ lệ công bố năm 2008, trong đó ở các nước đang phát triển tỷ lệ
TCC do Norovirus là 14%-19%, ở các nước phát triển tỷ lệ này là 20% .

5
Tương tự như Rotavirus, tỷ lệ TCC do Norovirus ở các nước phát triển cao
hơn ở các nước không phát triển , điều này cho thấy yếu tố vệ sinh môi
trường, nước sạch không làm giảm thiều đáng kể tỷ lệ mắc Norovirus. Khác
với Rotavirus, thế giới hiện chưa có vắc xin phòng Norovirus, trong khi
Norovirus đang là căn nguyên quan trọng gây TCC ở trẻ em trên toàn thế giới
và có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây.
1.1.2. Tình hình tại Việt Nam
Trong mô hình bệnh tật chung của toàn thế giới, Việt Nam, một nước
đang phát triển cũng chịu gánh nặng bệnh tật do TCC do Rotavirus,
Norovirus gây ra. Theo Nguyễn Văn Mẫn và cộng sự (năm 2005) tiến hành
trên 6 bệnh viện ở cả miền Bắc và miền Nam, tỉ lệ TCC do Rotavirus dao
động từ 50% đến 70% . Tại miền nam, nghiên cứu của Đoàn Thị Lan Phương
và cộng sự (năm 2003) cho thấy tỉ lệ trẻ TCC do Rotavirus là 65,6% . Tại
miền bắc, nghiên cứu của Đỗ Phương Thảo (năm 2016) tại bệnh viện Nhi
Trung ương công bố tỉ lệ TCC do Rotavirus là 41,2% . Như vậy, ở nước ta, tỷ
lệ TCC do Rotavirus có xu hướng giảm nhưng vẫn chiếm tỷ lệ cao trong các
căn nguyên gây TCC ở trẻ em.
Cho đến nay, các nghiên cứu trong nước cho thấy tỷ lệ TCC do
Norovirus khá dao động. Theo nghiên cứu của Nguyễn Tuấn Anh và cộng sự
(năm 2007) trên 1010 trẻ TCC nhập viện ở thành phố Hồ Chí Minh cho thấy
tỷ lệ TCC do Norovirus là 5,5% . Nghiên cứu của Nguyễn Vân Trang (năm
2013) nghiên cứu trên 501 trẻ tiêu chảy cấp, tại bệnh viện Nhi Trung ương
cho thấy tỷ lệ TCC do Norovirus là 36%, trong đó 100% là nhóm II . Tỉ lệ trẻ
TCC do Norovirus trong nước có sự dao động lớn như vậy do nhiều nguyên
nhân như địa lí, độ tuổi của trẻ tham gia nghiên cứu, kỹ thuật phát hiện virus.
1.2. Đặc điểm tính chất hệ gen của Rotavirus, Norovirus

6
1.2.1. Đặc điểm của Rotavirus

Hình 1.2. Hình ảnh minh họa cấu trúc của Rotavirus
(Nguồn: Jayaram và cộng sự, (năm 2004)).
Rotavirus thuộc họ Reoviridae có hình khối cầu 20 mặt, đường kính
trung bình 65-75nm. Rotavirus được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 từ
mảnh sinh thiết ruột non của bệnh nhân dưới kính hiển vi điện tử . Rotavirus
có cấu trúc gồm capsid và acid nucleic. Vật chất di truyền của Rotavirus là
ARN sợi kép (ds RNA) gồm 11 đoạn dsRNA, chứa khoảng 18.500 cặp base
(Bảng 1.1). Mỗi đoạn có chiều dài nằm trong khoảng từ 667 đến 3302 bp và
mã hóa cho một protein cấu trúc hoặc protein không cấu trúc, trừ đoạn gen 11
mã hóa 2 protein ,. ARN của Rotavirus được bao bọc bởi 3 lớp protein đồng
tâm lần lượt là lớp ngoài, lớp trong và lớp lõi. Lớp ngoài được cấu tạo từ 780
phân tử protein VP7 và 60 gai nhú dimer VP4. Lớp trong bao gồm 780 phân
tử protein VP6 phân bố đều trên 20 mặt của capsid. Protein VP6 đóng vai trò
kết nối giữa lớp ngoài và lớp lõi. Lớp lõi chứa 120 phân tử protein VP2 sắp
xếp trên 20 mặt của capsid và 12 phức hợp VP1/VP3 gắn bên trong bề mặt
của lớp VP2. Các phân tử protein được chia làm 2 nhóm: protein cấu trúc và


7
protein phi cấu trúc. Protein cấu trúc bao gồm 6 loại là: VP1, VP2, VP3, VP4,
VP6, VP7. Protein phi cấu trúc bao gồm 6 loại là: NSP1, NSP2, NSP3, NSP4,
NSP5, NSP6.
Bảng 1.1. Các đoạn gen của Rotavirus
Đoạn
gen
1
2

3
4
5
6
7
8
9
10

Kích
cỡ (bp)
3302
2687
2592
2362
1581
1356
1062
1059
1074
751

11

666

Protein
mã hóa
VP1
VP2

VP3
VP4
NSP1
VP6
VP7
NSP2
NSP3
NSP4
NSP5
NSP6

Kích cỡ
(kDa)
125
94
88
86
58
44
37
36
34
20
21
12

Vị trí
Nhân
Nhân
Nhân

Lớp ngoài
Protein phi cấu trúc
Lớp trong
Lớp ngoài
Protein phi cấu trúc
Protein phi cấu trúc
Protein phi cấu trúc
Protein phi cấu trúc
Protein phi cấu trúc

Số
phân tử
12
120
12
180
780
780
Rất ít
-

Quan sát trên kính hiển vi điện tử người ta thấy 3 loại hạt virus là hạt
virus hoàn chỉnh, virus có vỏ capsid đơn và lõi virus (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Cấu trúc và protein của Rotavirus
Hạt virus
Hoàn chỉnh
Vỏ capsid đơn
Lõi
Cấu trúc
3 lớp

2 lớp
1 lớp
Protein
VP1, 2, 3, 4, 6, 7
VP1, 2, 3, 6
VP1, 2, 3
Hiện nay, người ta chia Rotavirus thành 8 nhóm A, B, C, D, E, F,G và H
dựa vào đặc tính kháng nguyên của VP6 . Trong đó Rotavirus nhóm A, B, C
là nguyên nhân chính gây bệnh ở người. Đặc biệt, nhóm A là nguyên nhân
phổ biến gây tiêu chảy chiếm khoảng 90% các trường hợp lây nhiễm. Nhóm
B xuất hiện ít hơn và thường gây tiêu chảy ở người lớn. Nhóm C gây tiêu
chảy ở trẻ em nhưng hiếm gặp ,. Rotavirus lây truyền chủ yếu qua đường
phân miệng. Ổ chứa Rotavirus chủ yếu là người bệnh nhiễm Rotavirus. Số
lượng virus thải ra có thể đạt 10 11 trong 1 gram phân. Sau khi thải ra môi
trường, Rotavirus tồn tại bền vững sau nhiều ngày ở nhiệt độ 4C và duy trì


8
được khả năng gây bệnh . Nghiên cứu trên nhóm người tự nguyện cho thấy
liều 10 virus đủ gây mắc bệnh trên người . Rotavirus là nguyên nhân hàng đầu
gây viêm dạ dày ruột cấp ở trẻ em dưới 5 tuổi, đặc biệt ở trẻ từ 6 đến 24
tháng. Bên cạnh đó, Rotavirus có thể gây ra bệnh viêm phổi, viêm ruột hoại
tử, lồng ruột, tắc mật ngoài gan, nhiễm trùng huyết, viêm não… . Rotavirus đi
qua đường phân miệng bám vào, nhân lên trong tế bào trưởng thành nằm ở
đỉnh nhung mao niêm mạc ruột non. Chúng làm tổn thương các vi nhung mao
đồng thời làm tăng sản các tế bào hẽm tuyến ở niêm mạc ruột. Hậu quả gây ra
thiếu hụt các enzyme tiêu hóa, rối loạn nhu động ruột, rối loạn hấp thu nước,
điện giải và chất dinh dưỡng ,,. Vì vậy, bệnh nhân tiêu chảy cấp có các triệu
chứng tiêu chảy phân lỏng, sốt và nôn, dấu hiệu mất nước có thể từ nhẹ tới
nặng .

1.2.2. Đặc điểm của Norovirus

Hình 1.3. Hình ảnh minh họa cấu trúc của Norovirus
(Nguồn: Hiroshi Ushijima và cộng sự, (năm 2014))
Norovirus là thành viên của họ Caliciviridae, có hình khối 20 mặt đường kính
27- 40nm. Norovirus được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1972 khi Kapikian quan
sát mẫu phân của bệnh nhân dưới kính hiển vi điện tử , . Norovirus được cấu
tạo gồm cấu trúc vỏ capsid đơn và acid nucleic. Vật chất di truyền của


9
Norovirus là một sợi RNA dương (+) ss RNA), dài khoảng 7,7 kb. Bộ gen mã
hóa ba khung đọc mở ORF (open reading frame) gồm ORF1, ORF2, ORF3.
ORF1 mã hóa cho các protein phi cấu trúc bao gồm p48 (p37), p41 (p40),
NTPase, p22 (p20), VPg, CL pro, RdRp. Protein VPg liên kết cộng hóa trị với
đầu 5’ của RNA virus mang chức năng bắt đầu quá trình nhân lên của
virus .Chức năng của protein phi cấu trúc còn lại chưa được hiểu biết đầy đủ.
ORF2 mã hóa protein cấu trúc chính (major) VP1 và ORF3 mã hóa protein
cấu trúc nhỏ (minor) VP2 . RNA của virus được bao bọc bởi cấu trúc vỏ
capsid đơn gồm 90 dimer protein VP1 và một hoặc hai protein cấu trúc VP2 .
Protein VP1 chứa 530-555 amino acid, có trọng lượng phân tử 58-60 kDa.
Protein VP2 chứa 208-268 amino acid, có trọng lượng 22-29 kDa. Hiện nay,
Norovirus được phân chia thành 6 nhóm gen khác nhau từ GI đến GVI.
Trong đó, Norovirus gây bệnh ở người chủ yếu thuộc nhóm GI, GII và GIV .
Theo chương trình giám sát dịch tễ của Norovirus trên thế giới, nhóm GII
đang chiếm ưu thế, ước tính chiếm 80% các trường hợp lây nhiễm . Chúng có
khả năng lây truyền từ người sang người qua đường phân miệng với liều lây
nhiễm từ 10 đến100 virus ,. Ổ chứa chủ yếu là người bệnh nhiễm Norovirus.
Chúng có khả năng tồn tại bền vững ngoài môi trường trong nhiều ngày và bị
bất hoạt ở 630C trong 30 phút, 1000C trong vài giây . Vì vậy, khả năng lây

nhiễm từ người bệnh sang người lành cao. Norovirus là tác nhân gây viêm dạ
dày ruột cấp ở người đặc biệt là trẻ nhỏ. Gần đây, Norovirus còn được xem là
tác nhân liên quan đến cơ chế bệnh sinh của một số bệnh lý khác như: viêm
ruột hoại tử ở trẻ đẻ non, hội chứng ruột kích thích, bệnh lí não, đông máu rải
rác lòng mạch . Norovirus đi qua tiêu hóa, bám vào biểu mô ruột non gây ra
sự thay đổi mô học và chức năng của ruột non tương tự như Rotavirus. Hậu
quả gây ra sự tổn thương của các vi nhung mao ruột, gây ra sự kém hấp thu
các chất dinh dưỡng D-xylose, lactose, chất béo; sự rối loạn nhu động dạ dày
ruột, sự rối loạn bài tiết các enzyme tiêu hóa . Vì vậy, bệnh nhân tiêu chảy cấp


10
có các triệu chứng tiêu chảy phân lỏng, sốt và nôn, dấu hiệu mất nước có thể
từ nhẹ tới nặng . Gần đây, người ta nhận thấy người bệnh nhiễm Norovirus
phụ thuộc vào sự hiện diện kháng nguyên nhóm máu Histo đặc hiệu ở người
(HBGA) trong ống tiêu hóa . Sự mẫn cảm của người nhiễm khác nhau được
giải thích dựa trên liên kết đặc hiệu của virus và sự biến đổi trên thụ thể
HBGA , .
1.3. Các kỹ thuật phát hiện Rotavirus, Norovirus.
1.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy
Nuôi cấy luôn được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán. Kỹ thuật
nuôi cấy virus yêu cầu cao về kỹ thuật bao gồm: lựa chọn tế bào, lựa chọn
môi trường nuôi cấy tế bào thích hợp, gây nhiễm tế bào, quan sát bệnh lý tế
bào sau khi gây nhiễm. Hiện nay, người ta hoàn toàn có thể tiến hành nuôi cấy
Rotavirus, Norovirus trong phòng thí nghiệm. Rotavirus có thể nuôi cấy trên
tế bào HEK, CK, LLC-MK2 . Norovirus được nuôi cấy trên tế bào đại thực
bào, tế bào trình diện kháng nguyên của chuột, của người , và tế bào B của
chuột, của người ,. Tuy nhiên, kĩ thuật nuôi cấy yêu cầu phòng xét nghiệm có
đủ trang thiết bị, yêu cầu kĩ thuật cao và đặc biệt thời gian nuôi cấy kéo dài
nhiều ngày .

1.3.2. Phát hiện Rotavirus, Norovirus bằng kính hiển vi điện tử
Phương pháp phát hiện Norovirus, Rotavirus bằng kính hiển vi điện tử ra
đời rất sớm từ những năm 1972, 1973 , , . Kỹ thuật này chủ yếu dựa vào nhận
định về hình thái virus. Các tiêu chuẩn chính nhận định Rotavirus dưới kính
hiển vi điện tử là hạt virus hình cầu đường kính 70 nm, lớp capsid ngoài
mỏng, mịn. Tương tự, Norovirus dưới kính hiển vi điện tử có hình cầu, đường
kính từ 27-40 nm, không vỏ. Khi so sánh phương pháp này với các phương
pháp kính hiển vi miễn dịch hay ELISA phát hiện Rotavirus, phương pháp
phát hiện bằng kính hiển vi điện tử có độ nhạy thấp nhất . Theo nghiên cứu
của Rabenau và cộng sự (năm 2003), so sánh 3 phương pháp phát hiện


11
Norovirus: dùng kính hiển vi điện tử, ELISA, PCR, độ nhạy lần lượt là:
58,3%; 31,3%; 94,1%; độ đặc hiệu lần lượt là: 98%; 94,9%; 94,1% . Như vậy,
phương pháp phát hiện virus bằng kính hiển vi điện tử có ưu điểm tương đối
nhanh, đơn giản, nhưng nhược điểm là phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của
người quan sát và độ nhạy chưa cao.

Hình 1.4. Hình ảnh Rotavirus dưới kính hiển vi điện tử
(nguồn: Hans R. Gelderblom/RKI)


12

Hình 1.5. Hình ảnh Norovirus dưới kính hiển vi điện tử
(nguồn: Kapikian và cộng sự).
1.3.3. Các kỹ thuật miễn dịch dùng để phát hiện Rotavirus, Norovirus.
1.3.3.1. Kỹ thuật miễn dịch ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
Kỹ thuật ELISA phát hiện virus sử dụng nguyên lí dùng kháng thể đặc

hiệu để bắt giữ kháng nguyên Rotavirus, Norovirus. Kháng nguyên virus được
phát hiện nhờ phản ứng màu bằng cách sử dụng kháng thể đặc hiệu bậc 2 có
gắn enzyme. Hiện nay, trên thị trường có nhiều bộ kit thương mại sử dụng
nguyên lí này để phát hiện Rotavirus như Premier™ Rotaclone® (Meridian
Bioscience, Inc.), ProSpecT™ (Oxoid, Ltd.) and RIDASCREEN® (Rbiopharm AG). Khi so sánh với kỹ thuật RT-PCR, ba bộ kit này có độ đặc
hiệu là 100% và độ nhạy lần lượt là 76,8%, 75% và 82,1% . Một số bộ kit
thương mại sử dụng kĩ thuật ELISA để chẩn đoán Norovirus như IDEIA
Norovirus EIA, SRSV(II)-AD, RIDASCREEN,… Các kĩ thuật ELISA chẩn
đoán Norovirus có độ nhạy của kỹ thuật dao động từ 35% -52%, độ đặc hiệu
thường trên 90% . Như vậy, kỹ thuật ELISA có ưu điểm đơn giản, thời gian
trả kết quả ngắn dao động từ 2 đến 3 giờ, phù hợp với điều kiện phòng xét
nghiệm không có kính hiển vi điện tử. Tuy nhiên, nhược điểm chính của kỹ
thuật là độ nhạy còn hạn chế ,


13

Hình 1.6. Nguyên lí của phương pháp ELISA ( nguồn:
/>Kháng thể được cố định vào đáy giếng nhựa. Kháng nguyên trong mẫu
bệnh phẩm sẽ kết hợp với kháng thể tạo phức hợp kháng nguyên - kháng thể.
Bước rửa loại bỏ thành phần không kết hợp với kháng thể. Kháng thể bậc hai
kết hợp với enzym gắn với phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Phức hợp
này được nhận biết bằng phản ứng màu sau khi bổ sung cơ chất đặc hiệu với
enzyme cộng hợp.
1.3.3.2. Kỹ thuật sắc kí miễn dịch
Kỹ thuật sắc kí miễn dịch dùng dạng que nhúng để phát hiện kháng
nguyên virus thông qua nhận định vạch màu. Que nhúng có chứa kháng thể
gắn cộng hợp với các hạt keo vàng được phân bố trên bản sắc kí. Kháng thể
đặc hiệu được cố định tại vị trí vạch kết quả. Kháng nguyên trong bệnh phẩm
sẽ kết hợp với kháng thể gắn hạt keo vàng và di chuyển. Phức hợp này sẽ kết

hợp với kháng thể cố định trên bản sắc kí tạo vạch màu hồng tại vị trí vạch kết


14
quả. Phần phức hợp còn lại không gắn với kháng nguyên di chuyển đến vạch
chứng cho một vạch hồng. Điều đó chứng tỏ que nhúng hoạt động bình
thường và kết quả có giá trị. Như vậy khi xuất hiện cả 2 vạch màu hồng
chứng tỏ mẫu dương tính. Khi chỉ có một vạch hồng tại vị trí vạch chứng
nghĩa là âm tính. So sánh với kĩ thuật ELISA, kỹ thuật ngưng kết hạt latex, kỹ
thuật sắc kí miễn dịch phát hiện Rotavirus có độ nhạy, độ đặc hiệu tương
đương kỹ thuật ELISA . Một nghiên cứu của Park Sung Kwi (năm 2012) so
sánh kỹ thuật sắc kí miễn dịch với phương pháp RT-PCR, bộ kit thương mại
SD BIOLINE Norovirus (Standard Diagnostics, Korea) sử dụng nguyên lí sắc
kí miễn dịch có độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự đoán dương tính, giá trị dự
đoán âm tính lần lượt là: 76,5%; 99,7%; 98,1%; 95,5% . Như vậy, kỹ thuật
sắc kí miễn dịch giải quyết được vấn đề thời gian trả kết quả rất nhanh từ 30
phút đến 1 giờ, nhưng nhược điểm là độ nhạy hạn chế.

Hình 1.7. Nguyên lí của kĩ thuật sắc kí miễn dịch
(nguồn: Trung tâm thống tin và thống kê khoa học và công nghệ thành phố Hồ Chí Minh)


15
1.3.4. Kỹ thuật sinh học phân tử
1.3.4.1. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)
PCR là kỹ thuật tổng hợp acid nucleic trong ống nghiệm, sử dụng cặp
mồi đặc hiệu gắn vào đoạn gen đích và khuếch đại đoạn gen này trong một số
chu kỳ lặp lại. Gen đích sẽ được tăng theo hàm số mũ sau mỗi chu kỳ. Do vật
chất di truyền của Rotavirus, Norovirus là RNA nên phương pháp sinh học
phân tử được áp dụng là reverse transcription (RT-PCR) hay còn gọi là PCR

phiên mã ngược. Đây là kỹ thuật sử dụng RNA mạch đơn làm khuôn để tổng
hợp chuỗi DNA bổ sung (cDNA). Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 2 giai đoạn. Giai
đoạn thứ nhất tổng hợp cDNA từ RNA nhờ enzyme sao mã ngược và các mồi
oligo-(T) hoặc các mồi ngẫu nhiên. Giai đoạn thứ hai, cDNA sẽ được tách làm
hai sợi đơn, hai mồi đặc hiệu được gắn vào hai sợi đơn và kéo dài mạch dưới
tác động của enzyme DNA polymerase . Sản phẩm khuếch đại sẽ được phát
hiện sau khi điện di trên gel agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và đọc
dưới ánh sáng đèn cực tím.
Rotavirus được phát hiện và định typ bằng cách tách chiết RNA của
virus từ các mẫu phân, phân tích bằng RT-PCR với các mồi đặc hiệu cho các
vùng gen khác nhau như vùng gen mã hóa VP7 (typ G), VP4 (typ P), NSP 3,
sau đó sự có mặt của virus được xác định bằng kích thước sản phẩm sau điện
di trên gel agarose . Kỹ thuật RT-PCR phát hiện Norovirus được phát triển
dựa trên các cặp mồi đặc hiệu cho các gen Norovirus khác nhau, chủ yếu ở
vùng bảo thủ nằm trên gen mã hóa RNA polymerase thuộc ORF1 ,. Ưu điểm
của kỹ thuật này là có độ nhạy cao phát hiện được virus ở nồng độ thấp, độ
đặc hiệu cao, có thể trả kết quả trong ngày. Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi
các trang thiết bị chuyên dụng, kỹ thuật viên được đào tạo chuyên sâu và
nguyên vật liệu đắt tiền.