Nghiên cứu một số bất thường di truyền phối hợp ở bệnh nhân lơ xê mi cấp m3 tại bệnh viện bạch mai từ 2014 đến 2018

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lơ xê mi cấp (LXMC) thể M3 theo phân loại FAB hay LXMC thể tiền
tủy bào (APL- Acute promyelocytic leukemia) là một thể bệnh đặc biệt,
chiếm 5-10% trong LXMC dòng tủy. Những năm 1970 các nhà khoa học đã
phát hiện ra chuyển đoạn giữa nhiễm sắc thể (NST) 15 và NST 17 tạo ra gen
lai PML/RARα là bất thường di truyền đặc trưng của thể bệnh LXMC M3.
Theo tác giả Sandy D Kotial chuyển đoạn NST t(15;17) gặp trên 95% bệnh
nhân LXMC M3 [1]. Từ những hiểu biết về di truyền đó đã giúp phát hiện ra
tác dụng của ATRA trên BN LXMC M3. Trong vòng 50 năm, từ khi ATRA
được sử dụng như thuốc điều trị nhắm trúng đích đã làm thay đổi hoàn toàn
tiên lượng của LXMC M3, từ thể bệnh có tỷ lệ tử vong cao thành thể bệnh có
tỷ lệ chữa khỏi cao. Người ta thấy hơn 90% bệnh nhân LXMC M3 đạt lui
bệnh hoàn toàn và hơn 75% bệnh nhân được chữa khỏi khi sử dụng ATRA kết
hợp hóa chất [2], [3].
Tuy nhiên vẫn có một số bệnh nhân có biểu hiện rất nặng trên lâm sàng
ngay từ khi phát hiện, không đáp ứng với điều trị bằng ATRA hoặc tái phát
sớm. Nhiều tác giả đã thấy rằng những bệnh nhân này có tổn thương phức tạp
về số lượng và cấu trúc NST bên cạnh t(15;17) đặc trưng [4], [5].
Ngoài phân tích NST, bệnh nhân LXMC M3 được phân tích di truyền
sinh học phân tử có thể phát hiện thấy một số yếu tố liên quan đến mức độ
nặng như dạng S-form của gen PML/RARα [6] hay các nhóm đột biến FLT3ITD và NPM1-Muta [7]. Một số tác giả thấy rằng tỷ lệ bệnh nhân có biểu
hiện xuất huyết rầm rộ ở nhóm PML/RARα S-form cao hơn nhóm L-form. Tỷ
lệ đột biến FLT3-ITD và NPM1-Muta chiếm tỷ lệ cao và có ý nghĩa tiên lượng
trong LXMC dòng tủy nói chung tuy nhiên trong các bệnh nhân thể M3 tần suất
và ý nghĩa tiên lượng của các đột biến này vẫn còn là vấn đề tranh cãi.


2

Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu một
số bất thường di truyền phối hợp ở bệnh nhân Lơ xê mi cấp M3 tại bệnh
viện Bạch Mai từ 2014 đến 2018” với hai mục tiêu sau:
1.

Mô tả một số bất thường di truyền tế bào và phân tử ở bệnh nhân Lơ xê
mi cấp M3.

2.

Nhận xét các đặc điểm lâm sàng, kết quả xét nghiệm và đáp ứng điều
trị theo các nhóm bất thường di truyền.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Định nghĩa
Lơ xê mi cấp là một nhóm bệnh đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy
trong tủy xương và ở máu ngoại vi của những tế bào tạo máu chưa trưởng
thành, ác tính (blast). Những tế bào này sẽ dần thay thế và ức chế quá trình
trưởng thành và phát triển của các dòng tế bào bình thường trong tủy xương.
Các tế bào non ác tính sẽ lan tràn ra máu ngoại vi, thâm nhiễm các tổ chức
trong cơ thể gây ra các biểu hiện lâm sàng như gan, lách, hạch to.
LXMC tiền tủy bào là thể mà các tế bào ác tính là các tiền tủy bào tăng
sinh hạt đặc hiệu hay nói cách khác là các tế bào dòng tủy bị gián đoạn trưởng
thành một cách ác tính ở giai đoạn tiền tủy bào. Các tế bào blast có hình thái
đặc trưng riêng của tiền tủy bào với nhân lớn, nguyên sinh chất nhiều hạt ưa
azua, que Auer [8]. Biến thể M3v là một thể đặc biệt thuộc LXMC M3,có

tiền tủy bào ác tính mang những đặc điểm đặc biệt như nguyên sinh chất mịn,
ít hạt, nhân cuộn và không rõ hạt nhân.
1.2. Dịch tễ
LXMC tiền tủy bào là thể bệnh hiếm gặp, chiếm khoảng 5-15% các
trường hợp bạch cầu dòng tủy. Tại Mỹ hàng năm có khoảng 30.800 trường
hợp bệnh bạch cầu cấp được chẩn đoán. Khoảng 1.000 trong số này là bệnh
bạch cầu cấp tính thể M3 [1]. Tại Ý tỷ lệ mới mắc hàng năm của bệnh
LXMC tiền tủy bào là khoảng 0,6 trên 1 triệu người. Tỷ lệ nam/nữ là gần 1 ở
bệnh nhân mắc LXMC tiền tủy bào. Tuổi trung bình khởi phát của bệnh
khoảng 40 tuổi, ít gặp trẻ em dưới 10 tuổi và người cao tuổi [2].
Tại Việt Nam, các nghiên cứu trong một vài năm gần đây cũng thấy tỷ lệ
LXMC tiền tủy bào trong số những bệnh nhân LXMC là khoảng 10% với tuổi
mắc bệnh trung bình 30-40 tuổi [9].


4

1.3. Bệnh sinh
Chuyển đoạn t(15;17) tạo ra gen lai PML/RAR  gặp trên 95% ở các
bệnh nhân LXMC thể M3 được cho là đóng vai trò chính trong cơ chế bệnh
sinh của bệnh [10]. Gen RAR nằm trên NST số 17 đóng vai trò quan trọng
trong biệt hóa của nhiều loại tế bào và chức năng này được điều chỉnh thông
qua retinoic acid receptor (RAR). Sản phẩm protein của gen RAR  bình
thường có chức năng hoạt hóa quá trình sao mã của các gen giúp tế bào có thể
trưởng thành. Protein RAR có tác dụng như một chất gắn gây ra hiện tượng
sao mã bằng cách gắn với yếu tố đáp ứng đặc hiệu ở vùng promotor của gen
đích (RARE). Phức hệ RAR-RARE-RXR khi gắn vào ADN sẽ khởi động
quá trình sao mã của gen đó. Gen kết hợp PML/RAR  kìm hãm sao mã do ức
chế RAR vì vậy mà ngăn cản sự biệt hóa của tiền tủy bào [11].
Gen PML nằm trên NST 15 có vai trò mã hóa cho protein ức chế khối u

và protein này là một phần của thể nhân, đóng vai trò chủ đạo trong một số tín
hiệu chết theo chương trình. Gen PML còn hoạt động như một đồng yếu tố
sao mã với p53, một gen ức chế khối u. Sản phẩm của gen PML là protein
PML thuộc họ protein nhân liên quan đến quá trình sao mã, có liên quan đến
ức chế khối u và kiểm soát sự bền vững của bộ gen. Protein này liên quan đến
hiện tượng cảm ứng phụ thuộc p53 của apoptosis, ức chế tăng trưởng, ức chế
lão hóa tế bào trong đáp ứng với phóng xạ ion hóa và tiến triển sinh u. Ngoài
ra, protein PML còn ức chế sao mã qua trung gian là các yếu tố ức chế khối u
khác như Rb và Mad .
Cả protein PML và PML thể nhân đều bị phá vỡ trong LXMC tiền tủy
bào do phức hợp gen PML/RAR. Sự phá vỡ này sẽ làm mất chức năng sinh
lý bình thường của protein PML. Sự có mặt của phức hợp gen này không làm
ức chế ngay quá trình biệt hóa của dòng bạch cầu hạt mà nó làm thay đổi cán
cân trong sinh máu dòng tủy theo hướng kém trưởng thành. Sản phẩm của gen


5

kết hợp tạo ra là một protein gây ức chế sao mã dẫn đến tế bào ngừng biệt hóa
và phát triển ác tính ở giai đoạn tiền tủy bào do protein này gắn với RARE với
ái tính tương tự protein của RARα, tranh chấp RARE với RARα. Vì hoạt
động tính trội, tranh chấp RARE với RARα nên với nồng độ ATRA sinh lý
(10⁻⁹ M) kích thích không đủ để giải phóng ức chế để hoạt hóa phiên mã, mà
phải cần nồng độ ATRA là 10⁻⁶ M mới có thể giải phóng ức chế [12].
1.4. Bệnh nguyên
Nguyên nhân gây nên bệnh lơ xê mi cấp tiền tủy bào (LXMC M3) đến
nay vẫn đang được nghiên cứu. Tuy nhiên vẫn chưa tìm được nguyên nhân cụ
thể. Các nhà nghiên cứu ghi nhận các yếu tố có thể liên quan đến bệnh lý này
như sau:
- Hóa chất: các chất nhóm Alkyl, nhóm benzen (những hóa chất có cấu

trúc hóa học nhân vòng).
- Tia xạ hay tia ion hóa: tỷ lệ bệnh gặp nhiều ở những người tiếp xúc với
tia xạ lâu ngày hay ở trong vùng nhiễm xạ nặng.
- Virus: nhiều nghiên cứu ghi nhận một số virus gây bệnh trên người một
thời gian dài cũng gây ung thư
- Yếu tố di truyền: có một số bệnh bẩm sinh di truyền như Hội chứng
Down, hội chứng thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh, hội chứng Poland… làm
người bệnh dễ mắc thêm bệnh lơ xê mi cấp.
- Yếu tố môi trường: môi trường bị nhiễm độc do hóa chất, thuốc trừ sâu,
tia xạ…gây nên tình trạng nhiễm độc nguồn nước, thức ăn…và các chất độc
này gây đột biến nhiễm sắc thể.
1.5. Lâm sàng
Biểu hiện xuất huyết là đặc điểm nổi bật của LXMC tiền tủy bào. Các
biểu hiện xuất huyết thường rất đa dạng và nặng nề: xuất huyết dưới da, niêm
mạc, xuất huyết trong cơ, xuất huyết võng mạc, ho ra máu, đái máu, xuất


6

huyết tiêu hóa, ở bệnh nhân nữ hay thấy kinh nguyệt kéo dài với số lượng
nhiều. Đặc biệt trước đây, xuất huyết não là nguyên nhân gây tử vong của 1030% các trường hợp ngay từ những ngày đầu tiên phát hiện bệnh hoặc trong
quá trình điều trị hóa chất. Các nguyên nhân gây xuất huyết ngoài do giảm
tiểu cầu như trong những thể LXMC thì chủ yếu còn do nguyên nhân rối loạn
đông máu, trong đó phần lớn là DIC [10]. Có một tỷ lệ nhỏ (5,1%) các trường
hợp biểu hiện lâm sàng là tình trạng huyết khối nhưng kết quả xét nghiệm vẫn
cho thấy tình trạng đông máu nội mạch rải rác.
Thiếu máu khá phổ biến trong LXMC tiền tủy bào. Bên cạnh tình trạng
ức chế sinh máu tại tủy của các tế bào ác tính, tình trạng xuất huyết nặng nề
cũng là nguyên nhân gây nên thiếu máu.
Các biểu hiện hay gặp khác của LXMC như sốt do tình trạng nhiễm

trùng. Số lượng bạch cầu đa nhân trung tính thấp do các tế bào dòng tủy không
trường thành được, nên bệnh nhân LXMC M3 dễ bị nhiễm trùng nặng hơn.
Gan, lách, hạch to hay các biểu hiện thâm nhiễm da, thần kinh ít gặp hơn
ở LXMC tiền tủy bào.
1.6. Xét nghiệm
Tế bào học
Khi phân tích máu ngoại vi của các bệnh nhân LXMC tiền tủy bào
thường cho thấy tình trạng giảm số lượng hồng cầu mức độ vừa và nặng, số
lượng tiểu cầu thường thấp và giảm động học theo diễn biến của DIC, số
lượng bạch cầu thường không cao, thậm chí có những trường hợp giảm rất
sâu dưới 1 G/l nên dễ bỏ sót chẩn đoán nếu không quan sát kỹ tiêu bản máu.
Tuy nhiên biến thể M3v lại thường có số lượng bạch cầu cao (50-200G/l) và
là một trong những yếu tố tiên lượng xấu do có thể xuất hiện DIC nặng hơn
và mắc hội chứng retinoic trong quá trình điều trị ATRA.
Tế bào học tủy xương và hóa học tế bào là xét nghiệm quan trọng quyết


7

định chẩn đoán của bệnh nhân và điều trị trước cả khi có kết quả gen để giảm
nguy cơ tử vong sớm do rối loạn đông máu. Ở thể M3, đại đa số các tế bào có
nhân trong tủy xương (30-90%) là các tiền tủy bào ác tính. Các tiền tủy bào
này có đường kính khoảng 15-20 m với bào tương rộng vừa phải, chứa đầy
các hạt đặc hiệu, đôi khi trùm kín nhân, các hạt ưa azua này lớn hơn, thô và
bắt màu thuốc nhuộm đậm hơn so với các tiền tủy bào bình thường. Một số tế
bào có rất nhiều que Auer được gọi là faggot cell. Các tế bào này cho phản
ứng rất mạnh với MPO, soudan đen. Chính vì hình thái đặc biệt này mà
nhuộm Giemsa cũng đã có thể xác định được bệnh. Biến thể M3v hay còn gọi
là thể vi hạt, chiếm 20-25% LXMC tiền tủy bào, có hình thái học của các tiền
tủy bào ác tính tương đối giống bạch cầu mono với bào tương xám mờ, mịn,

bờ nhân không đều, nhân cuộn và không rõ hạt nhân. Nên trên tiêu bản
nhuộm Giemsa thể này có thể nhầm với thể M4, M5. Lúc này việc chẩn đoán
cần kết hợp nhiều xét nghiệm khác như hóa học tế bào, di truyền tế bào, di
truyền phân tử tìm gen kết hợp đặc trưng.
Miễn dịch học
LXMC tiền tủy bào có đặc điểm miễn dịch là: HLA-DR âm tính, CD33
và CD9 dương tính, CD14 âm tính. CD34 thường âm tính hoặc có tỷ lệ dương
tính rất thấp tuy nhiên có một số trường hợp người ta nhận thấy CD34 dương
tính ở mức cao và có sự liên quan với tăng số lượng bạch cầu, kiểu gen kết
hợp PML/RAR hoặc biến thể M3v. Một số trường hợp về hình thái học và
kết quả miễn dịch giống với M3v nhưng khi kiểm chứng bằng di truyền tế bào
thì không thấy có chuyển đoạn đặc trưng t(15;17) mà chỉ có bất thường nhiễm
sắc thể 17 hoặc bất thường NST 17 kết hợp với NST khác ngoài NST 15,
những bệnh nhân này có thể đáp ứng kém với điều trị bằng ATRA. Vì thế
những bệnh nhân này được xếp vào nhóm tiên lượng xấu.
Đông máu


8

Bệnh nhân LXMC M3 thường biểu hiện tình trạng đông máu nội mạch
rải rác (DIC) nặng nề. Cơ chế rối loạn đông máu trong bệnh nhân LXMC M3
rất phức tạp, theo nhiều con đường. Nhưng nguyên nhân đều bắt nguồn từ các
hạt đặc hiệu chứa protease (elastase), yếu tố tổ chức phát động đông máu nội
mạch rải rác và yếu tố tiêu sợi huyết trong nguyên sinh chất TTBAT. Đông
máu nội mạch rải rác sẽ dẫn đến tăng tiêu thụ các yếu tố đông máu, tiểu cầu,
fibrinogen và prothrombin dẫn tới tình trạng chảy máu. Vô số các cục đông
máu nhỏ trong lòng mạch sẽ làm cho các hồng cầu đi qua bị tổn thương dẫn
đến có nhiều mảnh vỡ hồng cầu và các hồng cầu nhỏ hình cầu. Hệ thống tiêu
sợi huyết cũng được khởi động mạnh mẽ do giải phóng các yếu tố

plasminogen hoạt hóa từ các TTBAT. Kết quả, trên xét nghiệm sẽ thấy thời
gian PT, APTT đều kéo dài, định lượng fibrinogen giảm, sản phẩm thoái
giáng của fibrin và firinogen tăng, nghiệm pháp rượu dương tính, nghiệm
pháp Von-Kaulla có thể thể hiện tình trạng tiêu sợi huyết hoặc không.
1.7. Di truyền
1.7.1. Di truyền tế bào
Khi phân tích NST, người ta thấy chuyển đoạn tương hỗ giữa NST 15 và
NST 17 t(15;17) ở trên 95% bệnh nhân LXMC M3. Vì tỷ lệ xuất hiện cao,
nên đây được coi như một yếu tố hỗ trợ chẩn đoán, đặc biệt trong những
trường hợp khó phân định trên tế bào học.


9

Hình 1.1 : Chuyển đoạn t(15;17) trên phân tích NST
(Nguồn: />Tuy nhiên, đột biến này xảy ra trên 2 nhiễm sắc thể thuộc nhóm D, E, là
các nhóm có kích thước nhỏ và chuyển đoạn kích thước ngắn, nên có thể bị
bỏ sót. Ngoài ra, bệnh nhân có thể khảm giữa những dòng tế bào bị tổn
thương và các dòng tế bào bình thường nên khi phân tích cũng có thể bỏ sót
dòng tế bào bất thường này. Đặc biệt dòng tế bào bất thường này còn có khả
năng phân bào kém hơn, nên khả năng không phát hiện được t(15;17) khi
phân tích NST càng cao hơn. Tác giả Vũ Minh Phương khi nghiên cứu mối
liên quan giữa phân tích NST và PCR cũng kết luận rằng phân tích NST có độ
nhạy kém hơn nguyên nhân có thể do những lí do kể trên [9].
Để khắc phục nhược điểm của kỹ thuật này, hiện nay có thể áp dụng
thêm kỹ thuật FISH để phát hiện t(15;17). Kỹ thuật FISH được tiến hành dựa
trên cơ sở của phản ứng lai ghép. Trong tế bào, phân tử DNA tồn tại dưới
dạng phân tử kép gồm 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên
kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động
của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, phân tử DNA bị tách thành 2 sợi đơn. Tuy

nhiên khi nhiệt độ hay pH thay đổi, liên kết hydro cũng nối lại nhanh chóng.


10

Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng các đầu dò đặc hiệu có gắn
huỳnh quang để lai ghép các đoạn DNA tương đồng trên NST. Từ đó phát
hiện đột biến trên NST một cách chính xác và nhanh chóng.
Đầu dò đặc hiệu sử dụng để phát hiện t(15;17) hiện đang sử dụng tại Trung
tâm Huyết học và Truyền máu Bệnh viện Bạch Mai thuộc loại đầu dò chuyển
đoạn 2 màu (PML/RARα Dual color Dual fusion Translocation Probe). Tín hiệu
màu xanh lá cây gắn ở vị trí 17q21 đánh dấu vị trí gen RARα. Tín hiệu màu cam
đỏ gắn ở vị trí 15q22-24 đánh dấu vị trí gen PML. Bình thường, trong 1 nhân tế
bào có 2 tín hiệu xanh, 2 tín hiệu đỏ nằm tách riêng.

Hình 1.2: Tín hiệu màu bình thường trong kỹ thuật FISH phát hiện t(15;17)
(nguồn: www.micro-shop.zeiss.com)
Khi có chuyển đoạn t(15;17), 2 gen này sẽ kết hợp với nhau làm cho chúng ta
quan sát được fusion màu vàng do tín hiệu xanh và da cam đỏ đứng sát cạnh nhau.
Khi tiến hành phân tích kết quả FISH, kĩ thuật này yêu cầu phải phân
tích ít nhất trên 200 nhân tế bào, vì vậy có thể phát hiện được bất thường ở
những bệnh nhân mà dòng tế bào bất thường chiếm tỷ lệ nhỏ.


11

Hình 1.3: Tín hiệu fusion trong tế bào tiền tủy bào ác tính trên kỹ thuật FISH
phát hiện t(15;17)
(Nguồn: />Tuy có độ nhạy cao hơn phân tích NST, nhưng kỹ thuật FISH không thể
thay thế mà chỉ có ý nghĩa hỗ trợ, bổ sung, vì kỹ thuật FISH không thể phát

hiện những đột biến NST khác đi kèm với t(15;17).
Bên cạnh những bệnh nhân LXMC thể M3 cải thiện đáng kể sau điều trị
với ATRA nhắm trúng đích, có một số bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng xuất
huyết rầm rộ, khó lui bệnh, hay sau điều trị có thể tái phát và tử vong sớm.
Nhiều tác giả đã thấy những bệnh nhân này thường có t(15;17) phối hợp với
đột biến NST khác nữa. Từ nhận định đó, tác giả De Botton S đã tiến hành
nghiên cứu trên 292 bệnh nhân thấy có 26% bệnh nhân có bất thường di
truyền NST ngoài chuyển đoạn t(15;17), trong đó gặp nhều nhất là trisomy 8
(chiếm 46% bệnh nhân có bất thường). Tuy nhiên sau khi so sánh các chỉ số
đáp ứng điều trị, thời gian lui bệnh… tác giả thấy rằng đây không phải là một


12

yếu tố tiên lượng đáp ứng điều trị không tốt cho bệnh nhân LXMC thể M3
[13]. Một nghiên cứu khác của Takaaki Ono tiến hành tại Nhật Bản cũng cho
kết quả tương tự nghiên cứu của De Botton S,tác giả này nghiên cứu trên 225
bệnh nhân LXMC M3 và thấy tỷ lệ t(15;17) phối hợp với đột biến NST khác
là 30%, trisomy 8 cũng là bất thường chiếm tỷ lệ nhiều nhất (31%), sau đó là
các bất thường trên NST số 15 (11%), bất thường trên NST số 9 (9%), NST số
7 (9%), các NST số 17, 6 gặp với tỷ lệ ít hơn [14]. Tác giả cũng theo dõi
trong 10 năm, không thấy sự khác biệt về thời gian sống thêm toàn bộ và thời
gian sống thêm không bệnh giữa 2 nhóm bệnh nhân này. Tuy nhiên, một
nghiên cứu khác của Jose Cervera trên 424 bệnh nhân lại thấy t(15;17) phối
hợp với đột biến NST khác như một yếu tố liên quan đến tỷ lệ tái phát sớm và
nhóm này cũng có tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn kém hơn [15]. Trong nghiên cứu
trên 245 bệnh nhân LXMC M3, tác giả Poire X. thấy rằng nhóm bệnh nhân có
t(15;17) phối hợp với đột biến NST khác có thời gian sống thêm toàn bộ kém
hơn nhóm bệnh nhân chỉ có t(15;17) đơn thuần [16]. Một nghiên cứu khác
của X Lu tại Thượng Hải trên 284 bệnh nhân, cũng thấy tỷ lệ t(15;17) kết hợp

với đột biến NST khác chiếm 9.2%, trong đó cũng thấy chủ yếu là đột biến
thêm NST 8, sau đó là đột biến liên quan đến các NST 7,9,17... Đặc biệt tác
giả thấy tỷ lệ sống thêm toàn bộ và sống thêm không bệnh trong nhóm có
t(5;17) kết hợp với đột biến NST khác thấp hơn so với nhóm chỉ có t(15;17)
thông thường [17].Vì thế đây vẫn còn là vấn đề tranh cãi và cần được nghiên
cứu thêm.
1.7.2. Di truyền phân tử
Gen kết hợp PML/RARα được tạo ra do t(15;17). Điểm cắt cho chuyển
đoạn là tại gen ở vị trí q22 trên NST 15 và tại gen ở vị trí q21 trên NST 17.
Chuyển đoạn này sẽ tạo ra gen kết hợp giữa gen RAR (retinoic acid
receptor) với gen PML tạo nên PML/RARα. Chuyển đoạn NST t(15;17) đã
làm mất chức năng bình thường của gen RAR. Sản phẩm protein của gen


13

này bình thường có chức năng hoạt hóa quá trình sao mã (hoạt hóa ADN duỗi
xoắn và tổng hợp ARN thông tin) của các gen có vai trò giúp tế bào trưởng
thành. Protein này có một phần cấu trúc gắn vào ADN và một phần tương tác
với dẫn xuất của acid retinoic. Khi có chuyển đoạn PML/RAR, sản phẩm
protein tạo ra sẽ không những không hoạt hóa được sao mã mà còn ức chế
chức năng của gen RAR bình thường nên tế bào không thể trưởng thành
được mà dừng lại một cách ác tính ở giai đoạn tiền tủy bào .
Nếu điểm cắt của gen PML trên NST số 15 ở vị trí q22 trong vòng intron3
(bcr3) sẽ tạo ra ARN thông tin dạng ngắn (short form), trong khi điểm cắt trong
vòng intron 6, exon6 sẽ cho ARN thông tin dạng dài (long form). Kết quả của
nhiều nghiên cứu chưa thống nhất với nhau trong việc xác định mối liên quan
giữa hai dạng sản phẩm ARN thông tin dạng dài và dạng ngắn với yếu tố tiên
lượng bệnh mặc dù có ý kiến cho rằng dạng ngắn (short form) có thời gian
sống thêm toàn bộ và thời gian sống không bệnh ngắn hơn dạng còn lại.

Hình 1.4: Cơ chế hình thành các kiểu gen của gen lai PML/RARα
(Nguồn: />Tuy gen kết hợp PML/RARα gặp với tỷ lệ rất lớn trong số bệnh nhân
LXMC M3, tuy nhiên vẫn có 2-5% các trường hợp gen kết hợp với RARα
khác, tùy các nghiên cứu. Đến nay, đã có khoảng 8 gen kết hợp với RARα
khác, các gen này thường được báo cáo riêng lẻ do tính ít gặp của nó, tuy vậy
người ta cũng thấy một số gen dường như ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng


14

với ATRA, một số gen kết hợp làm bệnh nhân LXMC M3 kháng lại điều trị
với ATRA [18].
Một số gen kết hợp đã được nhắc đến là:
+ t(11;17)(q23q21) tạo gen kết hợp PLZF/RAR
+ t((11;17)(q13q21) tạo gen kết hợp NuMA/RAR
+ t(5;17)(q35q21) tạo gen kết hợp NPM/RAR
+ t(17 ;17)(q11q21) tạo gen kết hợp STAT 5b/RAR
+ t(X;17)(q11;q12) tạo gen kết hợp BCOR/RAR:
Trong đó chuyển đoạn t(11;17)(q23q21) tạo nên gen kết hợp
PLZF/RAR được quan tâm nhiều do kháng lại điều trị bằng ATRA.
Ngoài gen kết hợp PML/RARα, người ta còn thấy một số đột biến gen
như FLT3-ITD và NPM1-mutA có ý nghĩa trong việc tiên lượng điều trị cho
bệnh nhân.
Đột biến gen FLT3 là một đột biến gen hay gặp trong LXMC dòng tủy.
Gen FLT3 nằm trên nhánh dài NST 13 và có biểu hiện ít trên tế bào gốc tạo
máu, nhưng biểu hiện nhiều hơn trên các tế bào máu ác tính. Đột biến gen này
có 3 loại FLT3 – JM, FLT3 – ITD, FLT3 – TKD. FLT3 – JM là một đột biến
điểm dẫn đến tự ức chế tyrosin kinase, loại này rất hiếm gặp. Loại FLT3 –
ITD là một kiểu đột biến nhân đoạn nội gen, chiếm khoảng 28 – 34% bệnh

nhân LXMC dòng tủy. FLT3 – TKD là loại đột biến điểm, xen đoạn hoặc mất
đoạn liên quan đến codon 835 và 836, kiểu đột biến này chiếm khoảng 11 –
14% bệnh nhân LXMC dòng tủy. Tỷ lệ biến đổi FLT3 gặp ở khoảng 1/3
LXMC dòng tủy, ngoài ra còn xuất hiện ở bệnh rối loạn sinh tủy (3%), hiếm
gặp hơn ở bệnh LXMC dòng lympho, LXM king dòng bạch cầu hạt, hầu như
không gặp ở LXM kinh dòng lympho, bệnh đa u tủy xương, u lympho hoặc
người bình thường. Điều này cho thấy biến đổi FLT3 đặc hiệu cho bệnh


15

LXMC dòng tủy [19]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nếu bệnh nhân
LXMC có đột biến FLT3-ITD thì đáp ứng điều trị kém, thời gian sống thêm
toàn bộ ngắn hơn nhóm không có đột biến này [19]. Trong nhóm bệnh nhân
LXMC M3, đột biến này cũng được Gong nhận định là yếu tố tiên lượng xấu
với số lượng bạch cầu ở nhóm FLT3-ITD dương tính cao hơn nhóm âm tính,
đặc biệt nhóm dương tính có tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn, thời gian sống thêm
toàn bộ và thời gian sống thêm không bệnh ngắn hơn nhóm không phát hiện
đột biến này [20].
NPM1 còn được gọi là nuclephosmin, là gen nằm trên nhánh dài NST số 5,
bao gồm 12 exon, mã hóa 259 acid amin. Đột biến hay gặp nhất của gen này là
trên exon 12, thêm 4 nucleotid TCTG tạo ra dạng đột biến NPM1-mutA.

Hình 1.5: Các dạng đột biến gen NPM1
(Nguồn: />NPM1 có rất nhiều vai trò, tham gia vào quá trình phân bào, tháo xoắn
ADN, dịch mã, kết hợp với riboxom, tham gia quá trình tổng hợp protein và
sửa chữa ADN. Biến đổi gen NPM1 xuất hiện nhiều trong ung thư gan, não,
tuyến tiền liệt...Gặp tỷ lệ khá cao biến đổi gen này trong LXMC dòng tủy,

16

khoảng 35% LXMC dòng tủy ở người lớn và 6.5% LXMC trẻ nhỏ. Biến đổi
này thể hiện đáp ứng khá tốt với điều trị [21], [22]. Với thể bệnh LXMC M3,
Suchitra cũng thấy tỷ lệ xuất hiện đột biến NPM1-mutA là 45%. Trong đó, có
44% bệnh nhân có đồng thời 2 đột biến NPM1-mutA và FLT3-ITD, 56% bệnh
nhân chỉ có NPM1-mutA và không thấy đột biến FLT3-ITD. Khi so sánh 2
nhóm này, tác giả thấy tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn thuộc nhóm có NPM1-mutA
dương tính và không có FLT3-ITD cao hơn nhóm còn lại [23]. Vì vậy
NPM1-mutA xuất hiện và không kèm theo FLT3-ITD được coi như yếu tố
tiên lượng tốt cho bệnh nhân LXMC M3.
1.8. Điều trị
Phác đồ tiêu chuẩn ở Châu Âu có áp dụng những yếu tố liên quan đến
tiên lượng là phác đồ LPA99 và APL2000, nằm trong thử nghiệm PETHEMA
(Programa para el Estudio de la Terapéutica en Hemopatía Maligna) [24].
Phác đồ APL2000 chia bệnh nhân theo nhóm tuổi và số lượng bạch cầu: Với BN
dưới 60 tuổi có số lượng bạch cầu dưới 10G/l sẽ dùng ATRA 45mg/m2 da tới
lui bệnh hoàn toàn. Daunorubicin 60mg/m2 da/ngày trong 3 ngày và có thể
dùng kèm ARA-C 200mg/m2 da/ngày trong 7 ngày hoặc chỉ dùng
daunorubicin đơn độc. Sau lui bệnh hoàn toàn bệnh nhân được dùng 2 đợt:
1) Daunorubicin 60mg/m2 da/ngày trong 3 ngày và ARA-C 200mg/m2
da/ngày trong 7 ngày.
2) Daunorubicin 45mg/m2 da/ngày trong 3 ngày và ARA-C 1g/m2
da/12h trong ngày từ ngày 1-4.
Nhóm bệnh nhân 60 tuổi với số lượng bạch cầu 10G/l sẽ được điều trị
như nhóm có dùng Ara-C nhưng tăng liều lên 2g/m2 da/12h trong 5 ngày với
bệnh nhân<50 tuổi và 1,5g/m2 da/12h trong 5 ngày với bệnh nhân 50 tuổi.
Các bệnh nhân đều được tiêm tủy sống phòng thâm nhiễm thần kinh trung
ương bằng methotrexat 15mg, Ara-C 50mg và depomedrol.

17

Nhóm bệnh nhân trên 60 tuổi với số lượng bạch cầu dưới 10G/l được
điều trị như nhóm dưới 60 tuổi không dùng Ara-C. Điều trị củng cố 2 đợt
bằng daunorubicin 60mg/m2 da/ngày trong 3 ngày và 45mg/m2 da/ngày trong
3 ngày ở đợt tiếp theo.
Nhóm bệnh nhân trên 60 tuổi có số lượng bạch cầu cao từ 10G/l sẽ được điều
trị như nhóm bệnh nhân trẻ có số lượng bạch cầu <10G/l nhưng có dùng Ara-C.
Tất cả các bệnh nhân đều được điều trị duy trì bằng 6MP, methotrexat và
all trans retinoic acid (ATRA)
Phác đồ APL 2000 được áp dụng từ 2000-2004 ở 63 trung tâm của châu
Âu cho kết quả 97,2% lui bệnh hoàn toàn và tỷ lệ tái phát sau 2 năm là 4,5%,
không có bệnh nhân kháng thuốc.
Theo nghiên cứu GIMEMA AIDA 2000, nhóm bệnh nhân có số lượng
bạch cầu nhỏ hơn 10 G/l được điều trị bằng ATRA, mitoxantrone và
idarubicin. Nhóm bệnh nhân này đạt tỷ lệ sống thêm không bệnh và sống
thêm toàn bộ sau 6 năm là 86% và 89% [25].
Ngày nay, NCCN (National Comprehensive Cancer Network) hướng dẫn
thêm asenic trioxide (ATO) vào điều trị hàng một. ATO tác động vào tế bào
tiền tủy bào ác tính, làm tế bào này chết theo chương trình. Thử nghiệm của
nhóm Bắc Mỹ (North American Intergroup trial) kết luận thêm ATO vào điều
trị cải thiện kết quả điều trị, tăng tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn lên đến trên 90%.
Một thử nghiệm pha III ở Ý và Đức (Italian-German Cooperative Group) so
sánh nhóm A bệnh nhân được điều trị phối hợp ATRA với ATO 0.15 mg/kg
đến khi lui bệnh khi so sánh với nhóm B bệnh nhân được điều trị theo AIDA,
thấy rằng tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn sau đợt điều trị tấn công của nhóm A là
100% và nhóm B là 95%, tỷ lệ tử vong trong quá trình điều trị của nhóm A
cũng ít hơn nhóm B [26], [27].
Vì vậy cân nhắc phối hợp thêm ATO ngay từ đợt điều trị đầu tiên, đặc

18

biệt ở những bệnh nhân lớn tuổi, không dung nạp với hóa chất ARA-C,
daunorubicin,...Những bệnh nhân có yếu tố tiên lượng không tốt như có
t(15;17) phối hợp đột biến NST khác, có kiểu gen PML/RARα S-form hoặc
âm tính, có đột biến FLT3-ITD...cũng có thể cân nhắc phối hợp thêm ATO ở
ngay đợt điều trị đầu tiên [28]. Với những bệnh nhân tiên lượng xấu, sau khi
đạt lui bệnh hoàn toàn, có thể xem xét ghép tế bào gốc. Hiện nay, thuốc ức
chế FLT3 cũng đang được nghiên cứu để áp dụng trên những bệnh nhân có
FLT3-ITD dương tính, hy vọng cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân [29].
Tại Việt nam
ATRA được sử dụng cho các bệnh nhân LXMC M3 tại Việt Nam lần đầu
vào năm 1999, sau đó các bệnh nhân tái phát được sử dụng ATO năm 2002.
Kết quả lui bệnh hoàn toàn với những bệnh nhân sử dụng ATRA đơn thuần là
trên 70%. Tỷ lệ tái phát sau 2 năm là 49%. Các bệnh nhân lui bệnh có chất
lượng sống tốt [30].
Hiện nay các bệnh nhân mới chẩn đoán LXMC M3 được áp dụng điều trị
ATRA phối hợp daunorubicin và Ara-C theo hướng dẫn của Bộ Y Tế [31].
Những trường hợp có rối loạn đông máu điều trị hỗ trợ gồm fraxiparin và
truyền bổ sung các chế phẩm máu với những trường hợp có rối loạn đông máu.


19

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 79 bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị tại

Trung tâm Huyết học và Truyền máu Bệnh viện Bạch Mai đáp ứng các tiêu
chuẩn sau:
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
- BN được chẩn đoán xác định Lơ xê mi M3 theo tiêu chuẩn FAB 1986 [32]
- Chưa được điều trị bằng hóa chất trước đó
- Với mục tiêu 2: BN không có chống chỉ định điều trị hóa chất: bệnh
tim mạch, các bệnh lý ác tính khác, suy gan, suy thận... BN và gia đình đồng
ý điều trị hóa chất.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- BN chẩn đoán LXMC M3 trên nền một bệnh máu khác: rối loạn sinh
tủy, hội chứng tăng sinh tủy mạn,... hoặc thứ phát sau một bệnh ung thư khác.
- Với mục tiêu 2: BN có có bệnh lý nội, ngoại khoa có chống chỉ định
điều trị hóa chất: bệnh tim mạch, các bệnh lý ác tính khác, suy gan, suy thận...
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm: Trung tâm Huyết học và Truyền máu Bệnh viện Bạch Mai.
- Thời gian: Từ năm 2014 đến tháng 7 năm 2018.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
- Máu ngoại vi: để phân tích huyết đồ, đông máu, một số chỉ số sinh hóa
tại thời điểm chẩn đoán.
- Dịch tủy xương: Phân tích hình thái học tế bào tủy xương, nuôi cấy và
phân tích NST, FISH, tách bạch cầu, RNA để phân tích các kiểu gen
PML/RARα, đột biến FLT3-ITD và NPM1-mutA.


20

- Hồ sơ bệnh án: thu thập các triệu chứng, biểu hiện và đáp ứng điều trị
của bệnh nhân.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả, theo dõi dọc, kết hợp hồi cứu và tiến cứu.
2.4.2. Cỡ mẫu
Lấy tất cả các bệnh nhân đáp ứng các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ
trong thời gian nghiên cứu.
2.4.3. Nội dung và biến số nghiên cứu
- Đặc điểm di truyền ở BN Lơ xê mi cấp M3,chia BN thành các nhóm
t(15;17) đơn thuần và nhóm t(15;17) phối hợp với đột biến NST khác, các kiểu
gen PML/RARα L-form và S-form, nhóm đột biến FLT3-ITD và NPM1-mutA.
- Một số đặc điểm lâm sàng và huyết học theo các nhóm bất thường di
truyền trên: các hội chứng lâm sàng, chỉ số tế bào máu ngoại vi, chỉ số đông
máu, tế bào tủy.
- Đáp ứng điều trị với ATRA ở các nhóm BN trên: tỷ lệ lui bệnh hoàn
toàn, tỷ lệ lui bệnh một phần, tỷ lệ tử vong sau đợt điều trị đầu tiên. Theo dõi
bệnh nhân từ khi chẩn đoán đến kết thúc thời gian nghiên cứu, so sánh tỷ lệ
sống thêm toàn bộ, thời gian sống thêm trung bình, tỷ lệ tái phát...theo các
nhóm bất thường di truyền.
2.4.4. Các tiêu chuẩn đánh giá
2.4.4.1.

Tiêu chuẩn chẩn đoán LXMC M3 theo FAB 1986 [32]
- Lâm sàng: Hội chứng xuất huyết nổi bật, hội chứng thiếu máu, hội

chứng nhiễm trùng, hội chứng thâm nhiễm.
- Xét nghiệm:
 Tế bào máu ngoại vi: Có thể gặp hay không gặp tế bào bất thường mang
đặc điểm tế bào tiền tủy bào. Thường thấy thiếu máu, số lượng tiểu cầu giảm.
 Tế bào tủy xương:


21

Số lượng tế bào bất thường trong tủy ≥ 30%.
Hình thái tế bào bất thường:
Thể M3 điển hình: Tế bào bất thường có hình dạng tiền tủy bào bất
thường, tăng sinh các hạt đặc hiệu bắt màu ưa azua, quan sát dễ dàng bằng
kính hiển vi quang học. Một số tế bào bất thường có chứa thể Auer trong
nguyên sinh chất.
Biến thể M3v: Tế bào bất thường có hình thái giống tiền mono: nhân
lớn, cuộn, chia thùy, ít thấy hạt nhân, nguyên sinh chất rộng, không thấy có
hạt, có thể chứa thể Auer.
Đặc điểm hóa học tế bào:
P.A.S: Âm tính hoặc dương tính lan tỏa
MPO: Dương tính mạnh
Sudan đen: Dương tính mạnh
Esterase không đặc hiệu: Dương tính mạnh
Esterase không đặc hiệu có chất ức chế NaF: Dương tính mạnh.
2.4.4.2.

Tiêu chuẩn phân loại nhóm nguy cơ
Phân loại nhóm nguy cơ theo tiêu chuẩn Sanz’s Score [33]:
Nhóm nguy cơ thấp: BC < 10 G/l, TC > 40 G/l.
Nhóm nguy cơ trung bình: BC < 10 G/l, TC ≤ 40 G/l.
Nhóm nguy cơ cao: BC ≥ 10 G/l.

2.4.4.3.

Tiêu chuẩn đánh giá DIC
- Sử dụng tiêu chuẩn chẩn đoán đông máu nội mạch rải rác của ISTH

2001 sửa đổi [34]:

Nếu tổng≥5 điểm: DIC rõ ràng
Tổng <5 điểm: theo dõi động học các chỉ số dưới đây.
Chỉ số

Giá trị

Điểm


22

cao bình thường (dấu ấn

>100 G/l
50 - 100 G/l
<50 G/l
<2 lần
2 – 5 lần

0
1
2
0
2

tăng tiêu fibrin)

>5 lần

3

Thời gian prothrombin

≤3 giây hoặc >70%
>3 và ≤6 giây hoặc ≥40% và ≤70%
> 6 giây hoặc <40%
≥ 1 g/l
< 1 g/l

0
1
2
0
1

Số lượng tiểu cầu
D-Dimer so với giới hạn

hoặc tỉ lệ prothrombin
Fibrinogen
2.4.4.4.

Tiêu chuẩn phân tích NST theo ISCN (1981) [35]
- Tiêu bản sau khi nhuộm Giêmsa và băng G, số lượng và cấu trúc của

các cặp nhiễm sắc thể sẽ được khảo sát trên kính hiển vi AXO 100 (Zeiss) ở
độ phóng đại 1.000 lần và được phân tích bằng phần mềm Ikaros.
- Một số quy tắc trong khi phân tích:
 Thừa nhiễm sắc thể: có từ 2 cụm kỳ giữa trở lên thừa cùng 1 nhiễm sắc thể.
 Thiếu nhiễm sắc thể: có từ 3 cụm kỳ giữa trở lên thiếu cùng 1 nhiễm

sắc thể.
 Bất thường cấu trúc: có từ 2 cụm trở lên mang cùng 1 bất thường .
2.4.4.5.

Tiêu chuẩn đánh giá hiệu quả điều trị
Đánh giá hiệu quả điều trị theo NCCN 2013 [36].
- Lui bệnh hoàn toàn: Lâm sàng BN ổn định, số lượng BC trung tính

ngoại vi> 1,5 G/l, số lượng TC > 100 G/l, không còn tế bào bất thường ở máu
ngoại vi. Tế bào bất thường trong tủy xương dưới 5%, trên nền tủy sinh máu
bình tường. Không tái phát trong vòng 4 tuần. Không có bằng chứng tổn
thương ngoài tủy khác.
- Lui bệnh một phần: Giống các tiêu chuẩn của lui bệnh hoàn toàn
nhưng TC máu ngoại vi dưới 100 G/l và /hoặc số lượng bạch cầu đa nhân
trung tính dưới 1 G/l.
- Không lui bệnh: Khi không đáp ứng được các tiêu chuẩn trên.


23

- Tiêu chuẩn đánh giá bệnh tái phát: Tế bào bất thường trong tủy xương
≥ 20%. PCR phát hiện gen PML/RARα dương tính trở lại. Triệu chứng lâm
sàng xuất hiện rầm rộ trở lại.
2.4.5. Các kỹ thuật và phác đồ sử dụng trong nghiên cứu
2.4.5.1.

Nuôi cấy, phân tích NST và kỹ thuật FISH
 Nuôi cấy bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thời gian ngắn trong vòng

24h

a, Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
Cho 44ml môi trường nuôi cấy vào ống falcol 50ml, cho thêm 5ml huyết
thanh bào thai bê và 500µl kháng sinh, sau đó trộn đều.
b, Đếm số lượng tế bào
- Ly tâm 1.000 vòng/phút trong 8 phút lấy lớp buffy coat cho vào 3ml
môi trường trộn đều và đếm số lượng tế bào tủy trong hỗn dịch.
- Tính toán số lượng tế bào cho vào mỗi chai nuôi cấy sao cho số lượng
tế bào đạt từ 1- 4x10ˆ6 tế bào/ml môi trường nuôi cấy
c, Chuẩn bị chai nuôi cấy
- Mỗi chai nuôi cấy ghi thông tin người bệnh, ngày cấy, ngày thu hoạch.
- Trong mỗi chai nuôi cấy cho 10ml môi trường nuôi cấy.
d, Nuôi cấy tế bào
Nhỏ lượng tế bào như tính toán vào chai nuôi cấy đã chuẩn bị. Lắc nhẹ
cho mẫu tan vào môi trường, nới lỏng nắp, đặt nằm trong tủ ấm 37°C, 5%
CO2 trong vòng 24 giờ.
 Thu hoạch
a, Nhỏ colcemide: Sau 24 giờ cho vào mỗi chai nuôi cấy 50 μl dung dịch
colcemide 0.010/00 (10μg/ml), đặt lại trong tủ ấm trong 15 phút.
b, Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ:
- Bật tủ ấm 37ºC, làm ấm dung dịch KCL 0,075M (Số lượng đủ
8ml/mẫu).


24

- Chuẩn bị dung dịch carnoy theo tỷ lệ 3 methanol : 1 acid acetic.
- Chuẩn bị ống falcon 15ml, ống nghiệm thủy tinh, pipet thủy tinh theo
số lượng ống cấy.
c, Kĩ thuật
- Chuyển toàn bộ huyền dịch ở chai nuôi cấy vào ống falcon 15ml, ly

tâm ở máy ly tâm ngang 1.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Sau khi ly tâm hút bỏ phần dịch nổi ở trên, để lại cặn tế bào (chỉ hút
đến cách mặt trên cặn tế bào khoảng 5 mm).
- Cho thêm 8ml dung dịch nhược trương đã để ấm 37ºC vào ống ly tâm,
trộn nhẹ một vài lần rồi ủ ở bể ấm 37ºC trong 20 phút.
- Sau khi ủ 18 phút cho thêm vào mỗi ống 0.5-1 ml dung dịch carnoy,
trộn nhẹ để 5-10 phút.
- Lấy ống ra ly tâm lấy cặn, hút bỏ dịch nổi phía trên. Cho thêm vào mỗi
ống 10ml dung dịch carnoy trộn đều để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- Lặp lại bước 7 đến khi cặn tế bào trắng. Tái huyền dịch bằng carnoy.
Nhỏ tiêu bản.
- Các lam kính sạch rửa sạch ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn tuyệt
đối, chuyển sang ngâm nước cất để lên giá lam cho khô.
- Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau đó lấy ra để
nghiêng 20 – 30 độ trên giấy thấm.
 Phân tích NST bằng kỹ thyật nhuộm băng G
- Nhỏ một giọt huyền dịch vừa pha lên lam kính. Chú ý khi nhỏ tiêu bản
để đầu pipet cao hơn mặt lam kính từ 10-20 cm. Để tiêu bản khô tự nhiên
trước khi nhuộm.
- Nhuộm Giêmsa
- Nhuộm băng G
 Kỹ thuật FISH phát hiện t(15;17)


25

Ngày 1:
+ Kiểm tra, chọn lam sạch, nhỏ lên mặt lam một giọt huyền dịch.
+ Ghi tên tuổi và mã số lam.
+ Đánh dấu vùng tế bào có mật độ phù hợp bằng bút kim cương.

+ Chuẩn bị máy lai FISH: Bật máy trước 3 phút, xịt nước và thanh giữ
ẩm, cài đặt máy ở chế độ 75 độ C/ 5phút và 37 độ C lai trong thời gian 20 giờ.
+ Chuyển Probe và hóa chất FISH (sản phẩm của hãng Vysis) ra khỏi tủ
-20 độ C, rã đông ở nhiệt độ phòng. Vortex và spin nhẹ.
+ Mix Probe và hóa chất FISH theo tỷ lệ: 1 μl Probe + 7 μl LSI Buffer +
2 μl nước cất/ 1 lam. Vortex và spin nhẹ.
+ Nhỏ 10 μl dung dịch Probe vào vùng đã đánh dấu, gắn lamen 22*22 mm.
+ Dán kín xung quanh vùng lai bằng keo dán Cementt Rubber.
+ Đặt lam vào máy lai FISH, khởi động máy.
Ngày 2:
+ Chuẩn bị bể điều nhiệt ở 75 độ C.
+ Đặt cóng đựng dung dịch rửa 1 (0.3% NP40) trước 30 phút.
+ Tháo bỏ Lamen.
+ Nhúng lam và dung dịch rửa 1 trong 2 phút, lắc đều tay.
+ Chuyển lam qua dung dịch rửa 2 (0.1% NP40) trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Thấm nước ở mặt dưới và các cạnh của lam.
+ Để khô trong 3-10 phút.
+ Nhỏ 10 μl DAPI lên vùng đánh dấu, gắn lamen 22*22 mm.
+ Để tủ -20 độ C 1 vài tiếng trước khi phân tích.
Lưu ý: Các thao tác từ bước mix Probe và Buffer trở đi phải đảm bảo
được thực hiện tránh ánh sáng.
Phân tích kết quả:
+ Phân tích tiêu bản thu được dưới KHV huỳnh quang, chúng ta sẽ quan
sát thấy 3 màu: Màu xanh da trời đậm là màu nhân tế bào do nhuộm bằng