Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nanoemulgel tetrahydrocurcumin

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ KIM THOA

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN
CƠ SỞ CHO NANOEMULGEL
TETRAHYDROCURCUMIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ KIM THOA
MÃ SINH VIÊN: 1401587

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN
CƠ SỞ CHO NANOEMULGEL
TETRAHYDROCURCUMIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1.TS. Lê Thị Kim Vân
2.TS. Lê Đình Chi
Nơi thực hiện:
1.Viện Dược liệu
2.Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho
Nanoemulgel Tetrahydrocurcumin”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực của bản
thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía trường Đại học Dược Hà Nội, Viện
Dược liệu, thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Viện Dược liệu đã tạo rất
nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Lê Đình Chi – GV Bộ môn Hóa phân tích – Độc
chất đã đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Lê Thị Kim Vân – Khoa Bào chế Chế
biến – Viện Dược liệu, người đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược
liệu đã hỗ trợ em trong quá trình nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là
những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong quá
trình học tập, nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2019
Phạm Thị Kim Thoa


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về tetrahydrocurcumin .................................................................... 2
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất .................................................................... 2
1.1.2. Tác dụng dược lý .......................................................................................... 3
1.1.3. Ứng dụng ...................................................................................................... 5
1.2. Nanoemulgel ........................................................................................................ 6
1.2.1. Khái niệm ..................................................................................................... 6
1.2.2. Các tiêu chí đánh giá một nanoemulgel ...................................................... 6
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 12
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu.............................................................. 12
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 12
2.1.2. Hoá chất, chất chuẩn.................................................................................. 12
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................ 13
2.2. Nội dung nghiên cứu: ........................................................................................ 13
2.2.1. Định tính ..................................................................................................... 13
2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm
.............................................................................................................................. 13
2.2.3. Các tiêu chí khác ........................................................................................ 13
2.2.4. Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng để định lượng
tetrahydrocurcumin của chế phẩm trong 3 lô sản xuất thử nghiệm ................. 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 14


2.3.1. Định tính ..................................................................................................... 14
2.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm
.............................................................................................................................. 14
2.3.3. Các tiêu chí khác ........................................................................................ 18
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .................................... 20

3.1. Định tính............................................................................................................ 20
3.2. Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin bằng HPLC ......... 21
3.2.1. Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện sắc ký ..................................................... 21
3.2.2. Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình xử lý mẫu .............................................. 24
3.2.3. Thẩm định phương pháp ........................................................................... 25
3.2.4. Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng để định lượng
tetrahydrocurcumin trong chế phẩm của 3 lô sản phẩm ................................... 31
3.3. Các tiêu chí khác ............................................................................................... 32
3.3.1. Cảm quan ................................................................................................... 32
3.3.2. pH ............................................................................................................... 32
3.3.3. Độ đồng nhất .............................................................................................. 33
3.3.4. Độ nhớt ....................................................................................................... 33
3.3.5. Kích thước giọt và phân bố kích thước giọt .............................................. 34
3.4. Tiêu chuẩn cơ sở dự kiến .................................................................................. 35
3.5. Bàn luận ............................................................................................................ 36
3.5.1. Về phương pháp xử lý mẫu ....................................................................... 36
3.5.2. Về chương trình sắc ký và thẩm định phương pháp ................................ 36
3.5.3. Về tiêu chuẩn cơ sở dự kiến ....................................................................... 37
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................... 38


DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

ACN

Acetonitrin

AOAC

DAD

Association of Official Analytical
Chemists
Diod Array detector

DĐVN V
Dimethylformamid

DMSO

Dimethyl sulfoxid

HLB

Hydrophilic lipophilic balance

HPLCMS/MS

Hiệp hội các nhà hoá học phân tích

Detector mảng diod
Dược điển Việt Nam V

DMF

HPLC

Tên tiếng Việt

High performance liquid
chromatography
High performance liquid
chromatography- tandem mass
spectrometry

Chỉ số cân bằng dầu nước

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép
song song khối phổ

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

PDI

Polydispersity index

Chỉ số đa phân tán

RS

Resolution

Độ phân giải

RSD (%)

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

Tf

Tailing factor

Hệ số kéo đuôi


THC

Tetrahydrocurcumin

tR

Retention time

tt:tt

UHPLCMS/MS

Thời gian lưu
thể tích : thể tích

Ultra high performance liquid
chromatography- tandem mass
spectrometry

Sắc ký lỏng hiệu năng cực cao
ghép song song khối phổ


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ ACN trong pha động ............................................. 22
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát lựa chọn acid thêm vào pha động (A- acid formic 0,1%,
B- acid acetic 2%, C- acid phosphoric 0,1%) ............................................................ 23
Bảng 3.3. Các thông số đánh giá điều kiện sắc ký THC........................................... 24
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thể tích dung môi chiết mẫu ........................................ 24
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống .................................................... 25
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ tuyến tính ................................................................ 27
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ chụm........................................................................ 28
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ thu hồi ..................................................................... 30
Bảng 3.9. Kết quả định lượng THC .......................................................................... 31
Bảng 3.10. Kết quả đo pH ......................................................................................... 32
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ đồng nhất .............................................................. 33
Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ nhớt ....................................................................... 33
Bảng 3.13. Kết quả kích thước giọt và phân bố kích thước giọt ............................... 34

Bảng 3.14. Tiêu chuẩn cơ sở dự kiến ....................................................................... 35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của tetrahydrocurcumin ............................................... 2
Hình 1.2. Độ ổn định của THC so với curcumin và trong đệm pH khác nhau [14] .. 3
Hình 1.3. Nguyên lý hoạt động của thiết bị Nano partica SZ-100 series sử dụng
phương pháp tán xạ ánh sáng động ......................................................................... 10
Hình 1.4. Lực trượt tạo nên một gradient tốc độ trượt giữa các mặt song song của
chất lỏng [7] .............................................................................................................. 11
Hình 2.1. Chế phầm Hemulgel White (Nanoemulgel chứa THC)............................ 12
Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn ...................................................... 20
Hình 3.2. Phổ UV-Vis của pic THC trong mẫu chuẩn và thử.................................. 20
Hình 3.3. Phổ UV-Vis của pic THC thu được khi phân tích dung dịch chuẩn THC
.................................................................................................................................. 21
Hình 3.4. Sắc ký đồ đánh giá độ phù hợp hệ thống.................................................. 25
Hình 3.5. Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc ................................................................ 26
Hình 3.6. Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ ................................................................. 27
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mỗi quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic .................... 28
Hình 3.8. Sắc ký đồ đánh giá độ thu hồi của tetrahydrocurcumin ........................... 30
Hình 3.9. Cảm quan của Nanoemulgel Tetrahydrocurcumin .................................. 32
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện kích thước và phân bố kích thước giọt ........................ 34


ĐẶT VẤN ĐỀ
Curcumin nguồn gốc từ nghệ vàng (Curcuma longa L.), họ Gừng (Zingiberaceae)
có nhiều tác dụng như chống viêm, chống oxy hoá, chống virus, và chống ung thư.
Curcumin được sử dụng để ngừa mụn, liền sẹo trong mỹ phẩm. Tuy nhiên, các sản phẩm
chứa curcumin có nhược điểm về thẩm mỹ như gây dính trên da, vàng da. Do vậy, các
chất bán tổng hợp từ curcumin mà có tác dụng tương tự curcumin được tập trung nghiên

cứu để khắc phục nhược điểm trên, đáng chú ý nhất là tetrahydrocurcumin.
Tetrahydrocurcumin hay curcumin trắng là sản phẩm bán tổng hợp dựa trên cơ sở của
phản ứng khử hoá curcumin bằng dòng khí hydro ở điều kiện thích hợp với sự có mặt
của chất xúc tác như PtO2, Pd/C. Tetrahydrocurcumin có khả năng dọn dẹp các gốc tự
do trên bề mặt da và ức chế sự hình thành sắc tố da melanin. Do đó, mỹ phẩm chứa
tetrahydrocurcumin ngày càng được ưa chuộng làm sản phẩm dưỡng trắng da, chống
lão hoá ở dạng bào chế dùng ngoài da như gel, kem ở trong và ngoài nước. Tại Viện
Dược liệu, trong đề tài cấp cơ sở cũng đã hoàn thành bào chế sản phẩm nanoemulgel
chứa tetrahydrocurcumin. Mặc dù vậy, trong Dược điển chưa có chuyên luận nào quy
định tiêu chuẩn của tetrahydrocurcumin hay chế phẩm chứa tetrahydrocurcumin. Vì vậy,
chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nanoemulgel
tetrahydrocurcumin” với hai mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin bằng HPLCDAD.
2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dự kiến cho sản phẩm nghiên cứu.

1


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tetrahydrocurcumin
THC là một diarylheptanoid có thể được phân lập trực tiếp từ nghệ vàng
(Curcuma longa L.) bằng phương pháp sắc ký cột silica gel hoặc được bán tổng hợp từ
curcumin bằng phản ứng khử hóa với các tác nhân khử hóa và các chất xúc tác khác
nhau [22]. Trong cơ thể, THC cùng với hexahydrocurcumin và octahydrocurcumin là
những sản phẩm chuyển hóa của curcumin ở đường tiêu hóa [9].
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của tetrahydrocurcumin
- Tên khoa học: 1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)heptan-3,5-dion.
- Tên khác: Tetrahydrodiferuloylmethan.

- Công thức phân tử: C21H24O6 (công thức cấu tạo xem hình 1.1).
- Khối lương phân tử: 372,2 g/mol.
Tính chất vật lý:
Bột kết tinh màu trắng, không mùi, không vị.
Độ tan:
- Tan trong aceton, ethanol, DMSO, DMF. Tan nhẹ trong nước nóng.
- THC có độ tan cao trong PEG 400 (207,93 ± 3,32 mg/ml) có thể là do THC tạo được
dạng liên kết hydro với nhóm polyethylen oxyd của PEG 400.
- Với các chất diện hoạt thân nước có HLB cao từ 13-15 như Cremophor RH40 (189,95
± 4,42), Cremophor EL (159,61 ± 2,19), Labrasol (177,08 ± 1,94) (có chứa các nhóm
polyethylen oxyd) cũng có khả năng hòa tan cao THC.
- Capryol 90 và Labrafac PG đều có khả năng hòa tan cao THC (với Capryol 90 là
40,78 ± 0,91 mg/ml và với Labrafac PG là 13,85 ± 0,20 mg/ml [28]).
Nhiệt độ nóng chảy: 95-97ºC.
2


Dung dịch trong nước hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 272 nm.
Độ ổn định:
THC rất ổn định trong dung dịch đệm phosphat 0,1M ở các giá trị pH khác nhau.
Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng cho thấy THC ổn định hơn curcumin trong
dung dịch đệm phosphat pH = 7,2 (ở 37ºC) cũng như trong huyết tương (xem hình 1.2)
[14].

Hình 1.2. Độ ổn định của THC so với curcumin và trong đệm pH khác nhau [14]
1.1.2. Tác dụng dược lý
Tác dụng chống viêm
Curcumin và 4 dẫn xuất tổng hợp được nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm
trong mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin và mô hình gây viêm u hạt bằng dầu
hạt bông trên chuột cống. Hoạt lực chống viêm của curcumin, các dẫn xuất của curcumin

và phenylbutazon được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau:
Natri curcumin> tetrahydrocurcumin> curcumin > phenylbutazon> triethylcurcumin.
Khi so sánh curcumin và các dẫn xuất của nó trong các mô hình viêm cấp và bán
cấp thì kết quả cho thấy các dẫn xuất của curcumin có tác dụng chống viêm mạnh hơn
curcumin [14].

3


THC ức chế Lipoxygenase (LOX) (enzyme liên quan đến tình trạng viêm) bằng
cách ngăn chặn việc kích hoạt LOX-1. THC cho thấy ưu điểm hơn về độ hoà tan và độ
ổn định so với curcumin [29].
THC cũng ức chế tốt cyclooxygenase-2 và phospholipase A2 nên tác dụng chống
viêm rất tốt [10].
Tác dụng chống oxy hoá
Các nghiên cứu cả trên in vivo và in vitro đều chỉ ra rằng THC có khả năng chống
oxy hóa mạnh hơn curcumin, các curcuminoid khác [19, 24].
Poorichaya S. và cộng sự đã nghiên cứu so sánh hoạt tính chống oxy hóa của
curcumin cùng các dẫn xuất của nó đối với gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) và chỉ ra rằng THC thể hiện khả năng dọn gốc tự do DPPH cao nhất với
giá trị IC50 = 18,7 µM. Hoạt tính này giảm dần theo thứ tự: THC > HHC = OHC >
curcumin > DMC > BDMC. Nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng THC có khả năng
ức chế mạnh nhất đối với AAPH (2,2-azobis(2-amidinopropan)dihydroclorid) - một tác
nhân gây ra quá trình peroxy hóa lipid. Lý giải cho những điều này, các tác giả cho rằng
chính sự có mặt của nhóm methoxyphenyl và đặc biệt là sự hydro hóa hệ nối đôi liên
hợp trong mạch carbon trung tâm đã làm tăng hoạt tính của curcumin lên một cách đáng
kể [30].
Một nghiên cứu in vitro so sánh tác dụng chống oxy hóa của tetrahydrocurcumin
và các curcuminoid khác đã được thực hiện trên tế bào hồng cầu thỏ và gan chuột, sử
dụng acid linoleic là chất nền trong hệ ethanol/nước, được phân tích bằng phương pháp
thiocyanat và phương pháp TBA. Kết quả cho thấy rằng THC có hoạt tính chống oxy

hóa mạnh nhất trong tất cả các curcuminoid [14, 19].
Tác dụng ức chế của curcumin và tetrahydrocurcumin đối với quá trình peroxy
hóa lipid trên màng hồng cầu gây bởi tert-butylhydroperoxid đã được nghiên cứu gần
đây. Kết quả đã chứng minh rằng THC cho thấy hiệu quả tốt hơn curcumin. Các tác giả
kết luận rằng, THC có khả năng dọn các gốc tự do như tert-butoxyl và peroxyl một cách
triệt để [14].
Giải thích về cơ chế tác dụng và đặc tính chống oxy hóa mạnh hơn của THC so
với curcumin, các tác giả cho rằng THC là chất chuyển hóa chính của curcumin ở đường
tiêu hóa. Họ cho rằng THC đóng vai trò quan trọng trong cơ chế chống oxy hóa của

4


curcumin trong cơ thể, khi mà curcumin được chuyển hóa thành THC. Nhóm phenolic
đóng vai trò dọn các gốc tự do trong giai đoạn đầu của quá trình chống oxy hóa bằng
THC. Mặt khác, nhóm β-diketon cũng đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống
oxy hóa của THC, bởi vì sự phân cắt liên kết C–C trong khung β-diketon được quan sát
thấy trong quá trình chống oxy hóa. Như vậy, nhóm β-diketon đóng vai trò dọn các gốc
tự do trong giai đoạn sau của quá trình chống oxy hóa [14, 19].
Tác dụng trên tế bào ung thư
Nghiên cứu chứng minh rằng THC có tác dụng mạnh hơn curcumin trong việc
ức chế sự phát triển tụ điểm ẩn khác thường ACF (aberrant crypt foci) và sự tăng nhanh
tế bào, và tác dụng tương tự curcumin trong việc chống lại tác nhân gây ung thư trong
cơ thể [14].
Nhiều công trình nghiên cứu cũng đã chứng minh THC có khả năng ức chế một
số tác nhân gây ra nhiều bệnh ung thư như: ung thư da, ung thư máu, ung thư ruột kết,
ung thư đại tràng… [11, 34].
Nghiên cứu của Ching-Shu Lai và cộng sự đã chứng minh THC có tác dụng tốt
hơn curcumin trong việc ức chế azoxymethan (AOM) – một tác nhân gây ung thư đại
tràng ở chuột [11].

1.1.3. Ứng dụng
Trong mỹ phẩm, với vai trò chống oxy hóa đã được khẳng định, THC giúp bảo
vệ các tế bào sừng của da người chống lại các tổn thương do hypoxanthin/xanthin
oxidase trong các nghiên cứu in vivo. Bên cạnh đó, THC được cho rằng có khả năng dọn
dẹp các gốc tự do trên bề mặt da sinh ra do tiếp xúc với tia tử ngoại, hóa chất và các yếu
tố môi trường, giúp làm chậm quá trình lão hóa da. Đồng thời, với khả năng ức chế
tyrosinase, THC cũng giúp làm chậm quá trình tạo sắc tố da. Vì những lý do này, THC
có thể sử dụng làm thành phần của các chế phẩm chống lão hóa và dùng ngoài để duy
trì sức khỏe và sự mịn màng của da [14].
Trong các ứng dụng điều trị khác, THC còn được sử dụng trong điều trị bệnh
bạch biến, tăng cường hệ chống oxy hoá của thận và bảo vệ tổn thương do oxy hoá khi
giúp giảm đáng kể nồng độ urê huyết thanh và creatinine nên giảm được độc tính trên
thận khi sử dụng đường uống [6, 21].

5


Các thử nghiệm trên chuột cho thấy hiệu quả đối với các triệu chứng mãn kinh
và viêm khớp, cũng như glucose huyết, insulin huyết tương và men gan ở bệnh đái tháo
đường. Kỳ vọng có thể can thiệp được các bệnh lý này trên người [20, 23].
1.2. Nanoemulgel
1.2.1. Khái niệm
Nanoemulgel là sự kết hợp nanoemulsion vào trong mạng lưới hydrogel. Hoạt
chất được hòa tan trong pha dầu, sau đó được phân tán trong nước tạo ra nanoemulsion
với sự hỗ trợ của các chất diện hoạt và đồng diện hoạt, đạt kích thước hạt dưới 250 nm.
Nhũ tương sẽ được phối hợp với tác nhân tạo gel, tạo thành nanoemulsion gel có độ
nhớt lớn, thể chất ổn định hơn, giúp ức chế kết tinh và tăng độ ổn định của dạng nano
[25, 31].
Dạng bào chế này hiện đang được chú ý và nhiều loại thuốc dùng qua da, niêm
mạc đang được bào chế dưới dạng này.

1.2.2. Các tiêu chí đánh giá một nanoemulgel
1.2.2.1. Định lượng
Có nhiều phương pháp để định lượng hoạt chất có trong chế phẩm, sau đây xin
chỉ đề cập đến một số phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin.
Nghiên cứu trong nước
Năm 2017, trong bài nghiên cứu “Đánh giá sinh khả dụng đường uống của hệ
tiểu phân nano curcumin trên chuột thí nghiệm” của Dương Hồng Ánh, đã tiến hành
định lượng đồng thời curcumin và tetrahydrocurcumin trong huyết tương bằng phương
pháp LC-MS/MS với điều kiện sắc ký như sau: cột sắc ký Kinetex C18, 100 × 2,1 mm,
1,7 µm. Nhiệt độ cột 40°C. Pha động: ACN- dung dịch acid formic 0,05% (60:40). Tốc
độ dòng 0,3 ml/phút. Thể tích mẫu tiêm 10 µl. Giới hạn định lượng dưới LLOQ của
phương pháp LC-MS/MS đối với tetrahydrocurcumin là 0,5 ng/ml [2].
Năm 2012, trong “Nghiên cứu bào chế thuốc dùng qua da chứa
tetrahydrocurcumin”, Nguyễn Thị Những đã tiến hành định lượng THC trong chế phẩm
kem, gel của mình bằng phương pháp HPLC với điều kiện như sau: Cột SB-C18 4,6 ×
150 mm, hạt nhồi 5 µm. Pha động: ACN- dung dịch acid acetic 2% (40:60). Pha động
được lọc qua màng 0,45 µm, siêu âm 30 phút. Tốc độ dòng 1 ml/phút. Detector UV phát
hiện ở 272 nm. Thể tích tiêm mẫu 20 µl [4].
6


Nghiên cứu ngoài nước
Kỹ
thuật sử
dụng

Đối tượng

Điều kiện phân tích

phân tích

Nguồn
tài liệu

Dung môi pha mẫu: ACN.
UHPLCMS/MS

THC trong

Hệ thống sắc ký: Shimadzu Nexera UHPLC kết

huyết thanh

hợp với Shimadzu LCMS 8040.

và nước
tiểu chuột

[18]

Điều kiện sắc ký: cột Waters Acquity UPLC
BEH C18, pha động: ACN- acid formic 0,1%
(55:45), tốc độ dòng 0,4 ml/phút.

Hạt alginate Dung môi pha mẫu: Methanol.
chứa tự vi
HPLC

nhũ tương

THC.

Điều kiện sắc ký: pha động: ACN- acid acetic
2% (70:30), thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ

[32]

dòng 1 mL/phút, bước sóng 282 nm. Thời gian
sắc ký 8 phút, tR= 6,9 phút.
Dung môi pha mẫu: Methanol.
Phương pháp xử lí mẫu: voltex trong 5 phút,
sau đó li tâm 1000 vòng/phút trong 20 phút.

Nano nhũ
HPLC

Điều kiện sắc ký: Cột phân tích pha đảo

tương THC. Qualisil BDS (5 µm, 4.6 mm × 250 mm), pha
động Acetonitril và methanol theo tỷ lệ 53:47,
với axid acetic 0,26%, tốc độ dòng 0,6 ml/phút,
thể tích tiêm 20 µl. Bước sóng phát hiện 280
nm và nhiệt độ duy trì ở 25˚C ± 0,5˚C, tR =5,4
phút.

7

[17]

Điều kiện sắc ký: cột C18 (Phenomenex Luna
HPLCMS/MS

Huyết

250 mm × 4.6 mm), ACN- H2O (70:30) với

tương

acid acetic 0,005% (0,05 mL/L), thể tích tiêm

chuột.

10 uL, thời gian chạy 5 phút, tốc độ dòng 0,2

[13]

mL/phút.

1.2.2.2. Các tiêu chí khác
- Cảm quan
Các công thức nanoemulgel đều phải kiểm tra trực quan về màu sắc, độ đồng
nhất, sự tách lớp.
- pH
pH tự nhiên của da
Bề mặt da có độ pH acid. Độ pH bề mặt da cũng chính là độ pH của lớp sừng rất
quan trọng đối với da, kiểm soát hệ vi sinh vật trên da cũng như cũng như hỗ trợ các quá
trình sinh lý quan trọng như sự hình thành một cấu trúc tối ưu của hàng rào lipid và cân
bằng nội môi [12].
Khoảng pH này khá rộng từ 4-7 tuỳ thuộc vào vùng da, tuổi tác, giới tính, bã

nhờn và độ ẩm trên da, ngoài ra còn các yếu tố bên ngoài như chất tẩy rửa, mỹ phẩm, xà
phòng… [12, 26]. Tuy nhiên đã có chứng minh rằng, pH của da khoẻ mạnh sẽ nằm trong
khoảng 4,1-5,8 (trừ ở bộ phận sinh dục), trung bình ở 4,8 [16].
Do vậy, thông thường các sản phẩm mỹ phẩm nên kiểm soát pH nằm trong
khoảng 4,1-5,8 để phù hợp cho sử dụng ngoài da và không gây kích ứng.
Đo pH với mẫu có độ nhớt cao
Gel có đặc tính là nhớt, đặc quánh. Hơn nữa, nanoemulgel lại là nano nhũ tương
được phân tán vào gel, kích thước giọt rất nhỏ. Nếu đo pH trực tiếp, các mẫu này làm
tắc các điểm trên đầu điện cực dẫn đến chậm phản ứng điện cực, gây sai số đo pH. Độ
dày của mẫu có thể cũng gây ra vấn đề chuyển mẫu - sau khi điện cực pH được lấy ra
khỏi mẫu, một số mẫu có thể bám vào điện cực[27].

8


Do vậy, để đo các mẫu có độ nhớt cao nói chung, sẽ dung loại đầu điện cực dành
riêng để đo mẫu có độ nhớt (nhũ tương, gel, kem…). Các điện cực này thường là điện
cực mở hoặc là các mối nối mở chống tắc nghẽn và điện cực thì dễ rửa sạch như điện
cực InLab® Viscous (pH meter TOLEDO), hoặc các điện cực ROSS Sure-Flow,
Ag/AgCl Sure-Flow and AquaPro (Thermo Scientific).
Tuy nhiên, với điều kiện thiết bị tại phòng thí nghiệm, không có đầu điện cực để
đo trực tiếp. Vấn đề đặt ra là phải đo được pH gần chính xác nhất và không ảnh hưởng
tới đầu điện cực. Qua tham khảo tài liệu, gel sẽ được pha loãng với nước trước khi đo
pH[3, 4].
- Độ đồng nhất
Trong phụ lục của thuốc dùng ngoài, kem, gel thì độ đồng nhất là một chỉ tiêu
chung trong DĐVN V. Phần tiến hành sẽ được trình bày cụ thể trong phần phương pháp
nghiên cứu.
- Đánh giá kích thước giọt và phân bố kích thước giọt
Trong các phương pháp đánh giá kích thước giọt và phân bố kích thước giọt,

thường sử dụng 3 phương pháp sau: Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission
electron microsopy –TEM), kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy –
SEM), phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering – DLS). Trong 3
kỹ thuật thì phương pháp tán xạ ánh sáng động là kỹ thuật hay được sử dụng và phù hợp
nhất để đo kích thước và phân bố kích thước của giọt dầu trong nano nhũ tương hay gel
chứa nano nhũ tương vì phương pháp đơn giản, độ nhạy và độ chọn lọc cao, rút ngắn
được thời gian đo lường…
DLS là một kỹ thuật trong vật lý dựa vào sự tương tác của chùm sáng laser với
các hạt và phân tích các biến động cường độ ánh sáng để đo chuyển động Brown. Các
hạt cầu ở trong môi trường lỏng như: nước, ethanol… chuyển động hỗn độn và va chạm
với nhau theo chuyển động Brown. Khi chiếu chùm sáng đơn sắc như laser vào dung
dịch, các hạt cầu đang chuyển động Brown sẽ gây ra dịch chuyển Doppler khi ánh sáng
chạm tới hạt, làm thay đổi bước sóng của ánh sáng tới. Sự thay đổi này có liên quan tới
kích thước hạt. Ta có thể tính toán được sự phân bố kích thước hạt bằng cách đưa ra mô
tả chuyển động của các hạt này trong môi trường, đo được hệ số khuếch tán dựa vào

9


hàm tương quan. Từ kết quả đo hệ số khuếch tán, sử dụng phương trình Stockes-Einstein
tính được kích thước hạt và phân bố kích thước hạt [5].
Phương trình Stockes-Einstein:

Dh=
Trong đó:
Dh: Đường kính thuỷ động.
Dm: hệ số khuếch tán.
k: hằng số Boltzman.
T: nhiệt độ.
η: độ nhớt của môi trường phân tán.

Phương pháp này có thể sử dụng để đo kích thước hạt đặc biệt là trong khoảng
2-500 nm. Thường sử để mô tả các đặc điểm của hạt nano như tính toán kích thước hạt,
phân bố kích thước hạt [33].
Với thiết bị Nano partica SZ-100 series: một nguồn sáng được chiếu qua cốc đo,
và ánh sáng tán xạ được thu nhận tại hai góc 90° hoặc 173° (xem hình 1.3). Hệ thống
sẽ tự động lựa chọn góc tán xạ tối ưu và vị trí của cốc đo phụ thuộc vào nồng độ mẫu và
cường độ ánh sáng.

Hình 1.3. Nguyên lý hoạt động của thiết bị Nano partica SZ-100 series sử dụng
phương pháp tán xạ ánh sáng động

10


- Độ nhớt
Độ nhớt phản ánh khả năng lưu lại trên da của chế phẩm. Các thuốc dùng cho da
và niêm mạc cần có độ nhớt thích hợp giúp chế phẩm có khả năng bám dính tốt từ đó
duy trì tác dụng tốt hơn. Đồng thời độ nhớt cũng ảnh hưởng đến quá trình giải phóng
thuốc cũng như mức độ bao phủ bề mặt của chế phẩm. Vì vậy, đánh giá độ nhớt là một
đánh giá thường quy đối với các chế phẩm bôi ngoài da và niêm mạc.
Độ nhớt (η) của một chất lỏng được mô tả một cách đơn giản chính là sự kháng
lại sự chảy hoặc chuyển động. Newton là người đầu tiên nghiên cứu định lượng sự chảy
của chất lỏng và nêu ra định luật Newton [15].
Định luật Newton về sự chảy [15]: Khối chất lỏng được coi gồm những lớp phân
tử xếp song song. Lớp đáy được xem như cố định. Nếu lớp trên cùng di chuyển với một
tốc độ hằng định thì mỗi lớp bên dưới sẽ di chuyển với một tốc độ tỷ lệ với khoảng cách
của nó so với lớp đáy. Biến thiên tốc độ dν giữa hai lớp cách nhau một khoảng dr gọi là
gradient tốc độ (dν/dr hoặc δ/h) hay tốc độ trượt (γ). Lực tác dụng trên một đơn vị diện
tích (F/A) gọi là lực trượt hay ứng suất trượt (τ hoặc σ). Độ nhớt tỷ lệ thuận với ứng suất
trượt và tỷ lệ nghịch với lực trượt (xem hình 1.4):

F /A = η * (dν / dr) hay η = τ / γ
Đơn vị của độ nhớt là Pa.s và P (1cP = 1 mPa.s).

Hình 1.4. Lực trượt tạo nên một gradient tốc độ trượt giữa các mặt song song
của chất lỏng [7]

11


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chế phẩm nanoemulgel tetrahydrocurcumin- sản phẩm nghiên cứu của khoa Bào
chế và Chế biến, Viện Dược liệu (xem hình 2.1).

Hình 2.1. Chế phầm Hemulgel White (Nanoemulgel chứa THC)
Thành phần trong 1 đơn vị sản phẩm (10g):
- Tetrahydrocurcumin
- Tá dược vừa đủ.
- Nước vừa đủ 10g.
Công dụng: Làm mờ sẹo, chống lão hoá da, ngăn ngừa thâm nám.
Cách dùng: Rửa sạch da, làm khô, sau đó thoa lên vùng da cần điều trị.
2.1.2. Hoá chất, chất chuẩn
- Chất chuẩn: Tetrahydrocurcumin (CAS No, Chemsface, 96%).
- Mẫu placebo không chứa tetrahydrocurcumin do khoa Bào chế và chế biến, Viện
Dược liệu cung cấp.
- Dung môi, hoá chất tinh khiết HPLC: ACN, acid formic, acid phosphoric, acid acetic
(Merk, HPLC grade).
12

- Dung môi, hoá chất tinh khiết phân tích: Methanol (Trung Quốc, PA).
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
- Cân kĩ thuật Satorius TE3102s (Đức)
- Cân phân tích Satorius BP121S (Đức)
- Cân phân tích 5 số Mettler Toledo MS105 (Mỹ)
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản)
- MRC Digital Viscometer
- Máy phân tích kích thước hạt SZ 100 (Horiba)
- Máy đo pH MILLWAUKEE
- Bể siêu âm
- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 µm
- Bình định mức, pipet, vial, eppendof, màng lọc 0,22 µm
- Micropipet và các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm
2.2. Nội dung nghiên cứu:
2.2.1. Định tính
2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm
2.2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký
Khảo sát thành phần và tỷ lệ dung môi pha động.
2.2.2.2. Tối ưu hoá quy trình xử lý mẫu
Thể tích dung môi chiết mẫu.
2.2.2.3. Thẩm định phương pháp đã xây dựng
- Độ phù hợp của hệ thống
- Tính chọn lọc của phương pháp
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Độ tuyến tính và khoảng nồng độ
- Độ chính xác (độ chụm và độ đúng)
2.2.3. Các tiêu chí khác
- Cảm quan: đánh giá dựa trên thể chất và màu sắc bằng quan sát mắt thường.
13

- pH: được đo bằng máy đo pH.
- Độ đồng nhất: đánh giá theo phụ lục 1.12-DĐVN V [1].
- Độ nhớt: được đánh giá bằng máy đo độ nhớt dạng xoay.
- Kích thước giọt và phân bố kích thước giọt: đánh giá bằng phương pháp tán xạ ánh
sáng động sử dụng thiết bị Nano partica SZ-100 series (Horiba).
2.2.4. Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng để định lượng
tetrahydrocurcumin của chế phẩm trong 3 lô sản xuất thử nghiệm
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Định tính
Định tính THC trong chế phẩm được xác định thông qua so sánh thời gian lưu,
và phổ UV-Vis của mẫu thử và THC chuẩn trên hệ thống HPLC-DAD.
Yêu cầu: tại thời gian lưu của THC chuẩn phải xuất hiện pic THC của mẫu thử,
và phổ UV-Vis phải tương đồng nhau, có hệ số match trong khoảng 0,8-1,2.
2.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm
2.3.2.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn
Mẫu chuẩn: tiến hành cân chính xác 5mg chất chuẩn tetrahydrocurcumin hoà tan
trong vừa đủ 5ml methanol thu được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/ml. Pha loãng dung
dịch gốc thu được dãy chuẩn có nồng độ: 25, 50, 75, 100, 125, 150 µg/ml.
2.3.2.2. Khảo sát điều kiện pha động
Mẫu thử: Cân chính xác 1,0g mẫu thử, phân tán vào vừa đủ 25 ml với methanol.
Siêu âm 10 phút. Đem li tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút. Hút dịch phía trên lọc với
màng lọc 0,22 µm trước khi khai triển sắc ký.
Phân tích mẫu thử trong các điều kiện pha động khác nhau để chọn điều kiện tối
ưu nhất dựa trên các tiêu chí:
- Pic của THC tách hoàn toàn khỏi các pic khác.
- Pic của THC đạt yêu cầu về độ cân xứng, số đĩa lý thuyết.
2.3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Dựa vào các tài liệu đã tham khảo, các điều kiện được cố định như sau:

- Phương pháp chiết: Siêu âm.
- Dung môi chiết mẫu: methanol.
- Thời gian chiết: 30 phút.
14


Tối ưu hoá quy trình xử lý mẫu bằng cách khảo sát thể tích dung môi: 10ml,
25ml, 50ml, 100ml / 1g mẫu.
Sau khi chiết, tiến hành ly tâm 3500 vòng/phút, thu dịch, lọc qua màng 0,22 µm
trước khi khai triển sắc ký. Lựa chọn thể tích dung môi chiết được lượng THC tối ưu
nhất.
2.3.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi tối ưu hoá điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu, tiến hành thẩm định
phương pháp định lượng THC trong chế phẩm bằng HPLC theo hướng dẫn AOAC.
- Độ phù hợp hệ thống
Độ thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống
phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị.
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên. Ghi lại các giá
trị thời gian lưu, diện tích pic. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn
tương đối RSD của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu các giá trị thời gian lưu, diện tích
pic có RSD không quá 2%.
- Độ chọn lọc
Độ chọn lọc của phương pháp là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần
phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Trong
sắc ký lỏng hiệu năng cao, độ chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ các mẫu thử,
mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các
pic tạp.
Chuẩn bị mẫu placebo, mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu placebo thêm chuẩn. So sánh
sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên. Yêu cầu: Khi chạy mẫu placebo, tại
vị trí tương ứng với tR của tetrahydrocurcumin không xuất hiện pic.

- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát
hiện được nhưng chưa thể định lượng được theo phương pháp định lượng đã xây dựng.
Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của
chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N
= Signal to noise ratio). LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 25 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N =3.
15


Giới hạn định lượng là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có
thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
Cách xác định tương tự như xác định LOD. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà
tín hiệu tại đó lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N= 10.
- Độ tuyến tính
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự
phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Sau khi xác
định được khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn dựa vào khoảng tuyến tính đã xác
định. Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần, tiến hành sắc ký, xây
dựng phương trình đường chuẩn và tính hệ số hồi quy tuyến tính. Thông thường khoảng
tuyến tính được xác định bằng tối thiểu 6 điểm và đường chuẩn cần nằm trùm lên vùng
nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính.
Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:
Hệ số hồi quy tuyến tính:
0,995≤ R ≤ 1
Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn: sau khi lập đường
chuẩn xong, kiểm tra bằng cách tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để
xây dựng đường chuẩn, từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức:
∆i = (Ct – Cc)/Cc × 100
Trong đó:
∆i: độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct: nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn.
Cc: nồng độ của các điểm chuẩn.
Giá trị ∆i không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ
LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%.
- Độ chính xác
Độ chính xác của phương pháp là mức độ đồng nhất giữa các kết quả riêng biệt
khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng
nhất. Ở đây sẽ bao gồm 2 khái niệm là độ chụm và độ đúng.

16