Nghiên cứu tính đa hình đơn gen RTEL1 trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

U nguyên bào thần kinh đệm - Glioblastoma (GB) là loại u não nguyên
phát của hệ thần kinh trung ương, chiếm khoảng 15-20% các u nội sọ [1]. Tổ
chức Y tế Thế giới phân loại Glioblastoma là loại ác tính nhất (độ IV) [2]. Tỉ
lệ Glioblastoma ở nam cao hơn nữ giới, tuổi phát hiện trung bình khoảng 64
tuổi [3].
U nguyên bào thần kinh đệm là loại u rất ác tính, thường hình thành
trong chất trắng não, phát triển nhanh chóng, và có thể thành khối u lớn trước
khi xuất hiện triệu chứng. Biểu hiện lâm sàng đầu tiên thường bằng hội chứng
tăng áp lực nội sọ nặng, can thiệp điều trị thường không đem lại hiệu quả, thời
gian sống thêm của bệnh nhân sau mổ trung bình chỉ 10-12 tháng [4].
Do vậy, việc tìm ra căn nguyên, cơ chế bệnh sinh và quá trình sinh
bệnh học của u nguyên bào thần kinh đệm để có thể can thiệp chính xác và
hiệu quả, đồng thời đưa ra tiên lượng bệnh là điều rất cần thiết. Các nhà khoa
học trên thế giới đã tìm thấy sự biến đổi một số gen như RTEL1, TP53, RB1,
NF1, PIK3R1, ERBB2, EGFR, IDHl [5-8]…trong đó gen RTEL1được phân
loại như một gen ức chế khối u [11-14] nếu gen bị đột biến, tế bào bị tổn
thương DNA sẽ không được sửa chữa và kiểm soát, đó là cơ sở dẫn đến phát
triển thành khối u.
Gen RTEL1 nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể 20, dài 40,889kb, gồm
40 exon. Các đột biến hay gặp của gen trên u nguyên bào thần kinh đệm là
các đột biến điểm. Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy một số đa hình
gen như rs6010620, rs2297440 trên intron 12 của gen RTEL1 có liên quan
mật thiết tới nguy cơ mắc bệnh u nguyên bào thần kinh đệm. Tại Việt Nam
chưa có nghiên cứu nào về xác định một số đa hình trên gen RTEL1ở bệnh u


2

nguyên bào thần kinh đệm. Chính vì vậy đề tài: “Nghiên cứu tính đa hình
đơn gen RTEL1 trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm” được tiến
hành với 2 mục tiêu sau:
1. Xác định đa hình đơn rs6010620, rs2297440 gen RTEL1 trên bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
2. Phân tích giá trị đa hình thái đơn gen RTEL1(rs6010620, rs2297440)
đối với bệnh u nguyên bào thần kinh đệm.


3

CHNG 1
TNG QUAN

1.1.

1.1.1.

Tng quan u nóo
nh ngha u nóo v u nguyờn bo thn kinh m
U nóo l mt khi ca cỏc t bo bt thng hỡnh thnh trong nóo. Cú 2

loi u nóo chớnh l: khi u ỏc tớnh (hay ung th) v khi u lnh tớnh [15]. Cỏc
khi u ỏc tớnh cú th c chia thnh khi u nguyờn phỏt v khi u di cn ca
nóo [16]. Trong ú u nguyờn bo thn kinh m - Glioblastoma (GB) l loi u
nóo nguyờn phỏt ca h thn kinh trung ng [1] v c t chc Y t Th
gii phõn loi l loi ỏc tớnh nht ( IV) [2].
1.1.2.

Tỡnh hỡnh mc bnh trong nc v trờn th gii
Theo Kimberly R.Porter v cỏc cng s (2010) M cho thy, t l

mc ca u nóo nguyờn phỏt vo khong 18,1 trong 100.000 dõn mi nm, vi
t l sng sau 2, 3, 5 v 20 nm ln lt l 62%, 54%, 45% v 30% [17].
Tần suất mắc u não theo phân loại hình thái mô học
gồm 2 loại nguyên phát và thứ phát [16]. U thứ phát có nguồn
gốc từ các cơ quan khác trong cơ thể di căn vào não nh từ
phổi, vú, đờng tiêu hoá, biểu bì...luôn là những khối u ác
tính. U nguyên phát có nguồn gốc từ não, màng não và các
tuyến trong sọ, xy ra trong khong 250.000 ngi mi nm trờn ton
cu, chim cha ti 2% ung th [18]. Cỏc khi u nóo nguyờn phỏt thng gp
nht l: u nguyờn bào thần kinh đệm thờng gặp nhất chiếm
khoảng 50,4%, u màng não 20,8%, u tuyến yên 15%, còn lại là
các khối u khác [19]. Trong s cỏc khi u ỏc tớnh thỡ cú khong 8/10 l u
nguyờn bo thn kinh m [20]. tr em loi u ph bin nht l u nguyờn ty
bo ỏc tớnh (Medulloblastoma) [18], trong ú tr em di 2 tui, khong


4

70% các khối u não là u nguyên tủy bào, u tế bào hình sao thể lông và u thần
kinh đệm mức độ thấp [21].
Theo Bleeker và các cộng sự (2012) tỉ lệ mắc u nguyên bào thần kinh
đệm là 2-3 trường hợp trong 100.000 dân mỗi năm ở châu Âu và Bắc Mỹ,
thời gian sống trung bình sau điều trị là 15 tháng [22].
Tại Việt Nam theo Kiều Đình Hùng (2005) “Nghiên cứu ứng dụng quang
động học trong điều trị Glioma não ác tính”, tỉ lệ u nguyên bào thần kinh đệm
là 62,7% [23].
1.1.3.

Chẩn đoán
Chẩn đoán u não dựa vào lâm sàng và cận lâm sàng (trong đó chủ yếu

dựa vào MRI và CT, sau đó được xác định lại bằng chẩn đoán mô bệnh học)
[15], [16].
1.1.3.1. Triệu chứng lâm sàng
Hoàn cảnh phát hiện bệnh thường dựa vào những triệu chứng:
- Cơn động kinh: có thể động kinh cục bộ, động kinh toàn thể, hoặc động
kinh cục bộ dẫn tới toàn thể.
- Hội chứng tăng áp lực nội sọ:
 Đau đầu liên tục, không đỡ khi dùng thuốc, tăng lên khi đi bộ,buổi sáng,
cường độ đau ngày một tăng lên và cố định ở một vị trí.
 Nôn: thường là nôn vọt, khi thay đổi tư thế, hay xảy ra vào buổi sáng,
không liên quan với bữa ăn, không có biểu hiện cơn đau bụng trước nôn.
 Mờ mắt, phù gai thị: Phù hoặc teo gai thị giác là triệu chứng khách quan
khi tăng áp lực nội sọ sẽ đè ép vào các bó mạch của dây thần kinh thị giác
dẫn đến ứ máu tĩnh mạch và phù gai thị. Sau phù gai thị sẽ dẫn đến teo gai
thị giác.
 Ở trẻ em có dấu hiệu thóp phồng.
- Triệu chứng thần kinh giúp chẩn đoán định khu:


5

 Có thể gặp rối loạn vận động hoặc rối loạn cảm giác nửa người. Liệt một
hoặc một số dây thần kinh sọ nào đó. Rối loạn ngôn ngữ, hiện tượng bán
manh, hội chứng tiểu não. Rối loạn tâm thần: thờ ơ, lãnh đạm, chậm chạp.
Tất cả các triệu chứng này tập hợp thành hội chứng định khu như triệu
chứng vùng trán, vùng đỉnh, vùng thái dương. Những triệu chứng này thường

tiềm tàng, tiến triển từ từ theo kiểu “vết dầu loang”. Tuy nhiên, nếu ban đầu
có tính chất đột ngột thì nên nghĩ đến chảy máu trong khối u [24].
- Triệu chứng của thoát vị não:
 Thoát vị dưới liềm não: Rối loạn tri giác, giãn đồng tử.
 Thoát vị cạnh lều tiểu não: rối loạn tri giác, giãn đồng tử kèm giảm
phản xạ ánh sáng, liệt chi cùng bên.
 Thoát vị qua trung tâm lều: rối loạn tri giác,co đồng tử lúc đầu, sau
giãn, đái nhạt.
 Thoát vị qua lỗ chẩm: hôn mê, cứng gáy, rối loạn hô hấp.
1.1.3.2. Triệu chứng cận lâm sàng
Hiện nay, u não nói chung và u nguyên bào thần kinh đệm nói riêng sử
dụng các phương tiện chẩn đoán cận lâm sàng là chẩn đoán hình ảnh và chẩn
đoán mô bệnh học.
X quang hộp sọ
Chụp sọ có thể thấy hình ảnh tăng áp lực nội sọ: giãn khớp sọ ở trẻ em,
dấu ấn ngón tay. Ngoài ra có thể thấy khuyết sọ hoặc xương sọ quá sản, mỏm
yên mòn, đáy hố yên rộng và mỏng. Các đám ngấm vôi bất thường, tuyến
tùng ngấm vôi, lệch khỏi vị trí bất thường là những dấu hiệu có giá trị.
Điện não đồ
Đo điện não có thể phát hiện được những sóng chậm delta, bêta ở một
khu vực nào đó nếu kết hợp với các triệu chứng lâm sàng đúng đắn có thể
giúp ta chẩn đoán định khu của u não.
Siêu âm


6

Siờu õm ng gia, nu cú s dch chuyn ca ng gia t 1-1,5cm
l cú giỏ tr chn oỏn. Siờu õm Doppler, c ỏp dng trong vic chn oỏn
bnh nóo tr s sinh thúp cũn h. i vi ngi ln cú th khoan mt l s

chn oỏn nh trờn.
Chp ng mch nóo
Cú th chp ng mch cnh gc qua da hoc chp ng mch nóo bng
k thut Seldinger qua ng mch ựi, cú th chp hỡnh nhiu ng mch
cựng lỳc.
S tng sinh v xụ y mch mỏu trong nóo l hỡnh nh giỏn tip ca
khi choỏn ch.
Chp ct lp vi tớnh
Giỳp ta thy c v trớ, kớch thc ca thng tn, s lng u, hỡnh nh
phự nóo xung quanh u: ỏnh giỏ mc ỏc tớnh, xõm ln t chc xung quanh.
Du hiu choỏn ch: ố y ng gia, xp nóo tht cựng bờn, dón nóo tht
bờn i din. T trng khi u, mc ngm thuc cn quang.
Chp cng hng t (IRM)
nh v c v trớ ca u nóo.
ỏnh giỏ s tng quan 3 chiu ca thng tn vi t chc lõn cn.
Chn oỏn mụ bnh hc:giỳpchn oỏn xỏc nh v phõn loi mụ bnh
hc u nóo.
1.1.4. Phõn loi u nóo
1.1.4.1. Phân loại u não theo vị trí
Phân loại u não theo vị trí cũng quan trọng nh phân loại
theo mô học vì nó giúp định hớng chẩn đoán và điều trị.
Các u trên lều: nằm phía trên của lều tiểu não bao gồm
các u thuỳ não (u thuỳ trán, u thuỳ đỉnh, u thuỳ thái dơng
hoặc thuỳ chẩm), các khối u vùng trung tâm (u nhân xám


7

trung ơng, u não thất bên, u thể trai, u hố yên, u não thất III, u
tuyến tùng).

Các u dới lều (u hố sau):bao gồm các khối u tiểu não và u
não thất IV, thân não, u góc cầu tiểu não [24].
1.1.4.2. Phân loại mô bệnh học u nóo
Theo phõn loi ca WHO 2007, u ca h thn kinh trung ng cú 7 loi
sau õy:
U biu mụ thn kinh (neuroepithelial tissue), U ca dõy thn kinh s v
thn kinh ngoi biờn (crainial and paraspinal nerves), U mng nóo
(meninges), Ung th hch v t bo to mỏu (lymphoma and hematopoietic),
U t bo mm (germ cell tumous), U vựng h yờn (tumor of the sellar region),
U di cn (metastatic tumours).
Bng 1.1. Bng phõn loi u biu mụ thn kinh ca WHO 2007
Tờn ting anh
Tumor of neuroepithelial tissue
1.Astrocytic tumours
Piliocytic astrocytoma
Pilomyxoid astrocytoma
Subependymal giant cell
astrocytoma
Pleomorphic
xanthoastrocytoma
Diffuse astrocytoma
Fibrillary astrocytoma
Gemistocytic astrocytoma
Protoplasmic astrocytoma
Anaplastic astrocytoma
Glioblastoma
Giant cell glioblastoma

Ting vit
U biu mụ thn kinh

U t bo thn kinh m hỡnh
sao
U t bo sao th lụng
U biu mụ t bo sao khng l
mng ni ty
U biu mụ t bo sao hn hp
mu vng
U t bo sao lan ta
U t bo sao th si
U t bo sao th phng
U t bo sao nguyờn sinh
U t bo sao thoỏi trin
U nguyờn bo thn kinh m
U nguyờn bo m t bo
khng l

ỏc
ICD-O
tớnh

I
II
I

9421/1
9425/3
9384/1

II

9424/3

II

9400/3
9420/3
9411/3
9410/3
9401/3
9440/3
9441/3

III
IV
IV


8

Gliosarcoma
Gliomatosis cerebri
2.oligodendrogllal tumours
Oligodendroglioma
Anaplastic oligodendroglioma
3.Oligoastrocytic tumours
Oligoastrocytoma
Anaplastic oligoastrocytoma
4.Ependymal tumours
Subependymoma
Myxopupilary ependymoma

Ependymoma
Cellular
Papillary
Clear cell
Tanycytic
Anaplastic ependymoma
5.Choroid plexis tumours
Choroid plexus papiloma
Atypical chroid plexus
papiloma
Choroid plexus carcinoma
6.other neuroepithelial
tumours
Astroblastoma
Choroid glioma of the third
ventricle
Angiocentric glioma
7.Neuronal and mixed
neuronal-glial tumours

Sarcoma tế bào đệm
U tế bào đệm di căn não
U tế bào thần kinh đệm ít
nhánh
U tế bào thần kinh đệm ít nhánh
U tế bào thần kinh đệm ít
nhánh thoái triển
U tế bào thần kinh đệm hỗn
hợp( hình sao và ít nhánh)

U tế bào thần kinh đệm lợp
ống nội tủy
U dưới màng nội tủy
U nhú niêm màng nội tủy
U màng nội tủy
U tế bào
U nhú
Tế bào không màu
U màng nội tủy thoái triển
U đám rối màng mạch

IV

9442/3
9381/3

II
III

9450/3
9451/3

II
III

9382/3
9382/3

I
I

II

III

9383/1
9394/1
9391/3
9391/3
9393/3
9391/3
9391/3
9392/3

I
II

9390/0
9390/1

III

9390/3

II

9430/3
9444/1

I

9431/1

U tế bào thần kinh đệm không
rõ nguồn gốc

U neuron và u hỗn hợp neuron
tế bào đệm


9

Dysplastic gangliocytoma of
cerebellum
Desmoplastic infantile
astrocytoma/ganglioglioma
Dysembryoplastic
neuroepithelial tumour
Ganggliocytoma
Gangglioglioma
Anaplastic gangglioglioma
Central neurocytoma
Extraventricular neurocytoma
Cerebellar liponeurocytoma
Papillary glioneuronal tumour
Rosette-forming glioneuronal
tumour of the fourth ventricle
Paraganglioma
8.tumours of the pineal
region
Pineocytoma

Pineal parenchymal tumour of
intermediate differentiation
Pineoblastoma
Papilary tumour of the pineal
region
9.Embyonal tumours
Medulloblastoma
Desmoplastic /nodular
medulloblastoma
Medulloblastoma with
extensive nodularity
Anaplastic medulloblastoma
Large cell medulloblastoma
CNS primitive neuroectodemal
tumour

9493/0

U biểu mô thần kinh loạn sản
phôi
U tế bào hạch
U thần kinh đệm hạch
U thần kinh đệm hạch thoái triển
U tế bào thần kinh trung ương
chưa biệt hóa

I

9412/1

I

9413/0

I
I
III
II

9492/0
9505/1
9505/3
9506/1

II
II
I
I

9506/1
9506/1
9509/1
9509/1

I

8680/1

I
II,III

9361/1
9362/3

IV
II,III

9362/3
9395/3

IV

9470/3
9471/3

U tuyến tùng

U nguyên bào tuyến tùng

U nguyên bào thần kinh
U nguyên bào tủy

9471/3

U ngoại bì thần kinh nguyên
phát

IV

9474/3

9474/3
9473/3


10

CNS neuroblastoma
U nguyên bào thần kinh
9500/3
CNS ganglioneuroblastoma U nguyên bào hạch
9490/3
Medulloepithelioma
U biểu mô tủy
9501/3
Ependymoblastoma
U nguyên bào màng nội tủy
9392/3
Atypical teratoid/ rhabdoid
U quái/hình que điển hình
IV
9508/3
tumour
Theo phân loại trên u biểu mô thần kinh có 9 loại, trong đó có u tế bào
sao. U tế bào sao gồm có u tế bào sao thể lông, u biểu mô tế bào sao khổng lồ
màng nội tủy (độ I), u biểu mô tế bào sao hỗn hợp màu vàng, u tế bào sao lan
tỏa là độ II, có độ ác tính thấp. U tế bào sao thoái triển (độ III), u nguyên bào
thần kinh đệm (độ IV) có độ ác tính cao [2].
1.1.5. Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh
Điều trị chủ yếu phẫu thuật cắt khối u, tia xạ, hoá chất và điều trị triệu
chứng [16]. Tuy nhiên các can thiệp này đem lại kết quả rất hạn chế.

Phẫu thuật
Mục tiêu của việc phẫu thuật là loại bỏ u và không gây tổn thương đến
tổ chức não lành. Tuy nhiên mục tiêu đó đạt được hay không còn phụ thuộc
vào vị trí u nông hay sâu, u có giới hạn rõ hay không. Liên quan với u, khối
lượng u và trình độ chuyên khoa của phẫu thuật viên. Nhờ chụp cắt lớp vi
tính và kính hiển vi phẫu thuật người ta có thể lấy bỏ u một cách triệt để hơn.
Tuy nhiên không phải loại u nào cũng có thể lấy bỏ triệt để được, u màng
não có giới hạn rõ nhưng đôi khi cũng chỉ lấy được một phần.
U não ở sâu, ở hành não, thân não, ở các mạch máu lớn, ở nền sọ thì việc lấy
bỏ u sẽ rất khó khăn vì gần trung khu hô hấp, tim mạch và khó cầm máu.
Điều trị tia xạ
Tia phóng xạ trước hết được dùng để diệt những tế bào ác tính còn lại
sau khi cắt bỏ hoặc những u ác tính ở sâu mà người ta chỉ phẫu thuật tối thiểu
Stereotaxy với kết quả giải phẫu bệnh kèm theo. Người ta còn dùng để ngăn


11

không cho các u lành tính hoặc tương đối lành tính tái phát như Adenoma
tuyến yên hoặc Craniopharynoma. Nói chung trong những năm qua điều trị
các u não bằng tia phóng xạ đã có những bước tiến đáng kể do sự tiến bộ của
trang thiết bị máy móc. Hiện nay, người ta dùng dao gamma điều trị u não,
phẫu thuật an toàn, hiệu quả cao.
Điều trị hoá chất
Hiện nay kết quả điều trị u ác tính bằng hoá chất rất đáng khích lệ,
nhưng đối với u của mô não chưa thay đổi rõ rệt về tiên lượng. Người ta
khuyên chỉ nên dùng các hoá chất trong những trường hợp u ác tính phát triển
nhanh, cụ thể đối với các loại Glioblastoma, Astrocytoma độ III và độ IV.
Nhiều tác giả đã cho rằng hoá chất đã làm cho kết quả điều trị tốt hơn.
Các hoá chất được dùng trong điều trị u não có thể kể một vài loại sau:

Cyclophosphamide (Endoxan), 5 Fluoro-Uracyle (5FU), Methotrexate (Aethopterin),
Vincristine (Oncovin), Mythramycine (Mithrancin), Doxorabicine (Adriamycine).
Hoá chất dùng sau tia phóng xạ, cả hai phương pháp này dùng điều trị
bổ sung sau phẫu thuật.
Điều trị corticoid và điều trị bằng miễn dịch cũng được đề cập đến
trong u não. Mục đích của điều trị corticoid là ngăn ngừa tình trạng phù não
quanh u và điều trị miễn dịch là một hướng điều trị còn ở thời kỳ nghiên cứu.
Tóm lại, một u não lành tính thì việc điều trị có hiệu quả nhất là cắt bỏ
triệt để nhưng còn phụ thuộc vào vị trí giải phẫu, mối liên quan về chức năng
và khối lượng của khối u. Các u não ác tính khi phẫu thuật cố gắng lấy bỏ tối
đa khối lượng của chúng kèm theo điều trị phối hợp phóng xạ và hoá chất để
đạt hiệu quả cao hơn.
Dự phòng


12

Hiện nay, chưa có biện pháp dự phòng hiệu quả để phát hiện sớm u nguyên
bào thần kinh đệm cũng như u não nói chung. Chủ yếu phát hiện sớm các triệu
chứng gợi ý của các bệnh lý ở vùng sọ não: Nhức đầu kéo dài, cảm giác ngủ gà
ngủ gật, các rối loạn về tâm thần...mà nhiều trường hợp u não ở thể câm không
triệu chứng.
1.2.

1.2.1.

Cơ chế bệnh sinh bệnh u nguyên bào thần kinh đệm
Các yếu tố nguy cơ
Yếu tố di truyền: các yếu tố di truyền có tác động vào sự xuất hiện một

số loại u não như u nguyên bào võng mạc cũng như u thần kinh da. Trong
nhóm u xơ thần kinh typ 1, các u tế bào hình sao hay gặp nhiều gấp 4 lần.
Nhóm 2 (được đặc trưng bởi u dây VIII hai bên) là tập hợp rất nhiều u khác
nhau (u thần kinh đệm ngoại biên, u xơ thần kinh, u màng não, u thần kinh
đệm). Các u nguyên bào mạch trong não và trong ống sống thường xuất hiện
với bệnh Von Hippel Lindau.
2.

Suy giảm miễn dịch làm tăng nguy cơ mắc các u lymphô ở não. Khoảng
20% bệnh nhân có biểu hiện suy giảm miễn dịch kéo dài và từ 5% đến
8% bệnh nhân AIDS bị u lymphô ác tính, thường là lympho B.
1.2.2.Cơ chế bệnh sinh
Cấu trúc bậc hai của ADN trong quá trình sao chép, sửa chữa và tái tổ

hợp ADN phải được xử lý đúng cách để tránh biến đổi di truyền. RTEL-1
(regulator of telomere length-1) là ADN helicase quan trọng giúp ổn định cấu
trúc bậc hai của ADN và duy trì sự nguyên vẹn của telomere. RTEL-1 điều
khiển quá trình tái tổ hợp nhiễm sắc thể trong nguyên phân và giảm phân.
Trong những năm qua, các nhà khoa học đã đưa ra bằng chứng chứng minh
các đột biến điểm trên gen RTEL-1 làm tăng nguy cơ mắc các bệnh u não, u
thần kinh đệm, hội chứng Hoyeraal-Hreidarsson, v.v. Các nghiên cứu cũng chỉ


13

ra rằng các đột biến điểm đơn nucleotide (SNP) của gen RTEL-1 có liên quan
mật thiết tới các bệnh này [25], [26].
Vì các đột biến điểm SNP của gen RTEL-1 nằm ở vùng không mã hóa,
nên những ảnh hưởng của chúng ở cấp độ phân tử lên sự phát sinh và tiến
triển ung thư chưa được làm sáng tỏ. Các nhà khoa học đưa ra giả thuyết rằng,

đột biến điểm ở intron nằm gần các đoạn exon có thể làm mất đoạn exon bằng
cách biến đổi quá trình cắt nối mARN, qua đó tạo thành và làm tăng các quá
trình phiên mã vô nghĩa. Với những bằng chứng về việc đột biến gen RTEL-1
làm gia tăng nguy cơ ung thư não, RTEL-1 được xem như là gen ức chế ung
thư [27]. Tuy nhiên, hiện nay rất ít nghiên cứu tiến hành để xác định xem
RTEL-1 được điều khiển như thế nào hay helicase RTEL-1 đã lôi kéo các
telomere tham gia thực hiện các chức năng của chúng ra sao trong quá trình
phát sinh và tiến triển ung thư.
1.3.Gen RTEL1
Gen RTEL1 được phân loại như một gen ức chế ung thư, nằm trên cánh
dài nhiễm sắc thể 20, ở vị trí 13.3 từ cặp base 63.657.809 đến cặp base
63.696.252 dài 40,889kb, gồm 40exon.
Một số nghiên cứu cho thấy kiểu gen GG của rs6010620 thường hay
gặp ở người bình thường, trong khi đó kiểu gen AG và AA thường hay gặp ở
nhóm bệnh nhân bị bệnh u nguyên bào thần kinh đệm, vì vậy người có 2 kiểu
gen AG và AA tại vị trí rs6010620 được xem như là người có nguy cơ cao bị
bệnh [40][41].
Tương tự như vậy, kiểu gen CC của rs2297440 thường hay gặp ở người
bình thường, trong khi đó kiểu gen CT và kiểu gen TT thường hay gặp ở
nhóm bệnh nhân bị bệnh u nguyên bào thần kinh đệm, vì vậy người có 2 kiểu


14

gen CT và TT tại vị trí rs2297440 được xem như là người có nguy cơ cao bị
bệnh [40][41].
Một nghiên cứu lâm sàng được tiến hành trên 275000 đột biến soma ở
692 bệnh nhân trưởng thành mắc bệnh u não và 3992 người tình nguyện khỏe
mạnh (đối chứng) đã xác định được hai đột biến điểm SNP ở intron 12 là
rs6010620 và ở intron 17là rs4809324 của gen RTEL-1 có liên hệ mật thiết

với bệnh u tế bào thần kinh đệm và u tế bào thần kinh dạng sao. Một nghiên
cứu khác trên 500 000 đột biến điểm ở 1878 bệnh nhân u não và 3670 người
tình nguyện khỏe mạnh cũng có kết quả tương tự [28], [26]. Năm 2013, một
nhóm nhà khoa học người Trung Quốc đã tiến hành phân tích đa hình di
truyền của gen RTEL-1 trên 629 bệnh nhân u tế bào thần kinh đệm và 645
người tình nguyện khỏe mạnh chỉ ra hai đột biến điểm rs6010620, rs2297440
và hai haplotype GCT và ATT của gen RTEL-1 có liên quan mật thiết với
bệnh u tế bào thần kinh đệm [29]. Chính vì vậy, những đột biến điểm này trở
thành tiêu chuẩn quan trọng để tiên lượng sự sống sót của các bệnh nhân u
não.
1.4. Các phương pháp xác định kiểu gen RTEL1
1.4.1. Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR)
Nguyên tắc chung: dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase có khả
năng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn
loại nucleotid. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi
ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.Phản ứng PCR
là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94 oC
- 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.


15

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép
các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm
của các mồi sử dụng và kéo dài khoảng 30 giây - 1 phút.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được
tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt
(Taqpolymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt

nhất. Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự chuỗi DNA cần khuếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được
dùng làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản
phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA mạch kép có chiều dài là
khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được
xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [30], [31], [36].
Số lượng sản phẩm DNA tạo thành khi hoàn thành phản ứng PCR
được biểu thị bằng công thức sau:
N = 2n
N: số lượng bản copy sản phẩm tạo thành
n là số chu kỳ của phản ứng.
1.4.2. Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các
nucleotid trong phân tử DNA. Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như
trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi.
Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với
nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các
deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp. Sự gắn của
các dideoxynucleotidsẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA được


16

tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau.
Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA có thể được xác định bằng cách chạy
đồng thời bốn phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loại
dideoxynucleotid(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng hỗn
hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất phát
huỳnh quang đặc hiệu khác nhau.

Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP


17

Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn được phân tách
bằng điện di trên thạch acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệt
được các sợi đơn DNA hơn kém nhau 1 nucleotid. Trình tự các nucleotid
được xác định tương ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loại
dideoxynucleotid.
Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn dùng 4 màu huỳnh quang khác
nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, hệ thống điện di thường là điện di mao quản.
Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3 ’ của
đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhậnmàu
sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy
nhận biết được từng loại nucleotid và trình tự của DNA đích.
Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên GeneBank
(National Center for Biotechnology Information – NCBI).


18

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Thời gian nghiên cứu
Thời gian
Tháng 9/2015 đến
tháng 3/2016

Tháng 4-6/2016
Tháng 7-9/2016

Nội dung thực hiện
- Đọc tài liệu, dự trù kinh phí, hóa chất, thiết bị
- Lấy mẫu
Phân tích gen
Phân tích số liệu, viết luận văn và báo cáo kết quả

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Lấy mẫu nghiên cứu: Bệnh viện Việt Đức.
Phân tích gen: Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà
Nôi
2.2. Đối tượng nghiên cứu
Dựa vào công thức tính cỡ mẫu:
n = Z21-α/2
Trong đó α = 0,05

p = 0,05

ε = 0,2


19

Thay vào ta được:
n = 1,96 2 = 96,04
Như vậy số đối tượng chọn vào nghiên cứu là 96
- Nhóm chứng : 96 đối tượng
Tiêu chuẩn lựa chọn: người khoẻ mạnh, không có bất kỳ một khối u hay

ung thư một cơ quan nào, không mắc các bệnh mãn tính, đặc biệt là các bệnh lý
về phổi.
- Nhóm bệnh: Nhóm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm
Tiêu chuẩn lựa chọn: 96 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bằng mô
bệnh học tại bệnh viện Việt Đức là ung thư nguyên bào thần kinh đệm
Tiêu chuẩn loại trừ : Có bất kỳ một khối u hay ung thư một cơ quan nào
khác.
Các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn được lấy 2ml máu vào ống chống đông
EDTA, bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm lấy mẫu mô khối u đã được
xác định giải phẫu bệnh có tế bào ung thư, tách DNA bảo quản - 20˚C, chờ
phân tích gen.
2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
Phương pháp: Tiến cứu kết hợp mô tả cắt ngang
- Lấy mẫu: Tại bệnh viện Việt Đức
+ Lấy mẫu mô bệnh học: lấy khoảng 0,1 – 0,5 g mẫu sinh thiết u đã được
chẩn đoán giải phẫu bênh.
+ 2 ml máu vào ống chống đông EDTA
- Tách DNA và bảo quản - 20˚C: Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein,
Trường Đại học Y Hà Nội
- Phân tích gen:


20

+Tách chiết DNA từ máu ngoại vi từ mẫu máu của bệnh nhân và của nhóm
đối chứng theo phương pháp Phenol/Chloroform
+ DNA sau khi được tách chiết sẽ được khuếch đại 2 vùng gen rs6010620,
rs2297440 của gen RTEL1 bằng cặp mồi đặc hiệu.
+ Sản phẩm PCR của 2 vùng gen rs6010620, rs2297440 sẽ được giải trình

tự để xác định đa hình gen.

2.3.4. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê y học dựa vào phần mềm
thống kê SPSS.
-Tất cả các số liệu được nhập vào máy tính, làm sạch số liệu.
- Dùng test T-student đánh giá mối liên quan giữa đột biến RTELb1 với
tuổi.
- Dùng test chi-square đánh giá mối liên quan giữa đột biến RTEL1 với
giới tính.
- Dùng test2 đánh giá mối liên quan gữa đột biến gen RTEL1 với u
nguyên bào thần kinh đệm.
- Tính giá trị RR, CI để xem xét nguy cơ tương đối của các đột biến với
u nguyên bào thần kinh đệm.
- Phân tích tầng để đánh giá nguy cơ u nguyên bào thần kinh đệm khi
có một, hai hoặc nhiều loại gen đột biến ung thư.
2.3.5. Lập kế hoạch thực hiện
Tháng 9/2015 đến tháng 3/2016: Chuẩn bị tài liệu, thu thập mẫu, tiến
hành kỹ thuật và thu thập số liệu.
Tháng 4 đến tháng 9/2016: Xử lý kết quả, viết và bảo vệ luận văn.
2.3. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu.
 Các đối tượng tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện và có


21

quyền rút khỏi nghiên cứu khi không muốn tham gia nghiên cứu.
 Các thông tin liên quan tới người tham gia nghiên cứu được đảm bảo
bí mật.
 Nghiên cứu đảm bảo tuân thủ các quy định về đạo đức trong nghiên

cứu Y- Sinh học.
 Khóa luận được thực hiện hoàn toàn vì mục đích khoa học mà không vì
mục đích nào khác.
CHƯƠNG 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ
Theo 2 mục tiêu nghiên cứu:
1. Xác định đa hình thái đơn rs6010620, rs2297440 gen RTEL1 trên bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
2. Phân tích giá trị đa hình thái đơn gen RTEL1 (rs6010620, rs2297440)
đối với bệnh u nguyên bào thần kinh đệm.


22

CHƯƠNG 4
DỰ KIẾN BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN
Bàn luận và kết luận dựa trên 2 mục tiêu nghiên cứu.
So sánh tìm sự khác biệt tỷ lệ đột biến 2 gen này giữa người bình
thường và bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm. Đánh giá nguy cơ mắc u
nguyên bào thần kinh đệm dựa vào chỉ số OR, RR. Khả năng chỉ số tương
quan cao như trong một số nghiên cứu nước ngoài.


23

DỰ TRÙ KINH PHÍ
Đề tài được th ực hiên v ới s ự h ỗ tr ợ kinh phí c ủa Đ ề tài c ấp b ộ
đã được duy ệt theo quyết định s ố 4214/QĐ-BYT ngày 16/10/2014 c ủa
Bộ trưởng Bộ Y tế.
Tên đề tài: Nghiên cứu xác định đột biến một số gen trong

bệnh u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma)
Chủ nhiệm đề tài PGS. TS. Kiều Đình Hùng, Trường Đại h ọc Y Hà
Nội


24


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.

Apuzzo MLJ,Park Ridge, IL. (1990). Malignant Cerebral Glioma.
American Association of Neurological Surgeons. Neurosurgical Topics 2.

2.

David NL, Hiroko O, Otmar DW, et al. (2007). WHO classification of
tumours of the central Nervous System. Acta neuropathol. 114(2), 97-109.

3.

Thakkar JP, Dolecek TA, Horbinski C. (2014). Epidemiologic and
molecular prognostic review of glioblastoma. Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev. 23(10),1985-96.

4.

Deb P, Sharma MC, Mahapatra AK, et al. (2005). Glioblastoma
multiforme with long term survival. Neurol Indian. 53(3), 329-32.

5.

The Cancer Genome Atlas (TCGA) Research Network. Comprehensive
genomic characterization defines human glioblastoma genes and core
pathways.(2008). Nature. 455:1061–1068.

6.

Mischel PS, Shai R, Shi T, et al. (2003). Identification of molecular
subtypes of glioblastoma by gene expression profiling. Oncogene.
22:2361–2373.

7.

Molenaar RJ, Radivoyevitch T, Maciejewski JP, et al.( 2014). The
driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2
mutations in oncogenesis and survival prolongation. Biochimica et
Biophysica Acta. 1846. (2): 326–341.

8.

Linda B. C. Bralten and Pim J. French. (2011). Genetic Alterations in
Glioma. Cancers 2011. 3, 1129-1140.

9.

Shiraishi S, Tada K, Nakamura H, et al. (2002). Influence of TP53
mutations on prognosis of patients with glioblastoma. Cancer.
95(2),249-57.