Nghiên cứu tính đa hình của gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở cây lúa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------

Nguyễn Thị Nha Trang

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1
MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION
LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------

Nguyễn Thị Nha Trang

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1
MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION
LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA

Chuyên ngành : Di truyền học
Mã số : 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Đỗ Thị Phúc

Hà Nội - 2014


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân
tôi đã nhận đƣợc sự quan tâm, động viên giúp đỡ rất nhiệt tình của các thầy cô,
gia đình và bạn bè.
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: TS. Đỗ Thị Phúc
- ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn tôi, chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình thực
hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể các thầy cô trong bộ
môn Di truyền học- Khoa Sinh học- Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà
Nội đã hết lòng giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè
thân thiết đã luôn góp ý, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày .... tháng .... năm 2014
Học viên

Nguyễn Thị Nha Trang


BẢNG KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu
DNA

Tiếng Anh

TiếngViệt

Deoxyribonucleic

Acid deoxyribonucleic

Bp

Base pair

Cặp bazơ nitơ

CDS

Coding sequence

Trình tự mã hóa cho protein

CTAB Cetyl trimethylamoni bromide
dNTP

Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic

Ethylen diamin tetraacetic acid

Kb

Kilobase

M

Maker

Thang chuẩn DNA

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

TAE

Tris-acetate-EDTA

TE

Tris-EDTA

IRRI

International Rice Research Institute Viện nghiên cứu lúa Quốc tế

i

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 3
1.1.Vài nét sơ lƣợc về cây lúa ........................................................................ 3
1.2.Đất mặn và cơ chế chống chịu mặn ở Thực vật....................................... 5
1.2.1.Đất mặn .............................................................................................. 5
1.2.2.Cơ chế thích nghi stress mặn ở Thực vật................................... ........6
1.2.3.Phản ứng chống chịu mặn của cây lúa...............................................7
1.3.Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở Thực
vật......................................................................................................................9
1.4. Protein HKT ở thực vật........................................................................... .10
1.4.1. Vai trò, chức năng của protein HKT ở thực vật.......................... ... 10
1.4.2 Họ protein HKT ở lúa ...................................................................... 12
1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu, vai trò của nghiên cứu đa hình gen..........13
1.6.Tình hình nghiên cứu liên quan đến gen OsHKT1 ................................... 14
1.7.Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu của đề tài ....................................... 15
1.7.1.Mục tiêu ........................................................................................... 15
1.7.2. Nội dung nghiên cứu....................................................................... 15
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16
2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................ 16
2.1.1. Mẫu vật nghiên cứu ........................................................................ 16
2.1.2. Mồi phản ứng PCR ......................................................................... 16
2.1.3. Hóa chất ......................................................................................... 17
2.1.3.1.Các hóa chất đƣợc sử dụng để tách DNA tổng số........................18
2.1.3.2.Môi trƣờng trồng thủy canh...................................................18
2.1.3.3.Phản ứng PCR đƣợc thực hiện cùng với Taq DNA polymerase
2.1.3.4.Sản phẩm phản ứng PCR.......................................................19
2.1.4. Thiết bị ............................................................................................ 19
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 19

2.2.1.Trồng lúa sử dụng phƣơng pháp thuỷ canh và thí nghiệm xử lý mặn... 19
2.2.1.1.Trồng lúa sử dụng phƣơng pháp thủy canh……..................20
2.2.1.2.Thí nghiệm xử lý mặn........................................................... 20
ii


2.2.2. Tách chiết DNA tổng số ................................................................. 21
2.2.3. Phƣơng pháp PCR........................................................................... 22
2.2.4. Tinh sạch ......................................................................................... 23
2.2.5. Phần mềm sử dụng để phân tích số liệu .......................................... 24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 25
3.1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa.................................... 25
3.2.Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên một số đặc điểm sinh lý của
cây lúa.................................................................................................. 27
3.2.1 Kết quả đánh giá về chiều dài thân sau khi xử lý mặn .................. 27
3.2.2. Kết quả đánh giá chiều dài rễ sau khi xử lý mặn ........................ 30
3.2.3.Kết quả đánh giá khối lƣợng thân sau khi xử lý mặn....................31
3.2.4.Kết quả đánh giá khối lƣợng rễ sau khi xử lý mặn........................32
3.3. Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa ......................................................... 33
3.4. Nhân bản gen OsHKT1 ......................................................................... 34
3.5.Giải trình tự gen OsHKT1 ở 8 giống lúa. .............................................. 36
3.6. Phân tích trình tự gen ở 8 giống lúa ..................................................... 36
3.7.Phân tích trình tự acid amin suy diễn của protein mã hóa bởi gen
OsHKT1 từ 8 giống lúa ................................................................................... 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 42
Kết luận ....................................................................................................... 42
Kiến nghị ...................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 43

iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại chi Oryza[85]. ........................................................... 4
Bảng 1.2. Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa ...... 5
Bảng 1.3. Danh sách các protein thuộc họ protein HKT ở lúa ................... 12
Bảng 2.1. Danh sách các giống lúa nghiên cứu ......................................... 16
Bảng 2.2. Các cặp mồi phản ứng PCR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ....... 17
Bảng 2.3. Môi trƣờng đa lƣợng ............................................................. 18
Bảng 2.4. Môi trƣờng vi lƣợng ....................................................................... 18
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa...20
Bảng 2.6. Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trƣởng và phát triển........ 21
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 23
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ....................................................... 23
Bảng 3.1Vị trí sai khác acid amin...................................................................41
Bảng 3.2.Bảng số liệu sau 3 ngày xử lý mặn..................................................60
Bảng 3.3.Bảng số liệu sau 7 ngày xử lý mặn..................................................62
Bảng 3.4.Bảng số liệu sau 14 ngày xử lý mặn................................................64

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cây lúa (Oryza sativa L.) ................................................................ 3
Hình 2. Cơ chế thích nghi stress chung ở Thực vật ..................................... 7
Hình 3. Điều hòa K+/Na+ ở thực vật bậc cao.....................................................9
Hình 4.Chức năng vận chuyển của protein HKT........... ....................... 11
Hình 5. Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thƣớc các đoạn exon, intron của chín gen
OsHKT ở lúa ........................................................................................ 13

Hình 6. Vị trí bắt cặp mồi trên gen OsHKT1 .................................................. 16
Hình 7. Lúa trồng trƣớc khi xử lý mặn ........................................................... 25
Hình 8. Lúa sau 3 ngày xử lý mặn .......................................................... 25
Hình 9. Lúa sau 7 ngày xử lý mặn .................................................................. 25
Hình 10. Lúa sau 14 ngày xử lý mặn .............................................................. 25
Hình 11. Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái
của cây lúa sau 3 ngày ..................................................................................... 26
Hình 12. Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái
của cây lúa sau 7 ngày .................................................................................... 26
Hình 13. Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái
của cây lúa sau 14 ngày .................................................................................. 27
Hình 14. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 3 ngày xử lý mặn ............... 28
Hình 15.Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 7 ngày xử lý mặn ............... 29
Hình 16.Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 14 ngày xử lý mặn ............. 29
Hình 17. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 3 ngày xử lý mặn ................... 30
Hình 18. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 7 ngày xử lý mặn ................... 31
Hình 19.Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 14 ngày xử lý mặn .................. 31
Hình 20. Đồ thị biểu diễn khối lƣợng thân ..................................................... 32
Hình 21.Đồ thị biểu diễn khối lƣợng rễ...........................................................33
Hình 22.DNA tổng số tách từ lá lúa...............................................................33
Hình 23. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 1 ...................................... 34
v


Hình 24. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 2 ...................................... 34
Hình 25. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 3 ...................................... 35
Hình 26. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4 ...................................... 36
Hình 27. Hình ảnh cho thấy một phần kết quả giải trình tự đối với mẫu nếp
nõn tre sử dụng cặp mồi 3 ............................................................................... 36
Hình 28. So sánh trình tự vùng mã hoá của gen giữa các giống lúa............... 38

Hình 29. So sánh trình tự vùng không mã hoá của gen giữa các giống lúa... 39
Hình 30. So sánh trình tự acid amin suy diễn từ trình tự nucleotide thu đƣợc
giữa các giống lúa ........................................................................................... 40
Hình 31. Cấu trúc protein xuyên màng ........................................................... 41

vi


MỞ ĐẦU
Lúa là một trong năm loại cây lƣơng thực chính trên thế giới, diện tích trồng
lúa và lƣợng tiêu thụ chủ yếu ở Đông Nam Á và Châu Phi... Hiện nay, lúa đƣợc
trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau ở cả ba vùng nhiệt
đới, cận nhiệt đới và ôn đới trên tất cả các châu lục [4, 61 ].
Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp với truyền thống trồng cây lúa với nền
văn minh lúa nƣớc có trên 4000 năm lịch sử. Việt Nam còn đƣợc xếp vào hàng
những nƣớc xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Sản lƣợng gạo xuất khẩu năm 2014
lên tới 44,5 triệu tấn lúa (27,8 triệu tấn gạo). Lúa gạo cung cấp nguồn lƣơng thực

chính cho chúng ta, tạo việc làm cho hàng triệu nông dân và đóng vai trò quan
trọng trong sự phát triển kinh tế của Việt Nam.
Tuy nhiên, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lƣơng thực, sự
khan hiếm về nƣớc tƣới phục vụ cho nông nghiệp đã đƣợc báo động trong
nhiều hội nghị khoa học của thế giới gần đây. Lũ lụt và sự xâm nhập mặn sẽ
trở thành vấn đề then chốt trong những năm tới. Với tầm quan trọng nhƣ vậy,
ngƣời ta đã hoạch định một thứ tự ƣu tiên trong đầu tƣ nghiên cứu tính chống
chịu mặn và chống chịu hạn trên toàn thế giới, trong lĩnh vực cải tiến giống
cây trồng, sau đó là tính chống chịu lạnh, chống chịu ngập úng, chống chịu
đất có vấn đề (acid, thiếu P, ngộ độc Fe, ngộ độc Al, thiếu Zn, Mg, Mn và một
số chất vi lƣợng khác nhƣ Cu,…). Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự
nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần đƣợc quan tâm nghiên

cứu.
Cây trồng trên đất nhiễm mặn bị ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát
triển và năng suất. Khả năng điều hòa cân bằng hàm lƣợng ion Na + trong tế
bào là một trong những cơ chế quan trọng giúp cây sinh trƣởng, phát triển
trong điều kiện đất nhiễm mặn. Cơ chế điều hòa đƣợc thực hiện thông qua
việc: Hạn chế lƣợng ion Na+ đƣa vào tế bào; khu trú ion Na+ vào không bào;
thải loại ion Na+ ra ngoài môi trƣờng.
Gen OsHKT1 mã hóa cho protein có vai trò vận chuyển Na+ vào tế
1


bào ở cây lúa. Nghiên cứu cấu trúc, chức năng của gen OsHKT1 giúp làm
sáng tỏ cơ chế chịu mặn của cây lúa. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên
cứu “Nghiên cứu tính đa hình của gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận
chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở cây lúa” nhằm nghiên cứu tính
đa hình của gen OsHKT1 ở lúa.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Vài nét sơ lƣợc về cây lúa
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lƣơng thực chính
của nƣớc ta và nhiều nƣớc trên thế giới. Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở
các nƣớc Châu Á với mức tiêu dùng hàng năm khoảng 180 - 200 kg/ngƣời, ở
Châu Mỹ, Châu Âu khoảng 100 kg/ngƣời [6].

Hình 1. Cây lúa (Oryza sativa L.)[6]
Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trƣớc đây gọi là họ Hoà thảo
(Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và

Oryza glaberrima. Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza
glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi. Năm 1753, Lineaeus là ngƣời đầu tiên đã
mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza. Dựa vào dạng hạt tác giả đã phân chi
Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi
Oryza gồm tất cả 19 loài .
Hội nghị di truyền lúa Quốc tế đã tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa
Quốc tế, Philippines năm 1994 khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có
20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng[61].

3


Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New
Ginea là loài Oryza rhizomatis, đƣa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia
thành bốn nhóm genome [61]. Danh sách các loài, số lƣợng nhiễm sắc thể, bộ
gen của từng loài đƣợc ghi ở Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Phân loại chi Oryza[61]

Ngày nay, các nhà phân loại học đều thống nhất là chi Oryza có 23
loài, trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza
glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA. [3,6]. Loài Oryza
glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa đƣợc
gieo trồng khắp thế giới và đƣợc chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica.
Trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica
còn có nhiều loại hình trung gian nhƣ Javanica v.v..
Nghiên cứu biến đổi trình tự DNA của gen bằng phƣơng pháp địa lý thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng [2,7,8]. Kết quả cho thấy,
cây lúa trồng đã đƣợc thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác nhau
4

của loài Oryza rufipogon và sản phẩm của hai lần biến đổi này đã tạo ra hai
loài phụ là Indica và Japonica. Và đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát
của 3 nhóm lúa đƣợc trình bày ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa[61]
Đặc tính INDICA

JAVANICA

JAPONICA

Thân

-Thân cao

-Thân cao trung bình

Thân thấp

Chồi

-Nở bụi mạnh

-Nở bụi thấp

Nở bụi trung bình

Lá

-Lá rộng, xanh nhạt
-Hạt thon dài, dẹp

-Hạt hầu nhƣ không
có đuôi

Hạt

-Trấu ít lông và lông
ngắn
-Hạt dễ rụng

Sinh học

-Tính quang cảm rất
thay đổi

-Lá rộng, cứng, xanh
nhạt
-Hạt to, dầy
-Hạt không có đuôi hoặc
có đuôi dài
-Trấu có lông dài
-Ít rụng hạt

-Tính quang cảm rất yếu

Lá hẹp, xanh đậm
-Hạt tròn, ngắn
-Hạt không đuôi tới
có đuôi dài
-Trấu có lông dài và
dầy

-Ít rụng hạt
-Tính quang cảm rất
thay đổi

1.2 Đất mặn và cơ chế chống chịu mặn ở Thực vật
1.2.1 Đất mặn
Tất cả các loại đất đều có chứa một lƣợng muối tan nào dó. Trong số đó
có nhiều loại muối là các chất dinh dƣỡng cần thiết cho cây trồng. Tuy nhiên,
khi số lƣợng các muối trong đất vuợt quá giá trị cho phép, thì sự phát triển,
năng suất, chất luợng của hầu hết các loại cây đều bị ảnh hƣởng xấu, mức độ
ảnh hƣởng tuỳ thuộc vào loại và số lƣợng muối có mặt trong đất, tuỳ thuộc
vào giai đoạn sinh trƣởng, vào loại thực vật và các yếu tố môi trƣờng. Do đó
khi đất chứa một lƣợng muối gây cản trở và ảnh hƣởng đến chức năng cần
thiết để cây sinh trƣởng, thì đất đó đƣợc gọi là đất bị ảnh hƣởng bởi mặn (salt
affected soil). Tóm lại, rất khó có thể định nghĩa đất mặn một cách chính xác
và đầy đủ, vì vậy dựa vào chỉ tiêu độ dẫn điện EC, hoặc phần trăm Na+ trao
5


đổi (EPS) hoặc tỉ lệ hấp thu Na+ (SAR) và độ pH của đất bão hòa nƣớc [19]
đa số các nhà khoa học đã định nghĩa đất mặn là đất có độ dẫn điện EC cao
hơn 4 dS/m ở nhiệt độ 250C, phần trăm Na+ trao đổi (ESP) thấp hơn 15, và pH
nhỏ hơn 8,5 [1,62].
Ðất mặn đƣợc chia làm 2 dạng: đất mặn duyên hải và đất mặn nội địa:
- Ðất mặn duyên hải: xuất hiện ở vùng ven biển, tính mặn chủ yếu do
tràn ngập của nƣớc biển và nƣớc thƣờng có pH thấp, đất mặn ven biển thƣờng
có tổng số muối tan lớn hơn 0.5% (tƣơng đƣơng với > 0,15% Cl-) và nếu đạt
mức nhiễm mặn trung bình thì tổng số muối tan lớn hơn 0,25% (˜ 0.05 % Cl-)
- Ðất mặn nội địa: xuất hiện ở vùng khô và bán khô, tính mặn do nƣớc
dẫn thủy hoặc nuớc ngầm, sự bốc hơi cao dẫn đến muối tập trung ở vùng rễ

và đất thƣờng có pH cao [32].
1.2.2 Cơ chế thích nghi stress mặn ở thực vật
Nồng độ muối cao trong đất là nguyên nhân gây ra 2 vấn đề chính đối
với thực vật:
(1) giảm điện thế nƣớc trong đất gây khó khăn cho sự hấp thụ nƣớc, dẫn
đến tính trạng thiếu nƣớc;
(2) sự tích tụ hàm luợng Na+ và Cl- cao gây độc đối với tế bào thực vật
[10] và gián tiếp gây độc do khó hấp thụ các chất dinh duỡng cần thiết khác.
Khả năng chống chịu mặn của thực vật phụ thuộc vào sự thích nghi sinh
lý, sinh hóa và phân tử đƣợc kích hoạt bằng bộ gen để sống sót trong môi
truờng muối (Hình 2). Cơ chế thích ứng sẽ thiết lập lại sự vận chuyển nƣớc,
giới hạn hấp thụ Na+ và Cl- hoặc làm giảm nồng độ của chúng trong tế bào
chất và cho phép hấp thụ các ion cần thiết cho quá trình sinh trƣởng. Thực vật
cảm nhận stress mặn là do điện thế nƣớc trong môi trƣờng thấp,cây không thể
hút nƣớc và dẫn đến bị mất nuớc, kết quả là sự sinh trƣởng bị ức chế và dần bị
chậm lại. Vì thế, để có thể chống chịu với điều kiện điện thế nƣớc thấp do
stress mặn gây ra, thực vật phải điều chỉnh quá trình thoát hơi nƣớc, từ đó có
thể giới hạn sự mất nƣớc hoặc là tiến hành điều chỉnh điện thế thẩm thấu [19].
6


Stress
thẩm
thấu

Tình trạng
thiếu nƣớc

Độc tính
của Na+ và

Cl-

Stress
Mặn

Hoạt
hóa
gen

Cơ
chế
chống
chịu

Stress
ion

Sự không cân
bằng ion /
Ca2+, K+,
Mn2+, Mg2+,
NO-, PO42-,
2- chung ở thực vật [19]
Hình 2. Cơ chế thích nghi SO
stress
4
Ngoài ra, stress ion do cây hấp thụ chủ yếu các ion độc Na+ và Cl- vào
trong tế bào và sự không cân bằng các ion (Ca+, K+, Mn2+, Mg2+, NO3+, PO42,SO42- .v.v.) sẽ gây rối loạn trao đổi chất của tế bào, ức chế hoạt động enzyme
và các chất kích thích sinh trƣởng [19]. Ðồng thời, các hoạt động sinh lý của
tế bào cũng bị ảnh huởng nhƣ: quá trình quang hợp giảm mạnh [57], quá trình

tổng hợp sắc tố bị ức chế trong khi đó quá trình hô hấp lại tăng nhanh, các cơ
chất bị phân hủy lớn nhƣng hiệu quả năng lƣợng thấp, vì vậy thực vật không
bù đủ lƣợng vật chất do hô hấp phân hủy, chất dự trữ dần dần bị hao hụt, cây
không sinh trƣởng đƣợc, còi cọc, năng suất thấp, và nếu kéo dài sẽ dẫn đến bị
chết. Ðể có thể sinh trƣởng trên đất mặn, và hạn chế ảnh huởng của Na+ và
Cl-, thực vật đã phát triển cơ chế điều hòa với chiến lƣợc: giảm sự xâm nhập
và giảm nồng độ của Na+ trong tế bào chất bằng cách loại thải và khu trú ion
Na+ vào không bào, ƣu tiên hấp thụ K+(là ion đóng vai trò quyết định trong
việc đóng mở khí khổng, hoạt hóa enzyme, quang hợp và điều hòa áp suất
thẩm thấu) để duy trì tỉ lệ K+/Na+ trong chất nền [19] .

7


1.2.3 Phản ứng chống chịu mặn của cây lúa
Tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi theo các
giai đoạn sinh trƣởng khác nhau đối với cây lúa. Cơ chế chống chịu mặn của
cây đƣợc biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng [55]. Mặn
ảnh hƣởng đến hoạt động sinh trƣởng của cây lúa dƣới những mức độ thiệt
hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trƣởng phát triển khác nhau[56,57].
Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng tính chống chịu mặn xảy ra ở giai đoạn hạt
nẩy mầm, sau đó trở nên rất mẫn cảm trong giai đoạn mạ (tuổi lá 2-3), rồi trở
nên chống chịu trong giai đoạn tăng trƣởng, kế đến nhiễm trong thời kỳ thụ
phấn và thụ tinh, cuối cùng thể hiện phản ứng chống chịu trong thời kỳ hạt
chín[57,59].Tuy nhiên, một vài nghiên cứu ghi nhận ở giai đoạn lúa trổ, nó
không mẫn cảm với stress do mặn. Do đó, ngƣời ta phải chia ra nhiều giai
đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ cơ chế chống chịu mặn của cây trồng.
Theo [62], những thay đổi sinh lý của cây lúa liên quan đến tính chống
chịu mặn đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
• Hiện tƣợng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lƣợng muối dƣ

thừa nhờ hiện tƣợng hấp thu có chọn lọc.
• Hiện tƣợng tái hấp thu - Cây hấp thu một lƣợng muối thừa nhƣng đƣợc
tái hấp thu trong mô libe. Na+ không chuyển vị đến chồi thân.
• Chuyển vị từ rễ đến chồi – Tính trạng chống chịu mặn đƣợc phối hợp
với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở
chồi, làm cho sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi .
• Hiện tƣợng ngăn cách từ lá đến lá - Lƣợng muối dƣ thừa đƣợc chuyển
từ lá non sang lá già, muối đƣợc định vị tại lá già không có chức năng, không
thể chuyển ngƣợc lại.
• Chống chịu ở mô – Cây hấp thu muối và đƣợc ngăn cách trong các
không bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hƣởng độc hại của muối đối với
hoạt động sinh trƣởng của cây

8


• Ảnh hƣởng pha loãng – Cây hấp thu muối nhƣng sẽ làm loãng nồng độ
muối nhờ tăng cƣờng tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lƣợng nƣớc
trong chồi
Tỉ lệ Na+/K+ trong chồi đƣợc xem nhƣ là chỉ tiêu chọn lọc giống lúa
chống chịu mặn [41,43].Tất cả những cơ chế này đều nhằm hạ thấp nồng độ
Na+ trong các mô chức năng, do đó làm giảm tỉ lệ Na +/K+ trong chồi (< 1)
giúp cho cây sống đƣợc ở môi trƣờng nhiễm mặn.
1.3 Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở thực vật
Đến nay, một loạt các hệ thống vận chuyển đã đƣợc báo cáo là có khả
năng giúp thực vật cải thiện khả năng chịu mặn bằng cách ức chế sự hấp thụ
Na+, hoặc vận chuyển Na+ vào không bào của tế bào (Hình 3). Mô hình đơn
giản cho cơ chế hấp thụ K+ / Na+ , sự tuần hoàn và loại bỏ Na+ bởi các lớp
khác nhau của Na+ channels/transporters đƣợc thể hiện trong (hình 3). Chẳng
hạn nhƣ Kênh vận chuyển cation không chuyên biệt-Nonselective cation

channels ( NSCCs ), kênh đồng vận chuyển cation- Cl- - cation-Cl−cotransporter (CCC), kênh vận chuyển cation ái lực thấp - low-affinity cation
transporter (LCT) salt overly sensitive 1 (SOS1) , Na+ / H+ antiporter NHX1
và kênh vận chuyển K+ ái lực cao - high affinity potassium transporter (HKT /
HAK). Tế bào rễ thực vật hấp thụ Na+ / K+ từ đất thông qua một vài kênh
nhƣ (NSCCs, AKT1, LCT1 và CCC), transporter (KUP / HAK / KT và HKT)
và apoplastic. Kênh thẩm thấu-Permeations Channel và apoplastic là những
con đƣờng chính để hấp thụ Na+ dƣới tress muối. Con đƣờng SOS trung gian
loại bỏ Na+ qua màng tế bào ra ngoài dung dịch đất hoặc apoplast. NHX1
phân vùng Na+ trong không bào và điều hòa nồng độ Na+ trong cytosol.
AtHKT1; 1, OsHKT1; 5, TaHKT1; 5 và TmHKT1; 4/5 đƣợc chứng minh có
vai trò lấy Na+ từ xylem vào các tế bào nhu mô xylem và ngăn chặn Na+ tích
lũy trong chồi. Có giả thuyết cho rằng AtHKT1; 1 gián tiếp phục hồi Na+ từ
chồi tới rễ thông qua việc loại bỏ các Na+ từ xylem và chuyên chở Na + vào .
Các quá trình này đảm bảo cân bằng K+ / Na+ nội bào và cũng duy trì tỉ lệ K+ /
Na+ cao để giúp thực vật duy trì sự sống khi bị stress muối[39].
9


Hình 3. Điều hòa K+/Na+ ở thực vật bậc cao[39].
1.4 Protein HKT ở thực vật
1.4.1 Vai trò, chức năng của protein HKT ở thực vật
Vai trò quan trọng của protein HKT trong việc giúp cho thực vật có
thể tồn tại trong điều kiện đất nhiễm mặn đã đƣợc khẳng định trong các thí
nghiệm loại gen trực tiếp làm cây mẫn cảm với muối và thông qua biểu hiện
biến đổi gen của các gen trong họ gen HKT ở các loài thực vật khác, ví dụ:
biểu hiện của các gen: OsHKT1(hình bầu dục màu tím), OsHKT 8(hình bầu
dục màu cam), AtHKT1(hình bầu dục màu hồng) ở thực vật cho phép chúng
phát triển tốt hơn trong điều kiện mặn.(Hình 4)

10

Hình 4. Chức năng vận chuyển Na+ của protein HKT [42,62].
Nhƣ chúng ta đã biết ion Na+ là một ion có hại đối với tế bào, Na+ ở
nồng độ cao sẽ ức chế sự tăng trƣởng của cây. Vì vậy protein HKT có 2 chức
năng quan trọng là:
 Chức năng vận chuyển ion qua màng tế bào: Protein HKT đƣợc
mã hóa bởi họ gen HKT có vai trò quan trọng trong việc hấp thu Na+ từ ngoài
môi trƣờng vào tế bào ở cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm . Tuy nhiên,
kích thƣớc của họ gen HKT trong cây hai lá mầm là nhỏ hơn kích thƣớc họ
gen HKT trong cây một lá mầm. [37,39]
 Chức năng cân bằng nồng độ Na+ và K+ khi cây gặp điều kiện
mặn bằng cách: Ion Na+ có tác động phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế
bào chất trong cây. Ion K+ có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và
đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn của cây. Hơn nữa, sự mất cân
bằng tỷ lệ Na-K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt. Do vậy, cây chống chịu
mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na+ và gia tăng hấp thu K+ để duy
trì sự cân bằng Na+/K+ trong chồi [53].
1.4.2 Họ protein HKT ở lúa
Ở lúa có chín gen thuộc họ gen HKT ( OsHKT1 -9) (Bảng1. 3) đã đƣợc
xác định, chỉ có OsHKT5 đƣợc coi là một gen không có chức năng , do sự tồn
tại của ba stop codons trong mRNA của nó [33,34].Tất cả các gen khác có
11


chức năng mã hóa các protein có vai trò vận chuyển riêng biệt thể hiện trong
các mô / hoặc cơ quan khác nhau . [54]cho rằng OsHKT1 mã hóa cho protein
vận chuyển Na+ và OsHKT2 mã hóa cho protein đồng vận chuyển Na+ /
K+. [34] cũng cho thấy OsHKT1 có ái lực cao với vận chuyển Na+ và
OsHKT4 có ái lực thấp với vận chuyển Na+. OsHKT8 gần đây đã đƣợc biết

đến là một gen mã hóa cho protein có vai trò vận chuyển Na + , góp phần vào
khả năng chịu mặn ở thực vật bằng cách duy trì cân bằng nồng độ K+ [60] .
Do đó, họ gen HKT ở lúa có vai trò quan trọng đối với cân bằng nồng độ ion
ở thực vật nhờ việc hạn chế ion Na+ đƣa vào tế bào trong điều kiện đất
nhiễm mặn [13].
Bảng 1.3 Danh sách họ gen HKT ở lúa[34,42 ]
TênProtein
HKT

Nucleotide

Locus

Protein

OsHKT1

AB061311

Os06g48810

BAB61789

OsHKT2

AB06611313

OsHKT3

AJ491820

Os01g34850

CAD37187

OsHKT4

AJ491816

Os04g51820

CAD37183

OsHKT5

AJ506745

OsKHT6

AJ491818

Os02g07830

CAD37185

OsHKT7

AJ491853

Os04g51830

CAD37197

OsHKT8

AK108663

Os01g20160

BAB93392

OsHKT9

AJ491855

Os06g48800

CAD37199

BAB661791

Và vị trí, kích thƣớc các đoạn exon , intron của 9 genesOsHKT đƣợc
biểu thị trên hình sau:

12


Hình 5. Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thƣớc các đoạn exon, intron của chín
gen OsHKT ở lúa[34,42,61 ]
Các thanh màu đen đại diện cho khung đọc mở, và các vị trí và độ dài của intron

được quy định bởi các vết cắt và thanh màu xám. Intron lớn được đưa ra khỏi cấu
trúc mô hình gen và độ dài được ghi nhận. Các đường chấm chấm nối hai mảnh
màu đen của OsHKT2 không cho thấy sự tương đồng với gen HKT khác. Đoạn này
nằm ngoài cấu trúc mô hình, và chiều dài được ghi nhận.

1.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu, vai trò của nghiên cứu đa hình gen
Ngày nay, việc sử dụng các chỉ thị phân tử DNA về đa hình các đoạn
DNA nhân bản ngẫu nhiên RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),
đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn-RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism), sự lặp lại các chuỗi đơn giản-SSR (Simple Sequence
Repeats) hay còn gọi là tiểu vệ tinh (Microsatellite) để phân loại, nghiên cứu
đa dạng sinh học của động vật, thực vật và vi sinh vật ngày càng phổ biến trên
thế giới và ở Việt Nam .
Kỹ thuật PCR(polymerase Chain Reaction) này thực chất tạo dòng in
vitro, không cần sự hiện diện của tế bào. Điều kiện của phản ứng PCR: DNA,
hai đoạn mồi(mỗi mồi dài từ 18-24 nucleotide), Taq polymerase, dung dịch
đệm, ion Mg2+
Kỹ thuật RAPD phát triển trên cơ sở PCR sử dụng một số đoạn mồi ngẫu
nhiên. Kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng kết hợp cùng với một số kỹ thuật khác
để phân loại, nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các cá thể thực vật với nhau .
13


Dựa vào những kết quả đã đƣợc công bố, nghiên cứu đa hình bằng chỉ
thị phân tử cho kết quả có độ tin cậy cao, thời gian đƣợc rút gắn. Với lý do đó
các kỹ thuật nghiên cứu đa hình gen đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các nghiên
cứu.
1.6. Tình hình nghiên cứu liên quan đến gen OsHKT1
Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vai trò của gen mã
hóa cho protein vận chuyển ion Na+ ở lúa. Biểu hiện của OsHKT1, OsHKT2

và OsVHA đã đƣợc nghiên cứu nhờ kỹ thuật RT-PCR và insitu PCR.
Gần đây, một gen OsHKT từ giống lúa chịu mặn Nona Bokra đã đƣợc
cô lập. Gen này có vùng 5' tƣơng ứng với gen OsHKT2, nhƣng vùng 3' tƣơng
ứng với các OsHKT1. Gen mới này đƣợc gọi là OsHKT1-2 và nó là kết quả
của đột biến mất đoạn 15 kb trên nhiễm sắc thể số 6 của Nona Bokra, dẫn đến
một liên kết giữa đầu 5' gen OsHKT2 và đầu 3' gen OsHKT1 [54] .
Biểu hiện của OsHKT1-2 trong tế bào trứng ếch hoặc tế bào nấm
men cho thấy rằng OsHKT1-2 cho phép hấp thu cả Na+ và K+ qua màng tế
bào ngay cả khi nồng độ Na+ bên ngoài cao. Hoạt động của protein OsHKT12 là tƣơng tự với OsHKT2. Nhƣ OsHKT1 và OsHKT2, protein OsHKT1-2
đƣợc biểu hiện trong rễ cho phép vận chuyển ion K + qua màng tế bào. Trái
ngƣợc với OsHKT1, biểu hiện của OsHKT1-2 giảm xuống trong điều kiện
mặn nhƣng chức năng không bị mất đi. Hơn nữa, mức giảm biểu hiện này
trong OsHKT1-2 là ít nghiêm trọng hơn so với việc giảm biểu hiện của gen
OsHKT1 và OsHKT2. Điều này cho thấy OsHKT1-2 đóng một vai trò quan
trọng trong việc vận chuyển ion K+ khi cây gặp điều kiện mặn [54] .
Một nghiên cứu tiếp theo trên đối tƣợng gen OsHKT1 là nghiên cứu
đột biến định hƣớng đƣợc thực hiện trên cDNA gen OsHKT1của giống lúa
Nipponbare (Ni-OsHKT1) để xác định biến thể trên gen. Gen Ni-OsHKT1
đƣợc biểu hiện trong tế bào trứng ếch và đƣợc nghiên cứu chức năng khi đƣợc
biểu hiện ở tế bào trứng. Ni- OsHKT1, khi biểu hiện trong tế bào trứng, giống
nhƣ một Na+-K+ symport ở nồng độ Na+ và K+ rất thấp, và nhƣ là một Na+
Uniport với nồng độ Na+ trong khoảng millimolar [19,20]. Ni- OsHKT1 đƣợc
14


chứng minh vận chuyển cả Na+ và K+ ở nồng độ thấp khi thay đổi điện tích điện áp (I- V) .Ở nồng độ Na+ cao, OsHKT1không tiếp tục vận chuyển K+ nữa.
Một đặc tính đặc trƣng của OsHKT1 là có ái lực cao với K+. Các tính chất
chức năng của protein mã hóa bởi gen Ni- OsHKT1 ở lúa đƣợc so sánh với
biến thể OsHKT1 biểu hiện trong tế bào trứng ếch và nhận thấy không có sự
khác biệt về tính thấm Na+ và K+ cũng nhƣ cho thấy tính chất chức năng

chính của Ni- OsHKT1 đƣợc bảo toàn trong 6 biến thể: G17/V, G17/V
D403/E, R21/K R32/K, R21/R32 K/ KD403/E, F61/ S và các biến thể D403/
E gen OsHKT1 trong tế bào trứng ếch [33].
1.7. Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu của đề tài
1.7.1.Mục tiêu
Phát hiện sự sai khác trong trình tự nucleotide của gen OsHKT1 và trong
trình tự acid amin suy diễn tƣơng ứng của protein OsHKT1 ở một số giống lúa
có khả năng kháng mặn khác nhau .
1.7.2. Nội dung nghiên cứu
 Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa.
 Tách chiết DNA tổng số của các giống lúa
 Nhân bản gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một
số giống lúa
 Xác định trình tự gen OsHKT1ở một số giống lúa.
 So sánh trình tự nucleotide của gen OsHKT1 và trình tự acid amin
suy diễn ở một số giống lúa nhằm phát hiện đa hình của gen
OsHKT1.

15


CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Mẫu vật nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 14 giống lúa khác nhau đƣợc
cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên thực vật và Học viện Nông nghiệp Việt
Nam nhƣ trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh sách giống lúa nghiên cứu
STT
1

2
3
4
5
6
7

Tên Giống
Hom Râu
Nếp ốc
Nếp nõn tre
Ngoi
Nƣớc mặn dạng 2
Dâu Ấn độ
Nếp vải

STT
8
9
10
11
12
13
14

Tên Giống
Chiêm cũ
Ré nƣớc
IR-29(Chuẩn nhiễm)
Pokkali(Chuẩn kháng)

Nipponbare
IR-28(Chuẩn nhiễm)
Nếp đèo đàng

2.1.2 Mồi phản ứng PCR
Các mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng PCR đƣợc đặt tại IDT
(Integrated DNA technologies), Mỹ.
Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu hình 6

Hình 6. Vị Trí bắt cặp mồi trên gen OsHKT1
Đoạn exon màu xanh lục, màu nâu tương ứng intron, hộp màu xanh lá cây là
vị trí mã khởi đầu và hộp màu đỏ là vị trí mã kết thúc
16