Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp để thu nhận bioethanol tt

I.

1.

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

Đặt vấn đề

Hiện nay, nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất kì quốc gia nào trên thế giới. Trong số các
nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió, mặt trời, hạt nhân,…), năng lượng
sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu, nhất là ở các nước nông nghiệp và nhập khẩu nhiên liệu. Dựa vào
nguyên liệu sản xuất, người ta chia NLSH thành 4 thế hệ: Thế hệ I (từ tinh bột như ngô, sắn, mía đường), thế hệ
II
(từ sinh khối thực vật như thân cây lúa, ngô, lúa mỳ, bã mía), thế hệ thứ III (từ các loài vi tảo) và thế hệ
IV nhiên liệu tiên tiến (dựa trên các chuyển hóa sinh - hóa, nhiệt – hóa). Chúng phân thành ba nhóm là dầu sinh học
(biodiesel), khí sinh học (biogas) và bioethanol (ethanol sinh học). Trong đó, bioethanol đang rất được quan tâm
do từ ngày 01/01/2018 chính phủ ban hành quyết định sử dụng xăng sinh học E5 (5% bioethanol) thay thế xăng
RON 92 trên toàn quốc. Do vậy, nhu cầu sản xuất và tiêu thụ bioethanol ngày càng tăng cao.
Việc sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung và bioethanol theo thế hệ I từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường
(mía) rất phổ biến. Bên cạnh đó, bioethanol còn được sản xuất từ lignocellulose theo thế hệ thứ II. Nguồn
nguyên liệu này chủ yếu bao gồm: gỗ, rơm lúa, bã mía, thân cây ngô…là các sinh khối có thành phần
lignocellulose phổ biến nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này sử
dụng chưa hiệu quả mà chủ yếu theo phương pháp truyền thống như làm cơ chất nuôi nấm, thức ăn gia súc, ủ
làm phân bón, đốt... Do vậy, việc tận dụng nguồn cơ chất này để sản xuất bioethanol là một giải pháp thích hợp,
đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam. Mặc dù nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose
rất phổ biến nhưng những khó khăn để có thể tận dụng hiệu quả nguồn sinh khối này cho sản xuất các sản phẩm
có giá trị cao hơn chủ yếu do lignocellulose có cấu trúc phức tạp, khó chuyển hóa sinh học. Do đó, nhiệm vụ tìm
kiếm giải pháp thích hợp để chuyển hóa hiệu quả vật liệu trên thành dạng năng lượng có ích ngày càng trở nên
cấp thiết. Theo phương thức truyền thống có thể sử dụng phương pháp hóa học (axít/bazơ) hoặc hóa lý
(nghiền/nổ hơi). Tuy nhiên, một trong những hướng đi mới để giải quyết nhiệm vụ này là sử dụng xúc tác sinh
học (enzyme từ các loài nấm), chúng được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả giúp chúng phân hủy tốt

lignocellulose để giải phóng các đơn vị đường cần thiết cho quá trình lên men bioethanol. Tuy nhiên, nhìn chung
các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp trên cơ chất thô và việc xúc tác chuyển
hóa hiệu quả cơ chất cần kết hợp nhiều enzyme có tác dụng hiệp đồng. Với mục đích như trên đề tài NCS
“Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công-nông
nghiệp để thu nhận bioethanol” sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme
esterase (acetyl esterase và feruloyl esterase), enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa từ nấm để phân hủy các cấu
trúc polymer phức tạp để lên men thu nhận bioethanol. Việc sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối phụ phẩm
công - nông nghiệp một mặt tận dụng nguồn nguyên liệu rồi rào thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống (vd:
ngũ cốc, bắp, sắn), mặt khác tạo thành nguồn năng lượng sạch giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do đốt
hoặc xử lý theo phương pháp truyền thống gây ra, đồng thời không ảnh hưởng tới an ninh lượng thực quốc gia.
Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II.

1


2. Mục tiêu nghiên cứu
Hiên nay, khả năng chuyển hóa các vật liệu thô từ sinh khối giàu lignocellulose bằng các phương pháp
truyền thống còn nhiều mặt hạn chế. Do vậy, mục tiêu của đề tài luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tác
sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để chuyển hóa hiệu quả sinh khối giàu lignocellulose từ các phụ phẩm
công-nông nghiệp thành các đường (C 5 và C6) có khả năng lên men cho sản xuất bioethanol. Đặc biệt, luận án sử
dụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả năng chuyển hóa sinh học. Trong đó, nghiên cứu sử dụng
carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)] nhằm phối hợp với các enzyme tấn công
mạch chính (cellulase/xylanase) và mạch nhánh để thủy phân cấu trúc lignocellulose. Mục tiêu tiếp theo là đánh
giá khả năng lên men nguồn dịch đường sau thủy phân bằng “enzyme cocktail” thành bioethanol.
3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu chính đã thực hiện:
-

Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme carbohydrate

esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)];
-

Sinh tổng hợp và tinh sạch protein enzyme hoạt tính FAE và AE từ môi trường nuôi cấy nấm và xác định

đặc tính của enzyme tinh sạch.
-

Chuyển hóa vật liệu lignocellulose thành các đường đơn (hexose và pentose) có khả năng lên men sử

dụng đơn enzyme và “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanase và esterase xúc tác hiệp đồng.
-

Tối ưu quy trình chuyển hóa và nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch đường chuyển hóa quy mô

phòng thí nghiệm.
4.

Những đóng góp mới của luận án

-

44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và nấm Đảm (Basidiomycota) được

phân lập và sàng lọc khả năng sinh tổng hợp carbohydrate esterase (feruloyl esterase và acetyl esterase).
-

Lần đầu tiên, enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima và acetyl esterase từ nấm Xylaria

polymorpha được phân lập và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy giàu lignocellulose. Trong đó, feruloyl

esterase từ Alt. tenuissima (AltFAE) có trọng lượng phân tử Mw = 30,3 kDa với hoạt tính đặc hiệu 11,2 U/mg.
Acetyl esterase từ X. polymorpha (XpoAE) có trọng lượng phân tử M w = 44 kDa với hoạt tính đặc hiệu 13,1
U/mg. Hai enzyme này có độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 40 đến 45 0C và pH 5,0.
-

Enzyme carbohydrate esterases tinh sạch kết hợp với enzyme thương mại (hỗn hợp “enzyme cocktail”

hoạt tính cellulase/xylanse (cell/xyl)) được tối ưu thành phần và sử dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thô
(vd.
mía bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong túi…) thành các đường đơn có khả năng lên men bioethanol. Trong đó, bã
mía được chọn làm cơ chất phù hợp để sản xuất các đường C 5/C6 (vd: glucose, xylose).
Bằng quy hoạch thực nghiệm đã xác định điều kiện tối ưu cho chuyển hóa bã mía bằng “enzyme
cocktail” là
ở 400C, pH 5.0, trong 48 giờ và hoạt độ enzyme là cell/xyl: 100 U/g, AltFAE: 7,56 U/g, XpoAE: 10,8 U/g
sinh khối khô. Khi đó, tổng các đường lên men là 251,86 mg/g. Kết hợp xử lý bã mía bằng “enzyme cocktail”
và axit H2SO4 loãng (0,1%) thì các đường lên men sinh ra là 319,5 mg/g, đạt hiệu suất 49,8%.


2


-

Các đường đơn thu được bằng chuyển hóa enzyme đã được chứng minh có khả năng lên men bioethanol

(cồn sinh học) bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với hàm bioethanol thu được 178ml/kg bã mía,
đạt hiệu suất 79,8% so với lý thuyết.
5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
Bên cạnh sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía), bioethanol có thể được sản xuất
từ lignocellulose. Lignocellulose là loại sinh khối (biomass) phổ biến nhất trong sinh quyển. Sản xuất bioethanol

từ nguồn sinh khối là một giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam.
Hàng năm sản xuất công-nông nghiệp trong nước sản sinh hàng trăm triệu tấn phụ phẩm giàu lignocellulose là
nguồn cung cấp nguyên liệu vô cùng dồi dào cho sản xuất năng lượng sạch, mặt khác giải quyết vấn đề ô môi
trường do không được xử lý hay loại bỏ theo phương pháp truyền thống.
Theo các tài liệu công bố và kinh nghiệm nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, nhìn chung các enzyme thủy
phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp (không qua tiền xử lý) trên cơ chất thô. Điều này có thể
khắc phục bằng việc sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme thủy phân
và/hoặc oxy hóa để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp. Ngoài ra, sàng lọc enzyme bằng nuôi cấy vi sinh
vật có vai trò quan trọng trong việc tìm ra các enzyme mới với hoạt tính xúc tác thủy phân cao và các đặc tính
hữu ích.
Đề tài luận án không nhằm giải quyết được toàn bộ các bước từ chuyển hóa vật liệu sinh khối thô thành
bioethanol mà mục tiêu chính nhằm khai thác và sử dụng nguồn xúc tác sinh học từ nấm và tối ưu hóa cho
chuyển hóa sinh khối thành đường có khả năng lên men. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt
trong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II.
6.

Bố cục luận án

Luận án gồm 163 trang với 21 bảng, 58 hình, 144 tài liệu tham khảo. Bố cục của luận án: Mở đầu (4 trang),
Chương 1: Tổng quan (39 trang), Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (26 trang), Chương 3:
Kết quả và thảo luận: (67 trang), Kết luận (2 trang), Danh mục các công trình công bố (1 trang), Tài liệu tham
khảo (13 trang). Phụ lục (39 trang).
II.

NỘI DUNG LUẬN ÁN

Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học, tính mới, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của luận án.
Chương 1. Tổng quan
Phần này trình bày:
Tổng quan về phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose, trong đó trình bày về nguồn gốc, hiện

trạng sử
dụng phụ phẩm công-nông nghiệp ở Việt Nam nói chung và nguồn gốc, hiện trạng sử dụng, các vấn đề môi
trường từ bã mía ở Việt Nam nói riêng.
hóa

Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose bằng xúc tác sinh học. Trong đó làm nổi bật được cơ chế chuyển

của enzyme trong thủy phân lignocellulose, nguồn enzyme từ đa dạng nấm ở Việt Nam, enzyme thủy phân
lignocellulose từ nấm và vai trò enzyme carbohydrat esterase trong thủy phân lignocellulose.

3


Tổng quan về tình hình sản xuất bioethanol và những nghiên cứu, sản xuất bioethanol trong và ngoài
nước.
Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vi sinh vật
+
Quả thể nấm tươi được thu lượm từ vườn Quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình được sử dụng để phân lập
nấm,
sàng lọc và tinh sạch enzyme thủy phân phục vụ cho nghiên cứu.
+
Một số chủng nấm được chọn lọc từ bộ chủng giống lưu giữ tại phòng thí nghiệm Sinh học thực nghiệm,
Viện
+ Enzyme thương mại được tinh sạch từ nấm Trichoderma reesei (carboxymethyl cellulase and
glucuronoxylanase; 1-1,6 U/mg, Cell/Xyl, AB Enzyme, Darmstadt, Germany) hoạt động tối ưu ở pH 5.0-5.5,
nhiệt độ 40-45oC.
+
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 được cung cấp bởi phòng Vi sinh môi trường, Viện
Công

nghệ môi trường.
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật: Phân lập nấm; Nuôi cấy và bảo quản nấm men; Lên men bioethanol.
2.2.2. Định danh nấm: Định danh bằng phương pháp hình thái giải phẫu; Định danh bằng phương pháp sinh học
phân tử.
2.2.3. Sàng lọc hoạt tính esterase và lựa chọn chủng nấm
2.2.4. Đánh giá hoạt độ acetyl esterase và feruloyl esterase
2.2.5. Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase
2.2.6. Tinh sạch protein enzyme
2.2.7. Phương pháp hóa sinh: Sắc ký bản mòng (TLC); Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC; Xác định peptide bằng
phương pháp phổ khối (MS); Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic (DNS); Xử lý
nguyên liệu (bằng kiềm, axít và gia nhiệt); Xác định hàm lượng bioethanol.
2.2.8. Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose
2.2.9. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm
2.2.10. Phương pháp xử lý số liêu
2.3. Xây dựng sơ đồ nghiên cứu
2.3.1. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm
2.3.2. Sơ đồ thủy phân bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail”
2.3.3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa
Chương 3: Kết quả và thảo luận
3.1. Phân lập và sàng lọc nấm
Từ các mẫu nấm thu từ rừng QG Cúc Phương (Ninh Bình) đã phân lập được 44 chủng nấm thuộc 13 họ và
định tên khoa học đến loài. Các taxon nấm phân lập được:
3.1.1. Ngành nấm đảm Basidiomycota
Họ Polyporaceae: Coriolus unicolor, Tyromyces lacteus, Trametes insularis, Tr. consors, Tr. gibbosa,
Hexagonia apiaria, Nigroporus aratus


Họ Ganodermataceae: Ganoderma komingshegii, G. applanatum, Ganoderma sp.

4


Họ Coriolaceae: Poria versipora
Họ Marasmiaceae: Campanella junghuhnii, Marasmius maximus
Họ Agaricaceae: Coprinus disseminates
Họ Mycenaceae: Mycena galericulata
Họ Auriculariaceae: Auricularia delicate
Họ Hymernochaetaceae: Inonotus substygius, Polystictus didrichsenii
Họ Hygrophoropsidaceaee: Hygrophoropsis aurantiaca
3.1.2. Ngành nấm túi Ascomycota
Họ Xylariaceae: Xylaria polymorpha, X. carpophila, Hypoxylon monticulosum (CP629), Rosellinia sp.
(CP564), Nodulisporium sp. (CP582).
Họ Helotiaceae: Bisporella citrine
Họ Pleosporaceae: Alternaria tenuissima (SP66)
Họ Bionectriaceae: Bionectria sp. (CP587)
3.2. Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm
3.2.1. Sàng lọc hoạt tính feruloyl esterase (FAE)
Khả năng sinh tổng hợp feruloyl esterase của 44 chủng nấm lựa chọn được đánh giá qua khả năng phân giải
cơ chất ethyl ferulate (ethyl 4-hydroxy-3-methoxycinnamate) trên đĩa thạch. Chủng Alt. tenuissima SP66 do biểu
hiện hoạt tính feruloyl esterase cao nên được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo để xác định các điều kiện
nuôi cấy như thời gian, cơ chất/nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ và pH.
3.2.2. Sàng lọc hoạt tính acetyl esterase (AE)
Dịch lên men của 44 chủng nấm sau khi ly tâm để loại bỏ sinh khối và các thành phần tạp để xác định hoạt
tính acetyl esterase (AE) qua khả năng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl acetate. Chủng X. polymorpha A35 do
biểu hiện hoạt tính acetyl esterase cao nên được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp. Sau khi sàng lọc hoạt tính
feruloyl esterase và acetyl esterase đã lựa chọn hai chủng nấm có hoạt tính cao là Alt. tenuissima SP66 và X.
polymorpha A35. Sau đó các nghiên cứu về tối ưu các điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme, tinh sạch và đặc
tính AE và FAE cũng như sử dụng enzyme cho xúc tác chuyển hóa sinh khối lignocellulose sẽ được thực hiện.
3.3. Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử

SP66

A35

A

SP66 A35 M

B

Hình 3.1. (A) Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% và (B) Sản phẩm PCR của nấm SP66 và A35

5


Từ kết quả phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử và phân tích hình thái bào tử có thể kết luận mẫu
nấm phân lập ký hiệu SP66 là loài nấm túi Alternaria tenuissima SP66 thuộc họ Pleosporaceae và chủng nấm
A35 là Xylaria polymorpha A35 thuộc họ Xylariaceae.
3.4. Động học sinh tổng hợp enzyme esterase
Tối ưu hóa được các điều kiện sinh tổng hợp acetyl esterase và feruloyl esterase của hai chủng nấm X.
polymorpha A35 và Alt. tenuissima Sp66 như sau:
Hoạt tính acetyl esterase: Chủng X. polymorpha A35 nuôi cấy trên môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ
chất rơm, nguồn nitơ là pepton, thời gian nuôi cấy 10 ngày, nhiệt độ 25 oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, khi đó,
hoạt tính acetyl esterase cao nhất đạt 135,4 U/l.
Hoạt tính feruloyl esterase: Chủng Alt. tenuissima nuôi cấy trên môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ
chất rơm, thời gian nuôi cấy 12 ngày, nhiệt độ 25 oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, khi đó, hoạt tính acetyl
esterase cao nhất đạt 1154,4 U/l.
3.5. Tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm
3.5.1. Tinh sạch và đặc tính acetyl esterase của nấm X. polymorpha A35 (XpoAE)
Dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau 3 tuần được cô đặc bằng siêu lọc (màng lọc 10 kDa

cut-off). Sau đó, protein enzyme biểu hiện hoạt tính XpoAE đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate được tinh sạch
bằng sắc ký lỏng. Bước đầu tiên của quá trình rửa giải protein được thực hiện qua cột sắc ký trao đổi anion
DEAE Sepharose và kết quả đã thu được 3 phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE (ký hiệu phân đoạn I, II và III).
Tổng thể tích rửa giải của phân đoạn hoạt tính enzyme cao nhất (phân đoạn III) được nạp tiếp lên cột
SuperdexTM 75. Sau bước sắc ký lọc gel này, một phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE được thu (Hình 3.2).
Sau quá trình tinh sạch đã thu được lượng protein enzyme tinh sạch là 20,6 mg, tương đương 27 U và hiệu
suất 26,8 % với độ tinh sạch 18,3 lần. Phân đoạn enzyme tinh sạch này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp
theo về đặc tính protein enzyme cũng như nghiên cứu chuyển hóa in vitro vật liệu giàu lignocellulose (Bảng
3.1).

Hình 3.2. Tinh sạch XpoAE từ nấm X. polymorpha A35 qua các bước sắc ký lỏng
(A)
nm

sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose và (B) sắc ký lọc gel SuperdexTM 75; (─) độ hấp thụ ở λ=280

và (●) hoạt tính XpoAE trên cơ chất p-nitrophenyl acetate

6


Bảng 3.1. Các bước tinh sạch enzyme XpoAE
Các bước tinh sạch
Dịch chiết thô
Siêu lọc 30-10 kDa
DEAE Sepharose
(phân đoạn III)
SuperdexTM 75
Đặc tính hóa-lý của XpoAE: Điện di SDS-PAGE của phân đoạn III qua các bước tinh sạch ở trên cho thấy
một vạch protein hoạt tính XpoAE sau khi nhộm với Colloidal Blue Staining Kit với trọng lượng phân tử M W =

44 kDa. Trong khi đó, điện di điểm đẳng điện IEF cho thấy 2 vạch protein gần kề có giá trị pI lần lượt là 3,5 và
3,6 (Hình 3.3). Đặc tính hóa-lý của XpoAE tương ứng với đặc tính của các AE đã công bố (34-56 kDa).

Hình 3.3. Protein tinh sạch (1,3) biểu hiện hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) trên gel điện di SDS-PAGE (A) và
IEF (B); (2,4) protein marke
Nhiệt độ và pH tối ưu: Để xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu, phản ứng giữa enzyme XpoAE tinh sạch và cơ
chất p-nitrophenyl acetate được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 35-70°C. Kết quả cho thấy, hoạt tính XpoAE
tăng dần từ 40% ở nhiệt độ 35°C lên cực đại ở 42°C (100%). Sau đó, khi tăng nhiệt độ thì hoạt tính của enzyme
giảm dần chỉ còn 51% ở 61°C (Hình 3.4-B). Giá trị pH 5,0 thích hợp. Hoạt động tương đối giảm dần từ 100% ở
pH 6,5 xuống 57% ở pH 7.0 (Hình 3.4-A).

Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt

độ (B) đến hoạt tính enzyme XpoAE tinh sạch


7


Độ bền nhiệt và pH của enzyme XpoAE:
Enzyme tương đối bền ở nhiệt độ 40 0C sau 3 giờ ủ, sau đó giảm hơn 50% hoạt tính khi ủ thời gian 4 giờ và
lâu hơn. Hoạt tính của enzyme giảm nhanh ở 60 0C và mất hầu hết hoạt tính sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ này. Enzyme
tinh sạch cho thấy bền hoạt tính ở pH 5,0 nhưng mất trên 90% hoạt tính trong thời gian ủ 1 giờ dưới điều kiện
axít mạnh (pH 3; Hình 3.5). Enzyme XpoAE tinh sạch từ nấm X. polymorpha A35 tương đối bền trong khoảng
nhiệt độ 40°C ở pH 5.

Hình 3.5. Độ bền enzyme XpoAE tinh sạch từ nấm X. polymorpha A35 ở các điều kiện nhiệt độ (A) và pH (B)
khác nhau: (A): ♦ 40 oC, ▲60 oC; (B): ▲ pH 3, ● pH 5, ♦ pH 6
3.5.2. Tinh sạch và đặc tính feruloyl esterase của Alt. tenuissima SP66 (AltFAE)
Dịch enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau 2 tuần được siêu lọc 10 kDa cut-off, qua đó các protein

và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ cũng được loại bỏ. Sau đó, protein enzyme biểu hiện hoạt tính feruloyl
esterase đối với cơ chất methyl ferulate được tinh sạch bằng sắc ký lỏng. Bước đầu tiên của quá trình rửa giải
protein được thực hiện qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose. Sau bước sắc ký thứ nhất độ tinh sạch
tăng không đáng kể (từ 1,4 lần) nhưng có thể loại phần lớn các chất mầu (có thể là các hợp chất polyphenolic)
khỏi protein hoạt tính FAE đích. Tổng thể tích rửa giải của phân đoạn hoạt tính enzyme cao nhất được nạp tiếp
lên cột SuperdexTM 75. Hiệu quả tinh sạch cao nhất ở bước sắc ký lọc gel này, thể hiện ở độ tinh sạch tăng từ
~12 lên ~30 lần với hiệu suất ~ 44%). Trong khi đó, sử dụng sắc ký trao đổi anion mạnh (Q Sepharose; Hình
3.6) ở bước tiếp theo độ tinh sạch tăng lên 35,8 lần nhưng lượng protein và tổng hoạt tính tương ứng với hiệu
suất tinh sạch giảm tới gần ½ (hiệu suất cuối 28,9%; Bảng 3.2). Như vậy, bước tinh sạch cuối cùng cần thiết cho
các nghiên cứu cơ bản (yêu cầu độ tinh sạch tối đa), trong nghiên cứu ứng dụng enzyme AltFAE từ Alt.
tenuissima SP66 có thể sử dụng ngay sau bước sắc ký lọc gel để đảm bảo hiệu suất thu hồi cao và tiết kiệm thời
gian, chi phí.

8


Hình 3.6. Tinh sạch AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 qua cột sắc ký trao đổi anion Q
Sepharose® (●) Hoạt tính AltFAE đối với cơ chất methyl ferulate, (─) protein hấp thụ ở
λ=280 nm
Bảng 3.2. Tinh sạch enzyme AltFAE từ dịch lên men nấm Alt. tenuissima SP66

Các bước tinh sạch
Dịch chiết thô
Siêu lọc 10 kDa
DEAE Sepharose
SEC SuperdexTM 75
Q Sepharose®
Đặc tính hóa-lý của AltFAE: Điện di SDS-PAGE sau bước tinh sạch cuối cùng qua cột Q Sepharose® cho
thấy một băng protein biểu hiện hoạt tính FAE (cơ chất methyl ferulate) sau khi nhộm với Colloidal Blue
Staining Kit với trọng lượng phân tử MW=30,3 kDa (Hình 3.7).

Hình 3.7. Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính feruloyl esterase (AltFAE) trên
gel điện di SDS-PAGE (A); (2) protein marker


9


Nhiệt độ và pH tối ưu: Nhiệt độ enzyme AltFAE được xác định trong khoảng từ 30-800C và pH từ 4,0-9,0.
Hoạt tính tương đối giảm dần từ 100% ở pH 7.0 xuống 84% ở pH 9.0 (Hình 3.8-A). Enzyme được tinh sạch ổn
định trong suốt 2 giờ ủ ở pH trung hòa với hoạt tính còn lại là 97% ở pH 6.0 và 89% ở pH 8.0. Ngược lại, khi ủ
ở môi trường axit (pH 4.0) làm mất hoạt độ enzyme 57% sau 2 giờ ủ. Khi ủ ở 60 0C làm cho hoạt tính mất hơn
50% trong vòng 2 giờ, trong khi hơn một nửa hoạt độ ban đầu vẫn được xác định sau 8 giờ ủ ở 40 0C, khi nhiệt
độ tăng lên đến 700C hoạt tính enzyme giảm chỉ còn 30%. Do vậy, nhiệt độ tối ưu của enzyme AltFAE là 42°C
và pH 7 (Hình 3.8-B).

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) lên enzyme AltFAE
Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ từ 30-80°C và pH từ 4-9. Các thí nghiệm được thực hiện ba lần, độ
lệch chuẩn (SD) <5%
Độ bền nhiệt và pH của enzyme AltFAE: Enzyme tương đối bền ở nhiệt độ 25 0C và 400C sau 2 giờ ủ, sau
đó giảm hơn 10% hoạt tính sau 4 giờ ủ ở 25 0C và giảm 35% khi ủ lâu hơn 2 giờ ở 40 0C. Hoạt tính của enzyme
giảm nhanh ở 60oC và mất hầu hết hoạt tính sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ này. Enzyme tinh sạch cho thấy bền hoạt tính
ở môi trường có pH 5 và pH 6 nhưng mất trên 75% hoạt tính trong thời gian ủ 2 giờ dưới điều kiện môi trường
pH 8 (Hình 3.9).

Hình 3.9. Độ bền nhiệt của AltFAE ở nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau theo thời gian

10

(A): 25°C (KH: kim cương), 40°C (KH: vòng tròn), 60°C (KH: tam giác); (B): pH 10 (KH: kim cương),
pH 8.0 (KH: vòng tròn), pH 7.0 (KH: sao), pH 5.0 (KH: tam giác)
Kết quả phân tích peptide của AltFAE: Trình tự chuỗi peptide của protein biểu hiện hoạt tính AltFAE từ
nấm Alt. tenuissima SP66 được xác định thành công bằng phổ khối lượng ESI-MS (Hình 3.10 & Bảng 3.3) là cơ
sở phân loại ban đầu và có thể sử dụng dữ liệu cho thiết kế mồi (primer) xác định gen mã hóa cho protein này.

Hình 3.10. Dữ liệu phổ ESI-MS/MS các đoạn peptide của AltFAE tinh sạch
Bảng 3.3. Các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ nấm Alt.tenuissima SP66 xác định bằng thủy phân
với trypsin và LC-ESI-MS/MS
Peptide*

Trọng lượng phân tử (Da)

GAYSLSLR
GFFLFVEGGR
GSSIFGLAPGK
GKVALDDLLTQR
LNTLETEEWFFK
LNTLETEEWFFK
*Ký hiệu cho các axit amin theo quy định của IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)
3.5.3. Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch esterase từ nấm
+

Tinh sạch enzyme XpoAE từ nấm X. polymorpha A35
Quy trình lên men sinh tổng hợp và tinh sạch esterase bao gồm các bước chính sau:

Nuôi cấy nấm và sinh tổng hợp enzyme trên môi trường lên men dịch thể (5 L/mẻ):
Chủng X. polymorpha A35 được lên men 5 lít/mẻ trong môi trường cơ bản (cho mỗi 1 lít) với thành phần
như sau: MgSO4: 0,5 g; KH2 PO4: 1,5 g; Cao nấm men: 2,0 g; Dịch nguyên tố vi lượng (vết): 1 mL.
Môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ chất rơm, nguồn nitơ là pepton, nhiệt độ 25 oC, pH 7 trong điều kiện

nuôi lắc 200 v/ph, thời gian lên men 10 ngày. Song song với quá trình lên men lỏng thì chủng nấm trên cũng được lên
men rắn sử dụng 2-3 kg rơm khô được ngâm trong nước qua đêm sau đó cho vào các túi plastic chịu nhiệt và khử
trùng ở 1210C trong 30 phút. Sử dụng 2-3 hộp peptri môi trường thạch-malt có khuẩn ty nấm nghiền đồng thể. Tiếp
theo, cấy chuyển toàn bộ dịch khuẩn ty vào mỗi túi plastic với cơ chất rơm, toàn bộ quá trình

11


nuôi cấy được thực hiện ở điều kiện vô trùng. Khuẩn ty nấm được ủ ở 23 0C trong khoảng từ 10 - 14 ngày, sau đó
môi trường lên men bề mặt được chiết với nước cất (d.H2O) qua đêm trên máy lắc.
Chiết tách dịch enzyme thô bằng siêu lọc:
Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện thích hợp trên môi trường rắn và lỏng, enzyme sẽ được lọc sơ bộ qua vải
thô và giấy lọc (GF6 và RC 55, Whatman TM, Trung Quốc). Dịch chiết có hoạt tính esterase được loại khuẩn ty
nấm và cơ chất bằng ly tâm 5000-10 000 v/ph và siêu lọc 5, 10 và 30 kDa cut-off (hệ LongerPump K235 với
màng UFP 30MW, Amersham BioScience, Westborough, MA, USA, hoặc Vivaflow200, màng Polyethersulfon
10MW, Sartorius, Goettingen, CHLB Đức, hoặc amicon Ultra Centrifugal Filters, 5MW, Millipore, Bedford,
USA) ở 11oC.
Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký:
Để thu acetyl esterase tinh sạch từ nấm X. polymorpha A35 dịch enzyme thô biểu hiện hoạt tính esterase
được tinh sạch qua các bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose và Superdex TM
75 (GE Healthcare, Freiburg, CHLB Đức).
Bước đầu tiên được thực hiện trên cột trao đổi ion DEAE Sepharose ở pH 4,5 với đệm Na-acetate 50 mM.
Sau khi lọc rửa có thể thu được các phân đoạn hoạt tính với lượng 86,0 mg protein hoạt tính AE (43,2 U).
Bước tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel qua cột Superdex TM 75 ở pH 6,5 với đệm Na-acetate 50
mM và nồng độ NaCl 100 mM, phân đoạn hoạt tính acetyl esterase (đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate). Các
phân đoạn hoạt tính enzyme được trộn lẫn, cô đặc và thẩm tách qua màng lọc kích thước 10 kDa như trên với
đệm Na-acetate 10 mM (pH 6,0) và bảo quản ở -20 0C. Sau quá trình tinh sạch thu được 20,6 mg protein
enzyme/mẻ tương đương hoạt tính enzyme tổng là 270 U.
Protein sau mỗi bước siêu lọc và sắc ký được đo hoạt độ, đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng
phân tử bằng điện di SDS-PAGE (Novex Xcell SureLock mini cell; Laemmli 1970) và Native-IEF (Novex IEF

gel) (Hình 3.11).

12
Dịch chiết môi trường lên men X.
polymorpha A35


(5 L/mẻ môi trường lỏng và 2-3 kg
rắn, protein tổng 1408 mg)

Dịch sau ly tâm

- Lọc chân không
(Whatman GF6)
- Ly tâm 5000 v/ph
trong 10 phút

Siêu lọc 10kDa cut-off
(872 mg protein)

Sắc ký DEAE Sepharose

Sắc ký lọc gel SuperdexTM 75

Acetyl esterase
tinh sạch
(20,6 mg protein,
270 U enzyme)

Xácđịnh hoạt

Siêu lọc 30kDa cut-off
(cô đến 1000 ml)

độ enzyme; định lượng protein

Cặn ly tâm
(Loại bỏ)


Hình 3.11. Quy trình chiết tách và tinh sạch XpoAE từ nấm X. polymorpha A35

13


+

Tinh sạch enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66
Quy trình lên men sinh tổng hợp và tinh sạch esterase bao gồm các bước chính sau:

Nuôi cấy nấm và sinh tổng hợp enzyme trên môi trường lên men dịch thể (5 L/mẻ):
Nấm Alt.tenuissima SP66 được nuôi cấy trên môi trường cơ bản, sau đó, bổ sung nguồn cơ chất rơm, thời
gian nuôi cấy 12 ngày, nhiệt độ 25 oC, pH 7 trong các bình Erlenmeyer 1000 ml hoặc trên thiết bị lên men AmAr
(Mumbai, Ấn Độ) ở điều kiện có sục khí và lắc liên tục 200 v/ph.
Chiết tách dịch enzyme thô bằng siêu lọc:
Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện tối ưu, enzyme sẽ được lọc sơ bộ qua vải thô và giấy lọc (GF6 và RC 55,
WhatmanTM, Trung Quốc). Dịch chiết có hoạt tính enzyme esterase được loại khuẩn ty nấm và cơ chất bằng ly
tâm 5000-10000 v/ph và siêu lọc 10 và 30 kDa cut-off (UFP 30MW, Amersham BioScience, hoặc Vivaflow 200,
Polyethersulfon 10MW, Sartorius hoặc 5MW, Millipore) ở 11 0C.
Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký:

Dịch enzyme thô biểu hiện hoạt tính esterase được tinh sạch qua các bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc
gel sử dụng cột DEAE Sepharose, Q sepharose và Superdex TM 75 (GE Healthcare, Freiburg, CHLB Đức) với
đệm rửa giải Na-acetate (10mM; pH 4,5), NaCl từ 0-1 M và cột Superdex 75, đệm Na-acetate (50mM; pH 6,5).
Protein rửa giải được xác định trực tiếp sử dụng đầu dò ở λ=280nm hoặc bằng phương pháp so màu theo quy
trình của Bradforf (1976) ở λ=590/450nm. Các phân đoạn có hoạt tính esterase được gộp chung, cô loại bớt dịch
và hòa lại với đệm Na-acetate 10mM, pH 6,0. Mẫu được lưu giữ ở -20 0C.
Bước tinh sạch cuối cùng được thực hiện với cột trao đổi anion ở pH 5,0 với đệm Na-acetate 50 mM. Từ 5L
dịch lên men sau quá trình tinh sạch có thể thu được 13,5 mg protein enzyme FAE/mẻ tương đương hoạt tính
enzyme tổng là 151,2 U.
Protein sau mỗi bước siêu lọc và sắc ký được đo hoạt độ, đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng
phân tử bằng điện di SDS-PAGE (Novex Xcell SureLock mini cell; Laemmli 1970) (Hình 3.12).

14
Dịch môi trường lên men


Alt.tenuissima SP66
(5 L/mẻ; protein 1673 mg)

Siêu lọc 10 kDa cut-off
(cô đến 500 ml;
259,5 mg protein)

Sắc ký DEAE Sepharose

Sắc ký lọc gel SuperdexTM 75

Xácđịnh hoạt

Cặn ly tâm

(Loại bỏ)

độ enzyme; định lượng protein

Dịch sau ly tâm

- Lọc chân không
(Whatman GF6)
- Ly tâm 5000 v/ph
trong 10 phút

Sắc ký Q Sepharose

Feruloyl esterase
tinh sạch
(13,5 mg protein; 151,2
U enzyme)


Hình 3.12. Quy trình chiết tách và tinh sạch AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66

15


3.6. Sàng lọc nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa sinh học
Tiến hành đánh giá sản phẩm đường khử sau chuyển hóa trên 5 cơ chất là rơm rạ (RR), bã mía (MIA), bã
cà phê (CAF), mùn gỗ (MG), rong túi (RT) bằng hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl = 50 U/gds, AltFAE = 5
U/gds và XpoAE = 5 U/gds) theo các thí nghiệm khác nhau, phản ứng được ủ trong 24 giờ , ở 40 0C, sản phẩm
chuyển hóa được xác định bằng sắc ký bản mỏng (TLC).

Hình 3.13. Vết chất đường đơn xuất hiện trên bản mỏng
Các chất chuẩn là các đường khử có khả năng lên men: glucose (R f (Glu) = 0,34), galactose (Rf(Gla)=
0,28), xylose (Rf(Xyl) = 0,48) và mannose (Rf(Man) = 0,325)
Hàm lượng đường khử thu được sau chuyển hóa sinh học: Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)
để xác định vết chất đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa bằng hỗn hợp enzyme ( XpoAE, AltFAE và
Cell/xyl) trên 5 cơ chất: rơm rạ, bã mía, bã cà phê, mùn gỗ, rong, bã mía được lựa chọn là vật liệu nguyên cứu
do trên bản mỏng xuất hiện vết đường đơn đậm nét và tổng đường khử thu được cao nhất đạt 154,7mg/g.

Hình 3.14. Tổng đường khử tạo thành sau chuyển hóa bằng các đơn enzyme và “enzyme cocktail”
3.7. Tối ưu hóa enzyme cocktail bằng mô hình quy hoạch thực nghiệm
Áp dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm đã xác định được các điều kiện tối ưu cho hỗn hợp enzyme
cocktail để chuyển hóa bã mía (10%, w/v) thành các đường lên men, phản ứng diễn ra ở 40 0C, pH 5 và thời gian
ủ
48 giờ. Sử dụng thuật toán flexible quy hoạch phi tuyến với phương trình quy hồi mô tả hiệu quả chuyển
hóa

16


biểu thị qua tổng hàm lượng đường khử sinh ra phụ thuộc vào thành phần tham gia của mỗi enzyme đơn với
hoạt độ enzyme (x) tương ứng: Cell/Xyl (x1), AltFAE (x2), XpoAE (x3), phương trình có dạng:

y = 206,946 + 29,954x1 + 5,501x2 + 7,323x3 + 2,288x2x3 – 7,011 x12 , tương ứng hoạt độ (U) của “enzyme
cocktail” trên 1 gram bã mía sử dụng là Cell/Xyl = 100 U/gds, AltFAE = 7,56 U/gds, XpoAE = 10,8 U/gds với
giá trị ymax = 251,86 mg/g.
3.8. Kết hợp xử lý hóa học nâng cao hiệu quả chuyển hóa
3.8.1. Kết hợp thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail”
Để nâng cao hiệu quả cho quá trình chuyển hóa bã mía trước khi thủy phân bằng “enzyme cocktail” ở điều
kiện tối ưu, bã mía được xử lý bằng NaOH với các nồng độ khác nhau để đánh giá hiệu quả chuyển hóa.
Bảng 3.4. Tổng đường khử sau thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail”

Stt

NaOH (M)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
(*)

Bã mía (10%; w/v) được nghiền nhỏ ngâm trong dung dịch NAOH, trong 2,5 giờ, ở 85 0C. Chuyển hóa sinh
học sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” (100U Cell/Xyl/gds, 7,56U AltFAE/gds và 10,8U XpoAE/gds), trong 48
giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung bình của hai lần lặp lại.
3.8.2. Kết hợp thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail”
Bảng 3.5. Tổng đường khử sau thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail”
H2SO4 (C%)

Stt
1
2
3
4
5
6

7
8
9

17


(*)

Bã mía (10%; w/v) được nghiền nhỏ ngâm trong dung dịch H2SO4 trong 2,5 giờ, ở 850C. Chuyển hóa sinh
học sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl/gds: 100U, AltFAE/gds: 7,56U, XpoAE/gds: 10,8U), trong 48
giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung bình của hai lần lặp lại.
3.8.3. Kết hợp thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail”
Bảng 3.6. Tổng đường khử sau thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail”
Tổng hàm lượng đường khử (mg/g)

(*)

Bã mía (10%; w/v) nghiền nhỏ ngâm trong nước cất được thủy phân trong thiết bị gia nhiệt, ở 121 0C trong
120 phút dưới áp suất 1 atm. Chuyển hóa sinh học sử dụng “enzyme cocktail” (Cell/Xyl/gds: 100U,
AltFAE/gds: 7,56U, XpoAE/gds: 10,8U), trong 48 giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung
bình của hai lần lặp lại.
3.8.4. Hàm lượng đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa
Bảng 3.7. Hàm lượng carbohydrate sau chuyển hóa sinh học
Enzyme
Hỗn hợp enzyme
cocktail (Cell/Xyl,
AltFAE & XpoAE)
Trong các phương pháp thủy phân bã mía bằng kiềm, axít, gia nhiệt kết hợp với hỗn hợp “enzyme cocktail”
(Cell/Xyl, AltFAE & XpoAE). Xác định được phương pháp thủy phân bã mía bằng axít H 2SO4 loãng (0,1%,

850C, 2,5 giờ) kết hợp thủy phân bằng “enzyme cocktail” cho hiệu quả tốt nhất với tổng đường khử đạt 319,5
mg/g cơ chất. Trong đó, hàm lượng glucose và xylose, tương ứng là 195,4 mg/g và 60,4 mg/g và các đường lên
men khác chiếm khoảng 18 %.
3.9. Nghiên cứu sản xuất bioethanol
3.9.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường
Nguồn dinh dưỡng là một trong số những nhân tố tác động trực tiếp đến quá trình sinh trưởng, phát triển của
vi sinh vật nói chung và nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 nói riêng. Do vậy, cần tiến hành nghiên cứu
khảo sát để tìm ra môi trường lên men bioethanol thích hợp. Thí nghiệm được tiến hành trên hai môi trường BM
(dịch đường sau chuyển hóa) và môi trường BM+ (dịch đường sau chuyển hóa bổ sung các thành phần từ môi
trường hansen). Bổ sung 3% giống nấm men trên tổng thể tích dịch lên men, lên men ở 30 0C, pH = 4,8.
Bảng 3.8. Hiệu suất quá trình lên men trên môi trường BM và BM+
Thời gian
Kết quả
Tổng đường khử còn lại (mg/g)
Hàm lượng bioethanol (g/l)
Hiệu suất (g/g)
(1)

Môi trường lên men sử dụng dịch đường sau chuyển hóa

18


(2)

Môi trường lên men sử dụng dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thêm một số thành phần của môi trường
Hansen
3.9.2. Thời gian lên men
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men được tiến hành ở 30 0C; pH 4,8, bổ sung 3% giống
nấm men theo thể tích và sử dụng môi trường bổ sung các thành phần dinh dưỡng của môi trường Hansen.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất lên men
Stt

Thời gian
(giờ)
6
12
24
30
36
48
54
60
72
78
81

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
3.9.3. Ảnh hưởng pH

Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men được tiến hành ở 30 0C; thời gian lên men
78 giờ và bổ sung 3% giống nấm men.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất lên men
Stt

pH

1
2
3
4
5
6
7

4
4,3
4,6
4,8
5,2
5,5
6

3.9.4. Ảnh hưởng nhiệt độ
Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men được tiến hành ở pH 5.2; thời gian
lên men 78 giờ và tỷ lệ nấm men bổ sung là 3%.

19