Báo cáo Chất chống oxy hóa nguồn gốc tự nhiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO BÁO CÁO HẾT MÔN CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA
NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA
BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ
CỘNG HƢỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR)

TRÌ KIM NGỌC

Chuyên ngành: Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền
Mã số:60720406
Khóa 2016-2018

TP HCM, 05/2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO BÁO CÁO HẾT MÔN CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA
NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN

THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG
HƢỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR)

Chuyên ngành: Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền
Mã số:60720406
Khóa 2016-2018

Thầy hƣớng dẫn: PGS.Ts. Trần Hùng
Học viên : Trì Kim Ngọc

TP HCM, 05/2017


MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................................. 2
MỞ ĐẦU.................................................................................................................................... 3
Phần 1: TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƢỞNG SPIN
ĐIỆN TỬ (ESR) ........................................................................................................................ 4
1.1. Giới thiệu.............................................................................................................................. 4
1.2. Mô tả phương pháp .............................................................................................................. 4
1.2.1. Nguyên tắc ............................................................................................................... 4
1.2.2. Cơ chế ...................................................................................................................... 4
1.2.3. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................................... 4
1.2.4. Chuẩn bị mẫu ........................................................................................................... 5
1.2.5. Cài đặt máy đo phổ .................................................................................................. 5
1.2.6. Đo giá trị g ............................................................................................................... 5
1.3. Ưu điểm ................................................................................................................................ 5
1.4. Nhược điểm và cách khắc phục ........................................................................................... 5
Phần 2: ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƢỞNG SPIN

ĐIỆN TỬ (ESR) TRONG PHÂN TÍCH DƢỢC LIỆU ......................................................... 7
2.1. Xác định hoạt tính chống oxy hoá bằng quang phổ cộng hưởng spin electron ................... 7
2.1.1. Giới thiệu ................................................................................................................ 7
2.1.2. Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu ................................................................... 7
2.2.3. Kết quả .................................................................................................................... 8
2.2. Xác định hoạt động thu dọn gốc tự do của các chất chống oxy hóa từ dịch chiết hạt nho
bằng Quang phổ cộng hưởng điện tử Spin với hệ H2O2 / NaOH / DMSO ................................. 9
2.2.1. Giới thiệu ................................................................................................................ 9
2.2.2. Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu ................................................................... 9
2.2.3. Quy trình thí nghiệm ............................................................................................. 10
2.2.4. Kết quả .................................................................................................................. 11
2.3. Quang phổ cộng hưởng điện tử được nghiên cứu hoạt động thu dọn gốc tự do của
anthocyanin và pyranoanthocyanin có trong rượu vang ........................................................... 12
2.3.1. Giới thiệu .............................................................................................................. 12
2.3.2. Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu ................................................................. 12
2.3.3. Kết quả .................................................................................................................. 13

2


MỞ ĐẦU
Trong lĩnh vực sức khỏe hiện nay, nói đến nhiều tác hại của chất oxy hoá, phản ứng oxy hoá
và nhấn mạnh sự cần thiết sử dụng chất chống oxy hoá để bảo vệ, duy trì sức khỏe. Nhiều
hoạt chất đã được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa tốt bởi các phương pháp thử hoạt
tính chống oxy hóa khác nhau. Hoạt tính chống oxy hóa thường không thể đo trực tiếp

mà thông qua tác động của chất chống oxy hóa trên quá trình oxy hóa. Các phương
pháp đánh giá thường rất đa dạng, có thể dựa trên chất ban đầu, chất oxy hóa, các chất
trung gian hay sản phẩm cuối cùng [2]. Bên cạnh những phương pháp thử hoạt tính
chống oxy hóa cổ điển, được sử dụng rất phổ biến như:

 Phương pháp peroxy hóa lipid – định lượng malonyl dialdehyd (MDA)
 Phương pháp ức chế tạo thành gốc cation ABTS·+ (2,2'-azinobis-(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)
 Thử nghiệm dập tắt gốc tự do DPPH_ 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
 Thử nghiệm đánh giá khả năng khử ion sắt III (Ferric reducing antioxidant
power_FRAP)
Ngày nay các phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa hiện đại, ứng ụng máy móc,
kỹ thuật cao cũng được đưa vào sử dụng. Trong phạm vi bài báo cáo hết môn “Các
chất chống oxy hóa nguồn gốc tự nhiên”, trình bày về “Thử hoạt tính chống oxy
hóa bằng phương pháp phân tích phổ cộng hưởng spin điện tử (ESR)”.
Bài báo cáo góp phần giới thiệu một phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa mới,
hiện đại có thể làm giảm thời gian đo, tăng độ nhạy, cải thiện độ phân giải…[5]

3


Phần 1: TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ
CỘNG HƢỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR)
1.1. Giới thiệu
Ngày nay, phổ ESR là một trong số các phương pháp quan trọng nhất để điều tra cấu trúc và
động lực của các hợp chất thuận từ (paramagnetic). Phương pháp này rất nhạy và đặt hiệu do
đó được sử dụng trong nhiều lĩnh vực: hóa học, vật lý, sinh học, và khoáng vật học [5].
Mặc dù các phương pháp xung được giới thiệu trong quang phổ ESR cùng khoảng thời gian
với phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR nhưng phương pháp phổ này chỉ mới được nghiên cứu
trong khoảng 30 năm trở lại đây. Tuy nhiên, tình hình đã thay đổi trong vài năm qua. Hiện
nay quang phổ ESR là một lĩnh vực nghiên cứu nổi lên và đang phát triển nhanh chóng [5].
Hiện nay có thể xây dựng một phổ kế ESR sử dụng các thành phần chủ yếu có thể mua trên
thị trường. Hiện nay không chỉ có một phương pháp ESR mà bao gồm các phương pháp xung
khác nhau, các kỹ thuật có tầm quan trọng đặc biệt [5].
1.2. Mô tả phƣơng pháp
1.2.1. Nguyên tắc

Phổ cộng hưởng spin điện_Electron spin Resonance (ESR), còn gọi là cộng hưởng điện tử
thuận từ_ Electron paramagnetic Resonance (EPR), dựa trên sự hấp thụ của bức xạ điện từ
trong phạm vi vi sóng, là kết quả của sự chuyển tiếp giữa các mức năng lượng được tạo ra bởi
một từ trường trên các electron không ghép đôi, các gốc tự do hữu cơ, các ion tự do, các trung
tâm thiếu điện tử, các ion kim loại thuận từ và nhiều nguyên tử trong pha khí chứa các
electron không ghép đôi [4].
1.2.2. Cơ chế
Phương pháp đo phổ ESR phát hiện được các tâm thuận từ (ví dụ như các gốc_ radical). Các
tâm thuận từ này là do tác động của chiếu xạ hoặc do ảnh hưởng bởi sự có mặt của một số
hợp chất hợp khác. Từ trường ngoài mạnh sẽ tạo ra sự chênh lệch giữa các mức năng lượng
của các spin điện tử m = +1/2 và m = -1/2 dẫn tới sự hấp thụ cộng hưởng của một chùm vi
sóng đã sử dụng trong phổ kế. Phổ ESR thông thường được biểu thị theo vi phân bậc nhất của
độ hấp thụ tương ứng với một từ trường đã áp dụng nhất định [1].
Giá trị từ trường và tần số vi sóng phụ thuộc vào việc bố trí thực nghiệm (kích thước mẫu và
giá chứa mẫu), trong khi đó tỷ lệ giữa chúng (giá trị g) là đặc tính bên trong của tâm thuận từ
và tọa độ vị trí của chúng [1].
1.2.3. Thiết bị, dụng cụ [1]
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
1.2.3.1. Phổ kế ESR X-Band có bán sẵn, gồm có: nam châm, cầu vi sóng, bảng điều khiển
với bộ kiểm soát từ trường và kênh tín hiệu, các hốc hình trụ hoặc hình chữ nhật.
1.2.3.2. Thiết bị đo giá trị G, gồm có: máy đếm tần số, đầu đo từ trường (máy đo cộng
hưởng từ hạt nhân (NMR)) hoặc bất kỳ thiết bị nào có lắp bộ đo giá trị g.

4


1.2.3.3. Các ống ESR, có đường kính trong khoảng 4,0 mm (ví dụ; như ống thạch anh
Suprasil)
1.2.3.4. Cân, chính xác đến 1 mg (tùy chọn).
1.2.3.5. Tủ sấy chân không phòng thử nghiệm hoặc máy làm đông khô.

1.2.4. Chuẩn bị mẫu
Mẫu đông khô: Nếu mẫu không đủ khô sẽ gây ra khó khăn khi chỉnh các hốc của máy đo phổ.
Trong trường hợp này tốt nhất nên giảm lượng mẫu hoặc sấy khô mẫu hơn. Mẫu nên được sấy
hoặc làm khô trong tủ sấy chân không ở 40 oC dưới áp suất giảm dần hoặc trong máy làm
đông khô [1].
Mẫu pha loãng trong dung môi EtOH ở nhiệt độ phòng, đo trong cốc thạch anh [3].
1.2.5. Cài đặt máy đo phổ
Sử dụng hằng số thời gian và tốc độ quét thích hợp đối với các tín hiệu ESR cho chiều rộng
giữa 2 pic khoảng 0,2 mT đến 0,4 mT [1].
1.2.6. Đo giá trị g
Việc đo giá trị g của tín hiệu ESR là rất hữu ích nhằm để mô tả rõ hơn phổ ESR và đặc biệt
giúp cho việc nhận dạng mẫu chiếu xạ.
Giá trị g của một tín hiệu, gsignal được tính bằng công thức:

g signal 

71,448.VESR
B

Trong đó:
VESR là tần số vi sóng, đo bằng gigahertz (GHz);
B là mật độ dòng từ (chế độ cài đặt từ trường cho máy đo phổ), đo bằng militesla (mT)
(10Gauss=10G=1 mT).
Việc tính toán giá trị g của phổ ESR là để xác định vị trí từ trường ở tâm phổ ESR để đo tần
số v (ví dụ máy đếm tần số) và từ trường B (ví dụ gaussmeter) tại điểm đó.
1.3. Ƣu điểm

Đây là kỹ thuật phân tích duy nhất có thể phát hiện cụ thể các gốc tự do hình thành do
sự tự oxy hóa và các quá trình liên quan [2].
1.4. Nhƣợc điểm và cách khắc phục

Mặc dù bản chất nhạy cảm với các gốc tự do ổn định như di-tert-butyl, nitroxid; ESR
không đủ nhạy để phát hiện các gốc tự do có thời gian tồn tại ngắn ngủi liên quan đến
tự oxy hóa (từ 10-9 giây cho gốc hydroxyl đến một vài giây đối với các gốc peroxyl
thoáng qua với nồng độ dưới 10-8 M). Nhiều kỹ thuật đã được sử dụng để khắc phục vấn
đề này, bao gồm sự phóng xạ xung, hệ thống dòng chảy liên tục và bẫy spin. Trong số đó
bẫy spin đã được sử dụng rộng rãi nhất [2].
5


Bẫy spin liên quan đến việc bổ sung vào các mẫu một hợp chất phản ứng với các gốc
tự do để hình thành các gốc tự do gốc tồn tại lâu hơn và có thể được phát hiện mà
không gặp khó khăn bởi ESR. Bẫy spin thường là hợp chất nitroso hoặc nitrones và
thường được sử dụng trong các hệ thống sinh học bao gồm tert-nitrosobutan (tNB),
α-phenyl-tert-butylitrit
(PBN),
5,5-dimetylpyrrolin-N-oxit
(DMPO),
tert-butylnitrosobenzen (BNB), α-(4-pyridyl-1-oxit) -N-tert-butylititron (4-POBN) và
3,5-dibromo-4-nitrosobenzenesulfonic acid (DBNBS) [2].

6


Phần 2: ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ
CỘNG HƢỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR) TRONG PHÂN TÍCH
DƢỢC LIỆU
2.1. Xác định hoạt tính chống oxy hoá bằng quang phổ cộng hƣởng spin electron
2.1.1. Giới thiệu [7]
Các gốc tự do được tạo ra trong các quá trình thiết yếu của sự sống, như hô hấp, quang hợp và
các phản ứng enzym. Việc ổn định các gốc tự do là quá trình liên tuc của cơ thể sống. Tuy

nhiên, nếu các cơ chế bảo vệ trong tế bào bị gián đoạn, các gốc tự do tăng quá mức thì stress
oxy hóa có thể xảy ra.
Do đó hệ thống chống oxy hóa nội bào được bổ sung bởi lượng chất chống oxy hóa trong chế
độ ăn uống. Phụ gia thực phẩm chống oxy hóa tổng hợp như butylat hydroxytoluen (BHT) và
butylated hydroxyanisol (BHA) được sử dụng rộng rãi trong việc phòng ngừa thực phẩm bị
oxy hóa và kéo dài thời hạn sử dụng. Gần đây người ta tìm thấy trái cây và rau có khả năng
chống oxy hóa là do các hợp chất polyphenolic chẳng hạn như flavonoid và carotenoid.
Mặc dù lợi ích của chúng, một số chất chống oxy hoá tổng hợp như BHT có thể gây ung thư.
Các nhà sản xuất đang mong muốn sử dụng các lựa chọn thay thế từ tự nhiên. Do đó vitamin
C, vitamin E, acid citric, β-caroten, chất chiết xuất thảo mộc được sử dụng. Tuy nhiên, tác
dụng phụ của nhiều chất chống oxy hóa tự nhiên và hiệu quả chống oxy hóa tương đối chưa
được biết đầy đủ.
Hoạt động gốc tự do có thể được xác định chắc chắn bằng thực nghiệm với phương pháp cộng
hưởng spin electron (ESR). Việc đánh giá các chất dinh dưỡng liên quan đến hoạt động chống
oxy hoá có thể giúp biết được chế độ ăn có vai trò điều chỉnh và hạn chế các bệnh lý liên quan
tới stress oxy hóa.
Quang phổ ESR là một kỹ thuật phân tích có khả năng bẫy và nghiên cứu các gốc tự do. Mục
tiêu của nghiên cứu này là được sử dụng quang phổ ESR để cung cấp dấu hiệu bán định lượng
hoạt tính chống oxy hóa của năm hợp chất chống oxy hóa được biết đến.
2.1.2. Nguyên liệu, phƣơng pháp nghiên cứu [7]
Một hệ thống mô hình được phát triển trong đó OH· dược giải phóng từ phản ứng Fenton
trong quá trình oxy hóa. Chất chống oxy hóa catechin, acid caffeic,
6,7-dihydroxy-4-methylcoumarin, o-coumarin và scopoletin ở nồng độ trong dải
0-4.8 mM được trộn lẫn với bẫy spin N-tertbutyl-a-phenylnitrone (PBN). Chúng hoạt động
như tác nhân thu nhặt OH· cạnh tranh với PBN như sau:
Fe2+ + H2O2  Fe3+ + OH- + OH·
PBN + OH·  PBN-OH + H2O
Chất chống oxy hóa + OH· 

Chất chống oxy hóa-OH + H2O

7


Khi chất chống oxy hóa cạnh tranh thành công vớii bẫy spin trên OH·, cường độ tín hiệu ESR
sẽ giảm số lượng. Trong thí nghiệm này, cường độ tín hiệu ESR của phản ứng cạnh tranh
được đo với một mẫu MnO / CaO làm chất chuẩn nội.
Dùng phương pháp lặp lại để đo spin tương đối như vậy hiệu quả tương đối của các chất
chống oxy hóa có thể được xác định đối với bẫy spin.
Chuẩn bị:
Các hợp chất được hòa tan trong dimethyl sulphoxid (DMSO). Các hỗn hợp được sử dụng
cho quang phổ ESR của các chất chống oxy hoá được điều chế như sau: 0.5 ml PBN (Dung
tích 50 mM) được trộn với 0,2 ml FeSO4 (1 mM). Pha một dải nồng độ 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 và
1.0 ml dung dịch chống oxy hóa 10 mM với DMSO. Thêm 0.5 ml H2O2 (100%) và lắc đều
trong 10 giây. Sau đó ủ ở 40 °C trong 30 phút trong bồn nước. Các phản ứng được dừng lại
bằng cách đặt các mẫu trên nước đá. Sau đó 50 µl dung dịch được đưa vào ống kính mỏng
(đường kính trong 1mm) và ghi lại các phổ ESR trên quang phổ kế Bruker ER200D-SRC điều
kiện như sau:
Tần số vi sóng: 9,78 GHz; Điện vi sóng: 13dB; biên độ giảm dần 0.5 G ở tần số 100kHz; Từ
trường thu được: 1,25x105; độ rộng từ trường: 50G; thời gian quét: 100 giây với thời gian
hằng số 100 ms ở nhiệt độ phòng.
2.2.3. Kết quả [7]
Chiều cao tín hiệu cường độ (trong trường hợp không có chất chống oxy hóa) được xem như
100% và cường độ tín hiệu phần trăm được tính toán giảm tới 80% so với chiều cao cường độ
tín hiệu ESR là tối đa với năm chất chống oxy hóa ở nồng độ 4.8 mM. Khả năng bảo vệ tương
đối chống lại OH· thể hiện bằng việc giảm tỷ lệ phần trăm chiều cao cường độ tín hiệu ESR
của năm hợp chất thử nghiệm ở cùng nồng độ mol (4.8 mM) thể hiện trong bảng 1.
Bảng 1. Ảnh hưởng của chất chống oxy hóa lên độ cao cường độ tín hiệu ESR
Chất chống oxy hóa (4.8mM)

Phần trăm kiểm soát tín hiệu ESR

Axit Caffeic

8

O-coumarin

13

6,7-Dihydroxy-4-metylcoumarin

18

Catechin

19

Scopoletin

112

So sánh khả năng bảo vệ của chúng cho thấy thứ tự của hiệu lực là:
axit caffeic> O-coumarin> 6,7-dihydroxy-4-methylcummarin>Catechin> scopoletin.
Ngoài ra, cũng quan sát thấy trong số các phân tử ở nồng độ thấp (dưới 3,6mM) có scopoletin
cho cường độ tín hiệu ESR cao hơn cường độ tín hiệu hơn mức kiểm soát. Điều này chỉ ra
rằng có một nguồn bổ sung của gốc tự do OH·. Những OH· bổ sung này bắt nguồn từ phản
ứng của scopoletin với ion Fe2+.

8

Kết luận
ESR là một kỹ thuật phân tích hữu ích để bán định lượng hoạt động chống oxy hóa cho đa
dạng các hợp chất, cũng như cung cấp thông tin liên quan đến hoạt động chống oxy hóa
2.2. Xác định hoạt động thu dọn gốc tự do của các chất chống oxy hóa từ dịch chiết hạt
nho bằng Quang phổ cộng hƣởng điện tử Spin với hệ H2O2 / NaOH / DMSO
2.2.1. Giới thiệu [8]
Trong những năm gần đây, người ta cho rằng phản ứng oxy hóa đóng một vai trò quan trọng
trong nhiều căn bệnh như ung thư, xơ cứng động mạch, loét dạ dày, và các bệnh khác. Để
ngăn ngừa những bệnh này, các chất chống oxy hoá nhóm polyphenol trong trà và rượu vang
đỏ đã được đề cập rất nhiều. Đặc biệt, các polyphenol từ rượu vang đỏ làm giảm nguy cơ
bệnh tim mạch và xơ cứng động mạch trong các nghiên cứu dịch tễ học của Renaud và De
Lorgeril năm 1992.
Dịch chiết ethanol từ hạt nho giàu các hợp chất nhóm polyphenol (proanthocyanidin). Các
hiệu ứng thu hẹp gốc tự do hình thành trong trong hệ H2O2 / NaOH / DMSO của chiết xuất
hạt nho đã được kiểm tra bằng phương pháp cộng hưởng điện tử bẫy spin (ESR) và so sánh
với các chất chống oxy hoá tự nhiên khác như: acid ascorbic, dl-α tocopherol, và β-caroten.
2.2.2. Nguyên liệu, phƣơng pháp nghiên cứu [8]
Hóa chất
DMPO thu được từ Công ty LABOTEC (Tokyo, Nhật Bản). Chất đối chiếu mua từ Aldrich
Chemical Co. (Milwaukee, WI). Các hóa chất khác mua từ Wako Pure Chemicals Ltd.
(Osaka, Nhật Bản).
Chuẩn bị dịch chiết hạt Nho
Nho (Vitis vinifera) được lấy từ Kikkoman Corp. (Tokyo). Dịch chiết được chiết xuất từ hạt
Nho bằng dung dịch etanol 20%.
Phân tích hàm lƣợng các thành phần trong dịch chiết hạt Nho
Thành phần
%
Proanthocyanidin

38.7
Flavanol đơn
2.40
Độ ẩm (bằng phương pháp Karl Fischer)
2.10
Protein thô (tổng N × 6.25)
3.70
Chất béo (phương pháp chiết Soxhlet)
0
Chất xơ
0
Tro
5.00
Glucose
7.79
Fructose
8.85
Đường khác
2.66
Acid hữu cơ
11.60
Acid khác
5.05
Những thành phần khác có trong hạt Nho
11.99

9


Chuẩn bị Oligomer procyanidin tổng hợp.

Các oligomer procyanidin tổng hợp bao gồm: dimer, trimer, tetramer, và pentamer
(+) – catechin và (+) - taxifolin được kết tủa với sự hiện diện của NaBH4 trong ethanol.
Các chất phản ứng được tách ra bằng cách sử dụng cột sắc ký Sephadex LH-20
Dụng cụ đo phổ
Phổ ESR được ghi trên một quang phổ JEOL JESRE1X sử dụng cốc đo phẳng bằng thạch anh
được thiết kế cho dạng dung dịch.
Điều kiện ESR
Các điều kiện của quang phổ ESR là như sau:
Từ trường: 336,3 ± 5 mT; công suất: 8,0 mW; tần số điều chế: 100 kHz; biên độ điều chế:
0,063 mT; số lần quét: 500; thời gian quét 1 phút; thời gian liên tục: 0,03 s.
2.2.3. Quy trình thí nghiệm [8]
50 μL dimethyl sulfoxide (DMSO), NaOH 25 mM và dung dịch mẫu (dung dịch nước) được
trộn đồng lượng trong một ống nhựa dùng một lần, tiếp theo bổ sung 5 μL DMPO và 50 μL
hydrogen peroxide 30%.
Trong trường hợp chất chống oxy hoá tan trong dầu thì mẫu được hòa tan trong 50 μl DMSO,
nước tinh khiết và NaOH 25 mM pha đồng lượng, tiếp theo là bổ sung 5 μL DMPO và 50 μL
Hydrogen peroxide 30%.
Hỗn hợp sau phản ứng được hút vào cốc đo bằng thạch anh và đặt trong máy ESR. Quá trình
quét được bắt đầu sau khi bổ sung hydrogen peroxide 10 phút
Chiều cao tín hiệu được tính bằng cách sử dụng một chương trình phân tích gốc gắn liền với
công cụ.
Tính toán được thực hiện cho chiều cao tín hiệu dương của Methyl-DMPO và gốc hydroxylDMPO và cho chiều cao tín hiệu âm của superoxide-DMPO

Phổ ESR điển hình trong hệ thống H2O2/NaOH/DMSO

10


Khả năng thu dọn gốc tự do của acid ascorbic, dl-α tocopherol, β-caroten và dịch
chiết hạt nho ở ba nồng độ

2.2.4. Kết quả [8]
Chiết xuất hạt nho làm giảm đáng kể cường độ tín hiệu ESR của các gốc tự do superoxide5,5-dimetyl-1-pyrrolin-N-oxit (DMPO).
Chiết xuất hạt nho cũng có hoạt động thu dọn yếu đối với gốc tự do hydroxyl và hoạt động
nhỏ trên gốc methyl.
Axit ascorbic đã biểu hiện các hoạt động dọn sạch superoxide và hydroxyl mạnh mẽ nhưng nó
làm tăng lượng gốc methyl ở nồng độ cao.
dl-α tocopherol làm giảm lượng anion superoxide, đặc biệt là lượng gốc methyl. Tuy nhiên,
nó làm giảm nhẹ lượng gốc hydroxyl.
Caroten làm giảm lượng gốc hydroxyl và methyl triệt để, nhưng cũng làm giảm nhẹ anion
superoxid.
Trong trường hợp kết hợp sử dụng β-caroten và dl-α tocopherol, tất cả các loại gốc tự do đều
được thu dọn một cách triệt để.
Sự kết hợp Chiết xuất hạt nho và dl-α tocopherol cũng có thể làm giảm tất cả các loại một
cách triệt để.
Carotene và dl-α tocopherol có thể làm giảm gốc methyl được hình thành do axit ascorbic.

11


2.3. Quang phổ cộng hƣởng điện tử đƣợc nghiên cứu hoạt động thu dọn gốc tự do của
anthocyanin và pyranoanthocyanin có trong rƣợu vang
2.3.1. Giới thiệu [6]
Anthocyanin là một nhóm các sắc tố tự nhiên chịu trách nhiệm về màu sắc xanh đỏ của nhiều
loại trái cây và rau cải. Chúng là glycosid của anthocyanidin bao gồm các chất polyhydroxy
hoặc polymethoxy khác nhau của muối 2-phenylbenzopyrylium hoặc flavilium. Nhiều trái
cây, ngũ cốc và rau cải màu đỏ, cũng như rượu vang, là nguồn anthocyanin trong chế độ ăn
uống của con người. Lượng anthocyanins ở người đã được ước tính là 180-215 mg / ngày ở
Hoa Kỳ, cao hơn nhiều so với các flavonoid khác (23 mg / ngày) bao gồm quercetin,
kaempferol, myricetin, apigenin, và luteolin]. Anthocyanin được hấp thụ nhanh chóng với tỷ
lệ rất thấp (<1%). Sau đó xuất hiện trong tuần hoàn máu và nước tiểu dưới dạng các dạng

methyl hóa, glucur và / hoặc sulfoconugat. Trong quá trình lão hóa rượu vang đỏ, mất
anthocyanin và hình thành các chất màu khác, được gọi là vitisin thông qua sự tương tác của
các anthocyanin ban đầu với acid pyruvic.
Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy tiêu thụ anthocyanins vừa phải có thể liên quan đến việc
bảo vệ chống lại bệnh tim mạch, viêm mãn tính và ung thư. Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu
về hoạt động chống oxy hoá của chiết xuất nho cũng như rượu vang đỏ, hoạt động thu dọn
gốc tự do của anthocyanin và pyranoanthocyanin tinh khiết phần lớn không rõ. Trong nghiên
cứu này, hydroxyl và các hoạt động thu hồi anion superoxide của anthocyanin và các tương
tác với acid pyruvic của chúng đã được điều tra một cách có hệ thống bằng quang phổ cộng
hưởng electron spin và bẫy spin (ESR).
2.3.2. Nguyên liệu, phƣơng pháp nghiên cứu [6]
Chuẩn bị mẫu
Các thành phần thử nghiệm
Anthocyanin
(delphinidin-3-glucosid,
cyanidin-3-glucosid,
petunidin-3-glucosid,
pelargonidin-3-glucosid và malvidin-3-glucosid) đã được phân lập từ các chiết xuất methanolacid khác nhau và các pyranoanthocyanin tương ứng được tổng hợp từ anthocyanin.
Chuẩn bị chiết xuất
Delphinidin-3-glucosid, petunidin-3-glucosid và malvidin-3-glucosid đã được phân lập từ
chiết xuất vỏ Nho đỏ
Cyanidin-3-glucosid chiết xuất từ mận đỏ.
Pelargonidin-3-glucosid đã được phân lập từ dịch chiết dâu tây
Phân lập và tinh khiết hóa các anthocyanin
Anthocyanins đã được phân lập từ các dịch chiết nước bằng phương pháp HPLC bán điều chế
Sử dụng một sắc ký lỏng Waters 600. Cột Ultracarb ODS, 5 lm, 250610.00 mm
(Phenomenex).

12

Phát hiện ở bước sóng 520 nm. Dung môi được sử dụng là acid acetic 5% (A) và methanol
(B) ở tốc độ dòng chảy 3 mL/Phút
Tổng hợp và tinh khiết hóa pyranoanthocyanin
Kiểm tra sự tinh khiết của anthocyanin và pyranoanthocyanin
Độ tinh khiết của anthocyanin và pyranoanthocyanin được kiểm tra bằng HPLC
Thử khả năng chống oxy hoá bằng phổ cộng hƣởng spin điện tử
Nghiên cứu bẫy spin spin điện tử (ESR) được thực hiện trên một quang phổ JEOL JES-TE
200 (X-band đơn vị vi sóng). Thí nghiệm được tiến hành tỞ 23 oC.
Hoạt động thu dọn gốc tự do superoxid
Đối với bẫy spin ESR, hoạt tính của các chất chống oxy hoá được thực hiện trong dung dịch
600 µl trong một ống nghiệm nhỏ có chứa 160 µl dung dịch hypoxanthin 2 mM trong dung
dịch đệm phosphat 100 mM, 20 µl dung dịch DMPO 10,5 M, 160 µl dung dịch xanthin oxidas
trong nước cất 0,4 U/ml, 60 µl DTPA 10 mM (diehtylenetetramin-N, N, N9, N99, N99pentaacetic acid) trong nước cất, 100 µl nước cất và 100 µl dung dịch mẫu. Phản ứng bắt đầu
bằng việc bổ sung dung dịch xanthin oxidase.
Sau khi khuấy trong 5 giây, 50 µl của hỗn hợp phản ứng được chuyển sang ống mao quản
dùng một lần. Phổ ESR được đo 2 phút sau khi bổ sung dung dịch xanthin oxidase.
Cài đặt quang phổ ESR như sau:
Từ trường trung tâm 325 ± 5 mT; tần số vi sóng 9,00 GHz; biên độ điều chế 0.1 mT; công
suất vi sóng 8,00 mW; thời gian hằng số 0,3 giây; thời gian quét 0.5 phút; Và quét chiều rộng
100 G.
Hoạt động thu dọn gốc hydroxyl
Đối với nghiên cứu bẫy spin ESR, hệ phản ứng Fenton được thực hiện trong dung dịch nước
500 µl trong một ống nghiệm nhỏ có chứa 50 µl H2O2 5 mM, 50 µl DMPO mM (5,5-dimetyl1-pyrroline-N-oxit), 150 µl nước cất, 150 µl dung dịch đệm phosphat 50 mM (pH 7,4), 50 µl
của hợp chất thử và 50 µl dung dịch sắt clorua 0,5 mM mới chuẩn bị. Nước được sử dụng là
nước không có ion kim loại. Phản ứng Fenton được bắt đầu bằng cách thêm dung dịch FeCl2.
Sau khi khuấy trong 5 giây, 50 µl hỗn hợp phản ứng được chuyển sang mao quản dùng một
lần. Phổ ESR được đo 2 phút sau khi bổ sung FeCl2.
Cài đặt quang phổ ESR như sau:
Từ trường trung tâm 325 ± 5 mT; tần số vi sóng 9,00 GHz; biên độ điều chế 0.2 mT; công

suất vi sóng 8,00 mW; thời gian hằng số 0,3 giây; thời gian quét 0.5 phút; Và quét rộng 100 G
2.3.3. Kết quả [6]
Các 3-glucosid của delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin và malvidin, và tương tác
pyruvic của 3-glucosid của delphinidin có biểu hiện thu dọn anion superoxid mạnh, và ở mức
độ thấp hơn ở hydroxyl.

13


Các pyranoanthocyanin của cyanidin, petunidin, malvidin và pelargonidin cho thấy có khả
năng cao để loại bỏ các gốc anion superoxid nhưng không thải ra hydroxyl
Dữ liệu hiện tại chỉ ra rằng sự hình thành anthocyanin tương tác với acid pyruvic, có thể xảy
ra trong quá trình lão hóa rượu vang hoặc chế biến nước trái cây, làm giảm sự hấp thụ anion
hydroxyl và superoxid và do đó có thể làm giảm khả năng chống oxy hóa của các hợp chất
này.

Tài liệu tham khảo

1.

TCVN/TC/F5/SC1, T.b.k.t.t.c. (2007), "Thực phẩm -Phát hiện chiết xạ đối với thực
phẩm chứa đường tinh thể bằng phương pháp đo phổ ESR". Tiêu chuẩn Việt Nam.
TCVN 7747 : 2007.

2.

Antolovich, M., P.D. Prenzler, et al. (2002), "Methods for testing antioxidant activity".
The Analyst (Royal Society of Chemistry). 127(1): p. 183-198.

3.

Gardner, P.T., Donald B McPhail, et al. (1999), "Electron spin resonance (ESR)
spectroscopic assessment of the contribution of quercetin and other flavonols to the
antioxidant capacity of red wines". Journal of the Science of Food and Agriculture.
79: p. 1011-1014.

4.

Roman, O., M.-N.l. Maillard, et al. (2010), "Electron spin resonance spectroscopy: a
promising method for studying lipid oxidation in foods". Lipid Technology. Vol 22(4):
p. 87-90.

5.

Schweiger, A. (1991), "Pulsed Electron Spin Resonance Spectroscopy: Basic
Principles, Techniques, and Examples of Applications". A Journal of the Gesellschaft
Deutscher Chemiker. Vol 30(3): p. 265-292.

6.

Sons), W.B.J.W. (2005), "Electron spin resonance spectroscopy studies on the free
radical scavenging activity of wine anthocyanins and pyranoanthocyanins". Molecular
Nutrition & Food Research. Vol 49 (12): p. 1112-1119.

7.

Tran, T.T., M.T. Cronin, et al. (2000), "Determination of anti-oxidant activity by
electron spin resonance spectroscopy". Pest Management Science. Vol 56: p. 818-820.

8.

Yamaguchi, F., Y. Yoshimura, et al. (1999), "Free Radical Scavenging Activity of
Grape Seed Extract and Antioxidants by Electron Spin Resonance Spectrometry in an
H2O2/NaOH/DMSO System". Journal of Agricultural and Food Chemistry. Vol
47(7): p. 2544–2548.

14