Xác định hàm lượng acrylamid trong một số sản phẩm có nguồn gốc tinh bột bằng sắc ký lỏng khối phổ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----- oOo -----

NGUYỄN THỊ THU HIẾU

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACRYLAMID
TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM
CÓ NGUỒN GỐC TINH BỘT BẰNG
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU HIẾU
MSV: 1401215

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACRYLAMID
TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM CÓ
NGUỒN GỐC TINH BỘT BẰNG SẮC KÝ
LỎNG KHỐI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Nguyễn Thị HàBình
2. ThS. Nguyễn Thị Thùy Linh
Nơi thực hiện:

1. Viên Kiểm nghiệm ATVSTP QG
2. Bộ môn Hóa phân tí
ch – Độc chất

HÀ NỘI - 2019


Lời cảm ơn
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy côgiáo
TS. Trần Cao Sơn, ThS. Nguyễn Thị Hà Bình vàThS. Nguyễn Thị Thùy
Linh đã luôn tận tâm hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong quátrì
nh học
tập, nghiên cứu khoa học cũng như hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Khoa Độc học
vàdị nguyên thuộc Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã
hết lòng quan tâm, giúp đỡ vàtạo điều kiện tốt nhất trong quátrình em làm việc
tại Viện.
Em cũng xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo
Trường Đại học Dược HàNội và đặc biệt làcác thầy côgiáo bộ môn Hóa phân
tích và Độc chất đã dành hết tâm huyết, truyền đạt cho em những kiến thức quý
báu trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người bạn, những
người anh, chị, em đã luôn ở bên quan tâm, giúp đỡ, động viên, giúp em vượt
qua mọi khó khăn, là động lực để em học tập, rèn luyện vàhoàn thành khóa luận
của mình một cách tốt nhất.
Em xin chân thành cảm ơn!
HàNội, ngày 11 tháng 6 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hiếu

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................ 3
1.1.

Tổng quan về acrylamid ................................................................... 3

1.1.1.
1.1.2.
1.1.3.
1.1.4.
1.1.5.
1.2.

Giới thiệu chung về acrylamid ..................................................... 3
Độ ổn định .................................................................................... 4
Phản ứng tạo thành acrylamid..................................................... 4
Độc tính của acrylamid ................................................................ 5
Các quy định về mức tiêu thụ acrylamid ..................................... 7

Tổng quan về phương pháp xác định acrylamid ........................... 7

1.2.1. Phương pháp chiết- làm sạch ...................................................... 7
1.2.1.1. Phương pháp chiết .................................................................... 7
1.2.1.2. Phương pháp làm sạch ............................................................. 8
1.2.2. Phương pháp phân tích acrylamid ............................................... 8
1.3.

Tổng quan về sắc kýlỏng khối phổ LC-MS/MS .......................... 11

1.3.1.
1.3.2.

Nguyên lýhoạt động của thiết bị sắc kýlỏng khối phổ ............. 11
Cấu tạo thiết bị phân tích khối phổ ba tứ cực............................ 12

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 14
2.1.

Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 14

2.2.

Nguyên vật liệu, thiết bị.................................................................. 14

2.2.1.
2.2.2.
2.3.

Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 16

2.3.1.
2.3.2.
2.4.

Nguyên vật liệu........................................................................... 14
Thiết bị ....................................................................................... 15
Khảo sát các điều kiện phân tích xác định acrylamid ............... 16

Thẩm định phương pháp ............................................................ 16

Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 16

2.4.1.
2.4.2.
2.4.3.
2.4.4.
2.4.5.

Phương pháp lấy mẫu ................................................................ 16
Phương pháp xử lýmẫu sơ bộ ................................................... 17
Phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS .................................. 17
Phương pháp thẩm định ............................................................. 17
Phương pháp xử lýkết quả ........................................................ 20

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................... 21
3.1.

Khảo sát điều kiện tách bằng LC-MS/MS.................................... 21

3.1.1.
3.1.2.
3.2.

Khảo sát các điều kiện khối phổ ................................................ 21
Khảo sát các điều kiện sắc kýlỏng ............................................ 24

Khảo sát các điều kiện xử lýmẫu .................................................. 27

3.2.1.
3.2.2.
3.2.3.
3.2.4.
3.3.

Thẩm định phương pháp phân tích .............................................. 32

3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
3.3.4.
3.3.5.
3.4.

Khảo sát việc dùng dung dịch carrez ......................................... 28
Khảo sát loại cột SPE ................................................................ 28
Khảo sát thể tí
ch rửa giải SPE................................................... 29
Đánh giá ảnh hưởng nền............................................................ 30
Độ phùhợp hệ thống .................................................................. 32
Độ đặc hiệu ................................................................................ 32
Giới hạn phát hiện (LOD) vàgiới hạn định lượng (LOQ) ........ 34
Khoảng làm việc và đường chuẩn.............................................. 35
Độ lặp lại và độ đúng ................................................................. 36

Ứng dụng phương xác định acrylamid trong một số mẫu thực

trên địa bàn HàNội ................................................................................... 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Giải nghĩa

Từ viết tắt
ACN
AOAC

Acetonitril
Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội các
cộng đồng phân tích chí
nh thức)

CE

Collision energy (Năng lượng va chạm)

CZE

Capillary zone electrophoresis (Điện di mao quản vùng)

ESI

Electrospray ionization (Ion hóa phun điện tử)

GC-MS/MS

GC-ECD

HPLC-DAD

Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc kýkhí
khối phổ hai lần)
Gas chromatography with Electron Capture Detector (Sắc ký
khi với detector cộng kết điện tử)
High-performance liquid chromatography with a diode-array
detector (Sắc kýlỏng hiệu năng cao với detector mảng diod)

IP

Identification point (Điểm nhận dạng)

IS

Internal standard (chất chuẩn nội)

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký
lỏng khối phổ hai lần)

LOD

Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of quantification (Giới hạn định lượng)


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1. Độ tan của acrylamid trong một số dung môi

2

2

Bảng 1.2. Nguy cơ của acrylamid thông qua một số thực phẩm

5

3

Bảng 1.3. Một số phương pháp xác định acrylamid

9

4

Bảng 3.1. Mảnh mẹ, mảnh con của acrylamid vàd3-acrylamid

21

5

Bảng 3.2. Các thông số tối ưu của MS để phân tích acrylamid

23

6

Bảng 3.3. Khảo sát các cột sắc ký

24

7

Bảng 3.4. Chương trình gradient phân tích acrylamid

26

8

Bảng 3.5. Kết quả thẩm định tính tương thích hệ thống

32

9

Bảng 3.6. Tỷ lệ ion của acrylamid

33

10

Bảng 3.7. Kết quả thẩm định khoảng tuyến tí
nh

35

11

Bảng 3.8. Độ lặp lại và độ thu hồi của acrylamid tại các nồng độ

37

12

Bảng 3.9. Hàm lượng acrylamid trong một số mẫu bim bim khoai
tây vàkhoai tây chiên

38


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT
1
2

Tên hình
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acrylamid
Hình 1.2. Cơ chế đề xuất theo phản ứng Maillard, sự hì
nh thành
acrylamid từ asparagin và đường khử

Trang
3
4

3

Hình 1.3. Môhì
nh hệ thống HPLC-MS/MS

11

4

Hình 1.4. Bộ phận phân tích khối ba tứ cực

12

5

Hình 3.1. Phổ khối MS của acrylamid sau khi bắn pháion

22

6

7

Hình 3.2. Sắc ký đồ thu được khi khảo sát cột Symmetry® C18,
Atlantilis HILIC, IntertsilTM HILIC vàCosmosil HILIC
Hình 3.3. Sắc ký đồ thu được khi sử dụng cột Cosmosil HILIC
và chương trình gradient đã chọn tại nồng độ 100 ng/mL

25

27

8

Hình 3.4. Kết quả khảo sát thể tí
ch carrez

28

9

Hình 3.5. Kết quả khảo sát hiệu suất cột C18 vàHLB

29

10
11
12

Hình 3.6. Tí

n hiệu của acrylamid khi không rửa giải và3 lần rửa
liên tiếp
Hình 3.7. Quy trình xử lýmẫu tối ưu
Hình 3.8. Sắc ký acrylamid ở mẫu trắng, mẫu chuẩn trên dung
môi 100ng/mL vàmẫu trắng thêm chuẩn 100 ng/mL dịch đo

30
31
33

13

Hình 3.9. Sắc ký đồ của acrylamid tại LOD

34

14

Hình 3.10. Sắc ký đồ của acrylamid tại LOQ

35

15

Hình 3.11. Khoảng làm việc của acrylamid

36

16

Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu M1 vàM7

39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, xu hướng tiêu thụ các loại thức ăn nhanh như khoai tây chiên,
bánh mì, mì ăn liền…ngày càng trở nên phổ biến. Theo đó tiềm ẩn các mối nguy
mất an toàn thực phẩm, trong đó có thể có mặt các chất độc sinh ra trong quá
trì
nh chế biến. Gần đây, các nhàkhoa học đã có những cảnh báo về sự xuất hiện
của chất có khả năng gây ung thư là acrylamid (theo Tổ chức nghiên cứu ung
thư quốc tế IARC) [15]. Acrylamid được hì
nh thành trong quá trì
nh chế biến
thực phẩm cóchứa acid amin asparagin vànhóm cacbonyl ở điều kiện nhiệt độ
cao như chiên rán [24].
Tháng 4 năm 2002, Cơ quan Quản lýthực phẩm Thuỵ Điển cùng với nhóm
nghiên cứu của trường Đại học Stockholm lần đầu tiên đã tìm ra sự hiện diện
của acrylamid trong một số thực phẩm có nguồn gốc tinh bột được chế biến ở
nhiệt độ cao. Nghiên cứu này đã chỉ ra độc tí
nh có thể gây ung thư của
acrylamid. Ngoài ra, acrylamid cũng được xếp vào nhóm chất có khả năng gây
độc tí
nh thần kinh, độc tính sinh sản, độc tính trên gen vàảnh hưởng đến khả
năng sinh sản (hiệu ứng gây hại nhiễm sắc thể) ở động vật gặm nhấm [21].
Những nghiên cứu về độc tính của acrylamid trên người còn rất hạn chế.
Tuy vậy, việc phân loại acrylamid như một chất cónguy cơ gây ung thư ở người
đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu về phát hiện và định lượng
acrylamid. Từ đó, trên thế giới, nhiều nghiên cứu về định lượng acrylamid trong

thực phẩm đã được tiến hành. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện vẫn chưa có phương
pháp chính thức để xác định acrylamid trong thực phẩm. Điều đó đặt ra yêu cầu
cấp thiết phải có phương pháp phân tích đáng tin cậy và có độ nhạy thích hợp để
kiếm soát được lượng acrylamid trong các mẫu thực phẩm. Xuất phát từ yêu cầu
thực tế vànhận thấy trong các nghiên cứu trên thế giới, acrylamid xuất hiện chủ
yếu ở các sản phẩm cónguồn gốc tinh bột được chế biến qua quátrình chiên rán,
vìthế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định hàm lượng acrylamid
trong một số sản phẩm có nguồn gốc tinh bột bằng sắc ký lỏng khối phổ”
với các mục tiêu sau:
1


- Xây dựng vàthẩm định phương pháp xác định acrylamid trong bim bim
khoai tây vàkhoai tây chiên bằng LC-MS/MS.
- Ứng dụng phương pháp trên để xác định hàm lượng acrylamid trong
một số sản phẩm bim bim khoai tây vàkhoai tây chiên trên thị trường.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về acrylamid

1.1.1. Giới thiệu chung về acrylamid
 Cấu trúc hóa học
Acrylamid là một hợp chất vinylic có công thức phân tử C3H5NO, khối
lượng phân tử 71,08 g/mol vàcótên khoa học làprop-2-enamid.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acrylamid
- Tính chất hóa lý [8, 18]
Acrylamid làchất rắn kết tinh màu trắng; không mùi; dễ tan trong nước và
các dung môi phổ biến khác như aceton, methanol, ethanol; có nhiệt độ nóng
chảy là84,5 ± 0,3 oC; nhiệt đô sôi là 136 oC (ở áp suất 25 mmHg). Acrylamid
thể hiện cả tí
nh acid yếu vàbase yếu. Hệ số phân bố (log P) của acrylamid bằng
-0,67.
Bảng 1.1. Độ tan của acrylamid trong một số dung môi
g/100ml ở 30oC

Dung môi
Nước

215,5

Methanol

155,0

Ethanol

86,2

Aceton

63,1

Acetonitril

39,6

Ethyl acetat

12,6

Chloroform

2,66

Benzen

0,35

n- Heptan

0,0068
3


1.1.2. Độ ổn định
Acrylamide ổn định ở nhiệt độ phòng, bền trong acid, không bền trong base,
nhạy cảm với ánh sáng [26].
1.1.3. Phản ứng tạo thành acrylamid
Acrylamid là sản phẩm trung gian trong quá trình chế biến thực phẩm ở
nhiệt độ cao (hơn 120oC) như chiên, nướng, quay. Acrylamid được tìm thấy chủ
yếu trong các loại thực phẩm cónguồn gốc thực vật giàu tinh bột, đặc biệt làcác
sản phẩm từ khoai tây như khoai tây chiên; các loại thực phẩm ngũ cốc như
bánh quy, ngũ cốc ăn sáng, bánh mì nướng vàcàphê[29]. Sự hình thành của
acrylamid trong thực phẩm thông qua phản ứng Mailard, phản ứng hoáhọc giữa

acid amin Asparagin và đường khử ở nhiệt độ cao trên 120oC [24].

Hình 1.2. Cơ chế đề xuất theo phản ứng Maillard, sự hì
nh thành acrylamid
từ asparagin và đường khử [18]

4


Bảng 1.2. Nguy cơ nhiễm acrylamid thông qua một số thực phẩm [20]
Thực phẩm/ Nhóm thực phẩm

Nồng độ acrylamid (µg/kg)

Khoai tây (chưa qua chế biến)

<10 - <50

Khoai tây chiên/bim bim khoai tây (lát mỏng)

177– 4215

Khoai tây chiên/ bim bim khoai tây (dạng thanh)

59–5200

Các sản phẩm bánh mìvàbánh quy

18–3324

Bánh mì

<10–3200

Bánh mì ( nướng)

25–1430

Ngũ cốc ăn sáng

<10–1649

Các sản phẩm hoa quả vàrau khác

<10–70

Các sản phẩm chocolate

<2-826

Caférang

45-935

Caféthay thế ( không cócafein)

80-5399

Caféhòa tan

87-1188

Thịt

<10-116

Các sản phẩm giảm cân

<10-100

Thức ăn trẻ em vàsữa công thức

<10-130

1.1.4. Độc tính của acrylamid
- Động học [11, 9]
 Hấp thu
Acrylamid được hấp thu từ tất cả các con đường ăn, uống, thở, tiếp xúc qua
da. Việc hấp thu acrylamid qua đường ăn uống diễn ra nhanh chóng và hoàn
toàn ở tất cả các loài.
 Phân bố vàchuyển hóa
Các nghiên cứu trên động vật chỉ ra rằng acrylmid và glycidamid được
phân bố rộng rãi trong tất cả các mô của cơ thể, bao gồm cả trong sữa.
Glycidamid, sản phẩm oxy hóa của acrylamid vàglutathion, cóthể gây ung thư
và gây độc với gen trên động vật cao hơn so với chất gốc sinh ra nó. Khi so sánh
về chuyển hóa của acylamid ở người và động vật gặm nhấm kết quả chỉ ra rằng
5


mức độ oxy hóa của acrylamid ở chuột cao hơn động vật gặm nhấm và cao hơn

người. Ở chuột và động vật gặm nhấm, phần lớn sự hình thành glycidamid làdo
acrylamid liên hợp với glutathion. Ngược lại, ở người, phần lớn sự hì
nh thành
này thông qua thủy phân acrylamid, ít thông qua liên hợp với glutathion.
Con đường chuyển hóa chính của acrylamid ở người và động vật thí
nghiệm là tương đối giống nhau. Trong khoảng liều được sử dụng trong các
nghiên cứu độc tính trên động vật, mức độ chuyển hóa của chất gốc thành
glycidamid tỷ lệ nghịch với lượng acrylamid trong cơ thể- liều càng thấp thìtỷ
lệ chuyển đổi thành glycidamid càng cao.
 Thải trừ
Thời gian bán thải của acrylamid vàglycidamid khoảng 2 giờ với các loài
động vật gặm nhấm. Dữ liệu về dược động học ở người còn rất hiếm.
- Độc tính
Acrylamid được biết đến như một chất độc thần kinh ở người vàmột chất gây
ung thư ở động vật thínghiệm [30].
- Độc tính thần kinh
Tháng 6 năm 2002, theo báo cáo của Tổ chức FAO/WHO, việc tiêu thụ
acrylamid với hàm lượng cao trong thời gian ngắn sẽ gây ảnh hưởng đến hệ thần
kinh trung ương; trong khi đó, việc phơi nhiễm acrylamid trong thời gian dài với
liều lượng thấp thìgây ảnh hưởng lên thần kinh ngoại biên làchủ yếu [11].
- Độc tính gây ung thư
Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) đã phân loại acrylamid
thuộc nhóm 2A - “Có thể gây ung thư cho con người” (IARC 1994). Bằng
chứng khoa học về khả năng gây ung thư của acrylamid chủ yếu dựa vào dữ liệu
từ môhình thử nghiệm. Trong thínghiệm in vivo và in vitro đã chỉ ra rằng: Các
tế bào tiếp xúc với mức độ cao của acrylamid trải qua đột biến di truyền vàbiến
đổi tế bào [25]. Động vật tiếp xúc với acrylamid ở mức độ cao thấy có sự phát
triển của một số khối u, bao gồm cả các khối u tuyến vú, phổi, đường ruột và
đường sinh sản [12, 17].
6

1.1.5. Các quy định về mức tiêu thụ acrylamid
Theo khuyến cáo của Tổ chức FAO/WHO, mức cho phép tiêu thụ
acrylamide để không gây ảnh hưởng đến thần kinh là0,5 mg/kg cân nặng/ngày
[11].
Phụ nữ mang thai nên tuyệt đối tránh tiêu thụ acrylamid, đặc biệt hạn chế
ăn khoai tây chiên. Vìacrylamid tan tốt trong nước, mà lượng nước trong bào
thai làrất lớn. Các nhàkhoa học khuyến cáo phụ nữ mang thai không tiêu thụ
quá20 µg acrylamid mỗi ngày [11].
Ở Việt Nam chưa có quy định về mức cho phép tiêu thụ tối đa acrylamid
trong thực phẩm, hiện chỉ có quy định về mức hàm lượng tối đa trong nước ăn
uống là0,5 µg/L theo QCVN 01:2009.
1.2.

Tổng quan về phương pháp xác định acrylamid

1.2.1. Phương pháp chiết- làm sạch
Mẫu trước khi đem đi phân tích và phát hiện bằng detector phù hợp cần
được chiết vàlàm sạch bằng những phương pháp thích hợp.
1.2.1.1. Phương pháp chiết
Mục đích của quy trì
nh chiết là đưa được tối đa lượng chất cần phân tích từ
nền mẫu thực phẩm vào dung môi thí
ch hợp để làm các bước tiếp theo. Hợp chất
sẽ được kéo ra khỏi pha rắn nền mẫu vàphân bố vào pha lỏng dung môi chiết.
Hiệu quả của quy trì
nh chiết sẽ được đánh giá bởi hiệu suất thu hồi. Theo các
nghiên cứu trước đây [3, 13, 16, 14], dung môi chiết thường dùng là nước hoặc
methanol. Do acrylamid tan rất tốt trong nước, nên nước vừa có tác dụng làm

trương nở mẫu, tạo điều kiện cho quá trình chiết vừa là dung môi hòa tan
acrylamid. Tuy nhiên, ngoài việc hòa tan tốt acrylamid, nước còn hòa tan nhiều
thành phần khác trong mẫu như đường, protein, acid amin, acid hữu cơ [10]. Do
đó, ta cần lựa chọn phương pháp làm sạch cho phù hợp để loại bớt những tạp
này, làm giảm ảnh hưởng của chúng đến kết quả phân tích.
Kỹ thuật cơ học để lắc, trộn mẫu thường được sử dụng trong các nghiên
cứu làmáy lắc vortex.
7


1.2.1.2. Phương pháp làm sạch
Bước làm sạch giúp làm giảm ảnh hưởng của các yếu tố nhiễu vàtừ đó làm
tăng khả năng xác nhận của phương pháp phân tích. Bước làm sạch cần đáp ứng
các yếu tố cơ bản làloại chất béo trước khi chiết vàloại protein trong dịch chiết
[10]. Các nghiên cứu trên thế giới chủ yếu cóhai nhóm làm sạch là phương pháp
QuEChERS và phương pháp làm sạch bằng cột chiết pha rắn [22].
Phương pháp QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe)
ban đầu được ứng dụng để xác định dư lượng các hóa chất bảo vệ thực vật trong
cây. Sau đó đã có nhiều nghiên cứu phát triển cho nhiều nhóm chất khác nhau
do có các ưu điểm về chiết đồng thời các chất, thực hiện nhanh, giáthành thấp.
Hiện nay đã có nghiên cứu dùng QuEChERS để xác định acrylamid [22, 6]. Tuy
nhiên, phương pháp QuEChERS có nhược điểm khó làm giàu mẫu, dịch chiết
chứa nhiều tạp vàhiệu suất thấp.
Với làm sạch bằng cột chiết pha rắn, nhiều nghiên cứu đã sử dụng cột
Oasis HLB vàcột Accucat (Bảng 1.3). Phương pháp làm sạch bằng chiết pha rắn
có ưu điểm làchọn lọc hơn, ít tốn dung môi vàcho hiệu suất cao hơn. Do đó,
phương pháp làm sạch bằng cột chiết pha rắn đã được lựa chọn sử dụng cho
nghiên cứu này.
1.2.2. Phương pháp phân tích acrylamid
Để xác định hàm lượng của acrylamid, sắc ký lỏng (LC), sắc ký khí(GC)

và điện di mao quản (CE) đã được sử dụng.
a. Kỹ thuật điện di mao quản
Một nghiên cứu đã xác định hàm lượng acrylamid trong mẫu bánh quy, ngũ
cốc, bánh mì giòn, đồ ăn nhẹ vàcàphêbằng việc sử dụng phương pháp CZE với
dung dịch đệm phosphat 40mM (pH 8,5) và phát hiện bằng detector UV
(210nm). Phương pháp này có LOD là 1 ng/g đối với kỹ thuật tiêm mẫu trường
khuếch đại và20 ng/g đối với kỹ thuật tiêm mẫu xếp chồng [4].
Phương pháp này có ưu điểm làgiáthành rẻ, khả năng phân tách tốt, lượng
dung môi vàmẫu dùng cho CE hầu như không đáng kể so với HPLC. Tuy nhiên,
8


phương pháp có độ nhạy thấp nếu không dùng các kỹ thuật tiêm mẫu đặc biệt
trên, độ lặp lại kém và chưa phổ biến ở Việt Nam hiện nay.
b. Kỹ thuật sắc ký
Kỹ thuật sắc ký là kỹ thuật xác định phổ biến nhất hiện nay với các
detector khối phổ MS, bắt bẫy điện tử ECD, mảng diot array DAD…
Bảng 1.3. Một số phương pháp xác định acrylamid
Phương
pháp

Mẫu

LOD-

Xử lýmẫu

LOQ

TK

Sau khi làm sạch bằng n- LOD:
GC-MS

Khoai tây chiên hexan, acrylamid được rửa 5-50
giải bằng nước.

[10]

ng/g

Khoai tây chiên, n- hexan, chiết với dung dịch
GC-ECD

bim bim khoai
tây, cánh gà
chiên

GCMS/MS

Khoai tây chiên
vàsnack khoai
tây

nước của NaCl, dẫn xuất hóa LOD: 0,1
với KbrO3 vàKBr, chiết lỏng ng/g

[31]

lỏng với ethyl acetat

Phương pháp chiết siêu pha
rắn (SPME) được sử dụng để LOD: 0.1
chiết xuất acrylamid trong ng/g

[19]

nước
Chiết

acrylamid

với

methanol, loại tạp protein
HPLCDAD

Thực phẩm có bằng dung dịch Carrez I và
nguồn gốc từ
khoai tây

II, bay hơi methanol và
chuyển

dung

môi

thành

LOD: 4

ng/g

[13]

nước, làm sạch bằng cột
Oasis HLB vàcột Accucat.
LCMS/MS

Các sản phẩm

Chiết với nước và làm sạch

khoai tây và ngũ bằng cột Oasis HLB và cột
cốc

Bond Elut-Accucat®.
9

LOD: 10
ng/g

[14]


Khoai tây chiên, Mẫu được loại chất béo bằng LOD: 1.5
HPLC-

bánh mỳ giòn,

iso-hexan, chiết bằng nước ng/g

MS/MS

ngũ cốc, bánh

và acetonitril, loại protein LOQ: 5

quy, thịt.
Khoai tây chiên,
LC-MS

ngũ cốc, vụn
bánh mì,càphê

LCMS/MS

Các sản phẩm từ
khoai tây và ngũ
cốc

bằng dung dịch Carrez I, II

[16]

ng/g

Mẫu được chiết bằng nước;
làm sạch bằng cột Oasis LOD: 10
HLB vàcột Accucat.

ng/g

[26]

Mẫu được chiết bằng nước,
làm sạch bằng cột SPE là

[27]

Isolute Multimode 300 mg

Khoai tây chiên, Mẫu được chiết bằng nước LOD: 34
LC-

ngũ cốc, đồ ăn

MS/MS

qua chế biến

và làm sạch bằng cột Oasis ng/g
HLB vàcột Accucat.

như pizza, gà,…

LOQ: 68

[7]

ng/g

Bảng trên cho thấy:
- Cả phương pháp GC và LC đều được sử dụng phổ biến. Tuy nhiên,
phương pháp GC cần cóquátrì
nh dẫn xuất hóa trước khi phân tí
ch, vìvậy
quy trình xử lý mẫu phức tạp và tốn thời gian hơn. Ngoài ra, thời gian
phân tích cho mỗi mẫu bằng GC thường kéo dài hơn so với LC.
- Việc sử dụng detector MS hai lần cho độ nhạy cao, tính chọn lọc cao và
phùhợp với điều kiện sẵn cótại phòng thínghiệm.
Từ hai lýdo trên, phương pháp LC-MS/MS đã được lựa chọn để phân tích
acrylamid trong nghiên cứu này.

10


1.3.

Tổng quan về sắc kýlỏng khối phổ LC-MS/MS

1.3.1. Nguyên lýhoạt động của thiết bị sắc kýlỏng khối phổ
Sắc ký lỏng khối phổ làmột kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa
khả năng tách các chất của hệ thống HPLC và khả năng phân tích khối của
detector khối phổ. Một sắc kýlỏng khối phổ gồm: sắc kýlỏng (LC) vàkhối phổ.

Hình 1.3. Môhì
nh hệ thống LC-MS/MS
Sắc ký làmột kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột
chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố
của chúng gữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với

pha tĩnh và pha động. Thứ tư rửa giải các chất ra khỏi cột vìvậy phụ thuộc vào
các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột
cần được điểu chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.
Khối phổ làmột kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích ion (m/z)
được tạo thành trong pha khítừ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Các ion được
tạo thành trong buồn ion hóa, được gia tốc (dưới tác dụng của điện trường) và
tách riêng nhờ bộ phận tích khối trước khi đến detector. Dưới tác dụng của điện
trường, các ion cókhối lượng , điện tích khác nhau sẽ chuyển động với tốc độ và
quỹ đạo khác nhau. Do vậy, sau khi đi qua bộ phận phân tí
ch khối, các ion sẽ
được phân tách riêng thành từng loại. Bộ phận phát hiện sẽ ghi nhận loại ion
được lựa chọn thành từng vạch phổ tương tưng trên phổ đồ.

11


Năng lượng ion hóa làyếu tố quyết định sự phân mảnh các hợp chất. Quá
trì
nh phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của mỗi phân tử và là cơ sở để nhận
dạng, định danh, định tí
nh chất phân tích [2].
1.3.2. Cấu tạo thiết bị phân tích khối phổ ba tứ cực
1.3.2.1. Bộ phận nạp mẫu
Bộ phận nạp mẫu là đầu ra của một thiết bị phân tích khác được kết nối với
khối phổ. Với LC/MS, ta cần phải chuyển chất phân tí
ch từ pha lỏng sang pha
hơi trước khi chuyển sang bộ phận ion hóa.
1.3.2.2. Bộ nguồn ion hóa
Trong máy khối phổ có nhiều cách để ion hóa phân tử vànguyên tử của
mẫu ở trạng thái khíhoặc hơi. Một số kỹ thuật thường dùng:

- Va chạm electron (Electron Impact- EI)
- Ion hóa hóa học (chemical ionization- CI)
- Nguồn ion bằng phun sương khử solvat (dissolvation nebulization sources)
- Nguồn ion bằng giải hấp (Ionization desorption sources)
1.2.3.3. Bộ phận phân tí
ch khối ba tứ cực.

Hình 1.4. Bộ phận phân tí
ch khối ba tứ cực
Bộ phận phân tích khối gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau. Bộ Q1 vàQ3 làm
nhiệm vụ phân tích.
- Tứ cực thứ nhất (Q1) cónhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z
nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2.
- Tứ cực thứ hai (Q2) các ion phân tử mẹ bị phân li do va chạm với khí trơ
cómặt như khí N2, Ar, He, bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion
con. Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mànó chấp nhận tất cả các ion
do Q1 chuyển đến. Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3.
12


- Bộ tứ cực thứ ba (Q3) làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để
thu được ion con thí
ch hợp đi tới bộ phận phát hiện.
1.2.3.4. Bộ phận phát hiện (detector)
Có 2 dạng truyền thống lànhân electron vànhân quang. Máy LC-MS/MS
tại phòng thínghiệm cóbộ phận phát hiện thuộc dạng nhân electron. Cơ chế như
sau: Ion con tác động lên bề mặt của các bán dẫn sẽ tạo ra electron, nó được tăng
tốc, va chạm tiếp với bề mặt của các bán dẫn khác để tạo ra các electron khác.
Quátrình cứ thế tiếp diễn để tạo ra nhiều electron. Các e được thu nhận vàsố
lượng của chúng tỷ lệ với cường độ tí

n hiệu- số lượng ion đến detector [2].

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng của nghiên cứu này làacrylamid.
- Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giátrị sử dụng của phương pháp
vàứng dụng phương pháp là các mẫu bim bim khoai tây vàkhoai tây chiên
được lấy trên địa bàn HàNội.
2.2.

Nguyên vật liệu, thiết bị

2.2.1. Nguyên vật liệu
2.2.1.1. Chất chuẩn acrylamid
- Chuẩn acrylamid của hãng Dr. Ehrenstorfer GmbH, độ tinh khiết (P%): 99%.
Chuẩn được bảo quản ở nhiệt độ 4 ±4 oC.
- Pha dung dịch chuẩn
 Chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 0,1g chuẩn acrylamid vào cốc có mỏ,
hòa tan bằng nước cất hai lần, chuyển vào bình định mức 10 mL và định
mức đến vạch bằng nước cất hai lần. Dung dịch được bảo quản trong
vòng 1 tháng ở điều kiện 2-8oC.
Thực tế: mchuẩn = 0,1018g, P%= 99%. Do đó, chuẩn gốc có nồng độ 1%
(g/100mL).
 Chuẩn trung gian:

Dùng pipet lấy 100 µL dung dịch chuẩn gốc 1% vào bình định mức 10
mL, định mức bằng nước cất tới vạch. Ta thu được dung dịch chuẩn cónồng
độ 100 µg/mL.
 Chuẩn làm việc
Nồng độ (µg/mL)

Thể tích acrylamid 100 µg/mL

Thể tích nước

10

100 µL

900 µL

1

10 µL

990 µL

2.2.1.2. Chất chuẩn nội
- Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích với chất
chuẩn nội là d3-acrylamid của hãng Dr. Ehrenstorfer GmbH. Đây là một
14


đồng vị của acrylamid, cấu trúc giống acrylamid, chỉ hơn acrylamid 3 Dalton
do gắn thêm 3 nguyên tử Deuteri. D3-acrylamid đáp ứng yêu cầu cần cócủa

một chất chuẩn nội.
- Pha dung dịch chuẩn nội: Tiến hành tương tự như pha dung dịch chuẩn ta thu
được dung dịch chuẩn nội gốc cónồng độ 1% (g/100mL). Dùng pipet lấy 50
µL dung dịch chuẩn nội gốc vào bình định mức 10 mL, định mức bằng nước
cất tới vạch. Ta thu được dung dịch chuẩn nội cónồng độ 50 µg/mL.
2.2.1.3. Hóa chất vàdung môi
Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích của Merck
(Đức):
- Acetonitril loại dùng cho sắc ký.
- Amoniacetat, K4[Fe(CN)6] x 3H2O, ZnSO4 x 7H2O.
- Dung dịch amoniacetat 10 mM trong nước: cân 0,77 g amoniacetat pha
với nước đến 1L.
- Dung dịch carrez I: cân 15 g K4[Fe(CN)6] x 3H2O vào bì
nh định mức 100
mL, định mức bằng nước cất tới vạch.
- Dung dịch carrez II: cân 30 g ZnSO4 x 7H2O vào bình định mức 100 mL,
định mức bằng nước cất tới vạch.
- Pha động: (A) dung dịch amoniacetat 10 mM và(B) acetonitril.
2.2.2. Thiết bị
2.2.2.1. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần gồm sắc ký lỏng 20AD-UFLC của
Shimazu vàkhối phổ TripleQuad 5500 của Sciex.
- Cân phân tích (có độ chí
nh xác 0,1 mg), Metter Toledo.
- Máy lắc xoáy, IKA; máy ly tâm Mikro 200R, Hettich.
2.2.2.2. Dụng cụ
Micropipet có thể tích điều chỉnh được 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
và1000-5000 µL; bình định mức: 10 mL…; ống ly tâm nhựa 50mL; lọ đựng
mẫu 1,8 mL.
15

2.3.

Nội dung nghiên cứu

2.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích xác định acrylamid
2.3.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định acrylamide bằng LC-MS/MS
- Khảo sát điều kiện sắc kýlỏng: tìm các điều kiện sắc kýbao gồm pha động,
pha tĩnh.
- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion
mẹ, lựa chọn các ion con phùhợp.
2.3.1.2. Khảo sát các điều kiện xử lýmẫu
- Trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trước đây [13, 14, 16, 26, 7], chúng tôi
thực hiện phương pháp xử lý mẫu bằng cách chiết bằng nước và làm sạch
bằng SPE. Từ đó, chúng tôi khảo sát các điều kiện sau:
 Việc sử dụng Carrez để loại protein.
 Điều kiện chiết pha rắn: loại cột chiết pha rắn, thể tích rửa giải.
- Mẫu kiểm soát làmẫu được thêm chuẩn để kiểm soát hiệu quả chiết. Chuẩn
được thêm vào mẫu ngay sau khi cân. Chất chuẩn nội sẽ được thêm vào tất cả
các mẫu ngay sau khi cân bao gồm cả mẫu thêm chuẩn vàmẫu thử.
2.3.2. Thẩm định phương pháp
- Độ phùhợp hệ thống
- Độ đặc hiệu
- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
- Khoảng làm việc và đường chuẩn
- Độ lặp lại và độ thu hồi
2.4.

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp lấy mẫu
- Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại các cửa hàng tạp hóa tại địa bàn HàNội, gồm 5
mẫu bim bim (tối thiểu 5 đơn vị/mẫu), 04 mẫu khoai tây chiên (tối thiểu 500
g/mẫu).

16


- Sau khi lấy mẫu, mẫu được mãhóa vàbảo quản ở điều kiện thích hợp. Mẫu
bim bim khoai tây được bảo quản ở nhiệt độ phòng, mẫu khoai tây chiên
được bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh.
2.4.2. Phương pháp xử lýmẫu sơ bộ
Mẫu được xay nghiền toàn bộ bằng máy nghiền mẫu để đảm bảo độ đồng
nhất.
Phương pháp chiết bằng nước vàlàm sạch bằng SPE đã được lựa chọn để
chiết acrylamid do sự đơn giản vàhiệu quả làm sạch tốt.
2.4.3. Phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tí
ch LCMS/MS vàkhảo sát, lựa chọn điều kiện gồm:
- Điều kiện sắc ký LC: lựa chọn điều kiện phân tích acrylamid qua cột sắc ký
lỏng.
- Điều kiện khối phổ MS: lựa chọn 1 ion mẹ và2 ion con, một ion con dùng để
định lượng vàmột ion con dùng để xác nhận.
2.4.4. Phương pháp thẩm định
Thẩm định phương pháp được tiến hành theo AOAC và tiêu chuẩn
EC/657/2002 của châu Âu
2.4.4.1. Độ phùhợp hệ thống
Độ phù hợp hệ thống được đánh giá thông qua sự lặp lại của diện tí
ch pic

vàthời gian lưu của chất phân tích trong mẫu chuẩn (n=6), giátrị RSD (%) của
thời gian lưu vàdiện tích pic phải ≤ 2%.
2.4.4.2. Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu làkhả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp
chất khác [1].
Tính đặc hiệu của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh tín hiệu
của các chất phân tí
ch trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm
chuẩn. Mẫu trắng không được lên tí
n hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải
cótín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên mẫu
chuẩn. Ngoài ra, tính chọn lọc được khẳng định bằng số điểm nhận dạng (IP) và
17