Đa hình đơn genRTEL1 trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
U nguyên bào thần kinh đệm - Glioblastoma (GB) là loại u não
nguyên phát của hệ thần kinh trung ương, chiếm khoảng 15-20% các u nội
sọ [1]. Tổ chức Y tế Thế giới phân loại U nguyên bào thần kinh đệm là loại
ác tính nhất (độ IV) [2]. Tỉ lệ U nguyên bào thần kinh đệm ở nam cao hơn
nữ giới, tuổi phát hiện trung bình khoảng 64 tuổi [3].
U nguyên bào thần kinh đệm là loại u rất ác tính, thường hình thành
trong chất trắng não, phát triển nhanh chóng, và có thể thành khối u lớn trước
khi xuất hiện triệu chứng. Biểu hiện lâm sàng đầu tiên thường bằng hội chứng
tăng áp lực nội sọ nặng, can thiệp điều trị thường không đem lại hiệu quả, thời
gian sống thêm của bệnh nhân sau mổ trung bình chỉ 10 -12 tháng [4].
Do vậy, việc tìm ra căn nguyên, cơ chế bệnh sinh và quá trình sinh
bệnh học của u nguyên bào thần kinh đệm để có thể can thiệp chính xác và
hiệu quả, đồng thời đưa ra tiên lượng bệnh là điều rất cần thiết. Các nhà khoa
học trên thế giới đã tìm thấy sự biến đổi một số gen như RTEL1, TP53, RB1,
NF1, PIK3R1, ERBB2, EGFR, IDHl [5-8]… trong đó gen RTEL1 được phân
loại như một gen ức chế khối u, khi gen bị đột biến, tế bào bị tổn thương,
DNA sẽ không được sửa chữa và kiểm soát dẫn đến hình thành và phát triển
thành khối u [9-12].
Gen RTEL1 nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể 20, dài 40,889kb, gồm
40exon. Các đột biến hay gặp của gen trên u nguyên bào thần kinh đệm là
các đột biến điểm. Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy một số đa hình
gen như SNPrs6010620, SNPrs2297440 trên intron 12 của gen RTEL1 có
liên quan mật thiết tới nguy cơ mắc bệnh u nguyên bào thần kinh đệm [9-14].
Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về xác định một số đa hình trên gen


2

RTEL1 ở bệnh u nguyên bào thần kinh đệm. Chính vì vậy đề tài: “Đa hình
đơn gen RTEL1 trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm” được tiến
hành với 2 mục tiêu sau:
1. Xác định đa hình đơn SNPrs6010620, SNPrs2297440 gen RTEL1
trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
2. Phân tích mối liên quan của đa hình thái đơn gen RTEL1
(SNPrs6010620, SNPrs2297440) với bệnh u nguyên bào thần
kinh đệm.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.

Tổng quan u não

2.

Định nghĩa u não
U não là một khối của các tế bào bất thường hình thành trong não.

Có 2 loại u não chính là: khối u ác tính (hay ung thư) và khối u lành tính
[15]. Các khối u ác tính có thể được chia thành khối u nguyên phát và khối
u di căn của não [16].
Phân loại u não: Theo phân loại của WHO 2007, u của hệ thần kinh
trung ương có 7 loại sau đây: U biểu mô thần kinh (neuroepithelial tissue), U
của dây thần kinh sọ và thần kinh ngoại biên (crainial and paraspinal nerves),
U màng não (meninges), Ung thư hạch và tế bào tạo máu (lymphoma and

hematopoietic), U tế bào mầm (germ cell tumous), U vùng hố yên (tumor of
the sellar region), U di căn (metastatic tumouSNPrs).
3.

Tình hình mắc bệnh trong nước và trên thế giới
Ngày nay, ung thư đã trở thành một vấn đề sức khoẻ mang tính chất toàn

cầu. Theo thống kê của tổ chức ung thư thế giới (IARC) hàng năm trên thế giới
có khoảng 12,7 triệu ca mắc mới với 7,6 triệu ca tử vong, trung bình mỗi ngày
trên thế giới có khoảng 21.000 trường hợp tử vong do ung thư [15],[16]. Ước
tính đến năm 2050 thế giới sẽ có thêm khoảng 27 triệu ca ung thư mới mỗi
năm với khoảng 17,5 triệu bệnh nhân tử vong. Có một thực tế rằng tỷ lệ mắc
ung thư đang chậm lại ở các nước phát triển, nhưng lại tăng cao tại các nước
đang phát triển trong đó có Việt Nam. Rõ ràng chúng ta cần phải có những
biện pháp kịp thời để ngăn ngừa sự hình thành và tiến triển cũng như nâng cao
hiệu quả trong việc điều trị ung thư [17].


4

Từ những nghiên cứu đột phá trong Y học, cơ chế phân tử của ung thư
dần được sáng tỏ. Theo đó, chính sự tích lũy đột biến gen theo thời gian dẫn
tới sự phát sinh, phát triển mọi dạng tế bào ung thư trong cơ thể. Quá trình
chuyển dạng tế bào sang ác tính thường được đánh dấu bằng sự kích hoạt các
gen gây ung thư và đột biến gây bất hoạt các gen áp chế ung thư nằm tại một
số vị trí chủ chốt trên các con đường tín hiệu tế bào [18],[19]. Cơ chế điều
hòa gen vốn hoạt động nhịp nhàng và chặt chẽ cũng bị rối loạn khiến hệ thống
các enzym sửa chữa thương tổn gen của tế bào không thể khắc phục dẫn tới
việc tích lũy một số lượng lớn các đột biến, khởi phát quá trình ung thư [20],
[21]. Nhưng cũng chính các đột biến lại làm tăng ái lực của thuốc điều trị đích

với các phân tử này và ức chế sự dẫn truyền tín hiệu trong các tế bào ung thư.
Nhờ đó chúng làm tăng hiệu quả của thuốc điều trị đích trong việc tiêu diệt
các tế bào ung thư [22]. Chính vì vậy việc nâng cao hiệu quả điều trị, theo dõi
tiên lượng bệnh trong ung thư hiện nay luôn cần có các xét nghiệm phân tích
đột biến gen tương ứng với mỗi loại hình ung thư.
U nguyên bào thần kinh đệm (GB) là một trong các khối u não phổ biến
nhất hiện nay [23],[24]. Bệnh nhân mắc loại ung thư này thường có tiên lượng
không tốt do sự tiến triển nhanh chóng và xâm lấn các tổ chức mô não, thần
kinh của khối u trong hộp sọ [25]. Tuy nhiên với những hiểu biết về cơ chế
phân tử và sự kết hợp nhiều phương pháp điều trị, trong đó có liệu pháp điều
trị đích dựa trên phân tích tình trạng đột biến gen, đã làm gia tăng đáng kể
thời gian sống của bệnh nhân trong những năm qua [26]. Bên cạnh đó, xác
định đột biến gen của các đối tượng cùng huyết thống đã chỉ ra những yếu tố
nguy cơ góp phần vào việc làm giảm tỷ lệ mắc và ngăn ngừa sự phát sinh,
phát triển ung thư [27].


5

4.

Tổng quan về U nguyên bào thần kinh đệm
U nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) là một trong các khối u não

phổ biến nhất, chiếm khoảng 12 là 15% của tất cả các khối u não. U nguyên
bào thần kinh đệm thường hình thành trong chất trắng não, phát triển nhanh
chóng, và có thể thành khối u lớn trước khi xuất hiện những triệu chứng đầu
tiên nên biểu hiện lâm sàng bằng hội chứng tăng áp lực nội sọ nặng nề [15],
[17]. Về mô học, u được đặc trưng bởi vùng mô hoại tử, bao quanh là các tế
bào biệt hóa kèm theo là hiện tượng tăng sinh mạch. Tổ chức Y tế Thế giới

phân loại U nguyên bào thần kinh đệm như một u tế bào hình sao
(Astrocytoma) cấp III và IV với độ ác tính cao [33],[34]. Hầu hết các bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh đệm khi được chẩn đoán là khối u nguyên phát và
một số bệnh nhân là u thứ phát và phát triển từ khối u thần kinh đệm có mức độ
ác tính thấp hơn. Tỷ lệ mắc U nguyên bào thần kinh đệm trên thế giới được
thống kê là khoảng 3-5 ca trên 100.000 dân. Nghiên cứu của Richard Johnson
và cộng sự cho thấy năm 2010 có khoảng 10.800 bệnh nhân tại Hoa Kỳ được
chẩn đoán u nguyên bào thần kinh đệm, trong đó có gần 10 nghìn ca tử vong.
Tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm ở nam giới xấp xỉ 1.6 lần so nữ giới. Tỷ
lệ U nguyên bào thần kinh đệm phát hiện ra nhiều nhất vào độ tuổi từ 45 đến
62 và dưới 10% các trường hợp ung thư dạng này xảy ra ở trẻ em [25],[26].
1.3. Đặc điểm mô bệnh học của u nguyên bào thần kinh đệm
Các tế bào của u nguyên bào thần kinh đệm có nguồn gốc phôi thai
giảm biệt hoá tăng sản được chia thành 2 loại dựa vào nguồn gốc phát sinh là
u phôi thai tiên phát (60%) và u thứ phát từ tế bào hình sao [34].
Hình ảnh đại thể của u nguyên bào thần kinh đệm khá điển hình với
ranh giới hình vòng cung không rõ rệt, cắt ngang u có thể gặp màu xám hay
hồng, có điểm hoại tử màu vàng hoặc ở vùng có xuất huyết thì màu đỏ hoặc
nâu thâm. Thành mạch máu trong u tăng sinh dày, có thể gặp u thể nang hay


6

nhiều ô, u thường có mật độ mềm và chỉ cứng khi xâm lấn dánh vào màng
não gây chảy máu [35],[36].
Hình ảnh vi thể của các khối u nguyên bào thần kinh đệm rất khác nhau.
Khối u luôn dày đặc tế bào, nhưng có thể đồng dạng hoặc đa hình với nhiều
giai đoạn trung gian giữa hai loại tế bào. Tính biệt hoá thấp, tạo sự giảm thiểu
các nhánh bào tương và nhân bắt màu đậm, đa hình thái [35],[36]. Có 3 thể u
chủ yếu sau:

- U nguyên bào thần kinh đệm đa hình: gồm chủ yếu những nguyên bào
thần kinh đa hình xem kẽ một số neuron của vỏ não. Các tế bào này ít biệt hoá,
nhân bắt màu đậm, thô, nhiều nhân chia co cụm cung quanh một số điểm hoại tử
nhỏ. Mao mạch u thành dày, tăng sản mạnh tế bào nội mô, nhiều điểm xuất
huyết rải rác có chỗ lòng mạch bị chít hẹp và tổ chức hoá hay vôi hoá [36].

Hình 1.1. Tiêu bản nhuộm HE mô u nguyên bào thần kinh đệm
U nguyên bào thần kinh đệm
Độ phóng đại x400 lần; trên tiêu bản cho thấy mật độ u dày đặc, đa hình
dạng, có dị nhân, nhân quái, nhân chia. Tế bào biệt hoá theo hướng khác
nhau, hoại tử hình bản đồ, tăng sinh mội mạch dạng cuộn. Kết quả được thực
hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức.


7

- U nguyên bào thần kinh đệm thể hỗn hợp với saccoma xơ: mô não lành
liền kề xen kẽ với tổn thương sát bề mặt u gồm dày đặc tế bào đa hình thái.
Chủ yếu là dạng tế bào thoi, ít nhánh thần kinh đệm. Vùng não lành xung
quanh có một số tế bào u lan tràn nhưng không có phản ứng mạch máu [34-36].
- U nguyên bào thần kinh đệm thể tế bào khổng lồ: u dày gồm dày đặc
các tế bào đa hình thái, kích thước khác nhau, phần lớn là các tế bào hình tròn
hay ô van với nhân bắt màu kiềm đậm, thô, hay gặp hình ảnh nhân chia.
Ngoài ra có một số tế bào khổng lồ, nhân bắt màu thô đậm dạng hình tháp hay
đa diện với hạt nhân rõ, nhiều hình ảnh phân bào. Cả hai loại tế bào này đều ít
tơ thần kinh. Trong tổ chức u có nhiều điểm hoại tử thâm nhập bởi các vi bào
đệm thần kinh và một số vùng xuất huyết rải rác [34-36].
Mạch máu trong u nguyên bào thần kinh đệm: thay đổi liên quan đến sự
phát triển của khối u và các vùng lân cận. Biến đổi hình thái quan trọng nhất
là tăng sản nội mô mạch máu nhỏ nuôi u, đặc biệt có thể gặp các búi tế bào

nội mô xếp lại thành từng cụm [37]. Nhân tế bào nội mô trải rộng hay gặp
hình nhân chia. Đôi khi có một số biến đổi như các điểm mao mạch thành dày
lòng mao mạch giãn rộng tạo ra hình ảnh sao mạch [38].
Theo phân loại trên u biểu mô thần kinh có 9 loại, trong đó có u tế bào
sao. U tế bào sao gồm có u tế bào sao thể lông, u biểu mô tế bào sao khổng lồ
màng nội tủy (độ I), u biểu mô tế bào sao hỗn hợp màu vàng, u tế bào sao lan
tỏa là độ II, có độ ác tính thấp. U tế bào sao thoái triển (độ III), u nguyên bào
thần kinh đệm (độ IV) có độ ác tính cao [2].


8

1.4. Chẩn đoán u nguyên bào thần kinh đệm
1.4.1. Triệu chứng lâm sàng và những dấu hiệu thường gặp
Trong giai đoạn sớm, bệnh nhân không có các triệu chứng điển hình và
thường dễ dàng bị bỏ qua [32].
Trong giai đoạn bệnh tiến triển, bệnh nhân xuất hiện các triệu chứng
của tăng áp lực nội sọ do sự phát triển của khối u. Các triệu chứng bao gồm
những cơn đau đầu dữ dội vào các buổi sáng và giảm hơn trong ngày. Các
hoạt động làm gia tăng áp lực nội sọ như ho, hắt hơi, cúi xuống hoặc làm
các công việc nặng đều làm gia tăng mức độ của các cơn đau. Tăng áp lực
nội sọ khiến bệnh nhân có thể bị rối loạn tầm nhìn và rối loạn khả năng
thăng bằng [33],[34].
Ngoài ra, bệnh nhân còn có thể xuất hiện một số triệu chứng liên quan
đến vị trí của khối u như: thay đổi về tính cách và trí tuệ, khó khăn trong việc
diễn đạt ngôn ngữ, khó khăn trong việc thực hiện các di chuyển phối hợp, liệt
hoặc suy yếu nửa người…[31],[32].
Soi đáy mắt bệnh nhân có thể có phù gai thị, một dấu hiệu của tăng áp
lực nội sọ.
1.4.2. Các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh

Chụp cắt lớp vi tính não (CT-Scanner): có thể chụp thông thường hoặc
sử dụng thuốc cản quang để tăng cường hình ảnh tại một số vùng nhất định
của não. Phương pháp này cho phép xác định chính xác vị trí và kích thước
của khối u [38], [44], [45].
Chụp cộng hưởng từ (MRI): được áp dụng khi cần xác định chi tiết vị
trí khối u. MRI cho biết tỷ trọng, mật độ, cấu trúc và có thể phát hiện được
những thay đổi rất nhỏ bên trong và các vùng lân cận của khối u [38], [44], [45].


9

Chụp positron cắt lớp (chụp PET-CT): phương pháp này cung cấp hình
ảnh động của não bằng việc tiêm đường glucose có gắn với một lượng nhỏ
chất phóng xạ. Lượng thuốc phóng xạ sử dụng sẽ không nhiều hơn liều lượng
của một tia xạ thông thường. Khối u thường hấp thụ glucose và chất phóng xạ
hiển thị trên hình chụp. Bản chụp PET có thể cung cấp các thông tin liệu khối
u có đang tiếp tục phát triển hay không, là u lành tính hay ác tính. Ngoài ra
PET-CT còn đặc biệt có giá trị trong trường hợp chẩn đoá sự di căn của ung
thư và đánh giá mức độ ác tính của khối u [38], [44], [45].
Chụp động mạch não đồ: động mạch đồ hiển thị cấu trúc của mạch
máu và có thể hiển thị vị trí của khối u bên trong não. Đây là biện pháp hữu
ích cho các bác sỹ lên kế hoạch phẫu thuật loại bỏ khối u cho bệnh nhân
[38], [44], [45].
Tiêu bản mô bệnh học: bệnh nhân sau khi được phẫu thuật loại bỏ khối
u thì mẫu mô ung thư sẽ được làm tiêu bản giải phẫu bệnh để chẩn đoán chính
xác thể bệnh cũng như mức độ biệt hoá của ung thư dựa trên hình ảnh tế bào
và cấu trúc mô bệnh học [41],[43].
1.4.3. Điều trị
Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh
Điều trị chủ yếu phẫu thuật cắt khối u, tia xạ, hoá chất và điều trị

triệu chứng [31]. Tuy nhiên các can thiệp này đem lại kết quả rất hạn
chế.
Phẫu thuật
Mục tiêu của việc phẫu thuật là loại bỏ u và không gây tổn thương đến tổ
chức não lành. Tuy nhiên mục tiêu đó đạt được hay không còn phụ thuộc vào
vị trí u nông hay sâu, u có giới hạn rõ hay không. Liên quan với u, khối lượng
u và trình độ chuyên khoa của phẫu thuật viên. Nhờ chụp cắt lớp vi tính và


10

kính hiển vi phẫu thuật người ta có thể lấy bỏ u một cách triệt để hơn. Tuy
nhiên không phải loại u nào cũng có thể lấy bỏ triệt để được, u màng não có
giới hạn rõ nhưng đôi khi cũng chỉ lấy được một phần.
U não ở sâu, ở hành não, thân não, ở các mạch máu lớn, ở nền sọ thì việc
lấy bỏ u sẽ rất khó khăn vì gần trung khu hô hấp, tim mạch và khó cầm máu.
Điều trị tia xạ
Tia phóng xạ trước hết được dùng để diệt những tế bào ác tính còn lại
sau khi cắt bỏ hoặc những u ác tính ở sâu mà người ta chỉ phẫu thuật tối thiểu
Stereotaxy với kết quả giải phẫu bệnh kèm theo. Người ta còn dùng để ngăn
không cho các u lành tính hoặc tương đối lành tính tái phát như Adenoma
tuyến yên hoặc Craniopharynoma. Nói chung trong những năm qua điều trị
các u não bằng tia phóng xạ đã có những bước tiến đáng kể do sự tiến bộ của
trang thiết bị máy móc. Hiện nay, người ta dùng dao gamma điều trị u não,
phẫu thuật an toàn, hiệu quả cao.
Điều trị hoá chất
Hiện nay kết quả điều trị u ác tính bằng hoá chất rất đáng khích lệ,
nhưng đối với u của mô não chưa thay đổi rõ rệt về tiên lượng. Người ta
khuyên chỉ nên dùng các hoá chất trong những trường hợp u ác tính phát triển
nhanh, cụ thể đối với các loại U nguyên bào thần kinh đệm, Astrocytoma độ

III và độ IV. Nhiều tác giả đã cho rằng hoá chất đã làm cho kết quả điều trị
tốt hơn.
Các hoá chất được dùng trong điều trị u não có thể kể một vài loại sau:
Cyclophosphamide (Endoxan), 5 Fluoro-Uracyle (5FU), Methotrexate (Aethopterin),
Vincristine (Oncovin), Mythramycine (Mithrancin), Doxorabicine (Adriamycine).


11

Hoá chất dùng sau tia phóng xạ, cả hai phương pháp này dùng điều
trị bổ sung sau phẫu thuật.
Điều trị corticoid và điều trị bằng miễn dịch cũng được đề cập đến
trong u não. Mục đích của điều trị corticoid là ngăn ngừa tình trạng phù não
quanh u và điều trị miễn dịch là một hướng điều trị còn ở thời kỳ nghiên cứu.
Tóm lại, một u não lành tính thì việc điều trị có hiệu quả nhất là cắt bỏ
triệt để nhưng còn phụ thuộc vào vị trí giải phẫu, mối liên quan về chức năng
và khối lượng của khối u. Các u não ác tính khi phẫu thuật cố gắng lấy bỏ tối
đa khối lượng của chúng kèm theo điều trị phối hợp phóng xạ và hoá chất để
đạt hiệu quả cao hơn.
Dự phòng
Hiện nay, chưa có biện pháp dự phòng hiệu quả để phát hiện sớm u
nguyên bào thần kinh đệm cũng như u não nói chung. Chủ yếu phát hiện sớm
các triệu chứng gợi ý của các bệnh lý ở vùng sọ não: Nhức đầu kéo dài, cảm
giác ngủ gà ngủ gật, các rối loạn về tâm thần... mà nhiều trường hợp u não ở
thể câm không triệu chứng.
1.4.4. Tiên lượng u nguyên bào thần kinh đệm
Đây là một trong những loại ung thư có độ ác tính cao nhất ở người do
mức độ xâm lấn, huỷ hoại tế bào và các tổ chức thần kinh. Bệnh nhân mắc
loại ung thư này thường có tiên lượng không tốt dù được điều trị một cách
triệt để. Thời gian sống trung bình của các bệnh nhân kể từ khi phát hiện bệnh

vào khoảng 15 tháng và chỉ có một tỷ lệ nhỏ dưới 5% tổng số các bệnh nhân
có thời gian sống sau 5 năm [26],[31].
1.5. Cơ chế bệnh sinh bệnh u nguyên bào thần kinh đệm
1.5.1. Các yếu tố nguy cơ


12

Yếu tố di truyền: các yếu tố di truyền có tác động vào sự xuất hiện một
số loại u não như u nguyên bào võng mạc cũng như u thần kinh da. Trong
nhóm u xơ thần kinh typ 1, các u tế bào hình sao hay gặp nhiều gấp 4 lần.
Nhóm 2 (được đặc trưng bởi u dây VIII hai bên) là tập hợp rất nhiều u khác
nhau (u thần kinh đệm ngoại biên, u xơ thần kinh, u màng não, u thần kinh
đệm). Các u nguyên bào mạch trong não và trong ống sống thường xuất hiện
với bệnh Von Hippel Lindau.
Suy giảm miễn dịch làm tăng nguy cơ mắc các u lymphô ở não.
Khoảng 20% bệnh nhân có biểu hiện suy giảm miễn dịch kéo dài và từ 5%
đến 8% bệnh nhân AIDS bị u lymphô ác tính, thường là lympho B.
1.5.2. Cơ chế bệnh sinh
Cơ chế phân tử và vai trò của đột biến gen trong u nguyên bào thần
kinh đệm:
Nghiên cứu đầu tiên về tổn thương gen trong u nguyên bào thần kinh
đệm được công bố khoảng 35 năm trước đây. Trong nhiều năm sau đó, những
gen đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh ung thư như thụ thể yếu tố phát
triển nguyên bào sợi (fibroblast growth factor receptor, FGFR), thụ thể yếu tố
phát triển biểu mô (epidermal growth factor receptor, EGFR), gen áp chế ung
thư TP53 đã được nghiên cứu [41,42]. Bên cạnh đó một số gen đánh giá mức
độ ác tính và biệt hoá, hay kiểm soát sự phân chia của tế bào ung thư như
RTEL1 và Hes3 cũng được xem xét và đánh giá trong u nguyên bào thần kinh
đệm. Dựa trên tình trạng đột biến gen, các nhà khoa học, các bác sỹ lâm sàng

có một cái nhìn tổng thể về nguy cơ, mức độ tiến triển để có biện pháp can
thiệp điều trị kịp thời, nâng cao hiệu quả điều trị cũng như theo dõi tiên lượng
đối với bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm [46].
Cơ chế của gen RTEL1:


13

RTEL-1 (regulator of telomere length-1) là DNA helicase quan trọng
giúp ổn định cấu trúc bậc hai của DNA và duy trì sự nguyên vẹn của
telomere. RTEL-1 điều khiển quá trình tái tổ hợp nhiễm sắc thể trong nguyên
phân và giảm phân. Trong những năm qua, các nhà khoa học đã đưa ra bằng
chứng chứng minh các đột biến điểm trên gen RTEL-1 làm tăng nguy cơ mắc
các bệnh u não, u thần kinh đệm, hội chứng Hoyeraal-HreidaSNPrsson, v.v.
Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các đột biến điểm đơn nucleotide (SNP) của
gen RTEL-1 có liên quan mật thiết tới các bệnh này [44], [45].
Vì các đột biến điểm của gen RTEL-1 nằm ở vùng không mã hóa, nên
những ảnh hưởng của chúng ở cấp độ phân tử lên sự phát sinh và tiến triển
ung thư chưa được làm sáng tỏ. Các nhà khoa học đưa ra giả thuyết rằng, đột
biến điểm ở intron nằm gần các đoạn exon có thể làm mất đoạn exon bằng
cách biến đổi quá trình cắt nối mRNA, qua đó tạo thành và làm tăng các quá
trình phiên mã vô nghĩa. Với những bằng chứng về việc đột biến gen RTEL-1
làm gia tăng nguy cơ ung thư não, RTEL-1 được xem như là gen ức chế ung
thư [44]. Tuy nhiên, hiện nay rất ít nghiên cứu tiến hành để xác định xem
RTEL-1 được điều khiển như thế nào hay helicase RTEL-1 đã lôi kéo các
telomere tham gia thực hiện các chức năng của chúng ra sao trong quá trình
phát sinh và tiến triển ung thư.
1.6.Tính đa hình của gen RTEL1
1.6.1. Tính đa hình gen SNP
Tính đa hình gen SNP (Single Nucleotide Polymorphism) hay đa hình

thái đơn nucleotid là sự khác nhau về trình tự DNA xảy ra khi một nucleotid
đơn A, T, C hay G ở trong bộ gen (hay trong các trình tự được phân lập khác)
bị thay đổi, khác nhau giữa các cá thể của một loài hay giữa các cặp nhiễm
sắc thể (NST) của một người (Hình 1.3). Bộ gen người với 23 cặp NST (22
cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính) chứa khoảng 3,2 tỉ bp. Giống nhau


14

giữa các cá thể đến trên 99% và khoảng 1% sự khác biệt còn lại chủ yếu biểu
hiện bởi các SNP.
Đa hình gen SNP là một hiện tượng phổ biến, được coi là hậu quả của
những đột biến điểm thay thế một cặp nucleotid. Theo ngân hàng dữ liệu của
NCBI tính đến ngày 16/10/2014 bộ gen người có 112,736,879SNP. Tính trung
bình, cứ khoảng 3000 bp thì lại xuất hiện một SNP. Những biến thể này được
xem như là các đánh dấu sinh học, giúp xác định vị trí các gen liên quan đến
bệnh. Khi các SNP xảy ra trong gen hoặc trong một khu vực gần một gen quy
định, nó có thể có vai trò trực tiếp đến sự xuất hiện bệnh bằng cách ảnh hưởng
đến chức năng của gen.

Hình 1.2. Hình ảnh minh họa hiện tượng đa hình thái đơn nucleotid SNP
(Nguồn: )
Sự khác biệt trong trình tự DNA ở người có liên quan đến những khác
biệt trong sự phát triển bệnh, đáp ứng với các tác nhân gây bệnh, hóa chất,
thuốc, vaccine và các tác nhân khác. Trong nghiên cứu y sinh học, các nhà
nghiên cứu tiến hành so sánh trình tự gen của các nhóm người khác nhau
(giữa nhóm người bị bệnh và không bị bệnh...) để từ đó xác định mối liên


15

quan giữa các SNP với khả năng mắc bệnh, tìm ra các yếu tố nguy cơ cũng
như phương pháp chữa trị.
1.6.2. Gen RTEL1
Gen RTEL1 được phân loại như một gen ức chế ung thư, nằm trên cánh
dài nhiễm sắc thể 20, ở vị trí 13.3 từ cặp base 63.657.809 đến cặp base
63.696.252 dài 40,889kb, gồm 40 exon.
Một số nghiên cứu cho thấy kiểu gen GG của SNPrs6010620 thường
hay gặp ở bệnh nhân bị u nguyên bào thần kinh đệm, trong khi đó kiểu gen
AG và AA thường hay gặp ở nhóm người bình thường, vì vậy người có kiểu
gen GG tại vị trí SNPrs6010620 được xem như là người có nguy cơ cao bị
bệnh [12],[13],[15].
Tương tự như vậy, kiểu gen CC của SNPrs2297440 thường hay gặp ở
bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, trong khi đó kiểu gen TT và kiểu
gen TC thường hay gặp ở nhóm người bình thường, vì vậy người có kiểu
gen CC tại vị trí SNPrs2297440 được xem như là người có nguy cơ cao bị
bệnh [12],[13],[42].
Một nghiên cứu lâm sàng được tiến hành trên 275000 đột biến soma
ở 692 bệnh nhân trưởng thành mắc bệnh u não và 3992 người tình nguyện
khỏe mạnh (đối chứng) đã xác định được hai đột biến điểm SNP ở intron
12 là SNPrs6010620 và ở intron 17 là SNPrs4809324 của gen RTEL-1 có
liên hệ mật thiết với bệnh u tế bào thần kinh đệm và u tế bào thần kinh
dạng sao. Một nghiên cứu khác trên 500.000 đột biến điểm ở 1878 bệnh
nhân u não và 3670 người tình nguyện khỏe mạnh cũng có kết quả tương tự
[28], [26]. Năm 2013, một nhóm nhà khoa học người Trung Quốc đã tiến
hành phân tích đa hình di truyền của gen RTEL-1 trên 629 bệnh nhân u tế
bào thần kinh đệm và 645 người tình nguyện khỏe mạnh chỉ ra hai đột biến
điểm SNPrs6010620, SNPrs2297440 và hai haplotype GCT và ATT của

16

gen RTEL-1 có liên quan mật thiết với bệnh u tế bào thần kinh đệm [29].
Chính vì vậy, những đột biến điểm này trở thành tiêu chuẩn quan trọng để
tiên lượng sự sống sót của các bệnh nhân u não.
Một nghiên cứu thuộc Trường Đại học Y Xinan, Tứ Xuyên, Trung
Quốc đã nghiên cứu trên 110 bệnh nhân UNBTKĐ và 134 người khỏe mạnh.
Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra mối liên hệ giữa telomera kéo dài
helicase1 (RTEL1) đa hình của gen và sự nhậy cảm đối với u nguyên bào thần
kinh đệm với kết luận kiểu gen GG của SNPrs6010620 tăng nguy cơ u
nguyên bào thần kinh đệm (với OR= 2,706; 95%; CI= 1,0197-7,187; p<0,05).
Kiểu gen CC của SNPrs2297440 có nguy cơ tăng nguyên bào thần kinh đệm
(OR=2,889; 95%; CI=1,032-8,089 p<0,05) [32].
1.7. Các phương pháp xác định kiểu gen RTEL1
1.7.1. Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR)
Nguyên tắc chung: dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase có khả
năng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn
loại nucleotid. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi
ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn. Phản ứng
PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:
1. Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94 oC
- 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
2. Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40 oC - 70oC, tuỳ
thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài khoảng 30 giây - 1 phút.
3. Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được
tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt
(Taqpolymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt

17

nhất. Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự chuỗi DNA cần khuếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản
phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA mạch kép có chiều dài là
khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được
xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [33], [34], [35].

Bước 1: biến tính

Bước 2: bắt cặp

Bước 3: tổng hợp
Gen cần
khuếch đại

Phản ứng
khuếch đại

35 chu kỳ
DNA
mẫu

4
bản
sao

8
bản
sao

16
bản
sao

32
bản
sao

236= 68 tỷ
bản sao


18

Số lượng sản phẩm DNA tạo thành khi hoàn thành phản ứng PCR được
biểu thị bằng công thức sau:
N = 2n
N: số lượng bản copy sản phẩm tạo thành
n là số chu kỳ của phản ứng.
1.7.2. Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các
nucleotid trong phân tử DNA. Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như
trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi.
Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với
nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các
deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp. Sự gắn của

các dideoxynucleotidsẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA được
tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau.
Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA có thể được xác định bằng cách chạy
đồng thời bốn phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loại
dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng
hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất phát
huỳnh quang đặc hiệu khác nhau.


19

Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP
Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn được phân tách
bằng điện di trên thạch acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệt
được các sợi đơn DNA hơn kém nhau 1 nucleotid. Trình tự các nucleotid
được xác định tương ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loại
dideoxynucleotid.
Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn dùng 4 màu huỳnh quang khác
nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, hệ thống điện di thường là điện di mao quản.


20

Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3 ’ của
đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu
sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy
nhận biết được từng loại nucleotid và trình tự của DNA đích.
Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên Gene Bank
(National Center for Biotechnology Information – NCBI).
Hiện nay, người ta sử dụng máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn

được thiết kế trên nguyên tắc của Sanger. Với các máy thế hệ mới sau này,
người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP.
Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và
chỉ cần điện di trên một hàng mà không phải trên 4 hàng khác nhau như
trước đây, hệ thống điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một
vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ
phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và
chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận
diện được là nucleotid nào, từ đó biết được trình tự của DNA đích. Phương
pháp giải trình tự gen cho phép phát hiện tất cả các đột biến, đặc biệt là các
đột biến điểm, do đó kỹ thuật này được áp dụng cho việc phát hiện một số
SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn của gen.

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


21

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nhóm chứng: 80 đối tượng
Tiêu chuẩn lựa chọn: người khoẻ mạnh, không có bất kỳ một khối u
hay ung thư một cơ quan nào, không mắc các bệnh mãn tính, đặc biệt là các
bệnh lý về phổi.
Nhóm bệnh: Nhóm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm
Tiêu chuẩn lựa chọn: 80 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bằng mô
bệnh học tại Bệnh viện Việt Đức là u nguyên bào thần kinh đệm.
Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất kỳ một khối u hay ung thư một cơ quan
nào khác.
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

2.2.1. Trang thiết bị nghiên cứu
 Máy PCR (Eppendorf)
 Máy điện di: Mupid (Nhật Bản).
 Máy soi gel và chụp ảnh tự động (Dolphin Chemi Wealtec, USA).
 Máy quang phổ kế Nano-Drop (Nhật Bản).
 Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm các loại (Đức).
 Tủ lạnh âm sâu: -30oC và - 80oC (Sanyo-Nhật Bản).
 Máy điện di mao quản Beckman Coulter.
 Máy đọc trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (USA).


22

2.2.2. Dụng cụ nghiên cứu
 Dụng cụ được vô trùng tuyệt đối bằng hấp ướt 120oC trong 20 phút.
 Pipet, đầu côn các loại.
 Ống Eppendorf các loại.
2.2.3. Hóa chất nghiên cứu
- Hóa chất tách chiết DNA từ máu ngoại vi và tinh sạch DNA:
 Kít tách chiết DNA (Hàng QIAGEN-Đức).
 Dung dịch lysis buffer.
 Dung dịch K.
 Dung dịch SDS 10%.
 Proteinase K (10mg/l).
 Dung dịch phenol:chloroform: isoamyl có tỷ lệ 25:24:1.
 Dung dịch chloroform: isoamyl có tỷ lệ 24:1.
 Sodium acetate 3M, pH 5,2.
 Ethanol tuyệt đối và Ethanol 70%.
 Dung dịch TE để hòa tan DNA và bảo quản DNA sau khi tách.
 Kít tinh sạch DNA từ gel (Hãng QIAGEN-Đức).

 Quy trình pha một số hóa chất:


23

Dung dịch Lysis buffer
Hóa chất

Nồng độ

Lượng hóa chất

Sucrose

0,3M

51.3gram

Trisbase HCl (pH=7,5)

0,01M

0.785gram

MgCl2

0,005M

0,2375 gram

Trixton X-100

1% (v/v)

% ml (cho sau)

Thêm nước vừa đủ 500ml, chỉnh pH=7,7 bằng HCl
Dung dịch K
Hóa chất

Nồng độ

Lượng hóa chất

NaCl

0,075M

0,8775gram

EDTA

0,024M

1,7868gram

Thêm nước vừa đủ 200ml, chỉnh pH=8 bằng NaOH
- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR:
 Taq DNA polymerase 1000U (Hãng QIAGEN-Đức).
 Taq PCR Microsatellite kit (Hãng QIAGEN-Đức).

24

 dNTP, PCR grade (Hãng QIAGEN-Đức, 250µl).
 Sử dụng các cặp mồi được gắn với chất huỳnh quang đặc hiệu.

- Hóa chất chạy điện di:
 Sample Loading Solution (SLS).
 Size Standard 600.
 Mineral Oil.
 Buffer Plate, Sample Plate 96 wells.
- Hoá chất để giải trình tự gen:
 Big dye.
 Cột lọc.
 SAM solution.
 Terminator Solution.
2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang.
Dựa vào công thức tính cỡ mẫu:

n= Z21-α/2
Trong đó α = 0,05

p = 0,5

ε = 0,22

Thay vào ta được:

n = 1,962 = 79,37


25

Như vậy số đối tượng chọn vào nghiên cứu là 80.