Nghiên cứu xác định người lành mang gen và ứng dụng chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia a

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội,
nạn ô nhiễm môi trường và những nguy cơ phơi nhiễm với các tác nhân gây đột
biến như virus, khói thuốc, phóng xạ,... ngày càng tăng dẫn đến sự gia tăng đột
biến và sự vô hiệu hóa bộ máy sửa chữa thông tin di truyền trong tế bào. Hậu
quả là các tổn thương thông tin di truyền được lưu giữ trong bộ gen người bệnh
và có khả năng truyền lại cho các thế hệ sau. Mặc dù không phổ biến như một số
nhóm các bệnh lý khác nhưng thực tế cho thấy hàng năm có một số lượng lớn trẻ
sinh ra bị dị tật hoặc mắc các bệnh lý di truyền. Đây là nhóm bệnh lý gây nhiều
khó khăn trong điều trị và để lại hậu quả rất nặng nề về sức khỏe, tinh thần cũng
như chất lượng cuộc sống.Vì vậy, vấn đề cấp bách đặt ra là chúng ta phải tìm
hướng giải quyết một cách sớm nhất và triệt để nhóm bệnh lý di truyền, trong đó
ưu tiên các bệnh lý thường gặp tại Việt Nam [1], [2].
Bệnh máu khó đông hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên quan đến
iới tính, gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X không có alen tương ứng trên
nhiễm sắc thể Y, do vậy người mẹ mang gen bệnh có thể truyền bệnh cho 50%
con trai và truyền gen bệnh cho 50% con gái [3], [4], [5], [6]. Bệnh có thể di
truyền qua nhiều thế hệ và có nhiều người mắc bệnh trong cùng một gia đình.
Bệnh ảnh hưởng đến tâm sinh lý, thể chất trẻ nhỏ và là gánh nặng cho gia
đình và xã hôi. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh
hemophilia [7] và khoảng 30.000 người mang gen bệnh hemophilia. Mặc dù
trong thời gian qua, công tác chăm sóc bệnh nhân hemophilia A tại Việt Nam đã
có nhiều tiến bộ, số lượng bệnh nhân được chẩn đoán và quản lí đã tăng lên đáng
kể, tuy nhiên mới chỉ chiếm chưa tới 30% tổng số người bị bệnh và đa số người
mang gen bệnh chưa được chẩn đoán và quản lí [8].
Việc phát hiện người phụ nữ mang gen bệnh bằng các xét nghiệm thông
thường như xác định hoạt tính yếu tố VIII trong máu còn gặp khó khăn vì

2
hoạt tính yếu tố VIII của họ không giảm hoặc giảm ít, có thể dao động từ 50 –
150%, chỉ có khoảng 10% tổng số những phụ nữ này có hoạt tính yếu tố VIII
huyết tương <10% và có biểu hiện chảy máu [3], [4], [9], [10]. Có thể khẳng
định chắc chắn người phụ nữ mang gen bệnh, nếu người đó có bố hoặc có hơn
2 con trai bị hemophilia A. Người phụ nữ có nguy cơ cao mang gen bệnh nếu
người đó có 1 con trai bị bệnh hemophilia A hoặc là con gái của người mẹ
mang gen bệnh; hoặc là chị em con dì với người bị bệnh hemophilia A [3], [4].
Việc phát hiện người lành mang gen bệnh đóng vai trò quan trọng trong
công tác tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh để có thể giúp ngăn ngừa sinh
con bị bệnh và giảm tỷ lệ mắc bệnh [4], [10]. Ở Việt Nam, một số công trình
nghiên cứu về bệnh hemophilia A đã được công bố, chủ yếu là các nghiên cứu
về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng, tần suất mắc bệnh và đánh giá hiệu
quả điều trị bệnh bằng các chế phẩm thay thế 11,12,13, [14]; nghiên cứu
về tính chất gia đình của bệnh hemophilia A, nghiên cứu phát hiện người lành
mang gen bệnh bằng phân tích một số yếu tố đông máu; nghiên cứu phát hiện
người lành mang gen bệnh sử dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms) chỉ phát hiện được 4/9
(44,44%) người mẹ mang gen bệnh [16]...Tuy nhiên các nghiên cứu này dựa
trên cỡ mẫu nhỏ, phương pháp phát hiện gián tiếp, tỷ lệ người lành mang gen
phát hiện được thấp và như vậy vẫn chưa có một nghiên cứu đầy đủ và toàn
diện về tình trạng mang gen bệnh của các thành viên nữ có nguy cơ cao trong
gia đình bệnh nhân hemophilia A để có cơ sở tư vấn di truyền và chẩn đoán
trước sinh. Vì vậy đề tài “Nghiên cứu xác định người lành mang gen và
ứng dụng chẩn đoán trước sinh bệnh Hemophilia A” được thực hiện với các
mục tiêu sau:
1. Phát hiện người lành mang gen bệnh ở các thành viên gia đình bệnh
nhân hemophilia A đã xác định được đột biến gen F8.
2. Ứng dụng kỹ thuật I-PCR và giải trình tự gen chẩn đoán trước sinh

cho những thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemophilia A.

3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. ĐẶC ĐIỂM BỆNH HEMOPHILIA A
1.1. Những đặc điểm chung
1.1.1. Định nghĩa
Bệnh máu khó đông (hemophilia) là một bệnh di truyền do thiếu hụt
hoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương: thiếu
hụt yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A; thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh
hemophilia B; thiếu hụt yếu tố XI gây bệnh hemophilia C. Bệnh hemophilia A
là bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp nhất [17],18.
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu
Bệnh máu khó đông là một trong những bệnh di truyền đã được biết đến
từ thời cổ đại, tuy nhiên không có tên gọi chính thức cho nó. Trong các văn thư
cổ của người Do Thái từ thế kỷ thứ 2 trước công nguyên đã miêu tả những đứa
trẻ bị chết do chảy máu không cầm sau khi cắt bao qui đầu (tục lệ của người Do
Thái: trẻ em trai sinh ra đều cắt bao qui đầu). Vào thế kỷ 12 một bác sĩ người
Arap- Albucasis cũng miêu tả những đứa trẻ bị chết do chảy máu từ những vết
thương nhỏ. Bệnh máu khó đông được cho là bệnh di truyền hàng trăm năm qua
các thế hệ trong gia đình [9],[10]. Sự di truyền của bệnh máu khó đông liên kết
với giới tính được phát hiện từ những năm 80 của thế kỷ 19. Vào thời điểm này,
các nhà khoa học nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng
truyền bệnh cho con trai nhưng truyền gen bệnh cho con gái và người con gái
này có thể truyền gen bệnh cho con trai mình. Bệnh hemoliphia còn được biết
đến như căn bệnh của Hoàng Gia vì nữ hoàng Anh Victoria 1838-1901 mang
gen bệnh này và truyền nó cho nhiều thế hệ sau [5], [6].

4
1.1.3. Dịch tễ học bệnh Hemophilia A
Theo thống kê của tổ chức Hemophilia thế giới (WFH), hiện nay có
khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia và chỉ có khoảng 50.000
được điều trị đặc hiệu [19]. Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A gần giống nhau ở
các vùng địa lý, các nước, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng
30-100/1.000.000 dân 20. Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4000 
1/5.000 trẻ trai [11],[21].
Tại Việt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng
6000 bệnh nhân hemophilia. Số liệu điều tra những năm 19941996 về tình
hình bệnh hemophilia ở miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh hemophilia là
2560/1.000.000 dân [11]. 6000 người bị bệnh chảy máu di truyền, đó là số
liệu được Hội Rối loạn đông máu Việt Nam và Viện Huyết học - Truyền máu
Trung ương công bố ngày 15-4-2014 tại mít tinh hưởng ứng ngày Hemophilia
thế giới (17-4) [7].
Hiện nay trên toàn quốc mới có khoảng 2.200 (chiếm gần 40%) bệnh
nhân được phát hiện và chăm sóc thường xuyên. Như vậy, tỷ lệ bệnh nhân
chưa được chẩn đoán và điều trị vẫn còn ở mức cao [7].
Tại Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương
đang quản lý và điều trị khoảng 1.200 bệnh nhân, trong đó bệnh hemophilia A
chiếm 85%, bệnh hemophilia B chiếm 13,16% và còn lại là những bệnh nhân
bị các bệnh rối loạn đông máu khác. Trung bình mỗi ngày có từ 80 đến 100
bệnh nhân tới điều trị nội và ngoại trú [7], [8].
1.2. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh Hemophilia A
1.2.1. Đặc điểm chảy máu trong bệnh Hemophilia A
Bệnh hemophilia đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng
nguy cơ chảy máu. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết. Xuất huyết có
thể tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm
máu dưới da, tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp 12,13,17.

5
Chảy máu khớp
Thường gặp nhất là chảy máu khớp háng, khớp gối, khửu tay….trên
bệnh nhân Hemophilia A sau khi bị chấn thương hoặc trên những bệnh nhân
thể nặng.Nếu điều trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp
sẽ sưng và việc điều trị bị kéo dài tới vài ngày. Trẻ lớn có thể nhận biết được
chảy máu khớp trước khi đau và sưng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc
kiến bò trong khớp. Điều trị sớm sẽ dự phòng được tình trạng đau mạn tính
và biến dạng khớp.

Hình 1.1. Hình ảnh chảy máu khớp (khớp gối, khớp khuỷu tay)
ở bệnh nhân hemophilia A
(Nguồn: )
Chảy máu trong cơ
Chảy máu trong cơ cũng thường gặp và xuất hiện tự nhiên hoặc sau
chấn thương. Những cơ hay bị chảy máu là: cơ cẳng chân, cơ đùi, cơ cánh tay.
Chảy máu cơ gây ra sưng đau trong vài ngày. Một dấu hiệu quan trọng và kín
đáo trong chảy máu cơ là cảm giác đau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì. Nếu không
được điều trị sớm cơ sẽ bị tổn thương và có thể gây liệt.


6

Hình 1.2. Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A
(Nguồn: )
Chảy máu não
Có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương, ví dụ như ngã hoặc
đập đầu vào vật cứng. Triệu chứng chảy máu não có thể xảy ra ngay hoặc vài

ngày sau chấn thương, bao gồm: dễ kích ứng, ngủ gà, đau đầu, lú lẫn, nôn,
buồn nôn, nhìn đôi. Tất cả những sang chấn ở đầu đều nghiêm trọng và cần
được điều trị sớm để tránh chảy máu não và các hậu quả của chúng.
Chảy máu trong cổ và ngực
Chảy máu ở mặt, cổ và ngực có thể được coi là nghiêm trọng vì sưng
nề có thể gây chèn ép đường thở. Nhiễm trùng cũng có thể làm sưng cổ và
đôi khi khó có thể phân biệt hiện tượng sưng là do nhiễm trùng hay do chảy
máu.
Chảy máu ở vị trí khác
Bệnh nhân hemophilia rất dễ bị chảy máu nhưng hiếm gặp xuất huyết dưới da.
Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xước da có thể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không
cần điều trị. Chảy máu miệng, lợi và mũi cũng hay gặp. Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái
máu.


7

Hình 1.3. Hình ảnh chảy máu không cầm sau nhổ răng và từ vết xước da
ở bệnh nhân hemophilia A
(Nguồn: )
1.2.2. Những thay đổi về huyết học ở bệnh nhân Hemophilia A [14]
- Thời gian máu chảy kéo dài, thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1
giờ; chất lượng cục máu đông kém; thời gian Howell kéo dài…
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm hoặc không có.
+ Yếu tố von- Willebrand trong máu bình thường.
+ Số lượng tiểu cầu trong máu bình thường.
1.2.3. Chẩn đoán bệnh [18]
1.2.3.1. Chẩn đoán xác định
- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu.
- Dựa vào tiền sử gia đình

- Dựa vào xét nghiệm máu:
+ Số lượng tiểu cầu bình thường, PT (prothrombin time: thời gian
prothrombin) bình thường, fibrinogen bình thường, APTT (Activated Partial
Thromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa) kéo dài >
1,5 giá trị bình thường
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40%.
+ Yếu tố von Willebrand bình thường
+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.


8
1.2.3.2. Chẩn đoán mức độ bệnh
Mức độ

Nồng độ yếu tố VIII (%)
(hoạt tính (UI/ml))

Biểu hiện chảy máu
Chảy máu tự nhiên không

Nặng

<1% (<0.01)

(Chiếm 70%)

liên quan đến chấn thương,
thường chảy máu ở khớp và
cơ
Chảy máu tự nhiên hoặc liên

Trung bình

1-5% (0.01-0.05)

(Chiếm 15%)
Nhẹ
(Chiếm 15%)

> 5-40% (0.04-0.4)

quan đến chấn thương nhỏ.
Chảy máu nặng sau chấn
thương, phẫu thuật
Chảy máu sau chấn thương
lớn hoặc phẫu thuật

1.2.4. Điều trị bệnh hemophilia A[18], [22]
1.2.4.1. Nguyên tắc chung
- Trong điều kiện hiện nay nguyên tắc điều trị là cầm máu khi có chảy
máu và tụ máu.
- Chảy máu cấp nên được điều trị càng sớm càng tốt, tốt nhất là sau 2 giờ.
- Yếu tố đông máu cần được bổ sung để có thể đạt được hoạt tính trong
huyết tương đủ để cầm chảy máu.
1.2.4.2. Điều trị đặc hiệu
Việc điều trị thay thế phụ thuộc rất nhiều vào tính chất của các chế phẩm
máu có sẵn và thời gian bán hủy của yếu tố đông máu. Thời gian bán hủy của
yếu tố VIII là 8-12 giờ, của yếu tố IX là 24 giờ. Thời gian bán hủy có thể rút
ngắn nếu bệnh nhân chảy máu nhiều hoặc có chất ức chế.
- Truyền yếu tố VIII trong hemophilia A (Hemophil M, Dried Factor)

- Các chế phẩm điều trị khác:


9
+ Tủa lạnh, mỗi đơn vị tủa lạnh chứa 80 – 100 đơn vị yếu tố VIIIc/100ml
+ Plasma tươi.
+ Plasma sau khi lấy tủa lạnh (truyền cho hemophilia B)
+ Các thuốc cầm máu hỗ trợ → điều trị khi có chất ức chế.
1.2.4.3. Dự phòng chảy máu [23],[24]
- Cần hết sức tránh chấn thương.
- Tránh dùng các thuốc ảnh hưởng đến chức năng tiểu cầu, đặc biệt là
acetylsalicylic acid (Aspirin). Để giảm đau cho bệnh nhân có thể dùng
paracetamol hoặc paracetamol kêt hợp codein.
- Tránh tiêm bắp, châm cứu.
- Tiêm văc xin đầy đủ, đặc biệt tiêm phòng viêm gan virut B và A (không
dùng đường tiêm bắp mà chuyển sang tiêm dưới da)
- Tập thể dục hàng ngày để tăng thể lực, tăng sức mạnh cơ bắp, giúp
khớp hoạt động tốt hơn và giúp hạn chế chảy máu cơ khớp. Tránh các hoạt
động thể thao mang tính chất đối kháng như boxing, đá bóng, đấu vật. Nên
tập bơi, đi bộ và đi xe đạp.
1.3. Cơ chế phân tử bệnh hemophilia A
Bệnh hemophilia A (còn gọi là bệnh máu khó đông) là một bệnh di
truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của yếu tố đông máu huyết
tương - yếu tố VIII. Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đã cho
thấy những hiểu biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein yếu
tố VIII, mở đường cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh hemophilia A
và các dạng đột biến gen F8 gây bệnh [25].
1.3.1. Vai trò yếu tố VIII trong đông máu huyết tương
Trong con đường đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là đồng
yếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca 2+ và phospholipid

tiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự hình thành
thrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định fibrin từ


10
fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với tiểu cầu và yếu
tố thành mạch [17].
Thiếu hụt hoặc bất thường chức năng yếu tố VIII làm ngừng trệ dòng
thác đông máu theo con đường nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máu kéo dài,
không cầm ở bệnh nhân hemophilia A [22],[24].

(Nguồn: www.hemophilia.com)

Hình 1.4. Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương
1.3.2. Cơ chế phân tử bệnh hemophilia A
1.3.2.1. Vị trí và cấu trúc của gen mã hóa yếu tố VIII – protein yếu tố VIII
Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới
tính X, là một trong những gen lớn nhất của người, có kích thước 186 Kb
gồm 26 exon, trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp đến 262 bp và 2 exon
lớn nhất là exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), mã hóa 9 Kb mRNA.
Người đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm
rối loạn quá trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh
hemophilia A 25,[26],28,29.


11

Hình 1.5. Cấu trúc gen và protein yếu tố VIII
(Nguồn: Ye Jee Shim, Kun Soo Lee (2010))[30]
A) Vị trí gen yếu tố VIII trên NST giới tính X. B) Gen F8 bao gồm 25 intron

và 26 exon trong đó exon 26 mã hóa cho vùng 3’UTR; vùng intron 22 chứa 2
gen F8A và F8B. C) Phân tử mRNA được phiên mã có kích thước 9 kb. D)
Protein yếu tố VIII dạng tiền thân có 2332 acid amin, gồm vùng dẫn tín hiệu
(SP), các vùng chức năng lớn A1, A2, B, A3, C1, C2, các vùng chức năng xen
kẽ a1, a2, a3. Các yếu tố thuộc hệ thống đông máu như yếu tố X, Xa, IXa,
vWF, Phospholipid tương tác với yếu tố VIII tại những vị trí acid amin nhất
định. E và F) Các bước hoàn thiện phân tử protein F8 thành một yếu tố VIII
hoàn chỉnh được hoạt hóa.


12
Gen F8 mã hóa protein yếu tố VIII gồm 2332 acid amin, trọng lượng phân tử
khoảng 300 kD. Bản chất yếu tố VIII là polypeptid có cấu trúc A1-A2-B-A3Cl-C2, gồm hai chuỗi: chuỗi nặng là đoạn A1-A2-B có kích thước 200 kD,
chuỗi nhẹ là đoạn A3-C1-C2 có kích thước 80 kD. Cấu trúc của phức hợp này
được giữ ổn định nhờ sự tương tác giữa các liên kết ưa nước và kỵ nước với
yếu tố von Willebrand (vWF - là một kháng nguyên liên quan đến yếu tố
VIII) và Ca2+. Chuỗi nặng có đầu cuối là N, gồm các domain A 1-A2-B, chuỗi
nhẹ có đầu cuối là C, gồm các domain A 3-C1-C2. Vùng B được mã hóa bởi
một exon lớn và không có sự tương đồng với bất kỳ gen nào đã biết. Khi thủy
phân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin và threonin. Vùng B
không cần cho chức năng của yếu tố VIII và sau quá trình dịch mã, domain B
bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII 26,28],30.
Yếu tố VIII được sản xuất chủ yếu từ tế bào gan, ngoài ra còn được sản
xuất tại thận, lách. Hàm lượng yếu tố VIII trong huyết tương thấp (20-50
mg/ml). Đầu tiên, yếu tố VIII được tổng hợp như một chuỗi đơn gồm 2351
acid amin ở lưới nội bào, sau đó được chuyển vào thể Golgi. Tại đây đã xảy
ra các phản ứng để hình thành phân tử của yếu tố VIII. Nó được lưu thông
dưới dạng tiền “cofactor” không hoạt động [5].
Yếu tố VIII được hoạt hóa nhờ quá trình phân giải bởi thrombin hoặc
yếu tố Xa với nguyên lý hoạt động cắt yếu tố VIII ở vịt trí Arg 372 (chỗ nối

A1-A2), vị trí Arg 740 (chỗ nối A2-B) và vị trí Arg 1689 (chỗ nối B-A 3). Khi
vùng A2 tương tác với phức hợp A1/A3-C1-C2 thì yếu tố VIII thực sự được hoạt
hóa [31],[32].
1.3.2.2. Các dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A
Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A. Nghiên cứu
của Oldenburg và cộng sự đã chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thế


13
nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất
(47,5%) tiếp đến là dạng đột biến đảo đoạn gồm đảo đoạn intron 1 và
intron 22 (36,7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10 –
15%. Tùy thuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể
bệnh nặng nhẹ khác nhau 28,33,34,[35].
Đột biến điểm
Đột biến điểm gen F8 khi có sự thay đổi nucleotid trên gen. Nghiên cứu
của Shima và cộng sự chỉ ra rằng đột biến thay thế Arginin thành Histidin tại
vị trí 372 gây biến đổi vị trí cắt của thrombin và làm quá trình hoạt hóa yếu tố
VIII bị rối loạn, hoạt tính yếu tố VIII giảm mạnh còn 3  5% 36. Năm 2000,
Jacquemin và cộng sự đã chứng minh đột biến thay thế Serin thành Tyrosin tại
vị trí 2119 (vùng C2) làm giảm đột ngột khả năng tương tác giữa yếu tố VIII
và yếu tố vWF, dạng đột biến này thường gặp ở thể nhẹ và trung bình 33.
Điều đáng chú ý là mặc dù các đột biến nằm rải rác trên 26 exon mà không
tập trung vào một vùng hotspot, Goodeve A.C. và Jochen Graw chỉ ra phần
lớn các đột biến điểm đều có xu hướng xuất hiện ở đoạn trình tự CpG gây
thay thế acid amin Arginin thành một acid amin khác hoặc tạo mã kết thúc, ví
dụ: tại vị trí Arg 527, Arg531, Arg593, Arg 1689, Arg1781, Arg1941,
Arg2209, Arg2304…5,35.
Theo thống kê, khoảng gần 60% các đột biến điểm ảnh hưởng tới acid amin
Arginin, phần lớn các bệnh nhân mang đột biến này đều ở thể nặng 28,35.

Do phần lớn các đột biến gây bệnh là đột biến điểm vì vậy cho đến nay
phương pháp giải trình tự gen được coi là một tiêu chuẩn vàng trong việc phát
hiện các đột biến gen F8 [36].
Đột biến đảo đoạn


14
Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia vào quá trình
hoạt hóa yếu tố VIII nhưng các vùng intron của gen F8 lại là tác nhân chính
gây ra các dạng đột biến đảo đoạn ở bệnh nhân hemophilia A thể nặng [37].
Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm hơn
50% các thể bệnh nặng. Cách gen F8 một đoạn 500kb về phía đầu mút
telomere, nhiễm sắc thể X tồn tại hai vùng int22h2 và int22h3 có trình tự
tương đồng đến 99,9% với một đoạn thuộc intron 22 gen F8 (vùng int22h1).
Quá trình tái tổ hợp tương đồng giữa vùng int22h1 và một trong hai vùng
int22h2 và int22h3 chia cắt gen F8 thành 2 đoạn (exon 1-22 và exon 23-26)
cách nhau 400kb gây bất hoạt hoàn toàn gen mã hóa yếu tố VIII [30], [37]
Hiện tượng tái tổ hợp tương tự cũng diễn ra giữa intron 1 (int1h1) và
vùng trình tự tương đồng int1h2 cách gen F8 một đoạn 140kb về phía đầu
mút telomere gây nên dạng đột biến đảo đoạn intron 1 xuất hiện ở 5% các
thể bệnh nặng [30],[37],[38],[39].
Đột biến mất đoạn của gen yếu tố VIII
Đột biến mất đoạn lớn chiếm 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng.
Có thể mất 1 exon hoặc mất toàn bộ gen. Cơ chế phân tử của dạng đột biến
này đã được kết luận là do quá trình tái tổ hợp dẫn đến hiện tượng lặp lại Alu
[30]. Đột biến chèn đoạn lớn và hiện tượng Alu làm đứt gãy gen F8 và gây
bệnh hemophilia A thể nặng. Xóa đoạn và chèn đoạn nhỏ cũng thường thấy
trong hemophilia A thể nặng, trong đó thay đổi 1-55 nucleotid. Phổ biến nhất
là xóa hoặc chèn nucleotid Adenin vào exon 14, thường xảy ra trong vùng từ
c.3637 đến c.4379 [40].

Các dạng đột biến khác
Đột biến tại vị trí nối (splice site) và vùng promoter của gen được phát
hiện ở một số bệnh nhân [36].
Khi gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp yếu tố
VIII gây nên bệnh hemophilia A. Đối với hemophilia A vị trí kháng nguyên


15
trên protein yếu tố VIII vẫn bình thường nhưng các vị trí hoạt tính thì bị thay
đổi, thậm chí có thể chỉ là do mất, thêm hoặc thay thế một acid amin trên
chuỗi polypeptid làm cho các yếu tố đông máu huyết tương (IX, X, ion Ca 2+,
Cu2+) không có vị trí bám trong quá trình đông máu hoặc yếu tố vWF, X và
các phân tử phospholipid tiểu cầu không có vị trí để bám vào khi yếu tố VIII
được hoạt hóa [41], [42].
1.3.3. Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A
Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên quan đến giới tính, bệnh là
hậu quả của bất thường phân tử protein do thương tổn gen cấu trúc nằm
trên thể nhiễm sắc X. Nam giới có cặp nhiễm sắc thể giới tính XY, vì vậy 1
phần thể nhiễm sắc X không có sự tương đồng trên thể nhiễm sắc Y, nên
khi gen nằm trên đoạn đó (gen chỉ đạo tổng hợp yếu tố chống hemophilia
A) bị thương tổn, đã biểu hiện bệnh. Ngược lại ở nữ giới, tất cả nhiễm sắc
X này có thể nhiễm sắc X kia tương đồng (cặp thể nhiễm sắc giới tính của
nữ là XX) nên phụ nữ mang một thể nhiễm sắc X thương tổn vẫn không
biểu hiện bệnh vì đã được bù trừ. Nam giới bị bệnh tức là mang trong mình
nhiễm sắc thể X bị thương tổn, có thể đó là do hậu quả của một quá trình di
truyền phả hệ hoặc do đột biến.


16

Hình 1.6. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ con
Cơ chế di truyền của bệnh:
1/ Mẹ mang gen bệnh, bố bình thường: trong một gia đình có bố bình
thường (XHY), mẹ mang gen bệnh (XHXh) (người truyền bệnh) thì 50% số con
gái sẽ là người mang gen bệnh (XHXh), 50% con gái bình thường (XX), 50%
con trai bị bệnh (XhY) và 50% con trai bình thường (XHY).
2/ Bố bị bệnh, mẹ bình thường: 100% con gái là người mang gen bệnh
(XHXh) và 100% con trai bình thường (XHY).
3/ Bố bị bệnh, mẹ mang gen bệnh: 50% con gái bị bệnh (X hXh) đồng
hợp tử, 50% con gái mang gen bệnh (XHXh), 50% con trai bị bệnh và 50% con
trai bình thường (XHY). Như vậy nữ mắc bệnh khi mang đồng hợp tử gen
bệnh (cả 2 thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XhXh), nữ mang gen bệnh khi mang
dị hợp tử gen bệnh (một thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XHXh ).
4/ Do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc
từ người mẹ: thường chiếm khoảng 1/3 các trường hợp hemophilia. Tỉ lệ đột
biến gây bệnh hemophilia xẩy ra là 3 x 106 trên gen và trên một giao tử trong
một thế hệ [6]. Tỷ lệ đột biến mới xảy ra ở tế bào mầm sinh dục của nam cao
hơn 5 lần so với ở tế bào mầm sinh dục của nữ. Gần đây, người ta đã chứng
minh rằng tần suất đột biến theo giới tùy thuộc vào loại đột biến. Đột biến đảo
đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần so với ở tế bào
mầm sinh dục nữ. Hiện tượng này giải thích cho sự vắng mặt nhiễm sắc thể
thứ hai tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đảo đoạn trong giai đoạn phân
bào giảm nhiễm ở nam 43.
Trong quá trình di truyền phả hệ, gen bệnh lý sẽ mất dần khi người
bệnh không sinh đẻ hoặc khi thể nhiễm sắc X bị thương tổn không được
truyền cho thế hệ sau mà chỉ truyền thể nhiễm sắc X bình thường. Song do có


17
vấn đề đột biến gen mới nên tần suất của bệnh qua các thế kỷ vẫn giữ nguyên

tính hằng định của nó.
2. NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A
2.1. Đặc điểm chung
Người lành mang gen bệnh hemophilia A là người mang một nhiễm
sắc thể X bị đột biến gen F8 và một nhiễm sắc thể X bình thường, chính vì
vậy mà đa số họ không biểu hiện bệnh. Trong trường hợp nhiễm sắc thể X
bình thường bị bất hoạt khi đó người mang gen bệnh có biểu hiện chảy máu
với mức độ tương đương với trường hợp bệnh nhân hemophilia A thể nhẹ
trên lâm sàng [3].
Con gái của một bệnh nhân hemophilia A, người mẹ của hai con trai bị
bệnh; người mẹ của một con trai bị bệnh hoặc một con gái mang gen bệnh và
có một người nam cùng huyết thống trong phả hệ gia đình bị bệnh; là những
người chắc chắn mang gen F8 bị đột biến theo quy luật di truyền, được gọi là
người lành mang gen bệnh bắt buộc (obligate carrier). Bà ngoại của một cháu
trai bị bệnh hemophilia A, con gái của một người mẹ mang gen bệnh
hemophilia A, dì và em gái của một bệnh nhân hemophilia A là những người
có nguy cơ cao mang gen bệnh (possible carrier) [3], [44].
Người có biểu hiện bệnh máu khó đông tương tự như một trường hợp
hemophilia A thể nhẹ thì khi đó gọi là người lành mang gen bệnh có triệu
chứng (symptomatic carriers) [44]. Khoảng 10% người mang gen có hoạt tính
yếu tố VIII huyết tương thấp hơn so với bình thường, thậm chí một số ít
trường hợp người mang gen bệnh có hoạt tính yếu tố VIII huyết thanh rất thấp
dưới 4% gây chảy máu tương tự thể bệnh nặng, với nồng độ yếu tố VIII từ
5% đến 40% có thể bị chảy máu tương tự như bệnh nhân thể nhẹ. Khoảng
20% người lành mang gen bệnh biểu hiện triệu chứng chảy máu với các mức
độ khác nhau, bao gồm cả những người có hoạt tính yếu tố VIII huyết tương
trong giới hạn bình thường (40 đến 60%) [10], [45], [46].


18

2.2. Đặc điểm chảy máu của người lành mang gen bệnh hemophilia A
Chảy máu ở những người lành mang gen bệnh gồm hai loại chính [3], [44]:
- Chảy máu sản, phụ khoa:
+ Kinh nguyệt kéo dài (hơn bảy ngày), rong kinh là một trong những
triệu chứng phụ khoa phổ biến nhất. Có thể nặng nề với số lượng máu mất
trong khoảng thời gian dài. Theo thống kê, có đến 1/3 số phụ nữ bỏ lỡ đáng
kể thời gian học hoặc làm việc do rong kinh. Đó cũng có thể là nguyên nhân
của tình trạng thiếu sắt, thiếu máu và làm giảm chất lượng cuộc sống ở phụ nữ
mang gen bệnh. Chảy máu nặng trong kỳ kinh nguyệt đầu tiên của một người
lành mang gen bệnh có thể dẫn đến phải nhập viện.
+ Chảy máu bất thường âm đạo (băng huyết)
Băng huyết liên quan đến chảy máu bất thường xảy ra ngoài chu kỳ kinh
nguyệt bình thường. Chảy máu bất thường xảy ra đôi khi trong khoảng thời
gian giữa phần cuối của một chu kỳ kinh nguyệt với kỳ kinh bắt đầu tiếp theo.
Nếu chảy máu nặng nề cần nghỉ ngơi tại chỗ hoặc nhập viện để theo dõi.
+ Đau bụng kinh
Người mang gen bệnh hemophilia A có nhiều khả năng có đau bụng
giữa chu kỳ kinh nguyệt hơn những người không mang gen bệnh (đau bụng
do xuất huyết lúc rụng trứng).
+ U nang buồng trứng
Trong quá trình rụng trứng, một lượng nhỏ máu bị chảy có thể xảy ra
khi trứng được giải phóng khỏi nang (túi chứa đầy dịch, trong đó một quả
trứng phát triển). Chảy máu này có thể gây ra một loại u hình thành trên
buồng trứng, gọi là u nang thể vàng. Người mang gen bệnh hemophilia A có
nhiều khả năng bị chảy máu đáng kể và kéo dài lúc rụng trứng, gây ra đau
bụng vùng hạ vị. Hơn nữa, một u nang buồng trứng có nguy cơ bị vỡ vào kỳ


19
kinh nguyệt, gây ra chảy máu trong và đau đột ngột ở vùng bụng dưới, trường

hợp này gọi là u nang buồng trứng xuất huyết.
+ Chảy máu ổ bụng (hemoperitoneum)
Máu có thể chảy vào các mô xương chậu và dây chằng, đôi khi vào ổ
bụng và vùng chậu. gọi là chảy máu ổ bụng, là một cấp cứu ngoại khoa có thể
đe dọa đến tính mạng.
+ Chảy máu sau khi sinh:
Người mang gen bệnh hemophilia A có nguy cơ bị xuất huyết trong thai
kỳ. Tuy nhiên trong thực tế, do ảnh hưởng của hormon làm tăng hoạt tính yếu
tố VIII trong huyết tương nên nguy cơ này giảm xuống.
Người mang gen bệnh hemophilia A cũng có thể có nguy cơ chảy máu
nặng lúc chuyển dạ. Nhìn chung, nguy cơ xuất huyết trong vòng 24 giờ đầu
tiên sau khi sinh con của người bình thường là 4-5% thì nguy cơ này tăng lên
22% cho những người mang gen bệnh hemophilia A. 11% người mang gen
bệnh bị xuất huyết muộn sau khi sinh con so với 1% sản phụ nói chung. Chảy
máu muộn ở người mang bệnh hemophilia A thường xảy ra vào khoảng 5
đến10 ngày sau khi sinh con, khi hoạt tính yếu tố VIII huyết tương của họ trở
về giá trị trước khi mang thai [44], [46].
- Các chảy máu khác:
 Dễ bầm tím
 Chảy máu kéo dài từ vết thương nhỏ
 Chảy máu cam
 Chảy máu kéo dài sau khi nhổ răng


20
 Chảy máu nặng sau khi chấn thương hoặc phẫu thuật
 Chảy máu khớp và cơ bắp không phải là triệu chứng hay gặp ở những
người mang bệnh hemophilia A trừ trường hợp hoạt tính yếu tố VIII
huyết tương rất thấp (dưới 4%). Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng
nguy cơ chảy máu kéo dài (nhiều hơn năm phút) từ vết thương nhỏ

hoặc sau khi phẫu thuật ở người mang gen bệnh hemophilia A có triệu
chứng có thể cao gấp đôi so với những người mang gen bệnh không
biểu hiện triệu chứng trong cùng một gia đình.
2.3. Quản lý và điều trị dự phòng cho người lành mang gen bệnh
hemophilia A [3], [22], [44]
Những người được xác định là người lành mang gen hoặc có nguy cơ
cao mang gen bệnh cần được:
- Thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán thích hợp và theo dõi chảy máu
bất thường. Cần xác định chính xác bệnh phụ khoa và huyết học cơ bản.
- Điều trị thích hợp và chăm sóc phòng ngừa cho người có rối loạn chảy máu.
- Điều trị như một bệnh nhân hemophilia A thường xuyên (nếu cần).
- Tránh những phẫu thuật không cần thiết.
- Tránh sử dụng các sản phẩm máu nếu không thực sự cần thiết.
- Thông báo cho bác sĩ về tình trạng mang gen bệnh để có phương án
chuẩn bị cho gây mê, phẫu thuật, mang thai, sinh con và chăm sóc sau sinh.
- Tư vấn di truyền và hỗ trợ tâm lý.
2.4. Vai trò của việc xác định người lành mang gen bệnh
Với những thành viên nữ mang gen bệnh, việc xác định chính xác tình
trạng mang gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử giúp các nhà tư vấn sớm đưa
ra lời khuyên di truyền trước khi kết hôn để họ tăng cường nhận thức về bệnh,


21
làm giảm tỷ lệ mang thai và tỷ lệ trẻ sinh ra bị mắc bệnh hemophilia A [47].
Xác định tình trạng mang gen để giúp người phụ nữ có các biện pháp
tăng hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh tật, đồng thời nâng cao chất lượng
chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng và xã hội [48], [49], [50].
3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN
BỆNH HEMOPHILIA A
3.1. Các xét nghiệm đông máu

- Xét nghiệm định lượng hoạt tính yếu tố VIII huyết tương thường thấp
hơn giá trị bình thường (50-150%) [51]. Tuy nhiên cũng chỉ phát hiện được
khoảng 10-20% người lành mang gen có biểu hiện bệnh thể nhẹ và có hoạt
tính yếu tố VIII huyết tương < 35%, số người còn lại có hoạt tính yếu tố VIII
huyết tương dao động trong khoảng 40 – 60% và không có triệu chứng bệnh
[44], [46]. Do vậy xét nghiệm này không phát hiện được rất nhiều các trường
hợp mang gen bệnh.
3.2. Phát hiện người lành mang gen bệnh dựa vào phân tích phả hệ
Cây phả hệ của một gia đình chứa thông tin tối thiểu về 3 thế hệ: thế hệ III
gồm bệnh nhân, anh chị em ruột và anh chị em họ của bệnh nhân; thế hệ II gồm
cha mẹ, cô dì, chú bác của bệnh nhân; thế hệ I gồm ông bà nội hoặc ông bà
ngoại và ông bà họ của bệnh nhân [52].
Dựa vào phả hệ có thể xác định được những người có thể là người mang
gen bệnh trong gia đình bệnh nhân hemophilia A. Đối với những trường hợp
bệnh nhân có tiền sử gia đình rõ ràng, dựa vào kết quả phân tích phả hệ có thể
xác định chắc chắn tình trạng mang gen của các thành viên nữ trong gia đình
bệnh nhân. Tuy nhiên phương pháp này cũng chỉ phát hiện được số lượng hạn
chế người mang gen bệnh và các thông tin được thu thập để xây dựng phả hệ
đòi hỏi phải thật chính xác và bị ảnh hưởng bởi yếu tố chủng tộc. Kỹ thuật
này cũng không áp dụng được cho những trường hợp bệnh đơn lẻ trong gia
đình [52], [53].


22
3.3. Phát hiện người lành mang gen bệnh bằng các kỹ
thuật sinh học phân tử
3.3.1. Phương pháp phát hiện đột biến trực tiếp
Là phương pháp phát hiện tình trạng mang gen của người mẹ và các
thành viên nữ trong gia đình dựa trên đột biến chỉ điểm đã xác định được trên
bệnh nhân Hemophilia A. Phương pháp này phát hiện được 99-100% các

trường hợp người lành mang gen bệnh [52].
 Phát hiện đột biến điểm gen F8 bằng kỹ thuật giải trình tự gen
Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như trình tự mẫu cho phản
ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Sử dụng máy giải trình tự
gen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng dideoxynucleotid (ddNTP)
do Sanger và CS phát minh. Dựa vào màu huỳnh quang, máy sẽ nhận diện
được các nucleotid, từ đó biết được trình tự của DNA đích.
So sánh trình tự gen của mẫu DNA bệnh phẩm với trình tự gen chuẩn
của GeneBank (National center for biotechnology information, NCBI) và
phân tích theo phương pháp ABI Prism 3100 genetic analyzer (Applied
Biosystems) (Hình 1.7).

Hình 1.7. Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 [54]


23
Trình tự exon 14 gen F8 (mồi ngược) của bệnh nhân so sánh với trình tự
GeneBank (NM_000132) phát hiện có đột biến thêm 1 nucleotid C trên exon
14 tại vị trí c.4201insC. Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 của người mẹ
và chị gái bệnh nhân từ vị trí c.4201C xuất hiện 2 đỉnh chồng lên nhau chứng
tỏ người mẹ và chị gái bệnh nhân mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử.
 Phát hiện đột biến đảo đoạn gen F8
a/ Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22
Phương pháp I-PCR được miêu tả bởi Rosetti và cộng sự năm 2005
[55]. Quy trình gồm 3 bước: 1/Cắt DNA bằng enzym BclI; 2/Nối sản phẩm
cắt bằng T4 ligate; 3/Khuếch đại sản phẩm nối bằng phản ứng multiplex
PCR. Phương pháp I-PCR có ưu điểm là dễ tiến hành. Enzym BclI tác dụng
rất đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzym có tính đặc hiệu cao. Sản phẩm PCR
được khuếch đại dễ dàng trong thời gian khoảng 30 phút do các đoạn DNA có
kích thước ngắn (487 và 559 bp). Như vậy xét nghiệm phân tích gen được

tiến hành nhanh chóng, kết quả thu được có độ tin cậy cao, dễ thực hiện.

559bp
487bp

Hình 1.8. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện đột biến đảo đoạn
intron 22 bằng phương pháp I-PCR (Nguồn: Rossetti và cộng sự 2005)
Sản phẩm DNA người bình thường ở vị trí giếng số 2 có 1 băng kích
thước tương ứng 487 bp. Sản phẩm DNA ở giếng số 1 và 3 của bệnh nhân
hemophilia A thể nặng có 1 băng kích thước tương ứng 559 bp bệnh nhân bị


24
đột biến đảo đoạn intron 22. Sản phẩm DNA người mẹ bệnh nhân ở giếng số
4 có 2 vạch DNA kích thước tương ứng là 487 và 559b, là người lành mang
gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử.

b/ Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1
Phương pháp xác định đảo đoạn intron 1 theo quy trình chuẩn của
Tizzano và cộng sự [38]. Thiết kế hai phản ứng PCR có thể phát hiện được các
bệnh nhân có đột biến và người lành mang gen bệnh. Một phản ứng có chứa
các cặp mồi đặc hiệu cho int1h -1 cộng với mồi đặc hiệu cho chuỗi int1h -2
(9F, 9CR, int1h - 2F ); phản ứng còn lại chứa các cặp mồi đặc hiệu cho int1h -2
cộng với mồi đặc hiệu cho của int1h -1 (int1h - 2F, int1h -2R, 9F). Dựa vào
kích thước các đoạn DNA sau khi điện di để phát hiện đột biến (hình 1.9).

1908bp
1323bp

1191bp

1776bp

Hình 1.9. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra đảo đoạn intron1 [38].
Phản ứng đầu (A) cho một sản phẩm kích thước 1908bp từ DNA người
bình thường do mồi 9F và mồi 9cR bắt cặp với nhau (93-2); một sản phẩm
1323bp từ bệnh nhân bị đột biến đảo đoạn do mồi 9cR và mồi int1h-2F bắt cặp
với nhau (93-1), trong khi DNA ở phụ nữ mang thai có cả hai sản phẩm này (93-


25
3). Phản ứng sau (B) cho thấy một đoạn DNA kích thước 1191bp của người bình
thường do mồi int1h - 2F và int1h -2R bắt cặp với nhau(93-2); một sản phẩm
kích thước 1776bp của người bị đảo đoạn do mồi 9F và int1h -2R bắt căp (931), người phụ nữ mang gen có cả hai đoạn DNA kích thước trên (93-3).
 Phát hiện đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8
Trong những năm gần đây, MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification) là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột
biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8. Ngoài ra, MLPA còn giúp chẩn đoán dị hợp
tử với độ chính xác cao, cho kết quả nhanh chóng [56].
Nghiên cứu của Rost, Loffler và cộng sự năm 2008, khi phân tích mẫu
DNA của 80 bệnh nhân hemophiliaA bằng phương pháp MLPA (Kit P178,
MRC Hà Lan, Amsterdam, Hà Lan) để phát hiện những trường hợp đột biến
lặp đoạn, xóa đoạn [56]. Nghiên cứu sử dụng 44 probe để thăm dò toàn bộ 26
exon trong gen F8. Với đột biến xóa đoạn, các đỉnh tương ứng với từng exon
sẽ bị mất. Với đột biến lặp đoạn, kết quả được tính toán dựa vào tỉ lệ RPA
(Relative Peak Area) tương ứng với từng exon so với mẫu chứng, RPA của
mỗi exon được tính bằng cường độ tín hiệu tương ứng (A) chia cho tổng
cường độ tín hiệu của 44 đỉnh trong probemix (ΣA), exon lặp đoạn khi mà tỉ
lệ RPA lớn hơn 1,6. Nghiên cứu của Michelle O’Brien (2013) cũng ứng dụng
thành công phương pháp này trong phát hiện đột biến xóa đoạn lớn gây bệnh
hemophilia A và bệnh Von Willerbrand [57].