CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÍNH CHẤT PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÍNH CHẤT
PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER
Mã số: NCST 2011-05

Chủ nhiệm đề tài
NCS. Trần Thanh Trúc

Cần Thơ, tháng 12/2011


BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÍNH CHẤT
PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER
Mã số: NCST 2011-05

Xác nhận của trường Đại học Cần Thơ
(ký, họ tên, đóng dấu)

Cần Thơ, tháng 12/2011

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)


DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI
1. NCS Trần Thanh Trúc, Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp
& Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
2. PGs. Ts Nguyễn Văn Mười, Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông
nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
3. Ts Nguyễn Văn Thành, Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học,
Trường Đại học Cần Thơ
4. Nguyễn Tấn Đạt, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Khóa
15, Trường Đại học Cần Thơ.
5. Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ
uống Khóa 17, Trường Đại học Cần Thơ.
6. Vương Tố Trinh, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Khóa
17, Trường Đại học Cần Thơ.


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
MỤC LỤC
i
DANH SÁCH HÌNH....................................................................................................................iv
DANH SÁCH BẢNG....................................................................................................................v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................................vi
THUẬT NGỮ................................................................................................................................vi
PHẦN 1.

MỞ ĐẦU.................................................................................................................1

1.1

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI...............................................................................1

1.2

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU........................................................................................1

1.3

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU........................................................................................1

1.4

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................................................2

1.5

ĐỐI TƯỢNG & PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI....................................2

PHẦN 2

...................................................................................................................................3

Chương 2

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU......................................................................................3

2.1

GIỚI THIỆU VỀ PECTIN METHYLESTERASE.................................................3

2.1.1

Khái quát chung...................................................................................................3

2.1.2

Đặc tính sinh lý của enzyme PME.......................................................................3

2.1.3

Các nguồn enzyme PME tự nhiên........................................................................4

2.1.4

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme PME.......................................6

2.1.5

Ứng dụng của enzyme PME trong chế biến thực phẩm.......................................8

2.2

CƠ SỞ CỦA VIỆC THU NHẬN ENZYME TỪ ASPERGILLUS NIGER.........10

2.3

CÁC BIỆN PHÁP TINH SẠCH PECTIN METHYLESTERASE.....................11

2.3.1

Tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A. niger bằng phương pháp kết tủa...............11

2.3.2

Ứng dụng kỹ thuật lọc màng trong tinh sạch enzyme........................................13

2.4

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TINH SẠCH ENZYME BẰNG KỸ THUẬT ĐIỆN DI
13

2.5

ĐỘNG HỌC ENZYME.............................................................................................14

2.5.1

Khái niệm enzyme và cấu tạo hóa học...............................................................14

2.5.2

Động học phản ứng enzyme...............................................................................15

2.5.3

Phân tích động học quá trình xử lý nhiệt enzyme..............................................17
Trang i


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

2.6

CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN..........................................................................20

Chương 3
3.1

Trường Đại học Cần Thơ

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................23

PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU..............................................................................23

3.1.1

Địa điểm, thời gian............................................................................................23

3.1.2

Đối tượng nghiên cứu........................................................................................23

3.1.3

Thiết bị, hoá chất...............................................................................................23

3.2

PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM.............................................................................24

3.2.1

Phương pháp chuẩn bị mẫu...............................................................................24

3.2.2

Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả........................................................24

3.3

Phương pháp bố trí thí nghiệm................................................................................25

3.3.1 Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến
khả năng kết tủa enzyme PME từ A. niger......................................................................25
3.3.2 Thí nghiệm 2. Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme PME từ A. niger bằng
phương pháp lọc màng....................................................................................................26
3.3.3 Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất pectin đến hoạt tính
enzyme PME từ A. niger..................................................................................................27
3.3.4 Thí nghiệm 4. Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A. niger theo
nhiệt độ28
3.3.5

Thí nghiệm 5. Động học sự vô hoạt nhiệt của enzyme PME từ A. niger...........28

3.3.6 Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính enzyme
PME từ A. niger..............................................................................................................29
3.3.7 Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl và CaCl2 đến hoạt tính enzyme
PME từ A. niger..............................................................................................................30
3.4

PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU............................................31

Chương 4

KẾT QUẢ THẢO LUẬN....................................................................................32

4.1
ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI HÓA CHẤT VÀ TỶ LỆ SỬ DỤNG ĐẾN KHẢ
NĂNG KẾT TỦA ENZYME PME TỪ ASPERGILLUS NIGER....................................32
4.1.1

Đánh giá khả năng kết tủa enzyme PME từ Aspergillus niger bằng (NH4)2SO4....
32

4.1.2

Đánh giá khả năng kết tủa enzyme PME từ Aspergillus niger bằng NaCl........34

4.1.3 Ảnh hưởng của việc sử dụng dung môi hữu cơ đến khả năng kết tủa enzyme
PME từ A. niger..............................................................................................................35

Trang ii

Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

4.1.4

Trường Đại học Cần Thơ

Tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ Aspergillus niger bằng phương pháp lọc màng.
...........................................................................................................................37

4.2
ẢNH HƯỞNG CỦA NỐNG ĐỘ PECTIN ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME PME
TỪ ASPERGILLUS NIGER..................................................................................................39
4.3
ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH PECTIN
METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER.........................................................41
4.4
ĐỘNG HỌC SỰ VÔ HOẠT NHIỆT CỦA PECTIN METHYLESTERASE TỪ
ASPERGILLUS NIGER.........................................................................................................42
4.5
ẢNH HƯỞNG CỦA Ph ĐẾN SỰ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PECTIN
METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER.........................................................44
4.6
ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NACL VÀ CACL 2 ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA
PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER........................................45
4.6.1

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính của enzyme PME từ A. niger......45

4.6.2

Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính của enzyme PME từ A. niger.....46

PHẦN 3.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..................................................................................48

KẾT LUẬN..............................................................................................................................48
ĐỀ NGHỊ.................................................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................................49
PHỤ LỤC

.................................................................................................................................xii

Trang iii


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 1

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin với xúc tác của enzyme PME....2
Hình 2: Phức hợp pectate calcium.............................................................................................7
Hình 3: Tác dụng của enzyme PME trong quá trình làm trong nước quả..................................8
Hình 4: Nấm mốc A. niger.........................................................................................................9

Hình 5: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein............................................11
Hình 6: Hình minh họa động học theo phản ứng bậc một.......................................................16
Hình 7: Hình minh họa động học theo phản ứng chuyển đổi một phần..................................17
Hình 8: Hình minh họa ảnh hưởng của nhiệt đến hằng số tốc độ phản ứng............................18
Hình 9: Thiết bị lọc màng........................................................................................................26
Hình 10: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE các mẫu enzyme PME từ A. niger..................37
Hình 11: Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger...................39
Hình 12: Phương trình biểu thị sự vô hoạt nhiệt của enzyme PME từ A. niger.......................42

Trang iv


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Đặc tính sinh hóa của một số enzyme PME sau tinh sạch từ thực vật.........................4
Bảng 2: Thông số động học Km của một số enzyme................................................................15
Bảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu............................................................23
Bảng 4: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với (NH4)2SO4.............31
Bảng 5: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với NaCl.....................33
Bảng 6: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với ethanol..................34
Bảng 7: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với aceton...................34
Bảng 8: So sánh hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng các loại hóa chất khác nhau.............35
Bảng 9: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME từ A. niger sau quá trình lọc màng........................36
Bảng 10: Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger..................39
Bảng 11: Sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A. niger do ảnh hưởng của nhiệt độ............40
Bảng 12: Các thông số động học của quá trình bất hoạt nhiệt enzyme PME từ A. niger........42
Bảng 13: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme PME từ A. niger..............................43

Bảng 14: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger...................45
Bảng 15: Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger..................45

Trang v


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A. niger

Aspergillus niger

A. awamori

Aspergillus awamori

A. aculeatus

Aspergillus aculeatus

Cfu

Colony forming unit (số khuẩn lạc)

DE

Degree of esterification (độ ester hóa)

PE

Pectin esterase

PG

Polygalacturonase

PL

Pectat lyase

PME

Pectin methylesterase

SSF

Solid state fermentation (lên men rắn)

U

Đơn vị hoạt tính enzyme

THUẬT NGỮ
Pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger: enzyme PME được thu nhận từ
quá trình trích ly sinh khối nấm mốc sau Aspergillus niger quá trình lên men rắn hay
lỏng, Aspergillus niger ở các điều kiện lên men thích hợp.

Trang vi


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Đơn vị: Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung
Tên đề tài: Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất pectin methylesterase từ
Aspergillus niger
Mã số: NCST 2011 - 05
Chủ nhiệm đề tài: Ths Trần Thanh Trúc

Tel.: 0710.3831530 (8309)

E-mail:
Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Cần Thơ
Thời gian thực hiện: 8 tháng (từ tháng 01. 5. 2011 đến tháng 31. 12. 2011)
2. Mục tiêu
Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, thời gian gia nhiệt, pH, nồng độ
NaCl, nồng độ CaCl2 đến hoạt tính của enzyme PME từ A.niger.
3. Tính mới và sáng tạo
Pectin methylesterase (PME) là enzyme có ứng dụng quan trọng trong lãnh vực chế
biến rau, củ, quả; đặc biệt trong cải thiện cấu trúc nguyên liệu. Tuy nhiên, nghiên cứu
ứng dụng của enzyme này tại Việt Nam vẫn còn là một khái niệm mới mẻ, đồng thời

giá nhập ngoại của enzyme này rất cao. Việc xác định tính chất cơ bản của enzyme
này sau tiến trình sinh tổng hợp PME từ A. niger có ý nghĩa ứng dụng cao.
4. Kết quả nghiên cứu
Kết quả thí nghiệm cho thấy, kết tủa enzyme PME thô từ A. niger bằng ethanol với tỷ
lệ 3:1 (v/v) là tốt nhất, thể hiện ở hoạt tính riêng là 10,02 U/mg protein, hiệu suất thu hồi
91,48% và độ tinh sạch tăng gấp 7,98 lần so với mẫu enzyme thô. Sau khi kết tủa với
ethanol, tiến hành lọc màng ở khoảng phân đoạn 50 kDa thu được enzyme PME có
hoạt tính riêng đạt 15,63 U/mg protein, độ tinh sạch tăng 12,40 ± 0,89 lần khi so sánh với
mẫu enzyme thô. Enzyme PME từ A. niger có khối lượng phân tử khoảng 43 kDa,
hằng số Michealis–Menten (Km) của enzyme PME đạt được là 0,6668 ± 0,0379 g/L.
Hoạt tính của enzyme PME từ A. niger thể hiện cao nhất ở 40 oC, pH môi trường 5,0.
CaCl2 và NaCl đều có tác dụng hoạt hóa, làm tăng hoạt tính của enzyme PME từ

Trang vii


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

A. niger. Đồng thời, sự bất hoạt nhiệt của enzyme PME tuân theo phương trình bậc 1
chuyển đổi một phần với hệ số góc k tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 50 đến 70 oC.
5. Sản phẩm
- Các thông số cơ bản về tính chất của PME thu nhận từ A. niger.
- Các kết quả về đào tạo đã được thực hiện thông qua nghiên cứu:
+ Có 1 bài báo được đăng
Nguyễn Văn Mười, Nguyễn Tấn Đạt, Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Vương Tố Trinh và
Trần Thanh Trúc (2010). Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính pectin
methylesterase từ Aspergillus niger. Kỷ yếu hội nghị khoa học: Phát triển nông
nghiệp bền vững thích ứng với sự biến đổi khí hậu, 26/11/2010, phần II, NXB

Nông Nghiệp, trang 92-101..
+ 1 luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ ngành Công nghệ thực phẩm và Đồ uống
6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:
Hỗ trợ cho việc đào tạo Nghiên cứu sinh ngành Vi sinh vật học
Tài liệu giảng dạy ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Công nghệ thực phẩm
& Đồ uống.

Ngày

tháng

năm 2011

Xác nhận của Trường Đại học Cần Thơ

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ và tên, đóng dấu)

(ký, họ và tên)

Trang viii


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1. General information
Project Title: Factors effect to activity of pectin methylesterase from Aspergillus
niger.
Code number: NCST 2011 - 05
Coordinator: MsC. Tran Thanh Truc
E-mail:

Tel: 0710.3831530 (8309)

Implementing Institution: Can Tho University
Duration: from 01/05/2011 to 31/12/2011
2. Objectives
To find out factors effect to activity of pectin methylesterase from Aspergillus niger:
temperature, time, pH and role of NaCl and CaCl2.
3. Creativeness and innovativeness
Pectin methylesterase (PME) has important applications in the field of processed
vegetables and fruits, especially in improving the structure of materials. However,
research and application of this enzyme in Vietnam has been still a new concept, while
imported prices of this enzyme is very high. Determination the basic fators of this
enzyme from biosynthesis A. niger PME has great significance of appliccation .
4. Results obtained
The result showed that, ethanol was the suitable precipitant for PME purification.
Firstly, cold ethanol was added to the crude enzyme solution with the ratio of 3: 1
(v/v) for PME precipitation. In this case, specific activity of PME was 10.02
U/mgprotein,the purification factor achieved 7.98 fold and the PME recovery yield
obtained 91.48%. Combined with the cross flow membrane step, the specific activity
of PME reached to 15.63 U/mgprotein and the purification factor achieved 12.40 ± 0.89
fold in comparison to the crude enzyme solution. The molecular weight of the enzyme
was found to be 43 kDa and Michealis–Menten constant Km was 0.6668 ± 0.0379 g/L.
In addition, temperature and pH optimum of A. niger PME were 40 oC and 5.0,

respectively. The activity of the enzyme was stimulated by NaCl or CaCl 2. Isothermal
inactivation of partial purified A. niger PME could be described by a fractional–
conversion model and the inactivation rate constants increase with increasing
temperatures from 50 to 70 oC.
Trang ix


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

The studied resutls can be applied in teaching and researching in the field of
biotechnology. Based on experimental data, the optimal fermentation condition can be
determined.
5. Products
Some parameters of characteristic A.niger PME
Papers were submitted:
Nguyen Van Muoi, Nguyen Tan Dat, Nguyen Ngoc Huynh Tran, Vuong To Trinh and
Tran Thanh Truc, 2010. Factors effect to activity of pectin methylesterase from
Aspergillus niger. Proceedings of Conference: Development of sustainable
agricultural techniques for adapting to climate change, part II, The Agricultural
Publishing House, 92-101pp.
One master students of Food technology and Drinking.
6. Effects, technology transfer means and applicability
This supplied to the PhD Thesis in the filed of Microbiology.
The studied resutls can be applied in teaching and researching in the field of
biotechnology, microbiology and food technology & drinking.

Trang x

Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 2
2.1

PHẦN 1.

MỞ ĐẦU

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong vài thập kỷ trở lại đây,
các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong
các lĩnh vực kinh tế. Trong lĩnh vực chế biến thực phẩm, điều khiển hoạt động PME
đóng vai trò hết sức quan trọng, cụ thể là trong sản xuất nước quả citrus đục (Nath &
Ranganna, 1977), giúp tăng độ nhớt trong sản xuất nước quả và puree cà (Nath et al.,
1983), hoặc góp phần cải thiện cấu trúc và độ cứng chắc trong quá trình chế biến một
số loại rau quả (Pilnik & Voragen, 1993).
Hiện nay vi sinh vật là nguồn cung cấp enzyme chủ yếu do những ưu điểm như tốc độ
sinh sản nhanh, nguồn vật liệu rẻ tiền, dễ thu hồi, cùng lúc thu được nhiều loại
enzyme... (Favelar - Torres et al., 2006). Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy sinh enzyme
PME từ A. niger cũng như các loại vi sinh vật khác, sản phẩm thu được là một hỗn
hợp protein gồm rất nhiều enzyme. Hầu hết các enzyme pectinase thương mại được sử
dụng trong quá trình chế biến hiện nay đều là hỗn hợp pectin methylesterase, pectin
acetylesterase và rhamnogalacturonan acetylesterase; polygalacturonase,
rhamnogalacturonan hydrolase, và pectate lyase; pectin lyase và rhamnogalacturonan
lyase (Benen et al., 2003). Mặt khác, PME là enzyme khởi đầu cho quá trình thủy

phân pectin, tạo điều kiện cho các enzyme còn lại của hệ enzyme pectinase hoạt động.
Điều này gây khó khăn cho việc ứng dụng PME độc lập vào từng loại sản phẩm cụ thể
nhằm mang lại hiệu quả như mong muốn.
Do vậy, quá trình tinh sạch enzyme thô cần được tiến hành nhằm thu được enzyme
PME thuần nhất, có hoạt tính cao. Bên cạnh đó, đặc tính của enzyme và động học sự
vô hoạt enzyme cũng có vai trò đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng
enzyme.
2.2

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu đánh giá khả năng tinh sạch sơ bộ pectin
methylesterase từ A. niger, đồng thời xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của
enzyme thu được.
2.3

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

-

Đánh giá khả năng tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A. niger bằng phương pháp kết
tủa và lọc màng trước khi xác định các tính chất cơ bản.

-

Xác định hằng số Michaelis-Menten của enzyme PME từ A. niger.

Trang 0

Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

-

Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A. niger theo nhiệt độ và pH môi
trường.

-

Nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl và CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger.

2.4

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại từ 3 lần. Kết quả của các thí nghiệm so
sánh, chọn nghiệm thức tối ưu được thống kê và phân tích theo chương trình
Stagraphic 4.0. Các biến đổi động học được phân tích theo chương trình Prism 5.0.
Các kết quả được phân tích, đo đạc bằng các thiết bị hiện đại: điện di, máy quang phổ,
sử dụng phương pháp phân tích tin cậy.
2.5

ĐỐI TƯỢNG & PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài sẽ được tiến hành với enzyme pectin methylesterase (PME) đã được lên men
rắn từ Aspergillus niger, sử dụng bã táo ta. Enzyme PME sau khi trích ly từ nấm mốc
A. niger sẽ được kết tủa với dung dịch ethanol theo tỉ lệ 1 : 3 và ly tâm sau 2 giờ để
thu lấy phần kết tủa. Làm khô kết tủa trong tủ lạnh khoảng 1 ngày trước khi hòa tan

trong dung dịch đệm citrate/phosphate ở pH 4,5 để hòa tan kết tủa. Dựa trên nghiên
cứu đã thực hiện của nhóm tác giả và các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước có
liên quan đến đề tài, tiến hành thí nghiệm khảo sát đặc điểm enzyme.

Trang 1


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

PHẦN 2
CHƯƠNG 3
3.1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

GIỚI THIỆU VỀ PECTIN METHYLESTERASE

3.1.1 Khái quát chung
Enzyme pectin methylesterase (PME) còn được gọi là pectin esterase (PE), được đánh
số trong hệ thống phân loại là (EC 3.1.1.11). Enzyme PME thuộc nhóm enzyme
pectinase, nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân pectin. Enzyme PME chủ yếu thủy
phân trên các nhóm methylester nằm kề đơn vị không bị este hóa của D–galacturonan
tạo thành acid pectinic và methanol (Willats et al., 2001). Tuy nhiên, PME không thể
phản ứng trên các pectin ester hóa bởi nhóm ethyl, propyl hoặc methyl aginate.

Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin với xúc tác của enzyme PME
Nguồn: Rexova–Benkova et al., 1976

Hầu hết các PME nguồn gốc thực vật thủy phân liên kết ester của pectin từ đầu khử
hoặc đầu không khử, hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng
cơ chế chuỗi đơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Bởi vì hoạt động cần có nhóm carboxyl
tự do trên mạch galacturonic nên PME từ thực vật hoạt động kém trên các cơ chất
pectin có độ ester hóa cao hơn 20 30% (Willats et al., 2006). Ngược lại, PME từ nấm
mốc Aspergillus có thể thuỷ phân ngẫu nhiên các nhóm methylester trên chuỗi
D–galacturonan (Ishii et al., 1979; Limberg et al., 2000). Các pectin đã bị khử ester
hóa sẽ tạo gel khi có sự hiện diện của ion canxi giúp cho thành tế bào trở nên cứng
chắc hơn (Micheli, 2001).
3.1.2 Đặc tính sinh lý của enzyme PME
Enzyme PME có phân tử khối trung bình vào khoảng 25 ÷ 54 kDa và điểm đẳng điện
pI khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc sản xuất ra chúng (Benen et al., 2003). Hầu hết
PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài trường hợp có PME
có tính acid. Điểm đẳng điện của PME từ nấm mốc và từ cà chua lần lượt là 3,1 và 11
(Bordenave, 1996).

Trang 2


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

Việc xác định các tính chất đã cho thấy có sự khác biệt giữa PME từ thực vật và vi
sinh vật, thậm chí PME trích ly từ các bộ phận khác nhau, ở các giai đoạn phát triển
khác nhau của cây cũng khác nhau (Bordenave et al., 1993).
Nhìn chung, hoạt động của PME rất nhạy cảm đối với các yếu tố của môi trường như
nhiệt độ, pH, cation, anion,... Enzyme PME thường được hoạt hóa bởi các cation như
Na+, Ca2+ và Mg2+. Hầu hết PME thực vật có pH tối ưu từ 6 ÷ 8, trong khi giá trị pH
tối ưu của PME vi sinh vật nằm trong khoảng từ 4 ÷ 9 (Bordenave, 1996). Giá trị pH

tối thích cho hoạt động của enzyme PME cà chua là 8,0 trong khi đó giá trị 4,5 là pH
tối ưu cho hoạt động của PME từ Aspergillus (Duvetter, 2007).
3.1.3 Các nguồn enzyme PME tự nhiên
Enzyme PME được sinh tổng hợp từ hai nguồn chủ yếu là thực vật và vi sinh vật. Đối
với vi khuẩn thì không có sự đa dạng về PME ngoại trừ Erwinia chrysanthemi, một
PME duy nhất được tìm thấy trong tất cả các nghiên cứu trên vi khuẩn (Benen et al.,
2003).
(i)

Enzyme PME từ thực vật

PME hiện diện trong hầu hết cây ăn trái với hàm lượng khác nhau. Chúng thường nằm
trong vách tế bào và hàm lượng gia tăng khi trái bắt đầu chín. Các loại trái chứa PME
nhiều nhất là cà chua, cam, chuối, kiwi, táo… PME nội bào của thực vật có liên quan
đến sự thoái hóa của pectin trong suốt quá trình phát triển của cây (Bordenave, 1996).
Phối hợp với các enzyme pectinase khác, PME có tác dụng điều khiển sự thoái hóa
của pectin và sự mềm đi của mô thực vật trong quá trình chín. PME có ảnh hưởng đến
các quá trình sinh lý như tăng kích thước và năng suất của củ, sự phát triển của rễ và
sự mềm đi của trái (Smout et al., 2004).
Enzyme PME từ thực vật có khối lượng phân tử trong khoảng 21  57 kDa và pI
khoảng 9,0. Hầu hết PME từ thực vật hoạt động trong khoảng pH trung tính và nhiệt
độ tối ưu trong khoảng 55  60 oC (Ly Nguyen B., 2004) .
Đặc tính sinh hóa của PME sau tinh sạch từ thực vật được tóm tắt trong bảng 1.
PME thực vật thường tồn tại các dạng đồng phân. Thông thường, các dạng đồng phân
của chúng khác nhau ở điểm đẳng điện pI và khối lượng phân tử (Bordenave., 1996).
Mối quan hệ giữa tỷ lệ của các dạng đồng phân này có thể thay đổi tùy theo mức độ
tăng trưởng của trái và nguồn gốc PME (Bordenave et al., 1993). Cà chua có hai loại
đồng phân là PME1 và PME2, hàm lượng cả hai PME này đều tăng trong giai đoạn
trái bắt đầu chín nhưng ở giữa giai đoạn chín thì PME1 giảm xuống, PME2 tiếp tục
tăng đến cuối quá trình chín. Bên cạnh đó, hai dạng đồng phân của PME trong cam có

tính chất rất khác nhau, PME1 có pI là 10,05 và PME2 có pI >11. Các đồng phân

Trang 3


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

trong kiwi thì có cùng khối lượng phân tử, cùng pI nhưng lại khác nhau về tính bền
nhiệt (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Bảng 1: Đặc tính sinh hóa của một số enzyme PME sau tinh sạch từ thực vật

Nguồn PME
Cà chua
Cà chua
Cà chua
Carrot
Carrot
Cherry

Nho

Khối lượng phân tử (kDa)
23
23,8
24,2
35
34,2
25

27,2
55,9
55,9
55,9
36
53,5

pI
–
9,3
8,9
> 9,3
9,8
> 8,6
> 8,6
7,05
6,36
5,24
> 10
> 10

Đu đủ

53

–

Đu đủ

28

27

>9
>9

Nguồn tài liệu
Tucker et al., 1982
Pressey & Woods, 1992
Giovane et al., 1994
Markovic et al., 2002
Alonso et al., 2003
Alonso et al., 1996

Seymour et al., 1991b
Lourenco & Catutani,
1984
Lim & Chung, 1993

Nguồn: Duvetter, 2007

(ii)

Enzyme PME từ vi sinh vật

So với thực vật, vi sinh vật được sử dụng phổ biến hơn trong sản xuất các chế phẩm
pectinase thương mại. Các loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp PME gồm nấm mốc
và vi khuẩn.
Enzyme PME từ nấm mốc
Cũng như các enzyme pectinase khác, enzyme PME có thể được sản xuất từ nhiều loại
nấm mốc khác nhau như Aspergillus awamori, A. foetidus, A. niger, A. terrus, A.

saitoi, Penicillium glaucum, P. ehrlichii, P. chrysogenum, P. expanam, P. cilrimim,
Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizoctonia solani, Rhizopus stolonifer,
Trichoderma sp., Neurospora crassa, etc., nhưng Aspergillus là nguồn chủ yếu (Joshi
et al., 2006 ).
PME từ nấm mốc thường là các enzyme ngoại bào, hoạt động tối ưu trong khoảng
nhiệt độ 30 ÷ 45 ºC và bị vô hoạt ở nhiệt độ trên 55 ºC. PME từ các loài Aspergillus có
điểm đẳng điện và pH tối ưu trong vùng acid. Hoạt động của PME từ A. niger đạt tối
ưu ở pH 4,5 và nhiệt độ 40 ºC (Fawole, 2003). Trong khi pH tối ưu của enzyme PME
từ A. species là 3,7 ÷ 4,2 và enzyme PME từ A. sojae là 5,5. Riêng với enzyme PME

Trang 4


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

từ A. repens có nhiệt độ tối thích là 30 ºC và pH tối ưu là 6,5 (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
Enzyme PME từ vi khuẩn
Enzyme PME cũng có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi khuẩn khác nhau như
Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes...
Khác với enzyme PME từ nấm mốc, enzyme PME từ vi khuẩn không có tính acid mà
có tính hơi kiềm, pH tối ưu của chúng nằm trong khoảng 7  8 và hầu hết bị vô hoạt ở
85 oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004). PME từ vi khuẩn Erwinia chrysanthemi có pI là
9,64 (Đặng Thị Thu et al., 2004).
3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme PME
(i)

Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme PME

Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH của môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt
động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. Thông thường, ở pH tối
thích, enzyme có điện tích tổng cực tiểu nên pH tối thích khá gần với điểm đẳng điện
pI của enzyme (Đặng Thị Thu et al., 2004). Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH
môi trường vì pH có ảnh hưởng đến trạng thái ion hoá các gốc R của các acid amin
trong phân tử enzyme, ion hoá các nhóm chức trong trung tâm hoạt động và ion hoá
cơ chất. Do đó, pH ảnh hưởng đến cả hai tham số động học K m và Vmax của enzyme
(Phạm Thị Trân Châu & Phan Tuấn Nghĩa, 2007).
Enzyme PME từ các nguồn gốc khác nhau có pH tối thích khác nhau. Hầu hết các
PME thực vật có pH tối thích trong khoảng 6,0  8,0 (Ly Nguyen B., 2004) nhưng
PME từ vi sinh vật có pH tối thích từ 4,0 đến 9,0 (Bordenave, 1996). Enzyme PME từ
cà chua có pH tối thích là 8,0. Trong khi đó, pH tối thích của PME từ Aspergillus là
4,5 (Duvetter, 2007).
(ii)

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme PME

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Cũng như các phản ứng hoá học
thông thường, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, do enzyme
có bản chất là protein nên dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao. Do đó, tốc độ phản ứng chỉ
tăng đến một giới hạn cao nhất gọi là nhiệt độ tối thích. Vượt quá nhiệt độ này, tốc độ
phản ứng enzyme sẽ giảm dần đến mức triệt tiêu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh
nhất ở nhiệt độ 40 ÷ 50 °C và bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70 °C (Lê Ngọc Tú,
2004). Tuy nhiên, nhiệt độ tối thích của enzyme còn phụ thuộc nhiều vào sự có mặt
của cơ chất, các ion kim loại, pH (Lê Ngọc Tú, 2004).
Giống như các phản ứng của enzyme khác, tốc độ của phản ứng phân giải pectin do
enzyme PME sẽ gia tăng cùng với sự gia tăng nhiệt độ đến nhiệt độ tối thích. Nhiệt độ

Trang 5

Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

tối thích cho hoạt động của enzyme PME dao động trong khoảng từ 45 ÷ 55 oC và bị
vô hoạt ở 55 ÷ 62 °C, phụ thuộc vào nguồn enzyme (Sila et al., 2003).
(iii)

Ảnh hưởng của các ion đến hoạt tính của enzyme PME

Enzyme thường được hoạt hóa bởi các cation Na+, K+, Ca2+, Mg2+ và Zn2+ (Arotupin et
al., 2008). Theo Nari et al., (1991), hoạt động của PME tăng cùng với sự tăng nồng độ
ion kim loại và đạt đến nồng độ tối thích, ở trên nồng độ này hoạt động của PME
thường giảm. Trong phản ứng khử ester hóa xúc tác bởi PME thực vật, ion kim loại
thúc đẩy cho phản ứng thủy phân xảy ra nhanh hơn. Ion kim loại phản ứng với nhóm
mang điện tích âm (nhóm carboxyl) cho phép enzyme phản ứng trên liên kết ester và
cắt đứt liên kết này. Ở nồng độ cao, ion kim loại ức chế hoạt động của enzyme. Điều
này được giải thích dựa trên nhóm carboxyl kế cận liên kết ester được giải phóng cho
phép phản ứng tiếp diễn nhưng những nhóm này có thể bị khóa bởi ion kim loại làm
cho enzyme không thể tiếp tục xúc tác (Nari et al., 1991).
Với NaCl, nồng độ tối ưu cho hoạt động PME là 0,2M. Theo Leiting & Wicker,
(1997) ở cùng mức độ ion hóa, khả năng hoạt hóa PME của những cation hóa trị II là
khác nhau. Hiệu ứng của cation hóa trị II trên hoạt động của PME xuất hiện phức tạp
hơn so với ion hóa trị I. Trong số những ion hoá trị II, calcium là một trong những ion
quan trọng nhất. Ở nồng độ thấp (5  25 nM), calcium tăng khả năng hoạt động của
PME. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, calcium làm giảm tốc độ phản ứng của PME do có sự
hình thành gel calcium–pectate (Leiting & Wicker, 1997). Đối với nấm mốc Vigra
radiata, magnesium là chất hoạt hóa mạnh hơn calcium. Magnesium có khả năng cân

bằng hoạt tính PME tự do và PME cố định, trong khi calcium chỉ kích hoạt enzyme cố
định (Bordenave et al., 1993). Bên cạnh đó, anion cũng có khả năng kích hoạt enzyme
dựa vào tác dụng hạ pH tối thích của enzyme xuống giá trị acid (Moustacas et al.,
1991).
(iv)

Ảnh hưởng của chất ức chế enzyme (PMEI) đến hoạt tính của PME

Chất ức chế glycoprotein của PME (PMEI) có thể được trích ly từ trái kiwi. PMEI có
thể phản ứng cạnh tranh và ngăn cản hoạt động của PME thực vật. Nhờ khả năng ức
chế của PMEI đối với PME thực vật, việc tinh sạch và cô đặc PME thực vật có thể
được tiến hành theo phương pháp sắc ký ái lực (Laratta et al., 1995; Ly Nguyen B.,
2004). Trong khi đó, việc tinh sạch PME vi sinh vật cần phải sử dụng một quy trình
hoàn toàn khác biệt và phức tạp hơn. PMEI được xác định không ảnh hưởng đến hoạt
tính của PME từ vi sinh vật (Laratta et al., 1995, Ly Nguyen B., 2004). Tuy nhiên,
catechin từ trà xanh cũng được chứng tỏ là chất có khả năng ức chế hoạt động của
PME (Lewis, 2008). Đây cũng là một thông tin hữu ích trợ giúp cho việc tìm ra
phương thức phù hợp cho việc tinh sạch enzyme PME đạt hiệu quả cao nhất.

Trang 6


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

3.1.5 Ứng dụng của enzyme PME trong chế biến thực phẩm
(i)

Cải thiện cấu trúc

Enzyme PME có vai trò quan trọng trong việc cải thiện cấu trúc cho các sản phẩm rau
cải muối chua, trái cây đóng hộp. Enzyme PME xúc tác thuỷ phân các liên kết ester
của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca 2+ tạo cấu trúc theo mong muốn
(Duvetter, 2007).

Hình 2: Phức hợp pectate calcium
Nguồn: Liners et al., 1992

Việc ứng dụng enzyme PME vào chế biến thực phẩm có thể thực hiện bằng cách kích
hoạt enzyme nội bào hoặc bổ sung enzyme ngoại bào. Enzyme PME của carrot có thể
được kích hoạt ở 60 ºC trong 40 phút hay 70 ºC trong 30 phút. Do đó, độ cứng của
carrot được duy trì khi tiền xử lý nhiệt kết hợp với ngâm trong dung dịch CaCl 2 nồng
độ 0,5% (Smout et al., 2004). Độ cứng của bí đỏ cũng được cải thiện khi chần một
phút trong dung dịch CaCl2 nồng độ 2,5% ở 40ºC (Luna et al., 1999). Tuy nhiên, một
số loại rau quả chứa rất ít PME nội bào, đồng thời việc tiền xử lý ở nhiệt độ
(50 ÷ 70ºC) có thể làm hoạt hóa một số loại enzyme không muốn. Vì vậy, nhiều
phương pháp khác nhau được đề nghị bổ sung enzyme vào mô thực vật ở trạng thái
nguyên vẹn (Baker & Wicker, 1996). Phương thức bổ sung đơn giản nhất là phương
pháp ngâm thông thường. Quá trình này thường xảy ra chậm và sự thấm enzyme vào
mô chỉ giới hạn ở bề mặt. Ngâm dưới áp lực trực tiếp hoặc trong chân không đã được
áp dụng thành công đối với việc bổ sung PME ngoại bào vào mô tế bào quả dâu tây và
một số loại trái cây khác (Duvetter, 2007).
(ii)

Trích ly dịch quả

Pectin là thành phần quan trọng trong cấu tạo vách tế bào. Quá trình trích ly dịch quả
có thể gặp khó khăn do pectin tạo độ nhớt cao, thành tế bào vững chắc ngăn cản dịch
bào thoát ra ngoài. Vì vậy, hiệu quả trích ly có thể được cải thiện khi sử dụng hệ

enzyme pectinase. Trong đó, enzyme PME xúc tác thuỷ phân các liên kết ester tạo

Trang 7


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

điều kiện cho enzyme PG và PL phân cắt pectin. Quá trình này thường kết hợp với
việc sử dụng enzyme cellulase để cho hiệu quả tối ưu (Tucker et al., 1993).
(iii)

Làm trong nước quả

Một trong những vấn đề quan trọng trong việc sản xuất nước quả là tránh được sự vẩn
đục của sản phẩm. Khi ép dịch quả, một lượng lớn protopectin sẽ theo dịch quả, gây
đục và tăng độ nhớt sản phẩm. Phức hệ protopectin gồm protein mang điện dương và
lớp vỏ pectin mang điện âm. Do lớp vỏ ngoài tích điện cùng dấu nên chúng đẩy nhau
và ở trạng thái lơ lửng, gây vẩn đục. Khi xử lý với hệ enzyme pectinase, lớp vỏ pectin
sẽ bị phân cắt làm cho các protein lộ ra. Khi đó, các phân tử protopectin sẽ hút nhau
và kết tủa (Bali, 2003). Ishii et al., (1972, trích dẫn bởi Ishii et al., 1979) đã thử
nghiệm và cho thấy hiệu quả tương tự khi ứng dụng xử lý làm trong nước táo bằng
cách kết hợp PME với PG (polygalacturonase) hoặc sử dụng PL (pectat lyase) độc lập.
Tuy nhiên, đến năm 1973, Ishii et al. lại cho thấy việc sử dụng PL độc lập không hiệu
quả bằng việc kết hợp PME và PG (Ishii et al., 1979)

Hình 3: Tác dụng của enzyme PME trong quá trình làm trong nước quả
Nguồn: Ishii et al., 1979

(iv)

Một số ứng dụng khác

Ngoài lĩnh vực chế biến nước quả, pectinase từ vi sinh vật còn có nhiều triển vọng
trong công nghiệp chế biến ca cao và cà phê. Khi xử lý bằng hệ enzyme pectinase
trong quá trình lên men ca cao và cà phê, lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bị
phân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khô.
Ngoài ra, hệ enzyme pectinase còn được ứng dụng trong việc tạo hương vị đặc trưng
cho sản phẩm rượu do sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc trong
nguyên liệu (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Trang 8


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

3.2

Trường Đại học Cần Thơ

CƠ SỞ CỦA VIỆC THU NHẬN ENZYME TỪ ASPERGILLUS NIGER

Aspergillus niger được biết đến như loại nấm mốc có màu đen (Abarca et al., 2004),
thuộc nhóm sinh sản vô tính. Loại nấm mốc này thường thấy trong quá trình thu hoạch
và bảo quản các loại thực phẩm như đậu phộng, bắp, táo, lê, đào, nho, dâu tây, cà chua
và dưa (Pitt & Hocking, 1997).

Hình 4: Nấm mốc A. niger
Nguồn: />

Aspergillus niger được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme (như
–galactosidases, lipases, proteases, hemicellulases, cellulases và pectinases) và acid
hữu cơ. Trong công nghiệp thực phẩm, A. niger đã được ứng dụng hơn mười thập kỷ
qua mà không có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người (Schuster et al., 2002).
Thêm vào đó, sản phẩm từ A. niger cũng được Viện nghiên cứu thực phẩm và dược
phẩm của Mỹ (FDA) chứng nhận là sản phẩm an toàn (GRAS) (Abarca et al., 2004).
PME từ A. niger đã được sản xuất thương mại ở Công ty DSM Food Specialties,
Seclin, Pháp (Degraeve et al., 2003).
Sản xuất enzyme từ A. niger có thể được thực hiện trên rất nhiều cơ chất khác nhau
theo phương pháp lên men trạng thái rắn hay lỏng. Cơ chất thường được sử dụng cho
quá trình lên men sinh enzyme là các nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật như ngũ
cốc, gạo, bắp, thực vật thân củ, cây họ đậu, các nguồn nguyên liệu giàu protein, lipid
hoặc các phụ phẩm nông nghiệp (Ashok P. et al., 2002). Tuy nhiên, một số các nghiên
cứu gần đây cho thấy, có thể ly trích PME hay các pectinase khác từ nấm mốc trên các
cơ chất giàu pectin như bã táo (Joshi et al., 2006), vỏ cam (Hamdy, 2005).
A. niger sản xuất nhiều loại enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân tử
pectin như pectin methylesterase (EC 3.1.1.11), pectin acetylesterase (EC 3.1.1.6),
endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15), exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67), pectate
lyase (EC 4.2.2.2) và pectin lyase (EC 4.2.2.10). Hoạt động của pectin methylesterase
cần thiết để tạo ra pectin có độ methyl ester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho

Trang 9


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

polygalacturonases và pectate lyase. Trong khi đó pectin lyase có thể sử dụng cơ chất
có độ methyl ester bất kỳ. Hệ enzyme pectinase từ A. niger có nhiều ứng dụng trong

công nghiệp thực phẩm và thức uống. Tuy nhiên, các enzyme này thường ở dạng hỗn
hợp sau khi trích ly, gây khó khăn trong việc ứng dụng. Chính vì thế, quá trình tinh
sạch nhằm loại bỏ các hệ enzyme khác, thu được enzyme PME thuần nhất đóng vai
trò rất quan trọng.
3.3

CÁC BIỆN PHÁP TINH SẠCH PECTIN METHYLESTERASE

Việc tinh sạch enzyme PME có thể thực hiện theo nhiều phương pháp khác nhau. Phổ
biến nhất là phương pháp kết tủa, sắc ký lỏng (sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực, sắc ký
lọc gel) (Ishii et al., 1979) hay ức chế chọn lọc pectin polymerase (sốc nhiệt, thay đổi
pH hay sử dụng chất hóa học) (Schmitz, 2002).
3.3.1 Tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A. niger bằng phương pháp kết tủa
Phương pháp kết tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh
học, đặc biệt là các phân tử có bản chất protein như enzyme. Cấu tạo phân tử enzyme
rất phức tạp, chúng có cả những nhóm kỵ nước và ưa nước nên tính tan phụ thuộc vào
sự phân bố của các nhóm này trên bề mặt.
Có thể dùng nhiều cách khác nhau để tủa enzyme như tủa bằng muối, bằng các dung
môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa enzyme. Các dung môi hoặc các
hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn enzyme nên có thể lôi kéo nước ra khỏi
phân tử enzyme, làm cho chúng mất lớp áo nước và tủa xuống.
Hỗn hợp enzyme thô thu được sau khi nuôi cấy nấm mốc A. niger được loại bỏ một
phần tạp chất bằng phương pháp tủa. Kết tủa được xem như là bước đầu tiên trong qui
trình tinh sạch enzyme thô. Sau khi tủa, tiến hành ly tâm hoặc lọc hỗn hợp lỏng–rắn
thu được phần rắn. Tiếp theo là hoà tan phần rắn bằng nước hoặc dung dịch đệm. Sau
đó là khử muối nếu cần thiết (Harris, 1995).
Kết tủa bằng muối ammonium sulfate
Ammonium sulfate thường được sử dụng để tủa enzyme ở bước đầu trong quy trình
tách chiết và tinh sạch. Ở trạng thái bình thường, các nhóm mang điện tích trên bề mặt
enzyme sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh qua liên kết hydro tạo lớp áo nước

quanh phân tử. Khi thêm muối ammonium sulfate vào với nồng độ cao, các phân tử
muối sẽ phân ly thành các ion, các ion này liên kết với các phân tử nước làm cho
enzyme mất lớp áo nước, liên kết lại với nhau và tủa xuống (Banerjee, 2006).
Các loại muối thường được dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4. Nhiều nghiên cứu
cho thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì có khả năng ổn định hầu hết các loại enzyme.
Có thể dùng muối (NH4)2SO4 dạng rắn hoặc dạng dung dịch bão hòa.

Trang 10


Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường

Trường Đại học Cần Thơ

Phương pháp này cũng được sử dụng để kết tủa và thu phân đoạn các enzyme trong
hỗn hợp dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở
một nồng độ muối khác nhau.
Enzyme được kết tủa bằng muối ít bị biến tính nhưng cần phải tiến hành thêm bước
thẩm tích để loại muối ra khỏi dung dịch trước khi tiến hành sắc ký.
Túi thẩm tích là một màng bán thấm, có những lỗ nhỏ cho phép các phân tử nhỏ đi
qua trong khi các phân tử lớn như enzyme được giữ lại (hình 5). Khi đặt trong môi
trường có nồng độ muối thấp hay không có muối, muối từ trong túi sẽ khuếch tán ra
bên ngoài để cân bằng nồng độ, lặp lại nhiều lần muối sẽ được loại khỏi enzyme. Thời
gian thẩm tích thường là 24 đến 28 giờ (Đỗ Quý Hai, 2005).

Hình 5: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein
Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2005

Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở độ hòa tan của protein phụ thuộc vào

sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử enzyme với các phân tử nước.
Khả năng hydrate hóa của enzyme sẽ bị giảm khi thêm vào dung dịch các dung môi
hữu cơ, các phân tử enzyme liên kết lại với nhau và kết tủa xuống. Dung môi hữu cơ
thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu.
Ở phương pháp này cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5 oC trở xuống) nhằm
tránh gây biến tính enzyme. Có thể dùng các dung môi hữu cơ này để tách phân đoạn
enzyme dưới 0 oC, như vậy sẽ có tác dụng tốt đến độ ổn định của enzyme.
Khi đã có kết tủa, phải tách nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng máy li tâm. Phương
pháp này có ưu điểm là không cần loại muối, các dung môi hữu cơ có nhiệt độ bay hơi
thấp nên dễ dàng tách khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ nhưng nhược điểm là hay có
màu (Lương Đức Phẩm, 2004).

Trang 11