Nghiên cứu một số phương pháp sàng lọc một số chất dị nguyên trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SÀNG
LỌC MỘT SỐ CHẤT DỊ NGUYÊN
TRONG THỰC PHẨM BẰNG SẮC KÝ
LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU
Mã sinh viên: 1401592

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SÀNG
LỌC MỘT SỐ CHẤT DỊ NGUYÊN
TRONG THỰC PHẨM BẰNG SẮC KÝ
LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Cao Sơn
2. TS. Đặng Thị Ngọc Lan
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất

2. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm an toàn
vệ sinh thực phẩm Quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn TS. Trần Cao Sơn
và TS. Đặng Thị Ngọc Lan đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và góp ý, giúp đỡ
em thực hiện khóa luận này.
Em xin cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Hà Bình đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp
đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận.
Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Hóa phân tích và Độc chất,
trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, cung cấp cho em những kiến thức cần
thiết, bổ ích và quan trọng.
Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm Quốc gia, TS. Trần Cao Sơn cùng các cán bộ khoa Độc học và Dị
nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện
giúp em thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên
quan tâm, động viên em trong suốt quá trình vừa qua.
Trong quá trình thực hiện đề tài do trình độ lý luận và thực tiễn còn hạn
chế, đề tài không thể tránh khỏi có những sai sót, mong nhận được sự góp ý của
quý thầy cô và các bạn sinh viên.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 17 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Thu

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ........................................................ vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 2
1.1. Giới thiệu về dị ứng và dị nguyên ............................................................... 2
1.1.1. Cơ chế dị ứng ........................................................................................ 2
1.1.2. Dị nguyên .............................................................................................. 2
1.2. Tổng quan về dị ứng thực phẩm ................................................................. 5
1.2.1. Thực phẩm gây dị ứng .......................................................................... 5
1.2.2. Các quy định hiện hành về dị nguyên ................................................... 7
1.3. Phương pháp xác định dị nguyên ................................................................ 8
1.3.1. Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ..................................................... 8
1.3.2. Phương pháp phân tích DNA ................................................................ 9
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ..................................................... 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 15
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................ 15
2.2.1. Thiết bị ................................................................................................ 15
2.2.2. Dụng cụ ............................................................................................... 16
2.2.3. Hóa chất .............................................................................................. 16
2.2.4. Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử, dung môi ..................................... 16
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 17

2.3.1. Xây dựng phương pháp sàng lọc đồng thời một số dị nguyên trong
thực phẩm bằng LC-MS/MS......................................................................... 17
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ..................................................... 18
2.3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích để sàng lọc một số dị nguyên trong
mẫu thực phẩm .............................................................................................. 18
2.4. Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 18
ii


2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu ...................................................................... 18
2.4.2. Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần ................ 20
2.4.3. Phương pháp thẩm định ...................................................................... 21
2.4.4. Phương pháp xử lý kết quả ................................................................. 21
2.4.5. Phương pháp lấy mẫu ......................................................................... 21
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................... 22
3.1. Xây dựng phương pháp sàng lọc đồng thời một số dị nguyên trong thực
phẩm bằng LC-MS/MS .................................................................................... 22
3.1.1. Khảo sát điều kiện phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần ........ 22
3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ............................................................. 26
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ........................................................... 31
3.2.1. Tính đặc hiệu....................................................................................... 31
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) ................................................................... 33
3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích để sàng lọc một số dị nguyên trong mẫu
thực phẩm ......................................................................................................... 36
3.4. Bàn luận .................................................................................................... 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 40
Kết luận ............................................................................................................ 40
Kiến nghị .......................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................
PHỤ LỤC ..........................................................................................................PL1

iii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

AOAC

Association of Official
Analytical Communities

Hiệp hội các cộng đồng
phân tích chính thức

DNA

Deoxyribonucleic acid

Acid Deoxyribonucleic

DTT

Dithiothreitol

Dithiothreitol

ELISA

Enzyme-linked Immune-sorbent Xét nghiệm miễn dịch liên
Assay
kết enzym

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IA

Iodoacetamide

Iodoacetamid

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandem
mass spectrometry

Sắc ký lỏng khối phổ hai
lần

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

MRM

Multi reaction monitoring

Kiểm soát đa phản ứng

OGS

Octyl β-D-glucopyranoside

Octyl β-D-glucopyranosid

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi polymer
Tài liệu tham khảo

TLTK

TOF

Time of flight

Thời gian bay

TRIS

Tris (hydroxymethyl)
aminomethane

Tris (hydroxymethyl)
aminomethan

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu xác định dị nguyên bằng ELISA ........................... 9
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu xác định dị nguyên bằng phương pháp PCR ....... 10
Bảng 1.3. Các protein và peptid đặc trưng của một số dị nguyên ...................... 12
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu xác định dị nguyên sử dụng hệ LC-MS/MS ........ 14
Bảng 2.1. Các dị nguyên thực phẩm và protein đặc trưng tương ứng ................ 15
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ion mẹ và ion con của từng protein ....................... 22
Bảng 3.2. Các thông số đã được khảo sát của MS .............................................. 23
Bảng 3.3. Chương trình gradient pha động ......................................................... 24
Bảng 3.4. Kết quả xác định nồng độ protein hòa tan .......................................... 27
Bảng 3.5. Thời gian lưu mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của các peptid............ 32
Bảng 3.6. Tỷ lệ ion đặc trưng của các dị nguyên ................................................ 33
Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện của các dị nguyên ................................................. 33

Bảng 3.8. Kết quả phân tích mẫu thực ................................................................ 36

v


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cơ chế gây dị ứng ................................................................................. 2
Hình 1.2. Phân loại dị nguyên ngoại sinh ............................................................. 3
Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu dự kiến ban đầu ................................................. 19
Hình 3.1. Sắc đồ của từng dị nguyên .................................................................. 25
Hình 3.2. Sắc đồ tổng của các dị nguyên ............................................................ 26
Hình 3.3. Quy trình chiết xuất protein dự kiến ban đầu..................................... 26
Hình 3.4. Kết quả khảo sát nồng độ trypsin ........................................................ 28
Hình 3.5. Kết quả khảo sát thời gian thủy phân .................................................. 29
Hình 3.6. Quy trình xử lý mẫu ............................................................................ 30
Hình 3.7. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn của casein α S1 ....... 31
Hình 3.8. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn của trứng................. 31
Hình 3.9. Sắc đồ của casein α S1(634,3/249,2) trong sữa tại 3 µg/g .................. 34
Hình 3.10. Sắc đồ của ovalbumin (673,4/223,2) trong trứng tại 20 µg/g ........... 34
Hình 3.11. Sắc đồ của Ara h1 (688,8/300,2) trong lạc tại 5 µg/g ....................... 35
Hình 3.12. Sắc đồ của Jug r1 (688,2/477,2) trong hạt óc chó tại 10 µg/g .......... 35
Hình 3.13. Sắc đồ của glycinin (575,2/219,2) trong hạt đậu tương tại 10 µg/g . 35

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, dị ứng thực phẩm đang là mối quan tâm lớn của toàn thế giới. Theo
một số nghiên cứu ở Mỹ và Châu Âu, tỷ lệ dị ứng thực phẩm ở người lớn là 2%,
ở trẻ nhỏ là 8% và có xu hướng ngày càng gia tăng [10], [23]. Ở nước ta, cho tới

nay chưa có số liệu thống kê chính xác, nhưng tình trạng dị ứng thực phẩm cũng
là một trong các vấn đề thường gặp, đặc biệt là ở trẻ em. Phản ứng dị ứng thường
xuất hiện ngay sau khi ăn thực phẩm gây dị ứng, chỉ với một lượng rất nhỏ dị
nguyên đã có thể gây ra các triệu chứng dị ứng trên các hệ cơ quan như da (viêm
da dị ứng, phù mạch, mề đay,...), hệ tiêu hóa (nôn, đau bụng, tiêu chảy,...), hệ hô
hấp (thở khò khè, khó thở, viêm họng cấp...), sốc phản vệ và tử vong.
Theo FDA, có tám nhóm thực phẩm gây dị ứng chính gồm sữa, trứng, lạc,
đậu tương, hạt cây, cá, động vật giáp xác và lúa mì. Năm dị nguyên: sữa, trứng,
hạt lạc, đậu tương và óc chó thuộc tám nhóm dị nguyên thực phẩm gây dị ứng phổ
biến nhất và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây sốc phản vệ do dị ứng thực phẩm.
Các dị nguyên này có khả năng nhiễm chéo cao trong sản xuất, chỉ với lượng nhỏ
dị nguyên đã có thể gây phản ứng dị ứng nghiêm trọng cho người sử dụng, thậm
chí là tử vong. Do đó việc xác định sự có mặt các dị nguyên trong thực phẩm là
rất cần thiết, đặc biệt là thực phẩm dành cho trẻ em bởi đây là đối tượng ở độ tuổi
có tỉ lệ dị ứng thực phẩm lớn nhất.
Ở Mỹ và châu Âu, hiện đã có những quy định chặt chẽ về ghi nhãn thực
phẩm gây dị ứng [23], [30]. Tại Việt Nam, hiện nay chưa có quy định cụ thể về
giới hạn dị nguyên cũng như chưa có phương pháp chính thức để xác định dị
nguyên trong thực phẩm. Do đó, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc một số chất dị
nguyên trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần” đã được thực hiện
với hai mục tiêu như sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp sàng lọc một số dị nguyên trong
thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần.
2. Ứng dụng phương pháp phân tích sàng lọc sự có mặt của dị nguyên trong
một số sản phẩm thực phẩm bao gồm sữa, bánh kẹo, thực phẩm bổ sung dạng
bánh cho trẻ em.
1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về dị ứng và dị nguyên
1.1.1. Cơ chế dị ứng
Bệnh dị ứng phát sinh là kết quả của phản ứng miễn dịch bất thường chống
lại protein trong môi trường (kháng nguyên). Mặc dù mọi người đều thường xuyên
tiếp xúc với các kháng nguyên, nhưng chỉ một phần nhỏ nhất định các cá nhân
xảy ra các phản ứng miễn dịch bất lợi đối với các kháng nguyên này [38]. Lần đầu
tiên tiếp xúc với dị nguyên, hệ thống miễn dịch của cơ thể sẽ tạo ra kháng thể IgE
đặc hiệu chống lại kháng nguyên. Khi phơi nhiễm với loại kháng nguyên đó lần
nữa, nó sẽ kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể sản sinh ra lượng lớn IgE và
các chất trung gian hóa học, đặc biệt là histamin, gây ra các phản ứng dị ứng đặc
trưng [17], [22]. Hình 1.1 mô tả tóm tắt cơ chế gây dị ứng.

Hình 1.1. Cơ chế gây dị ứng
1.1.2. Dị nguyên
1.1.2.1. Định nghĩa
Dị nguyên là những chất có tính kháng nguyên, khi đi vào cơ thể, chúng kích
thích cơ thể sinh ra các kháng thể như IgE, IgG, IgM ở những bệnh nhân có yếu
tố di truyền, cơ địa dị ứng [1].

2


Hầu hết các dị nguyên là các protein hoặc glycoprotein. Phân tử lượng của
các dị nguyên thường trong khoảng từ 5 đến 70 kDa, tuy nhiên, cũng có những dị
nguyên có khối lượng phân tử lớn hơn 200 kDa [23].
1.1.2.2. Phân loại dị nguyên
Có nhiều cách phân loại dị nguyên như phân loại theo nguồn gốc, phân loại
theo cấu trúc hóa học, phân loại theo đặc tính miễn dịch… Phân loại dị nguyên
theo nguồn gốc chia dị nguyên thành hai nhóm lớn là dị nguyên nội sinh (dị
nguyên tự sinh ra trong cơ thể) và dị nguyên ngoại sinh (dị nguyên lọt từ môi

trường ngoài vào cơ thể). Loại dị nguyên gây dị ứng chủ yếu là dị nguyên ngoại
sinh, dị nguyên ngoại sinh được phân chia thành các nhóm như hình 1.2. Theo
cách phân loại này, thực phẩm là nhóm dị nguyên gây dị ứng phổ biến nhất [8].
Dị nguyên ngoại sinh

Không nhiễm trùng

Bụi nhà,
đường phố

Hóa chất

Phấn hoa

Nhiễm trùng

Thuốc

Biểu bì,
lông súc vật

Thực phẩm

Nguồn gốc
động vật

Vi khuẩn

Virus

Nấm

Nguồn gốc
thực vật

Hình 1.2. Phân loại dị nguyên ngoại sinh
Phân loại theo cấu trúc hóa học, dị nguyên có thể là các protein hoặc phức
hợp của protein với polysaccharid, lipid, hóa chất đơn giản; phức hợp của
polysaccharid với lipid. Protein là loại dị nguyên phổ biến nhất trong tự nhiên và
có tính kháng nguyên mạnh nhất [27].
Theo đặc tính miễn dịch, có thể phân loại các dị nguyên (kháng nguyên)
thành hai nhóm là kháng nguyên hoàn toàn (complete antigen) và kháng nguyên
không hoàn toàn (hapten). Kháng nguyên hoàn toàn là những kháng nguyên có
khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với kháng thể, gồm
các phức hợp protid, phần lớn protein của người, động vật, một vài loại
3


polysaccharid. Các hapten không có khả năng kích thích sinh kháng thể nhưng
khi gặp kháng thể thì kết hợp đặc hiệu, thường là acid nucleic, lipid hoặc
polysaccharid, các hóa chất đơn giản [1].
1.1.2.3. Đặc điểm của dị nguyên
Dị nguyên có hai đặc điểm chính, đó là tính đặc hiệu và tính sinh kháng thể
(tính kháng nguyên) [1], [8].
 Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của dị nguyên được thể hiện bởi sự kết hợp đặc hiệu của dị
nguyên với kháng thể tương ứng. Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, kháng thể
đặc hiệu là các imunoglobulin như IgE, IgG, IgM. Trong đáp ứng miễn dịch qua
trung gian tế bào, các kháng thể đặc hiệu bám trên bề mặt tế bào lympho T. Tính
đặc hiệu của kháng nguyên thường rất nghiêm ngặt, một kháng thể thường chỉ gắn

đặc hiệu với một dị nguyên. Nhưng đôi khi cũng xảy ra trường hợp dị ứng chéo,
một kháng thể có thể gắn với nhiều dị nguyên khác nhau.
 Tính kháng nguyên
Là khả năng kích thích hệ thống đáp ứng miễn dịch của cơ thể sản xuất kháng
thể. Tính kháng nguyên của dị nguyên phụ thuộc vào một số điều kiện:
- Có bản chất “lạ” đối với cơ thể: Phân tử dị nguyên không được giống bất
cứ thành phần nào của cơ thể. Đây là điều kiện tuyệt đối cần thiết đối với
dị nguyên.
- Phân tử lượng của dị nguyên phải lớn: Các chất có phân tử lượng nhỏ không
có tính kháng nguyên. Những chất có phân tử lượng càng lớn (hơn 600.000
Da), cấu trúc hoá học càng phức tạp thì tính kháng nguyên càng mạnh. Tuy
nhiên, một số hóa chất có khối lượng phân tử nhỏ (formol, clorid picrin,…)
vẫn có tính kháng nguyên do các chất này làm biến đổi protein của cơ thể
tạo ra các protein có tính kháng nguyên đầy đủ.
- Bản chất và cấu trúc hóa học của dị nguyên: hầu hết các protein đều có tính
kháng nguyên mạnh. Tính kháng nguyên của protein phụ thuộc vào cấu trúc
hóa học, vị trí các nhóm chức đính trong phân tử protein. Các protein nguồn
gốc thực vật (phấn hoa, các loại hạt, trái cây,…) là những dị nguyên mạnh.
4


Dị nguyên có cấu trúc hóa học là polysaccharid, lipid, acid nucleic đa số có
tính kháng nguyên yếu.
- Đường vào của kháng nguyên, yếu tố cơ địa.
1.2. Tổng quan về dị ứng thực phẩm
1.2.1. Thực phẩm gây dị ứng
Theo Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), có hơn 160 loại
thực phẩm có khả năng gây ra phản ứng dị ứng, trong đó có 8 nhóm thực phẩm
chính gây dị ứng là sữa, trứng, cá, động vật giáp xác, hạt cây, lúa mì, đậu phộng,
đậu nành. Theo các nghiên cứu, có khoảng gần 90% các trường hợp dị ứng được

gây ra bởi 8 nhóm thực phẩm trên [31].
1.2.1.1. Sữa
Sữa là nguyên nhân gây dị ứng đầu tiên và phổ biến nhất ở trẻ nhỏ. Có khoảng
0,6% đến 3% trẻ em dưới 6 tuổi, 0,3% trẻ lớn và dưới 0,5% người lớn bị dị ứng
sữa bò, loại dị ứng sữa phổ biến nhất [30]. Trong dị ứng sữa, các triệu chứng điển
hình xuất hiện ngay lập tức hoặc trong vòng 2 giờ sau khi uống sữa bao gồm biểu
hiện trên da, hệ hô hấp và đường tiêu hóa. Trường hợp dị ứng nặng có thể gây sốc
phản vệ, dẫn đến nguy cơ tử vong cao. Dị ứng sữa là dị ứng thực phẩm phổ biến
thứ ba gây ra phản ứng phản vệ, chỉ sau lạc và hạt cây, chiếm khoảng 10% đến
19% của tất cả các trường hợp sốc phản vệ do thực phẩm [19], [31].
Dị ứng sữa liên quan tới phản ứng miễn dịch dịch thể qua IgE chống lại một
trong hai hoặc cả hai protein của sữa là casein và protein huyết thanh (whey
protein) [19], [31]. Casein là thành phần chính của protein sữa (80%), gồm 4 loại
αS1-, αS2-, β- và κ-casein. Các casein liên kết với nhau tạo thành micell casein.
Cấu trúc micell gồm phần kỵ nước ở trung tâm và phần thân nước bên ngoài chứa
các vị trí phosphoryl hóa [19].
1.2.1.2. Trứng
Tỉ lệ dị ứng với trứng chiếm khoảng 1,6% đến 3,2% trẻ em, do đó dị ứng với
trứng là tình trạng dị ứng phổ biến thứ hai ở trẻ em. Triệu chứng thường gặp nhất
của dị ứng trứng là viêm da dị ứng, nổi mề đay, đau bụng, tiêu chảy, trường hợp

5


dị ứng nặng cũng có thể gây sốc phản vệ. Thành phần gây dị ứng của trứng chủ
yếu là các protein có trong lòng trắng trứng như ovalbumin, ovomucoid, lysozym
và ovotransferrin, tuy nhiên protein có trong lòng đỏ trứng cũng có khả năng gây
dị ứng ở mức độ thấp như R-livetin [18].
Ovalbumin là thành phần chính của protein lòng trắng trứng, chiếm 55%
protein. Protein ovalbumin của trứng gà bao gồm 385 axit amin, khối lượng phân

tử tương đối của nó là 42,7 kDa và nó có cấu trúc giống như serpin [18].
1.2.1.3. Lạc
Lạc là một nguyên nhân chính gây nên các phản ứng dị ứng nghiêm trọng cả
ở người lớn và trẻ em. Một số khảo sát tại Hoa Kỳ cho thấy có khoảng 0,7 % trẻ
em bị dị ứng với lạc. Người bệnh dị ứng với lạc thường có phản ứng đầu tiên ở
độ tuổi trung bình là 22 tháng tuổi [5]. Không như dị ứng trứng hay sữa, dị ứng
lạc tồn tại suốt cuộc đời, các triệu chứng của dị ứng lạc thường nghiêm trọng, lạc
là thực phẩm dị ứng có tỉ lệ gây sốc phản vệ và tử vong cao nhất [15]. Các protein
gây dị ứng chính trong lạc là Ara h1, Ara h2 và Ara h3 [5], [15].
Ara h1 là một glycoprotein có phân tử lượng 64,5 kDa được công nhận gây
dị ứng trên 95% bệnh nhân bị mẫn cảm với lạc. Ara h3 có phân tử lượng là 14
kDa và có tính tương đồng cao với protein Glycinin [5].
1.2.1.4. Đậu tương
Dị ứng đậu tương thường gặp ở trẻ em bị viêm da cơ địa. Dữ liệu về dị ứng
đậu tương ở người lớn chưa rõ ràng [3]. Ít nhất 21 protein gây dị ứng đã được phát
hiện trong đậu tương, trong đó glycinin (chiếm 19,5% - 23,1% tổng protein trong
hạt đậu tương) là chất gây dị ứng chính. Glycinin có trọng lượng phân tử khoảng
300-380 kDa, glycinin được tạo thành từ các amino acid có tính acid và base tương
ứng liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide. Biểu hiện dị ứng đậu tương bao gồm
rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, rối loạn chức năng miễn dịch, tăng khả năng trầm
cảm. Mức độ nghiêm trọng của tình trạng dị ứng phụ thuộc vào lượng đậu tương
đưa vào cơ thể, liều lượng càng cao phản ứng càng nghiêm trọng, có thể gây sốc
phản vệ [16].

6


1.2.1.5. Các loại hạt cây
Phản ứng dị ứng với hạt cây có thể nghiêm trọng và đe dọa tính mạng. Các
loại hạt cây thường gây phản ứng dị ứng là hạnh nhân, quả óc chó, hạt điều, hạt

dẻ… Cùng với lạc, dị ứng hạt cây chiếm tỉ lệ lớn các ca tử vong được báo cáo do
dị ứng thực phẩm. Dị ứng hạt cây khởi phát từ khi còn nhỏ và nó thường kéo dài
đến suốt đời [24], [31]. Phần lớn các chất gây dị ứng hạt cây là protein có trong
hạt. Trẻ dị ứng với một loại hạt cây thường cũng sẽ dị ứng với các loại hạt cây
khác và có thể dị ứng chéo với lạc [6].
1.2.1.6. Nhóm thực phẩm gây dị ứng khác
Một số loại thực phẩm gây dị ứng phổ biến khác như ngũ cốc chứa gluten,
cá, động vật giáp xác... Phản ứng qua trung gian IgE đối với dị ứng cá, động vật
giáp xác là một trong những nguyên nhân gây dị ứng thực phẩm phổ biến nhất.
Jug r1 đã được chứng minh là một chất gây dị ứng hạt óc chó chính (92% bệnh
nhân bị dị ứng quả óc chó). Những triệu chứng thường gặp là nổi mề đay cấp tính,
phù mạch, viêm da dị ứng, trên hệ hô hấp (viêm mũi xoang, hen suyễn) và rối loạn
tiêu hóa (tiêu chảy, nôn), trong một số trường hợp có sốc phản vệ gây tử vong
[29].
1.2.2. Các quy định hiện hành về dị nguyên
Nhật Bản quy định bắt buộc phải ghi nhãn thực phẩm gây dị ứng khi có trên
10 µg/g (protein gây dị ứng hòa tan/thực phẩm) [26].
Hoa Kỳ đã ban hành Đạo luật bảo vệ người tiêu dùng và dán nhãn thực phẩm
(FALCPA) yêu cầu trình bày rõ ràng về nguồn gốc của các thành phần có nguồn
gốc là thực phẩm gây dị ứng chính. Bất kỳ thành phần nào có nguồn gốc từ những
thực phẩm thường gây dị ứng đều phải được ghi trên công bố thành phần của sản
phẩm bất kể mức độ sử dụng. Trong liên minh Châu Âu (EU), luật ghi nhãn thực
phẩm quy định phải ghi các thành phần chiếm tỉ lệ từ 5% trở lên, cũng yêu cầu
ghi nhãn của bất kỳ thực phẩm thường gây dị ứng hoặc thành phần gây dị ứng có
nguồn gốc từ thực phẩm đó ngay cả khi có ít hơn 5% [23], [30].

7


Ở Việt Nam, theo thông tư liên tịch số 34/2014/TTLT-BYT-BNNPTNTBCT về việc hướng dẫn ghi nhãn hàng hóa đối với thực phẩm, phụ gia thực phẩm

và chất hỗ trợ chế biến bao gói sẵn cũng đã quy định việc công bố thành phần cấu
tạo của thực phẩm, chẳng hạn như công bố sự có mặt của trứng, lạc, đậu tương,
sữa...[2].
Việc ghi nhãn sản phẩm thực phẩm về sự hiện diện của thực phẩm dị ứng
hoặc các thành phần có nguồn gốc từ chúng là cách hiệu quả cho những người dị
ứng thực phẩm tránh việc vô tình ăn phải các chất dị ứng. Tuy nhiên các quy định
ghi nhãn không bao gồm ô nhiễm chất dị ứng của các thực phẩm bằng cách tiếp
xúc chéo [23]. Vì thế vấn đề xác định chất gây dị ứng trong thực phẩm là mối
quan tâm lớn cho cả ngành công nghiệp thực phẩm, cơ quan quản lý thực phẩm
và người tiêu dùng. Do đó, cần có phương pháp phân tích đủ độ nhạy, độ đặc hiệu
để xác định nhanh chóng, chính xác, thậm chí sàng lọc sự có mặt các dị nguyên.
1.3. Phương pháp xác định dị nguyên
Hiện nay, một số phương pháp phân tích phát hiện dị nguyên trong thực
phẩm đã được phát triển và áp dụng. Các phương pháp phân tích được chia làm
ba nhóm chính là phương pháp xét nghiệm miễn dịch, phương pháp phân tích
DNA, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.
1.3.1. Phương pháp xét nghiệm miễn dịch
Nhóm phương pháp xét nghiệm miễn dịch gồm ELISA, dot plot, dipstick,
protein biosensor. Trong số đó, phương pháp ELISA đang được dùng phổ biến
nhất hiện nay [13], [14], [28].
Có ba loại ELISA là: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp và ELISA sandwich.
Loại ELISA sử dụng phổ biến nhất để phân tích dị nguyên là ELISA sandwich.
Nguyên tắc của ELISA là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu của kháng nguyên và kháng
thể. Kháng nguyên được gắn trên một bề mặt, kháng thể được “rửa” qua bề mặt
đó, các kháng thể có gắn với enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là
nitrophenol phosphat) vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất

8

có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể
với kháng nguyên và cường độ màu tỉ lệ với nồng độ kháng nguyên cần phân tích.
Một số nghiên cứu về xác định dị nguyên trong thực phẩm bằng ELISA được
tóm tắt trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu xác định dị nguyên bằng ELISA
Dị nguyên

Nền mẫu

LOD

TLTK

Lạc

Kem

40 µg/ml

[9]

0,02%

[28]

Gluten
Lòng trắng trứng

Tinh bột ngô, bột
mì, súp, thịt

Sản phẩm thô: 0,03%

Thịt đóng hộp

Sản phẩm tiệt trùng: 0,125%

[14]

Ưu điểm của phương pháp này là đầu tư ban đầu ít (về nhân lực, thiết bị, hóa
chất, dụng cụ), dễ thực hiện, giới hạn phát hiện thấp. Tuy nhiên, phương pháp
ELISA có thể gặp trường hợp dương tính giả. Ngoài ra, mỗi kit ELISA chỉ xác
định được một loại kháng nguyên, không thể xác định đồng thời được các dị
nguyên trong một bộ kit thử. Do đó muốn phát hiện đồng thời nhiều dị nguyên
cần sử dụng nhiều bộ kit thử dẫn đến tăng chi phí và thời gian thực hiện [23].
1.3.2. Phương pháp phân tích DNA
Nhóm phương pháp phân tích DNA gồm có real time PCR, PCR-ELISA,
DNA biosensor. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) là một phương
pháp gián tiếp nhằm mục đích phân đoạn gen mã hóa và khuếch đại sự hiện diện
của nó bằng phản ứng enzym DNA polymerase.
Nguyên tắc của PCR là sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các
bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzym polymerase.
Phương pháp được áp dụng phát hiện các chất gây dị ứng với bản chất là các
protein. Mỗi đoạn DNA gồm có 2 oligonucleotid ở đầu được coi như mồi cho
phản ứng, khuếch đại bởi polymerase. Các phản ứng bao gồm ba bước trong mỗi
chu kỳ khuếch đại. Thông thường sẽ thực hiện 25 đến 45 chu kỳ khuếch đại để
tạo ra một lượng bản sao DNA đủ lớn đem nhuộm thuốc nhuộm huỳnh quang và
thực hiện phân tích bằng điện di gel agarose [7], [11], [23].
9

Một số nghiên cứu về xác định dị nguyên bằng phương pháp PCR được tóm
tắt ở bảng 1.2. Sự kết hợp giữa các DNA là duy nhất, do đó, phương pháp có tính
đặc hiệu cao và ít bị phản ứng chéo với các dị nguyên khác. Vì PCR là một phản
ứng khuếch đại, chỉ cần một lượng nhỏ dịch chiết mẫu nên cho phép xác định chất
dị ứng ở mức hàm lượng thấp. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là không
xác định được cụ thể loại protein gây dị ứng và có thể mắc sai số lớn do protein
có thể bị thay đổi biến dạng trong các quá trình xử lý nhiệt [10], [23].
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu xác định dị nguyên bằng phương pháp PCR
Dị nguyên

Nền mẫu

LOD

TLTK

Hạt dẻ

Các loại bánh

0,001%

[11]

Bánh gạo

0,01%

[12]

Sữa trâu

0,5%

[7]

Đậu phộng, hạt dẻ, cần tây, đậu
nành, trứng, sữa, hạnh nhân và vừng
Sữa bò
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
1.3.3.1. Nguyên lý chung

Hiện nay phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đang được chú ý để phân tích
xác định các dị nguyên trong thực phẩm do có ưu điểm về độ tin cậy và khả năng
xác định đồng thời nhiều dị nguyên trong cùng một lần phân tích [23]. Phương
pháp LC-MS/MS đã khắc phục được hai nhược điểm lớn nhất của phương pháp
ELISA và phương pháp PCR. Các protein trong mẫu được chiết bằng dung dịch
đệm phù hợp, sau đó thủy phân cắt mạch thành các peptid có kích thước nhỏ hơn.
Các peptid này sẽ được phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ hai lần với chế
độ theo dõi đa phản ứng MRM. Mỗi dị nguyên được đặc trưng bởi 1 đến 2 protein,
mỗi protein được đặc trưng bởi các peptid. Mỗi peptid được đặc trưng bởi 1 ion
mẹ và 2 ion con.
1.3.3.2. Phương pháp xử lý mẫu
Theo một số nghiên cứu trên thế giới, quy trình xử lý mẫu của phương pháp
xác định dị nguyên bằng sắc ký lỏng khối phổ đều gồm hai bước cơ bản là chiết

10

xuất protein ra khỏi nền mẫu thực phẩm và thủy phân protein tạo thành các peptid
đặc trưng.
Các protein gây dị ứng được chiết xuất ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch đệm
phù hợp. Dung dịch đệm chiết được nhiều nghiên cứu lựa chọn là dung dịch đệm
TRIS [4], [10], [32].
Protein trong dịch chiết sau đó được phân giải thành các peptid ngắn hơn
bằng các enzym thủy phân. Phương pháp thủy phân bằng enzym để phân cắt các
liên kết peptid có tính đặc hiệu tương đối cao, chúng cắt mạch protein ở những vị
trí xác định, ví dụ, enzym trypsin cắt liên kết peptid đầu carboxyl của các acid
amin lysin hoặc arginin. Trong hầu hết các nghiên cứu, trypsin đều được chọn làm
tác nhân thủy phân trong quá trình cắt mạch các protein gây dị ứng [4], [10], [20],
[25], [32]. Trypsin là một protease serin được tìm thấy trong hệ tiêu hóa, ruột non
của nhiều loài động vật có xương sống, nơi chúng thủy phân protein [23].
1.3.3.3. Phương pháp phân tích
Sau khi phân giải protein, các peptid đặc trưng cho mỗi protein được lựa
chọn để phân tích trên thiết bị LC-MS/MS. Mỗi dị nguyên được đặc trưng bởi 1
đến 2 protein gây phản ứng dị ứng, protein được xác định bởi peptid đánh dấu
(còn được gọi là các marker), mỗi peptid được đặc trưng bởi 1 ion mẹ và 2 ion
con bằng việc sử dụng chế độ theo dõi đa phản ứng MRM. Các dữ liệu mảnh phổ
được đối chiếu với dữ liệu chuẩn MASCOT, đảm bảo đặc trưng riêng cho từng
peptid [10]. Bảng 1.3 giới thiệu một số protein và các peptid đặc trưng cho từng
dị nguyên thực phẩm.

11


Bảng 1.3. Các protein và peptid đặc trưng của một số dị nguyên
STT

Dị nguyên

Protein

Peptid
YLGYLEQLLR

Casein α S1
1

FFVAPFPEVFGK

Sữa

NAVPITPTLNR

Casein α S2

FALPQYLK
HIATNAVLFFGR

2

Trứng

Ovalbumin

YPILPEYLQCVK
DILNQITKPNDVYSFSLASR
ELINSWVESQTNGIIR
DLAFPGSGEQVEK

Ara h1
3

GTGNLELVAVR

Hạt lạc

RPFYSNAPQEIFIQQGR

Ara h3/4

WLGLSAEYGNLYR
NLQGENEGEDKGAIVTVK

4

Hạt đậu tương

VFDGELQEGR

Glycinin

SQSDNFEYVSFK
EAFGVNMQIVR
DLPNECGISSQR

5

Hạt óc chó

Jug r1

QCCQQLSQMDEQCQCEGLR
GEEMEEMVQSAR

Trong đó, A: Alanin, C: Cystein, D: Acid aspartic, E: Acid glutamic, F:
Phenylalanin, G: Glycin, H: Histidin, I: Isoleucin, K: Lysin, L: Leucin, M:
Methionin, N: Asparagin, P: Prolin, Q: Glutamin, R: Arginin, S: Serin, T:
Threonin, V: Valin, W: Tryptophan, Y: Tyrosin.

12


Để xác định các peptid có trong dịch chiết, các nghiên cứu sử dụng thiết bị
khối phổ phân giải cao (Qtrap hoặc Q-TOF). Một số nghiên cứu phân tích dị
nguyên bằng phương pháp LC-MS/MS được giới thiệu trong bảng 1.4.
Tham khảo các nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ trên
thế giới cho thấy các nhà nghiên cứu thường ưu tiên sử dụng khối phổ phân giải
cao loại Qtrap cho các nghiên cứu về dị nguyên. Với thiết bị khối phổ Qtrap, mẫu
sau khi được tách chất trên hệ thống sắc ký lỏng, các chất sẽ đi vào nguồn ion hóa.
Ở đây các chất sẽ được ion hóa và đi vào tứ cực thứ nhất. Các ion sẽ được tách ra
dựa trên trị số m/z và đi vào tứ cực thứ hai. Tại đây quá trình phân mảnh xảy ra ,
ion mẹ sẽ bị vỡ thành các ion con, các ion con này sẽ được đi vào bẫy ion (ion
trap). Tại bẫy ion, các ion con sẽ được tách ra để đi vào bộ phận nhận tín hiệu
(phổ MS2) hoặc được bẫy lại, cho phân mảnh tiếp rồi mới vào bộ phận nhận tín
hiệu (phổ MS3). Ngoài ra, một số nghiên cứu sử dụng thiết bị khối phổ kết hợp
tứ cực với thời gian bay (QTOF) nhằm xác định chính xác số khối cũng như tìm
ra các peptid điển hình cho từng loại dị nguyên.
Các ứng dụng này liên quan đến việc xác định khối lượng phân tử và giải

trình tự protein, peptid trong mẫu. Mục đích nhằm xác định hợp chất hoặc nghiên
cứu cấu trúc trong lĩnh vực sinh học phân tử. Nhìn chung, các ứng dụng này
thường dành cho các nhà nghiên cứu muốn xác định các mảnh khối lượng phân
tử đặc biệt hoặc trình tự của các protein hoặc các peptid có trong mẫu.
Chưa có nghiên cứu nào sử dụng hệ khối phổ ba tứ cực (Triple Quad), tuy
nhiên sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực cũng được xem là một sự thay thế phù hợp
với nhu cầu sàng lọc xác nhận sự có mặt của dị nguyên dựa vào việc xác định các
marker đặc trưng của chúng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng đến sử dụng
chế độ MRM trong sắc ký lỏng khối phổ loại ba tứ cực nhằm sàng lọc các dị
nguyên trong thực phẩm.

13


Bảng 1.4. Một số nghiên cứu xác định dị nguyên sử dụng hệ LC-MS/MS
TT

Dị nguyên

Mẫu thực
phẩm

Tác nhân

Dung môi chiết

thủy phân

Thiết bị

Giới hạn phát hiện

TL
TK

Sữa, hạt dẻ, lạc,
Sữa, lạc, trứng, hạt dẻ,
1

đậu tương, óc chó,
hạnh nhân

Các loại

Đệm TRIS-HCl,

Trypsin

Aligent

bánh

pH 8,2

0,1µg/µL

Qtrap 4000

hạnh nhân: 10 µg/g
Trứng, đậu tương:

[10]

50 µg/g
Óc chó: 70 µg/g

2

3

4

5

Trứng, sữa, lạc

Bánh quy
đường

Đệm Tris 50 mM,
Urea 2M, DTT

Trypsin

25mM

Sciex
QTRAP 6500

12 loại dị nguyên phổ

Bánh mỳ,

Đệm Tris, ure,

Trypsin

Sciex HPLC

biến: Trứng, sữa, lạc,...

bánh quy

OGS

1µg/µL

TripleTOF 6600

Lạc

Kem

Amoni bicarbonat

Trypsin cố

Aligent

Kali oxalat

định

Q-TOF II

Sữa

Bánh quy,
xúc xích,...

Đệm chiết (Tris
20 mM và Tween
0,1%)
14

Trypsin

5 ppm

[4]

10 ppm

[21]

10 ppm

[25]

Waters Cap

Bánh quy: 1,25 ppm

LC/MS-ESI QTOF

Xúc xích: 5 ppm

[32]


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là năm dị nguyên sữa, trứng, hạt lạc, đậu tương và
óc chó. Đây là những dị nguyên có tỉ lệ gây dị ứng cao nhất và sẵn có trên thị
trường Việt Nam. Sự có mặt của các dị nguyên trong mẫu thực phẩm được xác
định thông qua các protein đặc trưng của chúng.
Bảng 2.1. Các dị nguyên thực phẩm và protein đặc trưng tương ứng
TT

Thực phẩm gây dị ứng

Loại protein đặc trưng

1

Sữa

2

Trứng

Ovalbumin

3

Hạt đậu tương

Glycinin

4

Hạt lạc

5

Hạt óc chó

Casein α S1
Casein α S2

Ara h1
Ara h3/4
Jug r1

Đối tượng phân tích là bánh kẹo, thực phẩm bổ sung cho trẻ em (sữa bột,
bánh ăn dặm) chứa một số thực phẩm gây dị ứng sữa, trứng, lạc, óc chó, đậu
tương.
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.2.1. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ gồm thiết bị sắc ký lỏng HPLC LC20ADXR của Shimadzu kết nối với thiết bị khối phổ ABSciex Triple Quad 5500.

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Mettler Toledo.
- Cân kỹ thuật (có độ chính xác 0,01 g), Mettler Toledo.
- Thiết bị lắc xoáy, IKA.
- Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich.
- Thiết bị đồng nhất mẫu, Phillips.
15


2.2.2. Dụng cụ
- Micropipet có thể điều chỉnh thể tích 10-100 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
và 1000-5000 µL
- Bình định mức 10 mL, 100 mL, 500 mL, 1 L
- Ống ly tâm nhựa 15 mL
- Lọ đựng mẫu 2 mL
- Lọ đựng mẫu 5 mL
- Bơm tiêm 3 mL
- Màng lọc mẫu 0,22 µm.
2.2.3. Hóa chất
Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu, gồm:
- Acetonitril, loại dùng cho sắc ký
- Acid formic đặc, loại dùng cho sắc ký
- Tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), NH4HCO3, Iodoacetamid
(IA), Dithiothreitol (DTT), Trypsin (>250 N.F.U/mg), Acid acetic, Natri
clorid, N-hexan, Ure, (loại tinh khiết phân tích)
- Chất chuẩn:
+ Casein chuẩn 99,5% từ Sigma, lô C7078
+ Các protein khác chưa có chất chuẩn nên các loại thực phẩm trứng (công ty
DTK Phú Thọ), hạt lạc và đậu tương (công ty TNHH du lịch Phú Hải), hạt óc
chó (Thăng long) mua tại siêu thị được lấy làm chất chuẩn.
2.2.4. Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử, dung môi

- Dung dịch iodoacetamid (IA) 1M: hòa tan 0,9248g IA trong 5 mL nước cất
hai lần. Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng.
- Dung dịch dithiothreitol (DTT) 200mM: cân 3,0862g DTT vào cốc có mỏ
100mL, thêm khoảng 70mL H2O, khuấy đến tan hoàn toàn, chuyển vào
bình định mức 100mL và định mức đến vạch bằng nước cất hai lần.
- Dung dịch đệm chiết 1 (đệm TRIS- HCl pH 8,2): cân 1,5006g TRIS vào
cốc có mỏ 500mL, thêm khoảng 400mL H2O, khuấy đến tan hoàn toàn,
16


điều chỉnh đến pH 8,2 bằng dung dịch HCl 1M, chuyển vào bình định mức
500mL và định mức đến vạch bằng nước cất hai lần.
- Dung dịch đệm chiết 2 (ure 2M, đệm TRIS- saline 50mM, DTT 25mM):
cân 3,0259g TRIS và 4,3820g NaCl vào cốc có mỏ 500mL, thêm khoảng
300mL H2O, khuấy đến tan hoàn toàn, điều chỉnh đến pH 7,6 bằng dung
dịch HCl 1M. Cân 60,06g ure và 1,9284g DTT hòa tan lần lượt vào dung
dịch đệm trên. Chuyển dung dịch vào bình định mức 500mL, định mức đến
vạch bằng nước cất hai lần.
- Dung dịch NH4HCO3 100 mM: cân 0,7920g NH4HCO3 vào cốc có mỏ
100mL, thêm khoảng 80 mL H2O, khuấy đến tan hoàn toàn, chuyển vào
bình định mức 100mL và định mức đến vạch bằng nước cất hai lần.
- Dung dịch NH4HCO3 200 mM: cân 0,1581g NH4HCO3 vào cốc 10mL,
thêm khoảng 7mL H2O, lắc đến tan hoàn toàn, chuyển vào bình định mức
10mL và định mức đến vạch bằng nước cất hai lần.
- Dung dịch CH3COOH 50mM: Hút 285mL CH3COOH băng vào bình định
mức 100mL, định mức đến vạch bằng nước cất hai lần.
- Dung dịch Trypsin 1 (4 mg/mL trong CH3COOH 50 mM): cân 40mg
trypsin vào cốc 10 mL, thêm khoảng 8 mL dung dịch CH3COOH 50 mM,
lắc nhẹ đến tan hoàn toàn, chuyển vào bình định mức 10mL và định mức
đến vạch bằng dung dịch CH3COOH 50mM. Bảo quản ở -20oC.

- Pha động acid formic (kênh B): Hút 1 mL acid formic vào bình định mức
1L và định mức đến vạch bằng nước cất hai lần.
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng phương pháp sàng lọc đồng thời một số dị nguyên trong thực
phẩm bằng LC-MS/MS
2.3.1.1. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
Khảo sát và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu tối ưu:
- Khảo sát dung dịch đệm chiết xuất protein
- Khảo sát nồng độ trypsin thủy phân protein
17