Phân lập, định danh và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của vi khuẩn lactic từ kim chi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN HỮU TRUNG

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN
CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ KIM CHI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019
1


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN HỮU TRUNG

MÃ SINH VIÊN: 1401644

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN
CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ KIM CHI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Đinh Thúy Hằng
2. PGS.TS. Phùng Thanh Hương
Nơi thực hiện:
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học,
Đại học Quốc gia Hà Nội

HÀ NỘI - 2019
1


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận, em đã luôn nhận
được sự dạy dỗ, chỉ bảo tận tình của các thầy, cô giáo cũng như sự quan tâm chăm sóc từ
gia đình và bạn bè. Đó là nguồn động lực giúp em vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành
khóa luận này.
Đặc biệt, cho phép em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Đinh Thúy Hằng cán bộ tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dìu dắt,
hướng dẫn, giúp em hòa nhập với môi trường nghiên cứu khoa học, tạo mọi điều kiện thuận
lợi nhất cho em trong suốt quá trình làm thực nghiệm và viết khóa luận. Qua đó em đã biết
cách tiếp cận một nghiên cứu khoa học và có hành trang vững chắc cho con đường sau này.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc nhất , em xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS.
Phùng Thanh Hương - người thầy tâm huyết đã tận tình giúp đỡ em từ những ngày đầu
làm khoa học. Cô đã truyền cảm hứng cho em và khơi gợi niềm đam mê nghiên cứu trong
em. Không những vậy, cô luôn theo sát em trong suốt quá trình làm khoa học, kịp thời đưa
ra những lời khuyên bổ ích và những bài học về kĩ năng sống. Từ đó, bản thân em đã trưởng
thành và tự tin hơn trong con đường làm nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Hồng Minh, cán bộ phòng Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ cao, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà
Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện, hướng dẫn em có thể hoàn thành khóa luận của
mình.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị cán bộ trong Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học, gia đình, người thân và các bạn bè luôn ở bên giúp đỡ, động viên em
vượt qua những khó khăn trong học tập suốt những năm vừa qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Đoàn Hữu Trung
1


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................................ 2
1.1. Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) ........................................................... 2
1.1.1.

Khái niệm và môi trường sống của LAB ......................................................... 2

1.1.2.

Đặc điểm sinh học và di truyền của LAB ........................................................ 2

1.1.3.

Khả năng ức chế vi khuẩn của LAB ................................................................ 4

1.1.4.

Ứng dụng của LAB trong lĩnh vực y dược ...................................................... 5

1.2.

Định danh LAB ....................................................................................................... 6

1.2.1.

So sánh trình tự 16S rADN .............................................................................. 6

1.2.2.

Xác định các đặc tính sinh lý, hóa sinh ............................................................ 7

1.3. Biofilm ....................................................................................................................... 8
1.3.1. Khái niệm và cấu trúc .......................................................................................... 8
1.3.2. Sự hình thành và vai trò của biofilm đối với vi khuẩn ........................................ 9
1.3.3. Khả năng hình thành biofilm ở các loài vi khuẩn .............................................. 13
1.3.4. Tác dụng ức chế hình thành biofilm của vi khuẩn có lợi và ứng dụng ............. 13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 15
2.1.1.

Nguyên liệu .................................................................................................... 15

2.1.2.

Chủng vi khuẩn kiểm định ............................................................................. 15

2.1.3.

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu .......................................................... 16

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 19

1


2.3.1. Phân lập LAB từ kim chi ................................................................................... 19
2.3.2. Định danh các chủng LAB dựa trên so sánh trình tự 16S rADN ...................... 20
2.3.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn ........................................................................ 22
2.3.4. Đánh giá khả năng LAB ức chế hình thành biofilm .......................................... 22
2.3.6. Xử lý số liệu ....................................................................................................... 24
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................... 25
3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ kim chi .......................................................................... 25
3.2. Định danh vi khuẩn lactic ........................................................................................ 28
3.2.1. Kết quả tách ADN tổng số ................................................................................. 28
3.2.2. Kết quả khuếch đại 16S rADN, giải trình tự và dựng cây phân loại ................. 30
3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng LAB phân lập .................. 34
3.4. Kết quả đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm............................................. 35
KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 42
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

2


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Chú giải tiếng Anh

Chú giải tiếng Việt

ADN

Acid deoxyribonucleic

AHLs

N-acyl-homoserin lactons

API CH

Analytical Profile Index Carbohydrat

ARN

Acid ribonucleic

ATP

Adenosine triphosphate

BK

Bán kính

BSA

Bovine serum albumin

CTAB

Cetyltrimethyl ammonium bromide

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EPS

Extracellular polymeric substances

Các hợp chất polymer ngoại bào

GLP-1

Glucagon-like peptide 1

Peptid có cấu trúc giống glucagon

HACCP

Hazard analysis and critical control points

LAB

Lactic acid bacteria

LB

Lysogeny broth

LPS

Lipopolysaccharid

MQ

Mili Q

MRS

Man, Rogosa, Sharpe

OD

Optical density

Mật độ quang

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

QS

Quorum sensing

Cảm biến mật độ tới hạn

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Taq

Thermus aquaticus

UV

Ultraviolet

Chỉ số hồ sơ phân tích Carbohydrat

Albumin huyết thanh bò

Các điểm về kiểm soát tới hạn và
phân tích nguy cơ
Vi khuẩn lactic

Tia cực tím

1

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1

Các hợp chất hydratcarbon sử dụng trong kit API CH50

Bảng 1.2

Một số thành phần chính của biofilm

Bảng 1.3

Một số vai trò của màng biofilm

Bảng 2.1

Các mẫu kim chi Hàn Quốc sử dụng để phân lập vi khuẩn lactic

Bảng 2.2

Thành phần môi trường MRS

Bảng 2.3

Thành phần môi trường LB

Bảng 2.4

Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuyếch đại 16S rADN

Bảng 3.1

Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ kim chi

Bảng 3.2

Kết quả tách chiết ADN tổng số

Bảng 3.3

Kết quả so sánh trình tự 16S rADN của các chủng LAB phân lập với dữ liệu
GenBank

Bảng 3.4

Kết quả đo mật độ quang của 2 chủng kiểm định trên 3 môi trường

1


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1

Cây phát sinh chủng loại các chi vi khuẩn lactic

Hình 1.2

Sơ đồ các bước hình thành biofilm ở vi sinh vật

Hình 2.1

Thiết kế thí nghiệm

Hình 3.1

Hình ảnh phân lập LAB bằng kỹ thuật ống thạch bán lỏng

Hình 3.2

Hình ảnh tinh sạch LAB bằng kỹ thuật cấy trải trên đĩa thạch MRS

Hình 3.3

Ví dụ hình ảnh hình thái tế bào của một số chủng phân lập được chụp bằng
kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần

Hình 3.4

ADN tổng số của các chủng LAB thuần khiết sau khi tách chiết

Hình 3.5

Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 16S rADN của các chủng LAB

Hình 3.6

Cây phân loại của 12 chủng LAB phân lập được dựa trên so sánh trình tự
16S rADN

Hình 3.7

Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn trên S. aureus và P. aeruginosa
thuộc nhóm ESKAPE của các chủng LAB phân lập

Hình 3.8

Kết quả đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm của các chủng LAB
phân lập trên P.aeruginosa

Hình 3.9

Kết quả đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm của các chủng LAB
phân lập trên S.aureus

1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Kim chi là một sản phẩm truyền thống ở Hàn Quốc được sản xuất bằng cách lên men
rau củ cùng với các vi khuẩn có lợi. Theo đó, kim chi được coi như một nguồn thực phẩm
cung cấp probiotic và góp phần vào việc nâng cao sức khỏe của con người. Kim chi có hàm
lượng lớn các vitamin, các chất khoáng, chất xơ và một số thành phần khác. Theo nhiều
nghiên cứu đã công bố, kim chi có hoạt tính chống oxi hóa, chống ung thư, có thể làm giảm
cholesterol, nâng cao sức khỏe và tăng cường hệ miễn dịch [51]. Bên cạnh đó, hệ vi sinh
vật trong kim chi vô cùng phong phú, bao gồm nhiều loài vi khuẩn có lợi như: Leuconostoc
sp, Lactobacillus sp, Weissella sp và Lactococcus sp. Theo đó, vi khuẩn lactic chiếm phần
lớn trong hệ vi sinh vật và chúng góp phần vào các đặc tính của kim chi [35]. Nhiều nghiên
cứu trước đó đã cho thấy các tác dụng có lợi của vi khuẩn lactic và tiềm năng ứng dụng của
chúng trong ngành y dược. Nghiên cứu về tác dụng của vi khuẩn lactic phân lập từ kim chi

đã chứng minh được chúng có hoạt tính chống oxi hóa, chống béo phì, chống đái tháo
đường và hoạt tính ức chế sự sinh trưởng của Helicobacter pylori [35]. Nghiên cứu của
Abreu và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng, so với người khỏe mạnh, vi khẩn lactic bao gồm
Lactobacillus sakei suy giảm trong hệ vi sinh vật trong xoang mũi ở người mắc viêm xoang
mạn tính [1]. Thêm vào đó, theo kinh nghiệm dân gian tại Hàn Quốc, bằng cách nhỏ trực
tiếp dịch kim chi có thể làm giảm các triệu chứng của viêm xoang mạn tính. Trong khi đó,
hầu như chưa có công bố chính thức nào chứng minh cơ sở khoa học của cách điều trị dân
gian này.
Với những lí do trên, để góp phần cung cấp thêm thông tin về các tác dụng có lợi
của vi khuẩn lactic từ kim chi và tiềm năng ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y dược tại
Việt Nam, đề tài “Phân lập, định danh và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của vi
khuẩn lactic từ kim chi” đã được triển khai với 2 mục tiêu sau:
1. Phân lập và định danh vi khuẩn lactic từ kim chi
2. Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh và tác dụng kháng biofilm của vi khuẩn
lactic từ kim chi.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB)
1.1.1. Khái niệm và môi trường sống của LAB
Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn được đặc trưng bởi quá trình sinh ra acid
lactic - sản phẩm chuyển hóa cuối cùng khi vi khuẩn này lên men đường glucose. Trong
nhóm vi khuẩn LAB, các loài lên men đồng hình chỉ tạo ra acid lactic là sản phẩm lên men
chính (<85%), trong khi các loài lên men dị hình ngoài acid lactic còn tạo ra CO2, ethanol
hoặc acid acetic. Ít nhất 50% lượng carbon trong sản phẩm lên men cuối cùng của LAB có
nguồn gốc từ acid lactic [40].
LAB sống trong các môi trường giàu dinh dưỡng, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện. Môi
trường nuôi cấy LAB cần nhiều chất dinh dưỡng như carbohydrat, amino acid, peptid, các

acid béo, các dẫn chất của acid nucleic, vitamin và chất khoáng. Trong tự nhiên, LAB có
mặt trong các hốc tự nhiên của người và động vật, các nguyên liệu đang phân hủy có nguồn
gốc thực vật, một số loại rau củ quả (củ cải đường, khoai tây, dưa bắp cải), đồ uống và thức
ăn lên men (nước hoa quả, các sản phẩm từ sữa và cá lên men). Chúng còn là một phần
trong hệ vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa của người [40].
1.1.2. Đặc điểm sinh học và di truyền của LAB
LAB là vi khuẩn gram dương, tế bào thường không di động, không sinh bào tử và
sinh acid lactic - sản phẩm lên men đường chính. LAB hiện tại được xếp vào ngành
Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Latobacillales và được phân loại dựa theo đặc điểm hình thái,
đặc điểm sinh lý, đặc điểm phân tử, cách lên men glucose, khoảng nhiệt độ phát triển [53]
[5]. Ngoài ra, chúng không mang cytochrom (sắc tố tế bào có bản chất là hemeprotein gắn
màng có vai trò tổng hợp ATP) và không có khả năng tổng hợp porphyrin - một thành phần
trong nhân hem. Thay vào đó, LAB thường sử dụng quá trình phosphoryl hóa ở mức độ cơ
chất hơn là sử dụng chuỗi truyền điện tử hay phosphoryl oxi hóa để tạo ra năng lượng [73].
Nhóm vi khuẩn lactic có 14 chi, bao gồm: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Pediococcus, Streptococcus, Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum,
Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella, trong đó
Lactobacillus là chi lớn nhất với hơn 100 loài [72]. Chi Bifidobacterium không thuộc họ

2


Lactobacilliceae nhưng được xếp vào nhóm LAB do khả năng sinh ra acid lactic và acid
acetic trong quá trình lên men đường [44]. Mối liên hệ giữa các chi thuộc nhóm LAB được
thể hiện ở hình 1.1.

Hình 1.1: Cây phát sinh chủng loại các chi vi khuẩn lactic [40]
Hệ gen của LAB có tỷ lệ G+C < 55 mol% trong ADN và có kích thước từ 1,3 đến
3,3 Mb [79]. Bên cạnh đó, nhiều loài LAB mang plasmid và các plasmid đa dạng về cả kích
thước lẫn thành phần gen (gene content). Nhiều plasmid mang gen có tiềm năng giúp cho

tế bào vi khuẩn thích nghi được với môi trường vì các gen này mã hóa cho bacteriocin, acid
amin, hệ vận chuyển đường và hệ thống giới hạn – cải biến (restriction-modification
system) giúp chống lại các ADN ngoại lai nhờ các enzym cắt giới hạn [79] [59].

3


1.1.3. Khả năng ức chế vi khuẩn của LAB
Nhiều loài LAB có thể ức chế vi khuẩn thông qua khả năng cạnh tranh của tế bào,
giảm pH môi trường, sản xuất ra các hoạt chất có khả năng kháng khuẩn, bao gồm các acid
hữu cơ và các peptid kháng khuẩn - được gọi chung là bacteriocin. Các acid hữu cơ như
acid lactic được tạo ra bởi LAB có thể ức chế sự sinh trưởng của nhiều loài vi khuẩn, đặc
biệt là các vi khuẩn gây bệnh gram âm như Escherichia coli, Salmonella enterica. Các acid
hữu cơ do LAB tạo ra có khả năng thấm vào màng tế bào chất làm giảm pH nội bào và tiêu
diệu tế bào vi khuẩn. Trong khi đó, LAB có thể tồn tại trong môi trường pH bằng 4 hoặc
thậm chí pH bằng 2 do chúng có khả năng điều hòa tế bào chất và pH nội bào đến gần pH
trung tính trong suốt quá trình tăng trưởng hoặc bảo quản trong môi trường pH thấp [32].
Ngoài ra, một số loài LAB có khả năng sản sinh ra bacteriocin (có bản chất là peptid), có
thể kháng lại các vi khuẩn ngay cả ở nồng độ nano mol và pico mol. Bacteriocin từ LAB
tạo ra các hốc trên màng tế bào đích và xuyên thủng màng tế bào, từ đó gây ra sự thoát ion,
ATP và các chất cần thiết cho các chức năng chuyên biệt và chuyển hóa tế bào [39][42].
Theo đó, LAB và bacteriocin sakacin P đã được đề xuất sử dụng để ức chế Listeria
monocytogenes [39].
Nghiên cứu của Sikorska và cộng sự (2013) đã khẳng định vai trò của LAB trong
phòng và điều trị nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng kháng meticilin. Các chủng Lactobacillus
như L. plantarum, L. paracasei, L. acidophilus và Bifidobacterium được phân lập từ nhiều
nguồn khác nhau có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và S.aureus kháng meticilin
phân lập từ bệnh phẩm in vitro [65].
Nghiên cứu của Ji và cộng sư (2015) đã tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn
của vi khuẩn lactic phân lập từ kim chi đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh. Kết quả

cho thấy, cả 11 chủng vi khuẩn lactic phân lập được bao gồm Lactobacillus sp và
Leuconostoc sp đều ức chế sự sinh trưởng của Listeria monocytogenes, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli và Salmonella typhimurium [34]. Như vậy, các nghiên cứu đã
chứng minh được rằng LAB có khả năng ức chế một sự sinh trưởng của một số chủng vi
khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh tế bào trực tiếp hoặc tiết ra acid hữu cơ, bacteriocin
[65].

4


1.1.4. Ứng dụng của LAB trong lĩnh vực y dược
1.1.4.1. Probiotic
LAB là một nhóm probiotic quan trọng được dùng trong điều trị các rối loạn về tiêu
hóa và chức năng dinh dưỡng như không có khả năng dung nạp lactose, dị ứng thức ăn, tiêu
chảy cấp có nhiễm khuẩn, viêm khớp dạng thấp và ung thư đại tràng [21].
Các sản phẩm sữa lên men như sữa chua, sữa chua uống và phô mai là các dạng thực
phẩm giúp đưa LAB vào cơ thể dễ dàng nhất. Đối với công nghiệp dược, các chủng LAB
có mặt trong các sản phẩm ở dạng tế bào sống nhờ các kỹ thuật vi bao làm tăng tỷ lệ sống
sót của LAB qua các bước của quy trình sản xuất cũng như các điều kiện khắc nghiệt (pH
thấp, nồng độ muối mật và các enzym tiêu hóa cao) trong hệ tiêu hóa của vật chủ. Một số
nghiên cứu gần đây đã cho thấy việc sử dụng vi nang polymer như một hệ vận chuyển LAB
mang lại nhiều ứng dụng trong ngành dược [21].
1.1.4.2. Điều trị béo phì, hạ cholesterol
Trong nghiên cứu của Kadoka và cộng sự (2010), các yếu tố môi trường trong đường
ruột có liên quan đến bệnh béo phì ở người. Việc sử dụng Lactobacillus gasseri SBT2055
có thể làm giảm mỡ bụng, trọng lượng cơ thể, BMI và vòng hông. Các sản phẩm probiotic
có chứa LAB có thể được sử dụng để cải thiện chức năng bảo vệ đường ruột của cơ thể, từ
đó phòng tránh được các tình trạng viêm và nhiễm khuẩn [38]. Theo nghiên cứu của Ouweh
và cộng sự (2000), LAB có thể làm giảm khả năng tiết lipopolysaccharid (LPS) từ các tế
bào biểu mô ruột cũng như giảm khả năng sản xuất ra cytokin tiền viêm ở các mô mỡ, điều

hòa chuyển hóa lipid, từ đó làm giảm liều statin cần thiết (thuốc ức chế tổng hợp cholesterol)
và giảm nồng độ cholesterol trong huyết tương. Ngoài ra, một số loài LAB như L.
paracasei, L. sakei có thể điều hòa enzym chuyển hóa năng lượng dẫn đến làm giảm lượng
cholesterol, triglyecerid trong máu, tiết ra một số enzym như glycosid hydrolase để phân
cắt các polysaccharid từ thức ăn hằng ngày và tăng cường đáp ứng miễn dịch [49] [70].
1.1.4.3. Chống đái tháo đường typ 2
Tác dụng chống đái tháo đường của LAB đã được một số nhóm tác giả công bố. Nghiên
cứu của Yun và cộng sự (2009) khảo sát tác dụng của Lactobacillus gasseri BNR17 lên
nồng độ glucose trong máu và trọng lượng cơ thể ở chuột mắc bệnh đái tháo đường typ 2.

5


Kết quả theo dõi sau 6 tuần cho thấy, sử dụng BNR17 với liều 1010 cfu làm giảm chỉ số
HbA1c so với nhóm đối chứng. Mặc dù sự khác biệt chưa thực sự có ý nghĩa thống kê và
tác dụng trên giảm dần sau 12 tuần, nhóm nghiên cứu vẫn kiên định với tiềm năng ứng
dụng Lactobacillus gasseri BNR17 trong điều trị đái tháo đường typ 2 [80]. Trong một
nghiên cứu khác, Honda và cộng sự (2012) cho thấy Lactobacillus rhamnosus GG làm giảm
đáng kể nồng độ glucose trong máu sau ăn ở chuột KK-Ay được cho ăn nhiều sucrose và
tinh bột. Ngoài ra, một số loài LAB như L. sakei và L. plantarum có khả năng kích thích
tiết ra các hormon incretin (GLP-1) làm giảm glucose máu, tăng bài tiết insulin, ức chế
enzyme dipeptididyl peptidase IV và tăng cường đáp ứng miễn dịch [21].
1.2.

Định danh LAB
Là một nhóm vi khuẩn với nhiều loài có đặc tính sinh lý tương đồng, việc định danh

khoa học cho một vi khuẩn lactic mới phân lập đôi khi cần được tiến hành từ nhiều hướng
tiếp cận khác nhau. Các bước cơ bản như giải trình tự 16S rADN và thực hiện các phản ứng
sinh hóa cho phép định danh khoa học tới mức độ chi. Trong khi đó, để định danh tới loài

trong nhiều trường hợp cần so sánh các trình tự gen mã hóa cho các đặc tính riêng biệt và
phân tích các đặc điểm sinh lý như khả năng chống chịu trong điều kiện pH thấp hay nồng
độ muối và muối mật cao, khả năng tạo ra các chất kháng khuẩn…[44].
1.2.1. So sánh trình tự 16S rADN
Trình tự 16S rADN được lựa chọn làm chỉ thị phân tử để đánh giá mối liên quan
phylogeny giữa các loài Prokaryot do (i) tính phổ quát (phân tử 16S rARN có mặt ở mọi
loài Prokaryot), (ii) tính bảo thủ về chức năng (tham gia quá trình sinh tổng hợp protein
trong tế bào) và về cấu trúc (có tốc độ tiến hóa chậm) và (iii) xuất hiện rất sớm trong lịch
sử tiến hóa (gắn với chức năng sinh tổng hợp protein của tế bào), do vậy có thể lưu giữ
được các biến đổi trong lịch sử tiến hóa [78]. Ngoài ra, trình tự gen mã hóa cho 16S rARN
có độ dài xấp xỉ 1500 bp, đủ lớn để lưu giữ các biến đổi tiến hóa, đồng thời rất phù hợp cho
các thao tác tin sinh học.
Trên ngân hàng dữ liệu GenBank đã có hơn 20 triệu trình tự gen, trong đó có hơn
90000 trình tự gen 16S rARN, cho phép việc so sánh để tìm ra các loài gần gũi với độ tương
đồng cao trong trình tự này ngày càng trở nên chính xác. Theo quy ước hiện nay, hai loài
sinh vật nhân sơ (Prokaryotes) có trình tự 16S rADN tương đồng từ 97% trở lên được coi
6


là giống nhau. Tuy nhiên, chỉ dựa trên so sánh trình tự 16S rADN thì loài mới có thể được
khẳng định tên chi tương tự như loài gần gũi nhất, còn tên loài mới dừng ở ký hiệu sp. Để
xác định một cách chính xác tên loài, cần bổ sung thông tin từ các phân tích sinh hóa, sinh
lý so sánh với loài gần gũi đã xác định được dựa trên so sánh trình tự 16S rADN [69].
1.2.2. Xác định các đặc tính sinh lý, hóa sinh
API CH 50 (BioMereux, Pháp) là một loại kit dùng để xác định nhanh phổ cơ chất
hydratcarbon có thể được LAB sử dụng để lên men sinh acid lactic (Bảng 1.1). Phổ cơ chất
này mang tính đặc thù đối với các loài LAB khác nhau, do vậy khi kết hợp với kết quả so
sánh trình tự 16S rADN cho phép tiến gần hơn đến xác định tên loài [44].
Bảng 1.1: Các hợp chất hydratcarbon sử dụng trong kit API CH 50 [53]
TT

Tên hydratcacbon

TT

Tên hydratcacbon

TT

Tên hydratcacbon

1

Glycerol

17

Inositol

34

Melezitoza

2

Erythritol

18

Mannitol

35

D-Raffinoza

3

D-Arabinoza

19

Sorbitol

36

Tinh bột

4

L-Arabinoza

20

α-Methyl-d-mannosit

37

Glycogen

5

Riboza

21

α-Methyl-d-glucosit

38

Xylitol

6

D-Xyloza

22

N-Acetylglucosamin

39

Gentiobioza

7

L-Xyloza

23

Amygdalin

40

D-Turanoza

8

Adonitol

24

Arbutin

41

D-Lyxoza

9

β-Methy-xylosit

25

Esculine

42

D-Tagatoza

10

D-Galactoza

26

Salicin

43

D-Fucoza

11

D-Glucoza

27

Cellobioza

44

L-Fucoza

12

D-Fructoza

28

Maltoza

45

D-Arabitol

13

D-Mannoza

29

Lactoza

46

L-Arabitol

14

L-Sorboza

30

Melibioza

47

Gluconat

15

Rhamnoza

31

Sucroza

48

2-Ketogluconat

16

Dulcitol

32

Trehaloza

49

5-Ketogluconat

33

Inulin

7

Các đặc tính như khả năng chịu pH thấp, nồng độ muối hoặc muối mật cao cũng
thường được phân tích để xác định vị trí phân loại cũng như tiềm năng ứng dụng của chủng
LAB [27], trong khi đó khả năng sinh các chất kháng khuẩn như acid lactic và bacteriocin
lại là đặc tính riêng của từng chủng LAB [20].
1.3. Biofilm
1.3.1. Khái niệm và cấu trúc
Biofilm là tập hợp gồm các quần thể vi sinh vật bám dính, phát triển trên một bề mặt
các môi trường khác nhau và được bao bọc bởi mạng lưới polymer ngoại bào được sản sinh
bởi chính các tế bào vi sinh vật. Các tế bào vi sinh vật cư trú trong biofilm được bao bọc
trong chất nền có thành phần chính là các polymer sinh học ngoại bào (EPS), gồm
polysaccharid, protein, lipid, acid nucleic [22] [4]. Trong biofilm, các tế bào vi sinh vật chỉ
chiếm dưới 10% trọng lượng khô trong khi EPS chiếm trên 90%. Sự hình thành và duy trì
sự ổn định một quần thể vi sinh vật phần lớn phụ thuộc vào sự hình thành và chất lượng
của EPS [67]. Nồng độ, sự gắn kết, điện tích, khả năng hấp phụ, tính đặc hiệu và tính chất
của từng thành phần trong EPS cũng như cấu trúc 3 chiều của chất nền (matrix) quyết định
đặc tính của biofilm. Cấu trúc của biofilm bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như điều kiện
thủy động, nồng độ các chất cấu thành, sự di động của vi sinh vật và tương tác giữa chúng
[22]. Một số thành phần chính và tính năng của chúng trong biofilm được trình bày tóm tắt
tại bảng 1.2.
Bảng 1.2: Một số thành phần chính của biofilm
Thành phần

Đặc tính hóa học

Chức năng sinh học

Tài liệu
tham khảo

Chiếm tỷ lệ cao nhất trong

EPS, gồm 2 loại:

Polysaccharid

- Homopolysaccharid ví dụ Chất nền chủ yếu của
như glucan, fructan.
biofilm, tạo mạng lưới
[75] [8]
-Heteropolysacchrid: gồm làm giá thể bám cho tế
các polysaccharid không bào.
đồng nhất, có thể chứa các
nhóm thế vô cơ/hữu cơ

8


khác nhau, ví dụ như
alginat

Protein

Nhiều loại khác nhau, có
trọng lượng lớn, tương
đương hoặc cao hơn trọng
lượng của polysaccharid
trong biofilm

Lipid

Lypopolysaccharid là một

thành phần cao phân tử
chính của biofilm

Chất hoạt động
bề mặt
(biosurfactant)

Surfactin,
viscossin,
emulsan là một số chất
thường gặp

Nước

Chiếm tỷ lệ cao trong
biofilm

- Các enzym ngoại
bào: giúp chuyển hóa
các hợp chất cao phân
tử thành đơn phân/
hoặc làm chức năng
bảo vệ, phân hủy các
chất không có lợi cho
tế bào.
- Các protein vận
chuyển.
- Đóng vai trò trong
đặc tính bám dính của
một số loài.

- Góp phần tạo tính kỵ
nước cho biofilm
- Đóng vai trò trong
việc sáp nhập/phân
tách của vi sinh vật.
- Tạo tính kỵ nước cho
toàn bộ cấu trúc
- Có đặc tính kháng
khuẩn, kháng nấm.
Là môi trường để vận
chuyển các chất trong
chất nền biofilm.

[76] [58]

[47] [55]

[2]

[2]

1.3.2. Sự hình thành và vai trò của biofilm đối với vi khuẩn
1.3.2.1. Sự hình thành màng biofilm
Màng biofilm là dạng tồn tại phổ biến của vi sinh vật, chúng có bản chất là chất nền
hoạt động sinh học của các tế bào và các chất ngoại bào liên kết với bề mặt rắn. Sự hình
thành màng biofilm trải qua 3 giai đoạn chính: 1) Sự kết dính (attachment); 2) Sự tích tụ và
trưởng thành (Accumulation/ maturation); 3) Sự tách rời và phân tán (Detachment/
dispersal). Các giai đoạn hình thành màng biofilm được tóm tắt qua hình 1.2.

9

Hình 1.2: Sơ đồ các bước hình thành biofilm ở vi sinh vật [71]
Bước 1: Kết dính. Đây là giai đoạn tiếp cận đầu tiên, các vi sinh vật bám dính và
sinh sản nhanh trên bề mặt. Một số protein bề mặt (như protein gắn fibronectin, các yếu tố
đông máu, các plasmid nhạy cảm với protein) có chức năng nhận biết các phân tử chất nền
kết dính và được gắn với các thành phần của chất nền để bắt đầu cho sự kết dính, hình thành
biofilm [46]. Trong suốt quá trình này, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm
như độ phân cực, lực Val Der Waals, tương tác kỵ nước [71].
Bước 2: Tích tụ và trưởng thành. Sau khi các tế bào vi sinh vật gắn được trên bề
mặt thì chúng hình thành các vi khuẩn lạc (microcolony) ổn định, tăng sinh và kết dính với
nhau. Polysaccharid có nhiệm vụ kết dính các tế bào và là yếu tố cần thiết để dẫn đến sự
hình thành màng biofilm. Trong pha tích lũy này, vi sinh vật nhân lên và hình thành các
cụm tế bào xếp thành lớp ở trên bề mặt. Khi lớp thứ nhất của biofilm được tạo thành, các
vi khuẩn cùng loài và khác loài tiếp tục tập trung, tạo thành các lớp tiếp theo. Các vi khuẩn
lạc từ đó phát triển thành các khuẩn lạc lớn hơn (macrocolony). Màng biofilm phát triển từ
một lớp mỏng thành một cấu trúc có hình nấm, hình tháp và được bao bọc bởi EPS [19].
EPS tạo thành trong giai đoạn này có vai trò gắn kết các tế bào với bề mặt, đồng thời là lớp
rào chắn bảo vệ vi sinh vật bên trong dưới các điều kiện khắc nghiệt. Các vi sinh vật bên
10


trong chất nền EPS được sắp xếp thứ tự dựa theo mối liên hệ về chuyển hóa và hô hấp của
chúng. Ví dụ, các vi khuẩn kỵ khí thường nằm ở lớp dưới biofilm để tránh tiếp xúc với oxy.
Bên trong chất nền EPS, các tế bào truyền cho nhau các tín hiệu quorum sensing (QS) để
kiểm soát mật độ, dẫn đến tiếp cận và tách rời của các tế bào từ màng biofilm [16] [54].
Bước 3: Phân tách. Đây là giai đoạn rất quan trọng đối với vòng đời của màng
biofilm. Có nhiều yếu tố dẫn đến quá trình trên như sự cạn kiệt chất dinh dưỡng, sự cạnh
tranh khốc liệt giữa các vi sinh vật hoặc mật độ tế bào quá lớn. Việc phân tách có thể xảy
ra ở một vị trí hoặc tất cả các vị trí trong màng biofilm. Việc giải phóng các tế bào dạng tự

do dẫn đến sự bắt đầu hình thành màng biofilm mới ở các vị trí khác [54].
1.3.2.2. Vai trò của màng biofilm
Màng biofilm là hình thức tồn tại phổ biến của vi sinh vật trong tự nhiên, giúp chúng
tạo ra các vi môi trường thuận lợi cho quá trình sinh trưởng, tránh khỏi các bất lợi ở điều
kiện bên ngoài. Với sự có mặt của các polysaccharid và protein, màng biofilm có thể chống
lại cơ chế đề kháng đặc hiệu/không đặc hiệu của vật chủ và cho phép vi khuẩn chống lại
các chất kháng khuẩn (chất khử trùng, kháng sinh), hoặc các yếu tố bất lợi như oxy đối với
các loài kỵ khí [22]. Hiện tại có 3 giả thuyết giải thích sự đề kháng của biofilm với kháng
sinh. Thứ nhất, thành phần màng biofilm có chất nền EPS bao quanh các vi sinh vật, đóng
vai trò như một hàng rào ngăn cản sự khuếch tán của kháng sinh vào bên trong lớp màng
[34]. Thứ 2, bên trong màng biofilm, một số vi khuẩn rơi vào trạng thái tăng trưởng chậm
do thiếu chất dinh dưỡng hoặc tích lũy các chất chuyển hóa có hại, và do đó chúng tồn tại.
Thứ ba, bên trong màng biofilm có một tiểu quẩn thể vi sinh vật riêng biệt, có kiểu hình đề
kháng cao với kháng sinh [43]. Do đó, màng biofilm của các vi khuẩn là một trong những
nguyên nhân gây ảnh hưởng xấu đến đời sống và sức khỏe con người. Ví dụ, màng biofilm
tạo bởi Pseudomonas aeruginosa gây ra nhiễm khuẩn hô hấp mạn tính ở những bệnh nhân
vị xơ hóa nang (cystic fibrosis patients), Staphylococcus aureus còn tạo màng biofilm bám
vào các thiết bị y tế như máy điều hòa nhịp tim (paramaker) [26]. Bên cạnh đó, một nghiên
cứu khác cho thấy sự hình thành màng biofilm ở các vi sinh vật gây bệnh làm giảm khả
năng đáp ứng của bệnh nhân với thuốc và cho những kết quả không mong muốn sau khi
phẫu thuật. Các tế bào vi khuẩn được bao bọc bên trong màng biofilm có thể kháng lại sức

11


đề kháng của vật chủ như hệ thống miễn dịch và làm tăng khả năng kháng kháng sinh lên
tới 1000 lần, gây nên nhiều khó khăn trong việc điều trị bệnh và gây ảnh hưởng xấu đến
chất lượng cuộc sống của bệnh nhân [48].
Màng biofilm còn có thể kháng lại một số lực cơ học và giúp vi sinh vật bên trong
chịu được sự thiếu hụt chất dinh dưỡng, sự thay đổi pH, các gốc oxi hóa và các chất khử

trùng. Bên cạnh đó, màng biofilm còn có chức năng giữ nước, hấp phụ các chất hữu cơ để
cung cấp các chất dinh dưỡng và hấp phụ các ion vô cơ để đào thải chất độc từ môi trường
[33]. Một số vai trò khác của màng biofilm được tóm tắt qua bảng 1.3.
Bảng 1.3: Một số vai trò của màng biofilm [28]
Chức năng

Vai trò đối với vi sinh vật

Các thành phần
tham gia

Hoạt tính enzym

Cho phép thoái hóa các đại phân tử
ngoại sinh để thu nhận các chất dinh
dưỡng và thoái hóa EPS cấu trúc giúp
các tế bào có thể ly giải ra khỏi màng
biofilm.

Protein

Trao đổi các thông
tin di truyền

Tạo điều kiện cho sự trao đổi thông tin
di truyền giữa các tế bào.

ADN

Cho và nhận điện tử

Cho phép các phản ứng oxi hóa xảy ra
trong chất nền biofilm

Giải phóng các thành
Giải phóng vật chất tế bào
phần của tế bào
Giảm năng lượng dư
thừa
Gắn các enzym

Các protein, các hợp
chất humic.
Acid nucleic, enzyme,
lipopoly-saccharid,
phospholipid.

Tích trữ nguồn carbon khi vượt quá
Các polysaccharid
mức khi tỷ lệ carbon-nitơ mất cân bằng.
Bằng cách tương tác với các
Các polysaccharid và
polysaccharid, các enzym được tích
enzym.
lũy, giữ lại và ổn định.

12


1.3.3. Khả năng hình thành biofilm ở các loài vi khuẩn

Trong cùng một điều kiện môi trường, khả năng hình thành biofilm giữa các vi khuẩn
có sự khác biệt. Các cấu trúc đặc trưng và yếu tố sinh học của tế bào vi khuẩn đều liên quan
đến sự hình thành biofilm. Sự di động thông qua roi (Flagella mediated mobility) được cho
là có vai trò quan trọng trong việc vượt qua lực cản bề mặt của chất nền và cần thiết cho sự
bám dính ban đầu cũng như sự hình thành các khuẩn lạc [67]. Sự hình thành biofilm có liên
quan đến roi (flagellum) ở một số loài vi khuẩn như Escherichia coli và Aeromonas
hydrophila. Ngoài ra, polysaccharid ngoại bào có vai trò quan trọng nhất trong việc tạo nên
khung cấu trúc của biofilm. Bên cạnh đó, các phân tử tín hiệu quorum sensing (QS) như Nacyl-homoserin lacton (AHLs), có bản chất là các acid amin không thiết yếu [43] và các
yếu tố sinh học cũng có liên quan đến sự hình thành biofilm của một số vi khuẩn. Tóm lại,
tầm quan trọng tương đối của các yếu tố liên quan đến khả năng hình thành biofilm của vi
khuẩn được sắp xếp như sau: polysaccharid ngoại bào > roi > AHLs > protein ngoại bào >
khả năng di động theo nhóm [34].
1.3.4. Tác dụng ức chế hình thành biofilm của vi khuẩn có lợi và ứng dụng
Probiotic hay lợi khuẩn là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe của vật chủ
khi được sử dụng với một liều lượng hợp lý. Các vi khuẩn có lợi còn mang một số đặc tính
chuyên biệt như kháng lại môi trường acid và muối mật (trong hệ đường ruột), bám dính
tốt trên bề mặt niêm mạc (các hốc tự nhiên) và cạnh tranh được với các yếu tố gây bệnh.
Chính vì vậy các lợi khuẩn được sử dụng để cân bằng hệ sinh vật trong đường tiêu hóa hay
trong các vị trí như khoang miệng, tai mũi họng, âm đạo [68].
Tuy nhiên, trong y tế, các vi sinh vật có khả năng tạo biofilm là một mối nguy hại
lớn đến sức khỏe con người do chúng là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh truyền nhiễm
như viêm nội tâm mạc, viêm tai giữa, nhiễm trùng tiết niệm và bệnh xơ nang [10]. Phần
lớn các bệnh có thể gây nguy hại đến tính mạng con người có liên quan đến các nhiễm trùng
do vi khuẩn bám dính trên bề mặt và hình thành biofilm trên các mô, cơ quan, thiết bị y tế
và các thiết bị trong công nghiệp thực phẩm [7]. Các trường hợp nhiễm trùng gây ra bởi
các vi khuẩn tạo biofilm thường khó điều trị bằng kháng sinh và biofilm làm tăng khả năng
kháng kháng sinh của vi khuẩn từ 100 đến 1000 lần so với các tế bào vi khuẩn tự do. Nằm

13

trong cấu trúc biofilm, các tác nhân gây bệnh này có thể không bị tiêu diệt bởi các loại
kháng sinh và thuốc sát trùng, dẫn đến bệnh khó chữa khỏi [48]. Gần đây, các nhà khoa học
đã quan tâm đến hiện tượng ức chế hình thành biofilm của các lợi khuẩn trên các vi khuẩn
gây bệnh, ví dụ các vi khuẩn có lợi như Enterococcus faecium WB2000 và Bifidobacterium
adolescentis SPM1005 có khả năng ức chế sinh trường cũng như sự hình thành biofilm của
Streptococcus mutans, một loại cầu khuẩn kỵ khí thường gây sâu răng ở người [7] [41].
Thêm vào đó, trong nghiên cứu của Taheura và cộng sự (2016), một số chủng LAB có khả
năng ức chế hình thành biofilm của Bacillus cereus và Streptococcus salivarius, do đó
chúng được đề xuất sử dụng để phòng bệnh sâu răng và có tiềm năng ứng dụng trong sản
xuất thực phẩm chức năng phòng các bệnh răng miệng [68]. Tương tự, nghiên cứu của
Sciak (2017) còn cho thấy rằng, các lợi khuẩn bao gồm Lactobacillus salivarius có khả
năng ức chế hình thành biofilm của Streptococcus mutans và Candida albicans (một loại
nấm gây viêm đường sinh dục và làm suy giảm hệ miễn dịch) dẫn đến ức chế sự hình thành
sợi, quả thể của nấm và làm giảm khả năng gây bệnh do Candida albicans [60].

14


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu dịch kim chi được làm truyền thống (KCTT), dịch kim chi trong chế phẩm
công nghiệp (KC cut), dịch sốt kim chi (KC saurce) được sử dụng trong quá trình phân lập
vi khuẩn lactic. Các mẫu kim chi được làm từ cải bắp, cải thảo và lên men theo phương
pháp truyền thống ở Hàn Quốc. Các chế phẩm thương mại đều đạt tiêu chuẩn an toàn thực
phẩm HACCP (Hazard analysis and critical control points).
Thông tin về các mẫu kim chi được tóm tắt ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Các mẫu kim chi Hàn Quốc sử dụng để phân lập vi khuẩn lactic
Mẫu

Nguồn gốc

Ký hiệu

Thời điểm lấy mẫu

Kim chi truyền thống

Hàn Quốc

KCTT1

01/2016

Kim chi truyền thống

Hàn Quốc

KCTT2

07/2018

Cut Cabbage KimChi (Jongga)

Hàn Quốc

KC cut

07/2018

Kimchi Sauce (Hyomoro)

Hàn Quốc

KC sauce

07/2018

2.1.2. Chủng vi khuẩn kiểm định
Bộ vi sinh vật kiểm định ESKAPE thuộc phòng Vi sinh Y học, Viện Vi sinh vật và
Cộng nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội được sử dụng trong quá trình đánh giá hoạt
tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập được. Bộ VSV kiểm định
ESKAPE bao gồm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia,
Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus feacalis.
Các chủng vi khuẩn kiểm định được sử dụng trong quá trình thử khả năng ức chế sự
hình thành biofilm bao gồm: Staphylococcus aureus ATCC 12275 (Bộ VSV kiểm định
ESKAPE), Pseudomonas aeruginosa VTCC 10657 do Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi sinh
vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp.

15


2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Sinh thái Vi sinh vật, Phòng Nghiên cứu và
phát triển Công nghệ cao, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – ĐHQGHN, sử dụng
các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hóa phân tích đạt
tiêu chuẩn quốc tế.
 Bể ổn nhiệt Jeio Tech, Hàn Quốc

 Máy đo pH Horiba, Nhật Bản
 Máy ly tâm Eppendoff, Đức
 Máy PCR Eppendorf, Đức
 Máy điện di ngang Nyx Technik, Mỹ
 Máy GelDoc BioRad, Mỹ
 Máy đo quang phổ UV – Vis (GBC Instrument, Úc)
 Kính hiển vi phản pha và huỳnh quang Zeiss, Đức
 Máy định lượng ADN eppendorf biophotometer plus, Đức
 Máy giải trình tự tự động 3110 Avant Appied Biosystems, Đức
Ngoài ra, một số thiết bị, dụng cụ cần thiết khác được sử dụng trong quá trình nuôi
cấy vi khuẩn như: bình serum, bình khí Nitơ, ống nghiệm nút xoáy và màng lọc vi khuẩn.
2.1.3.2. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật và trong các thí nghiệm sinh
học phân tử gồm: glucose, NaCl, MgSO4, KH2PO4, CaCO3, CH3COONa, MnSO4,
glycerol, EDTA, KOH, HCl, Tris-HCl, SDS và một số các hóa chất khác sử dụng trong kỹ
thuật sinh học phân tử. Các loại hóa chất có độ tinh khiết cao được mua từ những hãng sản
xuất có uy tín như Thermo Scientific, Biobasic, Merck, Sigma, Wako.

16


Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu gồm có MRS
(Bảng 2.2) và LB (Bảng 2.3).
Bảng 2.2: Thành phần môi trường MRS
Hóa chất

Khối lượng (g/L)

Peptone

10

Beef extract

10

Yeast extract

5

Glucose

20

Tween 80

1

KH2PO4

2

CH3COONa

5

C6H5O7(NH4)3

2

MgSO4.7H2O

0,2

MnSO4.nH2O

0, 05

Nước cất

Vừa đủ

Bảng 2.3: Thành phần của môi trường LB
Hóa chất

Khối lượng (g/L)

Yeast extract

5

Bacto-Tripton

10

NaCl

5

Nước cất

Vừa đủ

Điều chỉnh đến pH = 7.0 bằng dung dịch NaOH 1M hoặc H2SO4
1M

17