Nghiên cứu một số bất thường di truyền phối hợp ở bệnh nhân lơ xê mi cấp m3 tại bệnh viện bạch mai từ 2014 đến 2018

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lơ xê mi cấp (LXMC) thể M3 theo phân loại FAB hay LXMC thể tiền
tủy bào (APL- Acute promyelocytic leukemia) là một thể bệnh đặc biệt của
nhóm LXMC dòng tủy. Bệnh hay gặp ở người trẻ, tuổi trung bình của bệnh
nhân LXMC M3 theo nhiều nghiên cứu đều khoảng 40 tuổi, đây là nhóm tuổi
trẻ hơn so với các thể LXMC khác [1], [2]. Đặc biệt, bệnh nhân LXMC M3
thường biểu hiện tình trạng xuất huyết rầm rộ, thậm chí có thể dẫn đến tử
vong do xuất huyết nặng. Chính do những lí do ấy mà thể bệnh này được
quan tâm và nghiên cứu từ rất sớm. Đến những năm 1970 các nhà khoa học
đã phát hiện ra chuyển đoạn giữa NST 15 và NST 17 tạo ra gen kết hợp
PML/RARα là bất thường di truyền đặc trưng của thể bệnh LXMC M3. Theo
tác giả Sandy D Kotial chuyển đoạn NST t(15;17) gặp ở 95% bệnh nhân
LXMC M3 [1]. Từ những hiểu biết về di truyền đó đã giúp phát hiện ra tác
dụng của ATRA trên BN LXMC M3. Trong vòng 50 năm, từ khi ATRA được
sử dụng thư thuốc điều trị nhắm trúng đích đã làm thay đổi hoàn toàn tiên
lượng của LXMC M3, từ thể bệnh có tỷ lệ tử vong cao thành thể bệnh có tỷ lệ
chữa khỏi cao. Người ta thấy nhiều hơn 90% bệnh nhân LXMC M3 đạt lui
bệnh hoàn toàn và hơn 75% bệnh nhân đươc chữa khỏi khi sử dụng ATRA kết
hợp hóa chất [3], [4].
Tuy bệnh nhân LXMC M3 được điều trị bằng ATRA mang lại hiệu quả
rất đáng kể, làm thay đổi hoàn toàn tiên lượng của nhóm bệnh nhân này,
nhưng trong quá trình diều trị người ta vẫn thấy có một số bệnh nhân có biểu
hiện rất nặng trên lâm sàng ngay từ khi phát hiện, không đáp ứng với điều trị
bằng ATRA hoặc tái phát sớm. Nhiều tác giả đã thấy rằng những bệnh nhân
này có tổn thương phức tạp về số lượng và cấu trúc bên cạnh t(15;17) đặc
trưng trên phân tích NST [5], [6]. Tuy nhiên, đa số các nhận xét trên được rút
ra từ những báo cáo ca bệnh, cũng có một số nghiên cứu được tiến hành

2

nhưng kết quả cho thấy không có mối liên quan hoặc mối liên quan yếu giữa
nhóm t(15;17) phối hợp với đột biến NST khác với kết quả điều trị.
Ngoài phân tích NST, bệnh nhân LXMC M3 được phân tích di truyền
sinh học phân tử có thể phát hiện thấy một số yếu tố liên quan đến mức độ
nặng như dạng S-form của gen PML/RARα [7] hay các nhóm đột biến FLT3ITD và NPM1-Muta [8]. Một số tác giả thấy rằng tỷ lệ BN có biểu hiện xuất
huyết rầm rộ ở nhóm PML/RARα S-form cao hơn nhóm L-form. Tỷ lệ đột
biến FLT3-ITD và NPM1-Muta chiếm tỷ lệ cao và có ý nghĩa tiên lượng trong
LXMC dòng tủy nói chung tuy nhiên trong các bệnh nhân thể M3 tần suất và
ý nghĩa tiên lượng của các đột biến này vẫn còn là vấn đề tranh cãi.
Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu một
số bất thường di truyền phối hợp ở bệnh nhân Lơ xê mi cấp M3 tại bệnh
viện Bạch Mai từ 2014 đến 2018” với hai mục tiêu sau:
1.
2.

Mô tả biến đổi di truyền ở bệnh nhân Lơ xê mi cấp M3.
Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm và đáp ứng điều trị theo
các nhóm biến đổi di truyền.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm chung
1.1.1. Định nghĩa
Lơ xê mi cấp là một nhóm bệnh đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy
trong tủy xương và ở máu ngoại vi của những tế bào tạo máu chưa trưởng

thành, ác tính (blast). Lơ xê mi cấp chính là hậu quả của quá trình tăng sinh
mạnh các tế bào non kém biệt hóa. Những tế bào này sẽ dần dần thay thế và
ức chế quá trình trưởng thành và phát triển của các dòng tế bào bình thường
trong tủy xương. Các tế bào non ác tính sẽ lan tràn ra máu ngoại vi, thâm
nhiễm các tổ chức trong cơ thể gây ra các biểu hiện lâm sàng như gan lách
hạch to.
LXMC tiền tủy bào là thể mà các tế bào ác tính là các tiền tủy bào tăng
sinh hạt đặc hiệu hay nói cách khác là các tế bào dòng tủy bị gián đoạn trưởng
thành một cách ác tính ở giai đoạn tiền tủy bào. Các tế bào blast có hình thái
đặc trưng riêng của tiền tủy bào với nhân lớn, nguyên sinh chất nhiều hạt ưa
azua, que auer.
1.1.2. Dịch tễ
LXMC tiền tủy bào chiếm 5-15% trong tất cả các bệnh bạch cầu dòng
tủy. Tại Mỹ hàng năm có khoảng 30.800 trường hợp bệnh bạch cầu cấp được
chẩn đoán. Khoảng 1.000 trong số này là bệnh bạch cầu cấp tính thể M3 [1].
Tại Ý tỷ lệ mới mắc hàng năm của bệnh LXMC tiền tủy bào là khoảng 0,6
trên 1 triệu người. Trên thế giới có khoảng 21.700 bệnh nhân chết vì bệnh
bạch cầu mỗi năm nhưng chưa có số liệu rõ ràng là bao nhiêu trong số đó là
do bệnh LXMC tiền tủy bào.Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp tiền tủy bào ở nam
và nữ là như nhau. Độ tuổi trung bình khởi phát của bệnh khoảng 40 tuổi, ít
gặp trẻ em dưới 10 tuổi cũng như người cao tuổi [3].


4

Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng nhận thấy chỉ số BMI cơ thể ở bệnh
nhân LXMC tiền tủy bào lớn hơn các bệnh nhân mắc thể bệnh khác, đây cũng
là một hướng nghiên cứu thêm các chỉ số tiên lượng ở bệnh nhân vì liên quan
đến tình trạng rối loạn chuyển hóa mỡ ở bệnh nhân trước và sau điều trị.
Tại Việt Nam, nghiên cứu một vài năm gần đây cũng cho thấy tỷ lệ

LXMC tiền tủy bào trong số những bệnh nhân LXMC là 11% với tuổi mắc
bệnh khá trẻ, trung bình 30-40 tuổi [9].
1.1.3. Đặc điểm lâm sàng
Xuất huyết là đặc điểm nổi bật của LXMC tiền tủy bào. Các biểu hiện
xuất huyết thường rất đa dạng và nặng nề: xuất huyết dưới da, niêm mạc, xuất
huyết trong cơ, xuất huyết võng mạc, ho ra máu, đái máu, xuất huyết tiêu hóa,
ở bệnh nhân nữ hay thấy kinh nguyệt kéo dài với số lượng nhiều. Đặc biệt
trước đây, xuất huyết não là nguyên nhân gây tử vong của 10-30% các trường
hợp ngay từ những ngày đầu tiên phát hiện bệnh hoặc trong quá trình điều trị
hóa chất. Nguyên nhân xuất huyết ngoài do giảm tiểu cầu như trong những
thể LXMC khác thì chủ yếu còn do nguyên nhân rối loạn đông máu, trong đó
phần lớn là DIC [10]. Có một tỷ lệ nhỏ (5,1%) các trường hợp biểu hiện lâm
sàng là tình trạng huyết khối nhưng kết quả xét nghiệm vẫn cho thấy tình
trạng đông máu nội mạch rải rác.
Thiếu máu khá phổ biến trong LXMC tiền tủy bào. Bên cạnh tình trạng
ức chế sinh máu tại tủy của các tế bào ác tính, tình trạng xuất huyết nặng nề
cũng là nguyên nhân gây nên thiếu máu.
Các biểu hiện hay gặp khác của LXMC như sốt, gan lách hạch to ít gặp
hơn ở LXMC tiền tủy bào.
Thâm nhiễm da và thần kinh trung ương khá hiếm gặp ở những bệnh
nhân mới chẩn đoán lần đầu.


5

1.1.4. Đặc điểm cận lâm sàng
Tế bào học
Máu ngoại vi: ở máu ngoại vi của các bệnh nhân LXMC tiền tủy bào
thường cho thấy tình trạng giảm số lượng hồng cầu đa phần mức độ vừa và
nặng, số lượng tiểu cầu giảm động học theo diễn biến của DIC, số lượng bạch

cầu thường không cao (phần đông là dưới 5G/l) nên dễ bỏ sót chẩn đoán nếu
không quan sát kỹ tiêu bản máu. Tuy nhiên biến thể M3v lại thường có số
lượng bạch cầu cao (50-200G/l) và là một trong những yếu tố tiên lượng mắc
hội chứng retinoic trong quá trình điều trị ATRA.
Tế bào học tủy xương và hóa học tế bào là xét nghiệm quan trọng quyết
định chẩn đoán của bệnh nhân và điều trị trước cả khi có kết quả gen do tính
chất cấp tính của bệnh. Ở thể M3, đại đa số các tế bào có nhân trong tủy
xương (30-90%) là các TTBAT. Các tiền tủy bào này có đường kính khoảng
15-20µm với bào tương rộng vừa phải, chứa đầy các hạt đặc hiệu đôi khi trùm
kín lên nhân, các hạt ưa azua này lớn hơn, thô và bắt màu thuốc nhuộm sậm
hơn so với các tiền tủy bào bình thường. Một số tế bào có rất nhiều thể Auer
được gọi là faggot cell. Các tế bào này cho phản ứng rất mạnh với MPO,
soudan đen. Chính vì hình thái đặc biệt này mà nhuộm Giemsa cũng đã có thể
xác định được bệnh. Biến biến thể M3v, gọi là thể vi hạt, chiếm 20-25%
LXMC tiền tủy bào, có hình thái học của các TTBAT tương đối giống
monoxit với bào tương xám mờ, khá mịn, bờ nhân không đều, nhân cuộn và
không rõ hạt nhân nên dựa trên tiêu bản nhuộm Giemsa có thể nhầm với thể
M4, M5. Lúc này việc chẩn đoán cần dựa vào hóa học tế bào (vì chúng vẫn có
tính phản ứng bắt màu mạnh với MPO và soudan đen) và xét nghiệm gen
(chuyển đoạn gen đặc trưng PML/RARα)


6

* Miễn dịch học
LXMC tiền tủy bào có đặc trưng miễn dịch là: HLA-DR âm tính, CD33
và CD9 dương tính, CD14 âm tính. CD34 thường âm tính hoặc có tỷ lệ dương
tính rất thấp tuy nhiên có một số trường hợp người ta nhận thấy CD34 dương
tính ở mức cao và có sự liên quan với tăng số lượng bạch cầu, loại gen kết
hợp PML/RARα hoặc biến thể M3v. Một số trường hợp về hình thái học và

kết quả miễn dịch giống với M3v nhưng khi kiểm chứng bằng di truyền tế bào
thì không thấy có chuyển đoạn đặc trưng t(15;17) mà chỉ có bất thường nhiễm
sắc thể 17, những bệnh nhân này không có đáp ứng điều trị với ATRA, điều
này mang ý nghĩa về mặt tiên lượng.
1.2. Điều trị
1.2.1. ATRA và cơ chế tác dụng
LXMC tiền tủy bào khác với các thể LXMC khác là tỷ lệ tử vong
nhanh cao do rối loạn đông máu. Nguyên nhân là do TTBAT chứa rất nhiều
enzyme tiêu protein và tiêu fibrin trong các hạt đặc hiệu. Vì vậy mà khi điều
trị hóa chất cho bệnh nhân, các TTBAT vỡ ra sẽ giải phóng càng nhiều hạt đặc
hiệu và gây rối loạn đông máu nặng nề hơn dẫn đến nguy cơ tử vong nhanh.
ATRA có hoạt động khác với hóa chất ở chỗ nó không tiêu diệt tế bào mà lại
biệt hóa tế bào ung thư thành tế bào dòng hạt trưởng thành. Người ta giả
thuyết ATRA có tác dụng ít nhất trên 2 giai đoạn của quá trình phát triển của
dòng tủy: tác dụng lên tiền tủy bào ác tính và tế bào nguồn sinh u giai đoạn
sớm (earlier neoplastic progenitor cell –loại tế bào có khả năng tự non hóa và
biệt hóa định hướng dòng tủy). Tác dụng biệt hóa này của ATRA là một chiều
đi từ tế bào ung thư cho tới tế bào trưởng thành rồi đi vào chu trình chết theo
chương trình.


7

Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của ATRA và ATO
(Nguồn: />Tác dụng của ATRA lên tế bào nhạy cảm dòng NB4 được thiết lập theo
2 bước tấn công biệt hóa TTBAT: bước đầu phụ thuộc retinoid (RA), các tế
bào sẽ trưởng thành thuần thục khi có retinoid, bước thứ hai phụ thuộc AMP
vòng-khởi động mồi RA của tế bào để kết thúc quá trình biệt hóa. Nồng độ
ATRA từ 10-9-10-8M sẽ có thể làm kết thúc quá trình biệt hóa TTBAT với sự
có mặt của AMP vòng. ATRA có thể làm tăng ngay lập tức lượng AMP vòng

nội bào và hoạt hóa con đường protein kinase A (PKA) sau khi dùng thuốc.
Tác dụng này bị hủy bỏ ngay khi có chất kháng PKA, điều này gợi ý rằng có
sự phối hợp cơ chế hoạt hóa giữa tín hiệu nhân RA và tín hiệu phối hợp AMP
vòng/PKA trên màng tế bào.
Retinoid có tác dụng lên tạo máu thông qua hai họ receptor nhân là
RARs và retinoid X receptor (RXRs). RARs và RXRs có hoạt động giống
như yếu tố liên kết tấn công cho quá trình sao mã. RARα là một protein tổ


8

hợp với RXR và phức hợp RAR/RXR này gắn lên vị trí đáp ứng với RA
(RARE-RA response eleenzymet) nằm trên vùng khởi động của gen đích. Khi
gắn retinoid, tổ hợp RAR/RXR bị phân ly về mặt hóa học với sự hoạt động
của histone deacetylase (HDAC) và phức hợp cũng bị phân hủy với đồng yếu
tố hoạt hóa histone acetylase.
PML-RARα có thể ảnh hưởng đến quá trình sao mã theo các cách khác
nhau liên quan đến yếu tố sao mã APL và yếu tố đáp ứng với interferon (IFN).
ATRA có thể thúc đẩy gen IRF-1(INF regulatory factor-1) tiến hành sao mã.
Biểu hiện của IRF-1 phối hợp với biểu hiện của IFN và gen đích IFN sẽ làm
ngừng phát triển tế bào và dẫn đến apoptosis. Như vậy IFN đóng vai trò trung
gian điều hòa với tác dụng của ATRA lên biệt hóa tế bào.
ATRA có tác dụng dị hóa PML/RARα, đây là cơ chế hoạt động chính
để biệt hóa tế bào TTBAT. Dưới nồng độ dược lý (10 -7- 10-6M), sự thay đổi
cấu hình của PML/RARα là do giải phóng các đồng yếu tố kìm hãm và
HDAC; tăng cường các phức hợp đồng hoạt hóa dẫn đến giải phóng các kìm
hãm sao mã. Các thực nghiệm cũng như các nghiên cứu lâm sàng dựa trên
những trường hợp có chuyển đoạn t(11;17) và protein PLZF/RARα đã cho
thấy sự tương hỗ giữa các đồng yếu tố ức chế và HDAC của phần RARα
trong PLZF/RARα sẽ bị điều chỉnh bởi ATRA ở nồng độ 10 -6M. Tuy nhiên

phần gắn của PLZF lên phức hợp đồng ức chế trên vùng POZ tại N tận cùng
thì vẫn tồn tại dù ở nồng độ ATRA rất cao (10 -5M). Vì vậy mà ATRA không
thể tạo được biệt hóa cho những tế bào mang gen kết hợp PLZF/RARα mà
mức độ ức chế HDAC lại phụ thuộc vào khả năng biệt hóa tế bào của ATRA.
Vì vậy mà nghiên cứu phá hủy histone deacetylase là một hướng điều trị cho
những bệnh nhân kháng ATRA.
ATRA thông qua AMP vòng, làm thúc đẩy mạnh mẽ quá trình sao mã,


9

khôi phục chức năng RXR, lập lại khả năng gây biệt hóa của những tế bào bị
biến đổi gen, ức chế các tế bào đã phát triển và điều tiết sự thay đổi ở pha
G1/S của quá trình phân bào [41]. Cơ chế thực sự của quá trình này thực ra
còn chưa được hiểu hết, tuy nhiên hoạt động xuôi chiều của protein kinase A
(PKA) là có khả năng phosphoryl hóa RARα, và cũng như vậy với
PML/RARα, điều chỉnh tương hỗ giữa các receptor, các đồng yếu tố ức chế
và các phức hợp đồng hoạt hóa. Và kết quả của quá trình điều chỉnh- thoái
giáng của cả PML/RARα hay RARα type nguyên thủy là thay đổi sâu sắc khả
năng sao mã của tế bào. ATRA cũng có thể làm tăng biểu hiện ức chế protein
p21 cyclin phụ thuộc kinase trên tế bào dòng tủy vì vậy mà dừng chu trình
tế bào ở pha G1. Một số nghiên cứu gần đây đã cho thấy gen C/EBP β và
sản phẩm protein của nó đóng vai trò quan trọng trong trong quá trình biệt
hóa TTBAT dưới tác dụng của ATRA. Đây được coi là gen đích của
PML/RARα phụ thuộc ATRA. Protein C/EBPβ là một thành viên trong họ
yếu tố sao mã C/EBP biểu hiện trên TTBAT dòng NB4, được xác định là
yếu tố châm ngòi cho quá trình biệt hóa TTBAT khi có mặt ATRA, tuy
nhiên chỉ trong trường hợp bệnh nhân có đột biến gen PML/RAR α. Người
ta thấy nồng độ protein C/EBPβ tăng nhanh ở tế bào HL60 khi có mặt
ATRA với liều dược lý.

Như vậy khả năng thúc đẩy biệt hóa của ATRA với TTBAT dựa trên hệ
thống sao mã và hệ thống protein bao gồm: tấn công một dãy các yếu tố sao
mã và đồng yếu tố, hoạt hóa tín hiệu canxi, thúc đẩy con đường INF, cần thiết
cho thoái hóa PML/RARα và khôi phục PML thể nhân thông qua hoạt động
của hệ thống ubiquitin/proteasome (UPS), ức chế chu kỳ tế bào, tấn công
cyclooxygenase 1, ức chế tân tạo mạch, giảm yếu tố tổ chức, tăng khả năng
chết theo chương trình. Một loạt các can thiệp trong biến đổi gen và chuyển


10

hóa kể trên sẽ đưa đến kết quả là các tiền tủy bào ác tính cuối cùng sẽ có thể
biệt hóa và chết theo chương trình (PCD-programmed cell death)
1.2.2. Phác đồ điều trị
Phác đồ tiêu chuẩn ở Châu Âu có áp dụng những yếu tố liên quan đến
tiên lượng là phác đồ LPA 99 và APL2000, nằm trong thử nghiệm PETHEMA
(Programa para el Estudio de la Terapéutica en Hemopatía Maligna).
Phác đồ APL2000 chia bệnh nhân theo nhóm tuổi và số lượng bạch cầu:
Với BN dưới 60 tuổi có số lượng bạch cầu dưới 10G/l sẽ dùng ATRA
45mg/m2 da tới lui bệnh hoàn toàn. Daunorubicin 60mg/m2 da/ngày trong 3
ngày và có thể dùng kèm ARA-C 200mg/m2 da/ngày trong 7 ngày hoặc chỉ
dùng daunorubicin đơn độc.
Sau lui bệnh hoàn toàn bệnh nhân được dùng 2 đợt:1) Daunorubicin
60mg/m2 da/ngày trong 3 ngày và ARA-C 200mg/m2 da/ngày trong 7 ngày.
2) Daunorubicin 45mg/m2 da/ngày trong 3 ngày và ARA-C 1g/m2 da/12h
trong ngày từ ngày 1-4.
Nhóm bệnh nhân ≤60 tuổi với số lượng bạch cầu ≥10G/l sẽ được điều
trị như nhóm có dùng Ara-C nhưng tăng liều lên 2g/m2 da/12h trong 5 ngày
với bệnh nhân<50 tuổi và 1,5g/m2 da/12h trong 5 ngày với bệnh nhân≥50
tuổi. Các bệnh nhân đều được tiêm tủy sống phòng thâm nhiễm thần kinh

trung ương bằng methotrexat 15mg, Ara-C 50mg và depomedrol.
Nhóm bệnh nhân tuổi >60 với số lượng bạch cầu <10G/l được điều trị
như nhóm <60 tuổi không dùng Ara-C. Điều trị củng cố 2 đợt bằng
daunorubicin 60mg/m2 da/ngày trong 3 ngày và 45mg/m2 da/ngày trong 3
ngày ở đợt tiếp theo.
Nhóm bệnh nhân>60 tuổi có số lượng bạch cầu cao≥10G/l sẽ được điều trị
như nhóm bệnh nhân trẻ có số lượng bạch cầu <10G/l nhưng có dùng Ara-C.
Tất cả các bệnh nhân đều được điều trị duy trì bằng 6MP, methotrexat và


11

all trans retinoic acid (ATRA)
Phác đồ APL 2000 được áp dụng từ 2000-2004 ở 63 trung tâm của châu
Âu cho kết quả 97,2% lui bệnh hoàn toàn và tỷ lệ tái phát sau 2 năm là 4,5%,
không có bệnh nhân kháng thuốc.
Tại Việt nam
ATRA đã được tác giả Đỗ Trung Phấn triển khai áp dụng lần đầu vào
năm 1999, sau đó ATO được sử dụng cho những bệnh nhân tái phát 2002. Kết
quả lui bệnh hoàn toàn với những bệnh nhân sử dụng ATRA đơn thuần
là>70%. Tỷ lệ tái phát sau 2 năm là 49%. Các bệnh nhân lui bệnh có chất
lượng sống tốt.
Hiện nay các bệnh nhân mới chẩn đoán được áp dụng điều trị ATRA
phối hợp daunorubicin và Ara-C.
Điều trị hỗ trợ bao gồm fraxiparin và truyền bổ sung các chế phẩm máu
với những trường hợp có rối loạn đông máu. Đồng thời sử dụng corticoid ngay
từ khi bắt đầu điều trị để ngăn ngừa hội chứng ATRA và giảm bớt nguy cơ rối
loạn đông máu sau điều trị hóa chất. Các bệnh nhân đều được điều trị duy trì
bằng 6MP, methotrexat và ATRA.
Với các trường hợp LXMC tiền tủy bào thứ phát hoặc tái phát người ta

có thể sử dụng ATRA phối hợp hóa chất hoặc sử dụng ATRA phối hợp ATO.
Nếu điều trị thất bại sẽ xem xét khả năng ghép tủy hoặc sử dụng gemtuzumab.
1.3. Cơ chế bệnh sinh
Chuyển đoạn t(15;17) và gen kết hợp PML/RARα gặp >95% các bệnh
nhân LXMC thể M3 được cho là đóng vai trò chính trong cơ chế bệnh sinh
của bệnh. RARα là gen mã hóa cho retinoic acid receptor α. Kết quả của gen
kết hợp này là ức chế chức năng bình thường của RARα lên quá trình biệt hóa
của dòng bạch cầu hạt trung tính. Thêm vào đó, PML/RARα làm phá vỡ thể


12

nhân mà PML là một phần trong đó và kết quả là mất đi tác dụng ức chế quá
trình phát triển sinh u của PML do sản phẩm protein PML đã biến đổi [10].
Gen RARα nằm trên NST số 17 đóng vai trò quan trọng trong biệt hóa
của nhiều loại tế bào và chức năng này được điều chỉnh thông qua retinoic
acid receptor (RAR). Sản phẩm protein của RARα bình thường có chức năng
hoạt hóa quá trình sao mã của các gen giúp tế bào có thể trưởng thành. Protein
RARα có tác dụng như một chất gắn gây ra hiện tượng sao mã bằng cách gắn
với yếu tố đáp ứng đặc hiệu ở vùng promotor của gen đích (RARE). Phức hệ
RARα-RARE-RXR khi gắn vào ADN sẽ khởi động quá trình sao mã của gen
đó. Gen kết hợp PML/RARα có thể kìm hãm sao mã một cách dai dẳng do ức
chế RARα vì vậy mà ngăn cản sự biệt hóa của tiền tủy bào [11].
Gen PML nằm trên NST 15 có vai trò mã hóa cho protein ức chế khối
u, đóng vai trò chủ đạo trong một số tín hiệu apoptosis. Gen PML còn hoạt
động như một đồng yếu tố sao mã với p53, một gen ức chế khối u.
Sản phẩm của gen PML là protein PML thuộc họ protein nhân liên
quan đến quá trình sao mã, có liên quan đến ức chế khối u và kiểm soát sự
bền vững của bộ gen. Protein này liên quan đến hiện tượng cảm ứng phụ
thuộc p53 của apoptosis, ức chế tăng trưởng, ức chế lão hóa tế bào trong đáp

ứng với phóng xạ ion hóa và tiến triển sinh u. Ngoài ra, protein PML còn ức
chế sao mã qua trung gian là các yếu tố ức chế khối u khác như Rb và Mad .
Cả protein PML và PML thể nhân đều bị phá vỡ trong LXMC tiền tủy
bào do phức hợp gen PML/RARα. Sự phá vỡ này sẽ làm mất chức năng sinh
lý bình thường của protein PML.
Điều thú vị là bản thân sự có mặt của phức hợp gen này không tự nó
làm ức chế ngay quá trình biệt hóa của dòng bạch cầu hạt. Đúng hơn là sự có
mặt của gen bệnh này làm thay đổi cán cân trong sinh máu dòng tủy theo


13

hướng kém trưởng thành. Sản phẩm của gen kết hợp tạo ra là một protein gây
ức chế sao mã dẫn đến tế bào ngừng biệt hóa và phát triển ác tính ở giai đoạn
tiền tủy bào. Khi tần số xuất hiện gen bệnh đạt đến khoảng 10-30%, lúc đó
bệnh biểu hiện qua các triệu chứng rầm rộ kết thúc thời gian tiềm tàng.
Khoảng thời gian này dao động từ 30 ngày đến 26 tháng.
1.4. Đặc điểm di truyền
1.4.1. Di truyền tế bào
-

Phân tích NST
Bên cạnh những bệnh nhân LXMC thể M3 cải thiện đáng kể sau điều
trị với ATRA đánh trúng đích, có một số bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng
xuất huyết rầm rộ, khó lui bệnh, hay sau điều trị có thể tái phát và tử vong
sớm. Nhiều tác giả đã thấy những bệnh nhân này thường có t(15;17) phối hợp
với đột biến NST khác nữa. Tuy nhiên, tác giả De Botton S nghiên cứu trên
292 bệnh nhân thấy có 26% bệnh nhân có bất thường di truyền NST ngoài
chuyển đoạn t(15;17), trong đó gặp nhều nhất là trisomy 8 (chiếm 46% bệnh
nhân có bất thường). Tuy nhiên sau khi so sánh các chỉ số đáp ứng điều trị,

thời gian lui bệnh… tác giả thấy rằng đây không phải là một yếu tố tiên lượng
đáp ứng điều trị không tốt cho bệnh nhân LXMC thể M3 [12]. Một nghiên
cứu khác của Takaaki Ono tiến hành tại Nhật Bản cũng cho kết quả tương tự
nghiên cứu của De Botton S,tác giả này nghiên cứu trên 225 bệnh nhân
LXMC M3 và thấy tỷ lệ T(15;17) phối hợp với đột biến NST khác là 30%,
trisomy 8 cũng là bất thường chiếm tỷ lệ nhiều nhất (31%), sau đó là các bất
thường trên NST số 15 (11%), bất thường trên NST số 9 (9%), trên NST số 7
(9%), trên các NST số 17, 6 gặp với tỷ lệ ít hơn [13]. Tác giả cũng theo dõi
trong 10 năm, không thấy sự khác biệt về thời gian sống thêm toàn bộ và thời
gian sống thêm không bệnh giữa 2 nhóm bệnh nhân này. Tuy nhiên, một
nghiên cứu khác của Jose Cervera trên 424 bệnh nhân lại thấy t(15;17) phối


14

hợp với đột biến NST khác như một yếu tố liên quan đến tỷ lệ tái phát sớm,
và nhóm này cũng có tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn kémhơn [14]. Trong nghiên
cứu trên 245 bệnh nhân LXMC M3, tác giả Poire X. thấy rằng nhóm bệnh
nhân có t(15;17) phối hợp với đột biến NST khác có thời gian sống thêm toàn
bộ kém hơn nhóm bệnh nhân chỉ có t(15;17) đơn thuần [15]. Vì thế đây vẫn
còn là cần được nghiên cứu thêm.
-

FISH phát hiện t(15;17)
Nguyên lý: Kỹ thuật FISH được tiến hành dựa trên cơ sở của phản ứng
lai ghép. Trong tế bào, phân tử DNA tồn tại dưới dạng phân tử kép gồm 2
chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro
là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao.
Lúc đó, phân tử DNA bị tách thành 2 sợi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH
thay đổi, liên kết hydro cũng nối lại nhanh chóng. Dựa trên đặc tính này, kỹ

thuật FISH sử dụng các đầu dò đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai ghép các
đoạn DNA tương đồng trên NST. Từ đó phát hiện đột biến trên NST một cách
chính xác và nhanh chóng.
Đầu dò đặc hiệu sử dụng để phát hiện t(15;17) hiện đang sử dụng tại Trung
tâm Huyết học và Truyền máu Bệnh viện Bạch Mai thuộc loại đầu dò chuyển
đoạn 2 màu. Tín hiệu màu xanh lá cây gắn ở vị trí 17q21 đánh dấu vị trí gen
RARα. Tín hiệu màu cam đỏ gắn ở vị trí 15q22-24 đánh dấu vị trí gen PML. Bình
thường, trong 1 nhân tế bào có 2 tín hiệu xanh, 2 tín hiệu đỏ nằm tách riêng.


15

Hình 1.2: Tín hiệu màu bình thường trong kỹ thuật FISH phát hiênh t(15;17)
(nguồn: www.micro-shop.zeiss.com)
Khi có chuyển đoạn t(15;17), 2 gen này sẽ gắn vào nhau làm cho chúng ta
quan sát được fusion màu vàng do tín hiệu xanh và da cam trộn lại với nhau.
Khi tiến hành phân tích kết quả FISH, kĩ thuật này yêu cầu phải phân
tích ít nhất trên 200 nhân tế bào, vì vậy có thể phát hiện được bất thường ở
những bệnh nhân mà dòng tế bào bất thường chiếm tỷ lệ nhỏ.

Hình 1.3: Tín hiệu fusion trong tế bào tiền tủy bào ác tính trên kỹ thuật FISH
phát hiện t(15;17)
(Nguồn: />1.4.2. Di truyền phân tử
PML/RARα


16

Hầu hết các bệnh nhân LXMC tiền tủy bào (>95%) đều có chuyển đoạn
NST đặc trưng t(15;17). Điểm cắt cho chuyển đoạn là tại gen ở vị trí q22 trên

NST 15 và tại gen ở vị trí q21 trên NST 17. Do tính phổ biến của nó mà
chuyển đoạn này giờ đây đã được xem như yếu tố chẩn đoán xác định bệnh.
Chuyển đoạn này sẽ tạo ra gen kết hợp giữa gen RARα (retinoic acid
receptor) với gen PML tạo nên PML/RARα. Chuyển đoạn NST t(15;17) đã
làm mất chức năng bình thường của gen RARα. Sản phẩm protein của gen
này bình thường có chức năng hoạt hóa quá trình sao mã (hoạt hóa ADN duỗi
xoắn và tổng hợp ARN thông tin) của các gen có vai trò giúp tế bào trưởng
thành. Protein này có một phần cấu trúc gắn vào ADN và một phần tương tác
với dẫn xuất của acid retinoic. Khi có chuyển đoạn PML/RARα, sản phẩm
protein tạo ra sẽ không những không hoạt hóa được sao mã mà còn ức chế
chức năng của gen RARα bình thường nên tế bào không thể trưởng thành
được mà dừng lại một cách ác tính ở giai đoạn tiền tủy bào .
Nếu điểm cắt của gen PML trên NST số 15 ở vị trí q22 trong vòng
intron3 (bcr3) sẽ tạo ra ARN thông tin dạng ngắn (short form), trong khi điểm
cắt trong vòng intron 6 sẽ cho ARN thông tin dạng dài (long form). Kết quả
của nhiều nghiên cứu chưa thống nhất với nhau trong việc xác định mối liên
quan giữa hai dạng sản phẩm ARN thông tin dạng dài và dạng ngắn với yếu tố
tiên lượng bệnh mặc dù có ý kiến cho rằng dạng ngắn (short form) có thời
gian sống thêm toàn bộ và thời gian sống không bệnh ngắn hơn dạng còn lại .
Tuy gen kết hợp PML/RARα gặp với tỷ lệ rất lớn trong số bệnh nhân
LXMC M3, tuy nhiên vẫn có 2-5% các trường hợp gen kết hợp với RARα
khác, tùy các nghiên cứu. Đến nay, đã có khoảng 8 gen kết hợp với RARα
khác, các gen này thường được báo cáo riêng lẻ do tính ít gặp của nó, tuy vậy
người ta cũng thấy một số gen dưởng như ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng


17

với ATRA, một số gen kết hợp làm bệnh nhân LXMC M3 kháng lại điều trị
với ATRA [16].

Một số gen kết hợp đã được nhắc đến là:
+ t(11;17)(q23q21) tạo gen kết hợp PLZF/RARα
+ t((11;17)(q13q21) tạo gen kết hợp NuMA/RARα
+ t(5;17)(q35q21) tạo gen kết hợp NPM/RARα
+ t(17 ;17)(q11q21) tạo gen kết hợp STAT 5b/RARα
+ t(X;17)(q11;q12) tạo gen kết hợp BCOR/RARα:
Trong đó chuyển đoạn t(11;17)(q23q21) tạo nên gen kết hợp
PLZF/RARα được quan tâm nhiều do kháng lại điều trị bằng ATRA.
FLT3-ITD
Đột biến gen FLT3 là một đột biến gen hay gặp trong LXMC dòng tủy.
Gen FLT3 nằm trên nhánh dài NST 13 (13q12) và có biểu hiện ít trên tế bào
gốc tạo máu, nhưng biểu hiện nhiều hơn trên các tế bào máu ác tính. Đột biến
gen này có 3 loại FLT3 – JM, FLT3 – ITD, FLT3 – TKD. FLT3 – JM là một
đột biến điểm dẫn đến tự ức chế tyrosin kinase, loại này rất hiếm gặp. Loại
FLT3 – ITD là một kiểu đột biến nhân đoạn nội gen, chiếm khoảng 28 – 34%
bệnh nhân LXMC dòng tủy có kiểu hình NST bình thường. FLT3 – TKD là
loại đột biến điểm, xen đoạn hoăc mất đoạn liên quan đến codon 835 và 836,
kiểu đột biến này chiếm khoảng 11 – 14% bệnh nhân LXMC dòng tủy có bộ
NST bình thường.
Tỷ lệ biến đổi FLT3 gặp ở khoảng 1/3 LXMC dòng tủy, ngoài ra còn
xuất hiện ở bệnh rối loạn sinh tủy (3%), hiếm gặp hơn ở bệnh ALL, CML, hầu
như không gặp ở CLL, MM, lymphoma hoặc người bình thường. Điều này
cho thấy biến đổi FLT3 đặc hiệu cho bệnh LXMC dòng tủy [17].


18

NPM1-mutA
NPM1 còn được gọi là nuclephosmin, là gen nằm trên nhánh dài NST
số 5, bao gồm 12 exon, mã hóa 259 acid amin.

NPM1 có rất nhiều vai trò, tham gia vào quá trình phân bào, tháo xoắn
ADN, dịch mã, kết hợp với riboxom, tham gia quá trình tổng hợp protein và
sửa chữa ADN. Biến đổi gen NPM1 xuất hiện nhiều trong ung thư gan, não,
tuyến tiền liệt...Gặp tỷ lệ khá cao biến đổi gen này trong LXMC dngf tủy,
khoảng 35% LXMC dòng tủy ở người lớn và 6.5% LXMC trẻ nhỏ. Biến đổi
này thể hiện đáp ứng khác tốt với điều trị. Đột biến hay gặp nhất của gen này
là trên exon 12, thêm 4 nucleotid TCTG tạo ra dạng đột biến NPM1-mutA.

Hình 1.4: Các dạng đột biến gen NPM1
(Nguồn: />

19

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 79 bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị tại
Trung tâm Huyết học và Truyền máu Bệnh viện Bạch Mai đáp ứng các tiêu
chuẩn sau:
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
-

BN được chẩn đoán xác định Lơ xê mi M3 theo tiêu chuẩn FAB 1986 [18]
Chưa được điều trị bằng hóa chất trước đó
BN không có chống chỉ định điều trị hóa chất: bệnh tim mạch, các bệnh lý ác

-

tính khác, suy gan, suy thận...
BN và gia đình đồng ý điều trị hóa chất.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ

-

BN có có bệnh lý nội, ngoại khoa có chống chỉ định điều trị hóa chất: bệnh

-

tim mạch, các bệnh lý ác tính khác, suy gan, suy thận...
BN chẩn đoán LXMC M3 trên nền một bệnh máu khác: rối loạn sinh tủy, hội
chứng tăng sinh tủy mạn,... hoặc thứ phát sau một bệnh ung thư khác.
2.2.

-

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: Trung tâm Huyết học và Truyền máu Bệnh viện Bạch Mai.
Thời gian: Từ năm 2014 đến tháng 7 năm 2018.
2.3.

Vật liệu nghiên cứu

-

Máu ngoại vi: để phân tích huyếtt đồ, đông máu, một số chỉ số sinh hóa tại

-

thời điểm chẩn đoán.
Dịch tủy xương: Phân tích hình thái học tế bào tủy xương, nuôi cấy và phân
tích NST, FISH, tách bạch cầu, RNA đểu phân tích các kiểu gen PML/RARα,

-

đột biến FLT3-ITD và NPM1-mutA.
Hồ sơ bệnh án: thu thập các triệu chứng, biểu hiện và đáp ứng điều trị của
bệnh nhân.


20

2.4.

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả, theo dõi dọc, kết hợp hồi
cứu và tiến cứu.
2.4.2. Sơ đồ nghiên cứu
BN được chẩn đoán Lơ xê mi
cấp M3
XN CT NST. CTM,ĐM, Tủy đồ

1.

Mô tả một số
bất thường di

truyền ở BN lơ
xê mi cấp M3

Nhóm 1:Nhóm
FLT3-ITD
(+)gen
Nhóm 1: chuyển đoạn
1: Kiểu
(-) Lt(15;17) đơn thuần và NPM1-mutA
PML/RARα
form
Nhóm 2: Có bấtNhóm 2: FLT3-ITD (+)
và NPM1-mutA
(+) gen
thường di truyền phối
Nhóm 2: Kiểu
hợp chuyển đoạn
PML/RARα SNhóm 3: FLT3-ITD (-)
t(15;17
form
và NPM1-mutA (-)
Nhóm 4: FLT3-ITD (-)
So sánh đặc điểmvà
lâm
sàng, huyết (-)
học, đáp ứng điều trị ở 2 nhóm BN
NPM1-mutA

2.4.3. Cỡ mẫu
Lấy tất cả các bệnh nhân đáp ứng các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ

trong thời gian nghiên cứu.
2.4.4. Nội dung và biến số nghiên cứu
-

Nghiên cứu đặc điểm di truyền ở BN Lơ xê mi cấp M3,chia BN thành các
nhóm t(15;17) đơn thuần và nhóm t(15;17) phối hợp với đột biến NST khác,
các nhóm theo kiểu gen PML/RARα, nhóm đột biến FLT3-ITD và NPM1mutA.


21

Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng và huyết học theo các nhóm bất thường

-

di truyền trên: các hội chứng lâm sàng, chỉ số tế bào máu ngoại vi, chỉ số đôn
máu, tế bào tủy.
Nghiên cứu đáp ứng điều trị với ATRA ở các nhóm BN trên: tỷ lệ lui bệnh

-

hoàn toàn, tỷ lệ lui bệnh một phần, tỷ lệ tử vong sau đợt điều trị đầu tiên.
Theo dõi bệnh nhân từ khi chẩn đoán đến kết thúc thời gian nghiên cứu, so
sánh tỷ lệ sống thêm toàn bộ, thời gian sống thêm trung bình, tỷ lệ tái
phát...theo các nhóm bất thường di truyền.
2.4.5. Các tiêu chuẩn đánh giá
2.4.5.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán LXMC M3 theo FAB 1986 [18]
-

Lâm sàng: Hội chứng xuất huyết nổi bật, hội chứng thiếu máu, hội chứng

•

nhiễm trùng, hội chứng nhiễm trùng.
Xét nhiệm:
Tế bào máu ngoại vi: Có thể gặp hay không gặp tế bào bất thường mang đặc

•
•

điểm tế bào tiền tủy bào, thiếu máu, Tc giảm
Tế bài tủy xương:
Số lượng tế bào bất thường trong tủy ≥ 30%.
Hình thái tế bào bất thường:
Thể M3 điển hình: Tế bào bất thường có hình dạng tiền tủy bào bất
thường, tăng sinh các hạt đặc hiệu bắt màu ưa azua, quan sát dễ dàng bằng
kính hiển vi quang học. Một số tế bào bất thường có chứa thể Auer trong
nguyên sinh chất.
Biến thể M3v: Tế bào bất thường có hình thái giống tiền mono: nhân
lới, cuộn, chia thùy, ít thấy hạt nhân, nguyên sinh chất rộng, không thấy có

•

hạt, có thể chứa thể Auer.
Đặc điểm hóa học tế bào:
P.A.S: Âm tính hoặc dương tính lan tỏa
MPO: Dương tính mạnh
Sudan đen: Dương tính mạnh
Esterase không đặc hiệu: Dương tính mạnh
Esterase không đặc hiệu có chất ức chế NaF: Dương tính mạnh.

2.4.5.2. Tiêu chuẩn phân loại nhóm nguy cơ


22

Phân loại nhóm nguy cơ theo tiêu chuẩn Sanz’s Score [19]:
Nhóm nguy cơ thấp: BC < 10 G/l, TC > 40 G/l.
Nhóm nguy cơ trung bình: BC < 10 G/l, TC ≤ 40 G/l.
Nhóm nguy cơ cao: BC ≥ 10 G/l.
2.4.6. Tiêu chuẩn đánh gía DIC
- Sử dụng tiêu chuẩn chẩn đoán đông máu nội mạch rải rác của ISTH
2001 sửa đổi [20]:
Nếu tổng≥5 điểm: DIC rõ ràng


23

Tổng <5 điểm: theo dõi động học các chỉ số dưới đây.
Chỉ số

cao bình thường (dấu ấn

Giá trị
>100 G/l
50 - 100 G/l
<50 G/l
<2 lần
2 – 5 lần

Điểm

0
1
2
0
2

tăng tiêu fibrin)

>5 lần

3

Thời gian prothrombin

≤3 giây hoặc >70%
>3 và ≤6 giây hoặc ≥40% và ≤70%
> 6 giây hoặc <40%
≥ 1 g/l
< 1 g/l

0
1
2
0
1

Số lượng tiểu cầu
D-Dimer so với giới hạn

hoặc tỉ lệ prothrombin

Fibrinogen

2.4.7. Tiêu chuẩn phân tích NST theo ISCN (1981) [21]
- Tiêu bản sau khi nhuộm Giêmsa và băng G, số lượng và cấu trúc của
các cặp nhiễm sắc thể sẽ được khảo sát trên kính hiển vi AXO 100 (Zeiss) ở
độ phóng đại 1.000 lần và được phân tích bằng phần mềm Ikaros.
- Một số quy tắc trong khi phân tích:
•
•
•

Thừa nhiễm sắc thể: có từ 2 cụm kỳ giữa trở lên thừa cùng 1 nhiễm sắc thể.
Thiếu nhiễm sắc thể: có từ 3 cụm kỳ giữa trở lên thiếu cùng 1 nhiễm sắc thể.
Bất thường cấu trúc: có từ 2 cụm trở lên mang cùng 1 bất thường .
2.4.8. Tiêu chuẩn đánh giá hiệu quả điều trị
Đánh giá hiệu quả điều trị theo NCCN 2017 [22].

-

Lui bệnh hoàn toàn: Lâm sàng BN ổn định, số lượng BC trung tính ngoại vi>
1,5 G/l, số lượng TC > 100 G/l, không còn tế bào bất thường ở máu ngoại vi.
Tế bào bất thường trong tủy xương dưới 5%, trên nền tủy sinh máu bình
tường. Không tái phát trong vòng 4 tuần. Không có bằng chứng tổn thương

-

ngoài tủy khác.
Lui bệnh một phần: Giống các tiêu chuẩn của lui bệnh hoàn toàn nhưng TC
máu ngoại vi dưới 100 G/l và /hoặc số lược bạch cầu đa nhân trung tính dưới
1 G/l.

24

-

Không lui bệnh: Khi không đáp ứng được các tiêu chuẩn trên.
Tiêu chuẩn đánh giá bệnh tái phát: Tế bào bất thường trong tủy xương ≥ 20%.
PCR phát hiện gen PML/RARα dương tính trở lại. Triệu chứng lâm sàng xuất
hiện rầm rộ trở lại.
2.4.9. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

-

Nuôi cấy và phân tích NST
a, Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
Cho 45ml môi trường nuôi cấy vào ống falcol 50ml, cho thêm 5ml
huyết thanh bào thai bê và 500µl kháng sinh, sau đó trộn đều.
b, Đếm số lượng tế bào
- Ly tâm 1.000 vòng/phút trong 8 phút lấy lớp buffy coat cho vào 3ml
môi trường trộn đều và đếm số lượng tế bào tủy trong hỗn dịch.
- Tính toán số lượng tế bào cho vào mỗi chai nuôi cấy sao cho số lượng
tế bào đạt từ 1- 4x106 tế bào/ml môi trường nuôi cấy
c, Chuẩn bị chai nuôi cấy
- Mỗi chai nuôi cấy ghi thông tin người bệnh, ngày cấy, ngày thu hoạch.
- Trong mỗi chai nuôi cấy cho 10ml môi trường nuôi cấy.
d, Nuôi cấy tế bào
Nhỏ lượng tế bào như tính toán vào chai nuôi cấy đã chuẩn bị. Lắc nhẹ
cho mẫu tan vào môi trường, nới lỏng nắp, đặt nằm trong tủ ấm 37oC, 5%
CO2 / giờ.

2.7.2. Thu hoạch
a, Nhỏ colcemide: Sau 24 giờ cho vào mỗi chai nuôi cấy 50 ul dung
dịch colcemide 0.010/00 (10μg/ml), đặt lại trong tủ ấm trong 15 phút.
b, Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ:
- Bật tủ ấm 37ºC, làm ấm dung dịch KCL 0,075M (Số lượng đủ
8ml/mẫu)


25

- Chuẩn bị dung dịch carnoy theo tỷ lệ: 3 methanol : 1 acid acetic
- Chuẩn bị ống falcon 15ml, ống nghiệm thủy tinh, pipet thủy tinh theo
số lượng ống cấy.
c, Kĩ thuật
- Chuyển toàn bộ huyền dịch ở chai nuôi cấy vào ống falcon 15ml, ly
tâm ở máy ly tâm ngang 1.000 vòng/phút trong 8 phút.
- Sau khi ly tâm hút bỏ phần dịch nổi ở trên, để lại cặn tế bào (chỉ hút
đến cách mặt trên cặn tế bào khoảng 5 mm).
- Cho thêm 8ml dung dịch nhược trương đã để ấm 37oC vào ống ly
tâm, trộn nhẹ một vài lần rồi ủ ở bể ấm 37oC trong 18 phút.
- Sau khi ủ 18 phút cho thêm vào mỗi ống 0.5-1 ml dung dịch carnoy,
trộn nhẹ để 5-10 phút.
- Lấy ống ra ly tâm lấy cặn, hút bỏ dịch nổi phía trên. Cho thêm vào
mỗi ống 10ml dung dịch carnoy trộn đều để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- Lặp lại bước 7 đến khi cặn tế bào trắng. Tái huyền dịch bằng carnoy.
- Nhỏ tiêu bản
- Các lam kính sạch rửa sạch ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn
tuyệt đối, chuyển sang ngâm nước cất để lên giá lam cho khô.
- Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau đó lấy ra để
nghiêng 20 - 300 trên giấy thấm.

- Nhỏ một giọt huyền dịch vừa pha lên lam kính. Chú ý khi nhỏ tiêu
bản để đầu pipet cao hơn mặt lam kính từ 10-20 cm. Để tiêu bản khô tự nhiên
trước khi nhuộm.
- Nhuộm Giêmsa
- Nhuộm băng G
-

Kỹ thuật FISH phát hiện t(15;17)
Ngày 1: