ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ của HOS TEST TRÊN các mẫu TINH TRÙNG bất ĐỘNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH THẢO

§¸nh gi¸ gi¸ trÞ cña HOS test
trªn c¸c mÉu tinh trïng bÊt ®éng
Chuyên ngành : Mô học - Phôi thai học
Mã số

: NT 62720101

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ NỘI TRÚ

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. NGUYỄN KHANG SƠN

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học,
Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình
học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn, biết ơn chân thành nhất đến PGS. TS.
Nguyễn Khang Sơn, phó trưởng bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y Hà
Nội, người thầy đã hướng dẫn chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong quá trình
học tập và hoàn thành luận văn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, anh chị trong bộ môn Mô – Phôi,
Trường Đại học Y Hà Nội đã luôn bên cạnh giúp đỡ tôi để tôi có điều kiện tốt
nhất vừa học tập vừa hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị em đồng nghiệp và bạn
bè đã quan tâm động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong
suốt thời gian học tập.
Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bác và mẹ kính
yêu, những người thân trong gia đình đã thông cảm, động viên và ở bên tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn!


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Thị Thanh Thảo, học viên lớp nội trú khóa XXXIX,
Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Mô – Phôi Thai học, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của PGS. TS. Nguyễn Khang Sơn.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kì nghiên cứu nào khác đã được
công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực,
khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, ngày 1 tháng 10 năm 2017
Người viết cam đoan

Nguyễn Thị Thanh Thảo

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DNA
HOST, HOS Test
ICSI
IVF
PVP
WHO

: Deoxyribonucleic Acid
: Hypo – Osmotic Swelling Test
: Intra Cytoplasmic Sperm Injection
Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn
: In Vitro Fertilization
Thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển
: Polyvinylpyrrolidone
: World Health Organization
Tổ chức y tế thế giới

MỤC LỤC



DANH MỤC BIỂU ĐỒ


DANH MỤC HÌNH


8

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kỹ thuật ICSI ra đời là một phương pháp điều trị hiệu quả cho những
cặp vợ chồng vô sinh, đặc biệt nguyên nhân do nam giới với tinh trùng rất ít,
yếu kèm hình dạng bất thường cao hoặc tinh trùng thu nhận từ mào tinh, tinh
hoàn. Tinh trùng tươi hoặc trữ đông sau lọc rửa được lựa chọn để tiêm vào
trứng dựa trên hình thái và khả năng di động của chúng. Tuy nhiên, trong
nhiều trường hợp, mẫu tinh trùng thu nhận được bất động hoàn toàn gây khó
khăn cho việc lựa chọn này. Thực tế cho thấy, một số trường hợp mẫu tinh
trùng bất động hoàn toàn vẫn có một tỉ lệ đáng kể tinh trùng sống. Việc lựa
chọn một cách ngẫu nhiên hay chỉ dựa vào hình thái tinh trùng trong các mẫu
tinh trùng bất động hoàn toàn để thực hiện ICSI gây giảm đáng kể tỉ lệ thụ
tinh và có thai. Để cải thiện kết quả ICSI trong những trường hợp này, nhiều
phương pháp đã được mô tả để lựa chọn tinh trùng bất động nhưng còn sống.
Một số phương pháp để xác định tinh trùng sống: kỹ thuật nhuộm eosin,
trypan blue, kích hoạt tinh trùng bằng cách bổ xung pentoxyfilline, kích thích
cơ học - kỹ thuật laser, tuy nhiên tất cả những phương pháp này đều có nhược
điểm là gây độc cho tinh trùng, ảnh hưởng đến khả năng sống của tinh trùng
[1]. HOS Test ra đời đã khắc phục được các hạn chế trên.
Khi đưa tế bào vào trong môi trường áp lực thẩm thấu thấp (môi trường
nhược trương) thì nước sẽ đi vào trong tế bào để cân bằng áp lực giữa bên
trong và bên ngoài màng tế bào; tế bào nào sống với chức năng màng còn
nguyên vẹn sẽ có biểu hiện trương phồng lên. Ứng dụng điều này năm 1984,
Jeyendran và cộng sự đã thử nghiệm đánh giá tính toàn vẹn chức năng màng
bào tương tinh trùng người bằng dung dịch có áp suất thẩm thấu thấp [2].
Màng tinh trùng không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất,
đảm bảo sự sống cho tinh trùng mà nó còn rất cần thiết trong quá trình thụ
tinh của noãn và tinh trùng như tham gia vào quá trình hoạt hóa tinh trùng,
phản ứng cực đầu, giúp tinh trùng bám trên bề mặt noãn.


9

Nghiệm pháp HOS Test ban đầu được xem như một tiêu chí đánh giá về
tỷ lệ sống của tinh trùng trên những mẫu tinh trùng hoàn toàn bất động, đã
được WHO 1992, 2010 ghi nhận là phương pháp đánh giá tỷ lệ sống, được áp
dụng rộng rãi cho các xét nghiệm tinh dịch. Sau đó được dùng để đánh giá
khả năng thụ tinh của mẫu tinh trùng [3], [4]. Với sự phát triển mạnh mẽ của
ngành hỗ trợ sinh sản hiện nay, HOS Test có vai trò quan trọng trong việc
phát hiện tinh trùng sống trong mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn với mục
đích sử dụng tinh trùng sống đó để tiêm vào bào tương của noãn (ICSI). Sự
kết hợp HOS Test với ICSI đã làm tăng hiệu quả của các chu kỳ ICSI với mẫu
tinh trùng bất động hoàn [2], [5].
Trong những trường hợp mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, việc kiểm
tra sự sống của tinh trùng rất quan trọng, quyết định sự thành công của IVF.
Chọn nhầm tinh trùng chết để ICSI sẽ đưa đến tỉ lệ thụ tinh thấp và không
tạo được phôi. Với mong muốn đánh giá một cách đầy đủ giá trị của HOS
Test trên các mẫu tinh trùng bất động, làm tăng tỉ lệ thành công trong các
chu kỳ ICSI, đặc biệt với các mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, chúng tôi
thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu: Đánh giá giá trị của HOS Test trên
các mẫu tinh trùng bất động.


10

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tình hình vô sinh trên thế giới và tại Việt Nam
Vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng quan hệ tình dục đều, không
dùng bất cứ biện pháp tránh thai nào mà không có thai tự nhiên trong thời
gian một năm (ở phụ nữ < 35 tuổi) hoặc không có thai tự nhiên sau 6 tháng (ở
phụ nữ > 35 tuổi) [6]. Vô sinh ảnh hưởng tới tâm lý, tình hình kinh tế, dẫn đến

các tổn thương về mặt y học, căng thẳng, đặc biệt trong một xã hội như chúng
ta mà vấn đề sinh được con rất được chú trọng.
Vô sinh và các vấn đề về suy giảm khả năng sinh sản đã và đang là mối
quan tâm lớn của các nhà y học, là một vấn đề lâm sàng có ý nghĩa lớn, ảnh
hưởng tới 8 -12% các cặp vợ chồng trên toàn thế giới. Trong tất cả các trường
hợp vô sinh, khoảng 40 - 50% là vô sinh nam - vô sinh do yếu tố nam giới. Các
bất thường có thể đơn độc hoặc kết hợp với nhau như mật độ tinh trùng thấp, khả
năng di động kém, hình thái bất thường. Tỉ lệ vô sinh ở các nước kém phát triển
cao hơn và nguyên nhân chủ yếu do ảnh hưởng của các bệnh truyền nhiễm [7].
Mặc dù chưa có số liệu chính xác về tỉ lệ vô sinh toàn cầu, nhưng ước
tính gần 72,4 triệu cặp vợ chồng trên toàn thế giới gặp vấn đề về sinh sản.
Theo ước tính của WHO có khoảng 60.000.000 - 80.000.000 cặp vợ chồng
trên toàn thế giới bị vô sinh. Tại Mỹ, theo trung tâm quốc gia về thống kê y tế,
khả năng sinh sản suy giảm ở phụ nữ tăng 2,7 triệu, từ 4,56 triệu năm 1982
lên 7,26 triệu năm 2002. Hơn nữa tỉ lệ sinh sản của nam giới dưới 30 tuổi
cũng suy giảm 15% trên toàn thế giới [8], [9].


11

Tại Việt Nam, nghiên cứu trên toàn quốc do Bệnh viện Phụ sản Trung
ương và Đại học Y Hà Nội năm 2015 tiến hành trên 14 300 cặp vợ chồng
trong độ tuổi sinh đẻ (15 - 49) ở 8 tỉnh đại diện cho 8 vùng miền sinh thái ở
nước ta đã cho thấy tỉ lệ vô sinh của các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ là
7,7%, nghĩa là có từ 700 000 đến 1 triệu cặp vợ chồng vô sinh. Trong đó vô
sinh nguyên phát là 3,9%, vô sinh thứ phát là 3,8%, có tới 50% cặp vợ chồng
vô sinh có độ tuổi dưới 30.
Theo thống kê ở Anh, nguyên nhân vô sinh do nam giới dao động từ 1957% các cặp vợ chồng hiếm muộn [10]. Tại Việt Nam, nghiên cứu của
Nguyễn Thị Được và Nguyễn Thị Thanh Mai (2001) trên 220 cặp vợ chồng
vô sinh đến khám tại phòng khám sản Đại học Y Thái Bình nhận thấy tỷ lệ vô

sinh do chồng chiếm 43,2% [11], [12]. Như vậy vô sinh nam chiếm khoảng
35%, trong đó hơn 90% các nguyên nhân đều dẫn đến kết quả gây bất thường
tinh trùng. Người ta ước tính các bất thường của tinh trùng về sản xuất hay
hoạt động chức năng chiếm từ 35- 50% các trường hợp vô sinh [13].
Nam giới với các thông số tinh dịch đồ thấp hơn giá trị bình thường của
WHO được xem là có yếu tố vô sinh nam. Đáng kể nhất trong số này là mật
độ thấp (oligospermia), di động kém (asthenospermia), hình thái bất thường
(teratospermia) hay dạng kết hợp. Các yếu tố khác cũng được quan tâm như
bệnh lý tiền liệt tuyến, túi tinh…[14], [15], [16], [17], [18].
1.1.1. Vô sinh nam do tinh trùng di động kém
Asthenozoospermia là thuật ngữ chỉ tình trạng tinh trùng của nam giới di
động kém. Nguyên nhân của tình trạng này có thể do các bất thường về trao
đổi chất ảnh hưởng tới di động của tinh trùng, bất thường đuôi như đuôi gập,
đuôi cuộn, bất thường siêu cấu trúc trong cấu tạo của đuôi, bất thường đoạn
cổ…Việc tinh trùng di động kém ảnh hưởng rất lớn đến khả năng thụ tinh


12

giữa noãn và tinh trùng. Trong thụ tinh tự nhiên, muốn thụ tinh được tinh
trùng phải bơi qua cả một quãng đường dài để tới nơi thụ tinh, mà khả năng
bơi của tinh trùng phụ thuộc rất lớn vào tính toàn vẹn của đuôi [16].
Trong quá trình trưởng thành tự nhiên của tinh trùng, khả năng di động
của tinh trùng được hoàn thiện khi tinh trùng qua mào tinh. Sự di động của tinh
trùng có vai trò rất quan trọng để tinh trùng di chuyển từ âm đạo tới vòi tử cung,
xuyên qua lớp tế bào hạt để tham gia thụ tinh. Do đó, có mối liên quan rõ ràng
giữa khả năng di động của tinh trùng và khả năng có thai tự nhiên.
Trong những trường hợp tinh trùng di động kém tỉ lệ thụ tinh thường rất
thấp, thậm chí không có thai tự nhiên. Đặc biệt với các mẫu tinh trùng bất
động hoàn toàn thì mong ước có con của chính họ của các cặp vợ chồng vô

sinh do tinh trùng bất động hoàn toàn là không thể. Với sự tiến bộ của y học,
sự phát triển mạnh mẽ của lĩnh vực hỗ trợ sinh sản hiện nay thì nguyện vọng
của các cặp vợ chồng trên có thể thực hiện được.
1.1.2. Thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển (IVF) và tiêm tinh trùng vào bào
tương noãn (IVF/ICSI)
1.1.2.1. Thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển
Em bé IVF đầu tiên trên thế giới ra đời năm 1978. Đến nay, đã có
khoảng 4 triệu trẻ ra đời từ IVF, hàng năm trên toàn thế giới có gần một triệu
trường hợp IVF và các kỹ thuật tương đương được thực hiện. Ở các nước phát
triển như Bắc Âu, Tây Âu và Úc, có từ 1 - 5% trẻ mới sinh ra đời hàng năm là
từ IVF. IVF đã làm thay đổi quan niệm của nhân loại về sinh sản. Với các kỹ
thuật hỗ trợ sinh sản, quan hệ tình dục và sinh sản để duy trì nòi giống có thể
được tách biệt thành hai vấn đề riêng biệt. Ngoài ra việc có con của một cặp
vợ chồng có thể có sự tham gia của người thứ 3: cho noãn, cho tinh trùng,
mang thai hộ…[5].


13

R.G. Edwards, người Anh, là một trong những nhà khoa học tiên phong
trong việc nghiên cứu về IVF trên người. Năm 1966, Edwards cùng một
nhóm nhà khoa học Mỹ đứng đầu là giáo sư Howard Jones, lần đầu tiên công
bố trường hợp lấy được noãn người qua phẫu thuật nội soi tại Mỹ. Đến năm
1971, Steptoe và Edwards ở Anh lần đầu tiên báo cáo nuôi cấy được phôi
nang người trong ống nghiệm và chuyển các phôi này vào buồng tử cung
người phụ nữ. Đến năm 1976, sau hàng trăm trường hợp thất bại, bác sĩ
Steptoe và tiến sĩ Edwards công bố trường hợp có thai đầu tiên từ IVF ở
người trên thế giới. Năm 1978, em bé đầu tiên từ IVF, Louise Brown ra đời đã
đánh dấu bước đầu cho sự phát triển của IVF trên người [5].
Kỹ thuật IVF được thực hiện để điều trị hiếm muộn cho các cặp vợ

chồng có các chỉ định sau: tắc vòi tử cung, bất thường về số lượng và chất
lượng tinh trùng, lạc nội mạc tử cung, hiếm muộn không rõ nguyên nhân…
Ngoài ra IVF còn được chỉ định cho các trường hợp xin noãn, chẩn đoán di
truyền tiền làm tổ.
Trong thời gian đầu, IVF được chỉ định chủ yếu cho vô sinh nữ. Dần dần
IVF được áp dụng cho các trường hợp thiểu năng tinh trùng. Tuy nhiên các thử
nghiệm áp dụng IVF cho vô sinh nam, đặc biệt các trường hợp có bất thường
tinh trùng nặng, không có tinh trùng, tinh trùng sau rã đông…cho kết quả khá
thất vọng với tỉ lệ thụ tinh giữa noãn và tinh trùng rất thấp và nhiều trường hợp
hoàn toàn không có thụ tinh. Với mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn thì không
áp dụng IVF được. Rõ ràng là số lượng, chất lượng và khả năng di động của
tinh trùng ảnh hưởng rất lớn đến sự thành công của phương pháp. Kỹ thuật
ICSI ra đời năm 1992 đã tạo ra một bước ngoặt lớn trong lĩnh vực hỗ trợ sinh
sản, đặc biệt với vô sinh nam [19], [20].


14

1.1.2.2. Tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn
Năm 1992 kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) được báo
cáo thành công lần đầu tiên tại Bỉ bởi Palermo và cộng sự. Trong kỹ thuật này
các tác giả tiêm trực tiếp một tinh trùng vào bào tương noãn để hỗ trợ sự thụ
tinh. Các thử nghiệm đầu tiên cho thấy sau khi tiêm tinh trùng vào bào tương
noãn, tế bào noãn vẫn có thể hồi phục, sự thụ tinh diễn ra và phôi sau đó phát
triển khá tốt. Tỉ lệ có thai lâm sàng của kỹ thuật ICSI luôn cao hơn so với kỹ
thuật IVF cổ điển, mặc dù số lượng và chất lượng tinh trùng kém. Sự thành
công này đã thực sự là một cuộc cách mạng trong điều trị vô sinh nam. Nếu
như trong sinh lý tự nhiên người đàn ông cần sản xuất ra hàng chục triệu đến
hàng trăm triệu tinh trùng trong một lần phóng tinh để có thể thụ tinh với một
noãn trong vòi trứng thì với kỹ thuật ICSI, sự thụ tinh có thể diễn ra giữa duy

nhất một tinh trùng với một noãn. Cho đến nay, do vấn đề vô sinh nam ngày
càng phổ biến đi kèm với hiệu quả của kỹ thuật ICSI được cải thiện không
ngừng, ICSI đã dần dần trở thành kỹ thuật được thực hiện nhiều nhất tại các
trung tâm hỗ trợ sinh sản. Hiện nay, đặc biệt tại một số trung tâm lớn, ICSI
còn được áp dụng thay thế hoàn toàn kỹ thuật IVF cổ điển ngay cả đối với các
trường hợp không liên quan đến vô sinh nam [16], [20], [21], [22].
Với sự ra đời của ICSI, những cặp vợ chồng vô sinh do yếu tố nam giới
bao gồm cả tinh trùng di động kém có thể có thai của chính họ. Tỉ lệ thụ tinh và
có thai của những trường hợp này cao nếu tinh trùng di động được chọn để ICSI.
Tuy nhiên, với các tinh trùng bất động hoàn toàn, việc lựa chọn ngẫu
nhiên tinh trùng bất động để ICSI làm tỉ lệ thành công sau ICSI đều giảm hẳn.
Trong những trường hợp này việc tìm ra phương pháp giúp phát hiện tinh
trùng bất động nhưng còn sống để tiêm vào bào tương noãn mà không ảnh
hưởng tới sự sống của tinh trùng, trứng cũng như sự phát triển của phôi là cực
kỳ quan trọng.


15

1.2. Cấu tạo tinh trùng [23]
1.2.1. Tinh trùng bình thường
Tinh trùng có cấu tạo bình thường dài khoảng 60µm và gồm ba đoạn là
đầu, cổ và đuôi. Đầu hình bầu dục, hơi dẹt, dài 4 - 5µm, rộng 2µm. Nhân lớn
chiếm gần hết đầu tinh trùng. Cổ là đoạn ngắn và hẹp, gắn thẳng trục với đầu.
Đuôi dài khoảng 55µm, chia làm 3 đoạn:
+ Đoạn trung gian: dài khoảng 4 - 5µm. Giữa đoạn trung gian và đoạn
chính, màng tế bào dày lên tạo thành vòng Zensen.
+ Đoạn chính: dài nhất, khoảng 45µm, gồm một dây trục nằm ở trung
tâm, vây quanh bởi một bao sợi xơ và bọc ngoài bởi màng tế bào.
+ Đoạn cuối: dài khoảng 2 - 3µm, tạo thành bởi dây trục được bọc bởi

màng tế bào.
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy đầu tinh trùng chứa nhân ở phần
phình nằm về phía giáp với cổ. Đoạn 2/3 trước của nhân được chụp bởi túi
cực đầu có hình cái mũ. Thành túi có cấu tạo màng kép, gồm hai lá ngoài và
trong. Lòng túi chứa nhiều enzyme có tác dụng tiêu huỷ các chướng ngại vật
bao quanh noãn chín để tinh trùng tiến vào bào tương của noãn khi thụ tinh:
hyaluronidase, neuramidase, acrosin...
Ở lá ngoài của túi cực đầu và phần bào tương phía trước lá này có một
loại protein đặc hiệu gọi là protein gắn vào noãn nguyên phát (primary egg
binding protein) có tác dụng gây ra kết dính giữa đầu tinh trùng và màng
trong suốt bọc noãn trong quá trình thụ tinh. Ở lá trong của túi cực đầu có một
loại protein đặc hiệu khác gọi là protein gắn vào noãn thứ phát (secondary egg
binding protein) có tác dụng gắn màng kép của túi cực đầu với màng trong
suốt bọc noãn khi lớp bào tương mỏng ở phía trước túi cực đầu đã bị tiêu huỷ
và lá ngoài của túi cực đầu bị rách trong quá trình tiếp xúc với màng trong
suốt. Những protein này mang tính đặc hiệu cho loài, do đó sự gắn kết giữa
tinh trùng và màng trong suốt của noãn chỉ xảy ra ở động vật cùng loài.


16

Ở cổ có tấm đáy, hố cắm, tiểu thể trung tâm và 9 cột chia đoạn xếp thành
hình ống. Dây trục nằm chính giữa cổ chạy suốt từ cổ đến chỗ tận cùng của
đuôi. Có 9 sợi đặc nối tiếp với 9 cột chia đoạn và tiến về phía đuôi tinh trùng.
Những ti thể hình que dài, xếp thành một hàng nằm ở phía bên ngoài và song
song với cột chia đoạn ở đoạn trên cổ và sợi đặc ở đoạn đuôi.
Đuôi gồm:
+ Đoạn trung gian có dây trục nằm chính giữa, 9 sợi đặc bao xung
quanh. Bao ti thể được cấu tạo bởi những ti thể xếp với nhau theo kiểu xoắn
ốc, cuốn quanh dây trục, được bọc bởi màng tế bào.

+ Đoạn chính: từ trung tâm ra ngoại vi gồm: dây trục, 9 sợi đặc, bao xơ,
màng tế bào.
+ Đoạn cuối: cấu trúc rất đơn giản, chỉ gồm dây trục bọc ngoài bởi màng
tế bào.
Phần đuôi tinh trùng chính là nơi chứa các thành phần cần thiết cho hoạt
động trao đổi chất và di động. Tinh trùng tự di động được là nhờ các vi sợi ở
đuôi tinh trùng. Các tinh trùng di động được chắc chắn là tinh trùng sống. Tuy
nhiên, không phải tất cả tinh trùng không di động đều là tinh trùng chết. Tinh
trùng còn sống mà không di động được thường do các bất thường nặng của
tinh trùng, đặc biệt là các bất thường về đuôi như gập cổ, đoạn cổ không cân
đối, đuôi ngắn, đuôi cuộn, đuôi gập, tế bào chất còn dư ở đuôi.


17

Hình 1.1. Cấu tạo siêu vi của tinh trùng.
I. Thiết đồ đứng dọc toàn bộ tinh trùng; II. Phóng to một phần đoạn đầu, cổ và một phần đoạn trung gian của tinh trùng ở hình I; III.
1. Đầu; 2. Cổ; 3. Đoạn trung gian; 4. Đoạn chính ; 5. Đoạn cuối; 6. Túi cực đầu; 7. Khoảng dưới túi cực đầu; 8. Màng nhân; 9. Nếp gấp


18

1.2.2. Tinh trùng bất thường
Trong tinh dịch bình thường, tinh trùng có cấu tạo bất thường gồm
những loại chính:
+ Tinh trùng chưa trưởng thành: có khá nhiều bào tương ở đầu, cổ và đuôi.
+ Tinh trùng có cấu tạo hình thái học bất thường: đầu to hay nhỏ, tròn
hay nhọn.
+ Tinh trùng già : đầu lỗ rỗ vì bào tương có nhiều không bào chứa sắc tố.
+ Tinh trùng thoái hoá: đầu bị biến dạng hay bị teo hoặc có hai đầu,

hai đuôi.
1.2.3. Tinh dịch đồ
-

Chỉ số tinh dịch đồ bình thường theo WHO, năm 2010 [4]
Màu sắc trắng đục, đồng nhất.
Thời gian ly giải 15 - 60 phút ở nhiệt độ 37⁰C
Thể tích ≥1,5ml
pH ≥7,2
Mật độ tinh trùng ≥15 triệu/ml
Tổng số tinh trùng mỗi lần phóng tinh ≥39 triệu
Tổng di động tiến tới ≥32% hay tổng di động tiến tới và không tiến tới ≥40%
Tỉ lệ sống ≥58%


19

- Tỉ lệ tinh trùng hình thái bình thường ≥4%
1.3. Một số phương pháp đánh giá khả năng sống của tinh trùng trước
khi có HOS Test
Đã có nhiều kỹ thuật đã được thực hiện nhằm phân biệt tinh trùng bất
động nhưng sống với tinh trùng bất động và chết sử dụng trong ICSI để cơ hội
có thai của các cặp đôi là lớn nhất. Một số kĩ thuật như nhuộm chất màu, sử
dụng pentoxyfiline, kích thích cơ học, sử dụng laser. Tuy nhiên mỗi phương
pháp đều có ưu, nhược điểm riêng.
1.3.1. Phương pháp nhuộm eosin, eosin - nigrosin, trypan blue
Một số chất nhuộm quan sát được dưới kính hiển vi trường sáng như
eosin, eosin - nigrosin, trypan blue, hoặc với kính hiển vi huỳnh quang một số
chất được dùng như propidium iodine, hoechst, ethidium homodimer- 1, YoPro- 1 đều được dùng để nhuộm tinh trùng nhằm phân biệt tinh trùng sống,
tinh trùng chết [24].

 Nguyên lý: Dựa trên sự toàn vẹn về cấu trúc màng tế bào. Khi nhuộm màu, tế
bào nào bị tổn thương cấu trúc màng tế bào đồng nghĩa là tế bào đã chết, chất
màu qua được màng tế bào vào bên trong nội bào dẫn đến tế bào có màu theo
chất nhuộm. Tế bào nào còn sống, không tổn thương cấu trúc màng thì tế bào
không bắt màu [3], [4], [24].


Phương pháp: Dùng các chất màu để nhuộm tinh trùng, quan sát dưới kính
hiển vi ở độ pháng đại 400 lần. Đếm số tinh trùng sống là những tinh trùng
mà phần đầu không bị nhuộm màu và số tinh trùng chết là những tinh trùng



mà phần đầu bị nhuộm màu trên tổng số 200 tinh trùng, [4].
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện ở mọi labo, rẻ tiền, độ nhạy và độ đặc hiệu
cao. Ban đầu được dùng để kiểm tra tế bào nào chết, tế bào nào còn sống. Sau
đó được WHO khuyến cáo dùng để đánh giá nhanh chóng tỉ lệ tinh trùng sống
trong một mẫu tinh dịch, một thông số quan trọng trong đánh giá tinh dịch đồ
[24].


20



Nhược điểm: Các kỹ thuật nhuộm dẫn tới chết tế bào, chất nhuộm màu ảnh
hưởng tới sự sống của tinh trùng cũng như sự thụ tinh của noãn, phát triển của
phôi, do đó các tinh trùng đã bị nhuộm màu không sử dụng được cho các kỹ
thuật hỗ trợ sinh sản [1], [2], [4].
1.3.2. Phương pháp kích thích cơ học

 Nguyên lý: đuôi tinh trùng có thể uốn cong hình cung mà không có chuyển
động của đầu khi bị kích thích bằng kim ICSI được xem là có thể còn sống và
do đó được chọn để ICSI. Ngược lại nếu đầu di chuyển cùng đuôi thì tinh
trùng đó đã chết [25].
 Ưu điểm: ngắn gọn, đơn giản, tiện dụng, làm được luôn trong quá trình ICSI.
Không có các chất khác ảnh hưởng thêm đến tinh trùng, trứng cũng như sự
phát triển của phôi [25], [26].
 Nhược điểm: phụ thuộc vào độ “cứng” của đuôi tinh trùng, tinh trùng có khả
năng hồi phục về trạng thái hình dạng ban đầu hay không khi dừng kích thích.
Nó cũng phụ thuộc rất lớn vào kỹ thuật cũng như kinh nghiệm của người làm.
Thêm vào đó phương pháp chỉ dựa trên tính chất vật lý mà không chú ý tới
tính toàn vẹn hóa học của màng tinh trùng [25], [26].
1.3.3. Kỹ thuật laser
 Nguyên lý, phương pháp: Kỹ thuật laser sử dụng tia laser đơn ngắn bước sóng
1,48µm, tốc độ 6 - 7ms chiếu trực tiếp tới phần cuối của đuôi tinh trùng. Tinh
trùng nào sống biểu hiện bằng phần cuối của đuôi uốn cong lại tại vị trí chiếu
tia laser trong khi tinh trùng chết thì không uốn cong [27], [28].
 Ưu điểm: Laser là một phương pháp an toàn để lựa chọn tinh trùng sống
nhưng bất động. Tỉ lệ thụ tinh, phôi chia cũng như tỉ lệ trẻ sinh sống khi áp
dụng laser để lựa chọn tinh trùng bất động nhưng sống cao hơn khi lựa chọn
tinh trùng ngẫu nhiên. Sử dụng tia laser tỉ lệ thụ tinh tăng từ 20,4% lên đến
45,4% [27], [29].
 Nhược điểm: đắt, và không phải ở đơn vị labo nào cũng làm được. Phương
pháp chỉ dựa trên tính chất vật lý mà không chú ý tới tính toàn vẹn hóa học
của màng tinh trùng [29], [30].


21

1.3.4. Sử dụng pentoxyfiline

Nhiều nghiên cứu cũng đã báo cáo về việc sử dụng pentoxyfiline để làm
tăng cường khả năng di động và khả năng thụ tinh của tinh trùng trên các mẫu
có tỉ lệ di động thấp nhưng có ít nghiên cứu trên các mẫu tinh trùng bất động
hoàn toàn [31], [32].
 Nguyên lý: Pentoxifilline là một chất ức chế 3’,5’- nucleotide phosphodiesterase, giúp
tinh trùng di động bằng cách kéo dài thời gian tồn tại của cAMP trong tế bào, chất
cần bổ sung trong quá trình hoạt động của tinh trùng [32].
 Phương pháp: Trộn tinh dịch với pentoxifilline nồng độ 7,2mM theo tỉ lệ 1:1,
ủ ấm 30 phút trong tủ 37oC có 5% CO2, 95% O2. Sau ủ ấm nhỏ một giọt lên
buồng đếm và đánh giá tỉ lệ di động của mẫu sau ủ [31].
 Ưu điểm: Với những mẫu tinh dịch có tỉ lệ tinh trùng di động thấp
pentoxifilline có tác dụng khởi động sự di động của tinh trùng, làm tăng tỉ lệ
tinh trùng di động. Pentoxifilline có tác dụng làm tăng tỉ lệ tinh trùng di động
trong các trường hợp khuyết trục sợi đuôi (hội chứng lông bất động), khuyết
tật về enzym (thiếu protein - carboxyl methylase), khuyết thiếu chức năng
đuôi tinh trùng, các mẫu tinh dịch bất thường nặng về di động, tinh trùng lấy
từ mào tinh, tinh hoàn qua MESA, TESE. Tuy nhiên với các trường hợp tinh
trùng bất động hoàn toàn vẫn cần có phương pháp giúp phát hiện tinh trùng
sống ví dụ như HOS Test. Pentoxifilline làm tăng tỉ lệ di động từ 51,8% lên
70,8% so với nhóm không sử dụng thì tỉ lệ di động không thay đổi. Trước đây
pentoxifilline được sử dụng khá rộng rãi trong các labo để làm tăng tỉ lệ di
động trong các mẫu tinh dịch làm IVF mà có tỉ lệ tinh trùng di động thấp. Kết
quả cho thấy tỉ lệ thụ tinh và có thai trong các mẫu có sử dụng pentoxifilline
tương đương với các mẫu có tỉ lệ tinh trùng di động trong giới hạn bình
thường. Nhìn chung pentoxifilline chủ yếu sử dụng trong các chu kỳ IVF cổ
điển với các mẫu tinh trùng có tỉ lệ tinh trùng di động thấp [31], [33], [34].
 Nhược điểm: ảnh hưởng của pentoxyfiline lên trứng, lên sự phát triển của phôi
vẫn chưa được đánh giá đầy đủ và có thể gây hại tới phôi. Phương pháp này
cũng chỉ áp dụng với các mẫu vẫn có tỉ lệ tinh trùng di động thấp, một số mẫu

22

bất động nhưng vẫn còn tiềm năng di động sau khi sử dụng pentoxyfilline. Với
những mẫu bất động hoàn toàn thì không áp dụng được [34].
Để khắc phục những nhược điểm trên, HOS Test đã được phát triển. Ưu
điểm là phát hiện được tinh trùng bất động mà còn sống, không làm chết tinh
trùng cũng như không ảnh hưởng tới sự sống của tinh trùng, sự thụ tinh của
noãn, phát triển của phôi.
1.4. Nguyên lý của HOS Test
1.4.1. Cấu tạo và chức năng màng bào tương [35], [36]
Màng tế bào là ranh giới ngăn tế bào sống với môi trường xung quanh
nó. Màng tế bào điều khiển sự vào ra của vật chất xuyên qua màng. Giống
như các màng sinh học khác nó là màng thấm chọn lọc cho phép một số chất
đi qua dễ dàng hơn những chất khác. Màng tế bào được cấu tạo bởi lipids,
proteins, carbohydrates. Trên màng có các kênh protein xuyên màng kết hợp
với tính linh hoạt mềm dẻo của màng giúp vận chuyển vật chất qua màng có
tính chọn lọc. Trên màng tế bào xảy ra hiện tượng khuếch tán, thẩm thấu qua
màng tạo ra áp suất thẩm thấu và cũng bị tác động bởi áp suất thẩm thấu.
Thẩm thấu là sự khuyếch tán của dung môi từ dung dịch có nồng độ thấp
sang dung dịch có nồng độ cao hơn qua màng. Áp suất thẩm thấu là lực đẩy
của các phân tử dung môi từ dung dịch có nồng độ thấp đến dung dịch có
nồng độ cao qua màng.
Quá trình thẩm thấu giữa hai dung dịch sẽ tiếp tục cho đến khi nồng độ
của hai dung dịch bằng nhau. Khi nồng độ của hai dung dịch cân bằng nhau
thì sẽ không có sự khuyếch tán của dung môi qua màng, tạo cân bằng áp suất
thẩm thấu
 Hiện tượng khuếch tán

23

Khuếch tán (Gradient nồng độ) là hiện tượng chất khuếch tán vận
chuyển từ nơi có nồng độ cao sang nơi có nồng độ thấp, nhờ năng lượng
chuyển động nhiệt.
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự khuếch tán:
- Bản chất của chất khuếch tán: tỉ lệ thuận với độ hoà tan trong lipid nhưng tỉ lệ
nghịch với trọng lượng phân tử.
- Nhiệt độ: tỉ lệ thuận với nhiệt độ, nhiệt độ tăng làm tăng chuyển động của
phân tử và ion trong dung dịch.
- Trạng thái của màng: tỉ lệ nghịch với độ dày của màng nhưng tỉ lệ thuận với
số kênh trên 1 đơn vị diện tích màng.
- Sự khuếch tán của 1 chất khác xảy ra đồng thời.
- Ảnh hưởng của sự chênh lệch nồng độ: tỷ lệ thuận với sự chênh lệch
nồng độ hai bên màng.
Có các hình thức khuếch tán sau:
- Khuếch tán đơn giản theo 2 cách là khuếch tán qua lớp lipid kép và
khuếch tán qua các kênh protein.
- Khuếch tán được gia tốc: chất khuếch tán là chất hữu cơ không tan
trong lipid và có kích thước phân tử lớn, đặc biệt là glucose, acid amin.
 Hiện tượng thẩm thấu (Gradient áp suất thẩm thấu= ASTT)
Sự thẩm thấu là sự chuyển động của các phân tử dung môi (trong cơ thể
chủ yếu là nước, trong bài này đề cập chính là nước) qua màng tế bào theo
hướng từ nơi có áp suất (nồng độ) thẩm thấu thấp đến nơi có áp suất (nồng
độ) thẩm thấu cao hơn.
Theo luật Van’t Hoff định nghĩa ASTT của một dung dịch tỉ lệ thuận với
nồng độ thẩm thấu theo công thức P= R.T.C trong đó R là hằng số khí lý
tưởng, T là nhiệt độ tuyệt đối, C là nồng độ thẩm thấu.

24

Trong sinh lý, đơn vị đo nồng độ thẩm thấu là Osmolarity, 1 Osmol =
1000 mosmol.
Sự thẩm thấu thực chất là một quá trình khuếch tán của các phân tử dung
môi (ở đây là nước). Sự thẩm thấu diễn ra rất nhanh, nhằm cân bằng nồng độ
thẩm thấu giữa trong và ngoài tế bào hay các ngăn dịch trong cơ thể.
Độ lớn của áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào nồng độ các phân tử bé và
ion. Dung dịch nhược trương (hypotonic) là dung dịch có áp suất thẩm
thấu thấp hơn áp suất thẩm thấu của tế bào, nghĩa là nếu cho tế bào vào
dung dịch này thì nước sẽ đi vào tế bào, tế bào trương lên (hình 1.2).

a

b

c

Hình 1.2. Hình dạng tế bào trong các môi trường áp suất thẩm thấu
khác nhau [37]
(a) tế bào trong môi trường bình thường
(b) tế bào trong môi trường ưu trương
(c) tế bào trong môi trường nhược trương
Như vậy áp suất thẩm thấu đóng vai trò quan trọng đối với hoạt động
sống của tế bào.
Màng tế bào có tính thấm chọn lọc, nghĩa là màng để cho nước và các
chất hoà tan trong nước đi qua nhiều hơn so với các chất khác. Vì vậy mà áp
suất thẩm thấu được giữ ổn định nhờ có cơ chế điều hoà nồng độ các chất hoà
tan trong nước ở trong tế bào.
Để đánh giá tế bào sống hay chết người ta thường dùng thuốc nhuộm

như trypan blue, eosin. Những tế bào chết sẽ bắt mầu thuốc nhuộm do màng
của tế bào chết không còn khả năng ngăn cản sự xâm nhập của thuốc nhuộm


25

vào nội bào. Trong khi tế bào sống thì không bắt mầu. Tuy nhiên tế bào sau
khi làm nghiệm pháp nhuộm mầu không thể được sử dụng tiếp.
Tinh trùng là một tế bào hoàn chỉnh, được bao bên ngoài bởi màng tế
bào với đầy đủ các chức năng của màng sinh chất. Vì vậy các nhà khoa học đã
ứng dụng tính chất tính thấm có chọn lọc của màng bào tương để phát hiện
tinh trùng bất động nhưng còn sống mà không gây ảnh hưởng đến sự sống của
tinh trùng thông qua HOS Test.
1.4.2. Nguyên lý của HOS Test
HOS Test đánh giá sự toàn vẹn màng bào tương bằng cách xác định xem
màng tinh trùng còn khả năng duy trì sự cân bằng giữa bên trong và bên ngoài
màng tinh trùng hay không. Trong HOS Test, khi tinh trùng trong môi trường
áp lực thẩm thấu thấp, nước đi vào tinh trùng cho đến khi cân bằng đạt được
giữa trong và ngoài màng tinh trùng. Sự chuyển dịch của dòng nước do stress
áp lực thẩm thấu thấp gây ra làm màng tinh trùng phồng lên không đồng đều
làm đuôi cuộn lại hay phồng đồng đều làm đuôi ngắn lại. Những tinh trùng có
biểu hiện như vậy cho thấy màng tinh trùng vẫn còn nguyên vẹn và đầy đủ
chức năng, hay đơn giản là tinh trùng đó còn sống.
Do nước đi vào tinh trùng, tinh trùng nở rộng ra, phồng lên. Những sợi ở
phần đuôi tinh trùng (phức hợp sợi trục) bình thường được bao quanh bởi
màng tinh trùng. Khi màng tinh trùng phồng lên do nước đi vào dưới điều
kiện áp suất thẩm thấu thấp, phần sợi ở đuôi sẽ uốn cong, cuộn lại bên trong
màng tinh trùng. Sự thay đổi ở đuôi này dễ dàng quan sát thấy dưới kính hiển
vi. Vì không thể nhận diện rõ ràng màng bào tương tinh trùng ở tình trạng
không nhuộm màu dưới kính hiển vi ánh sáng, nhưng phức hợp sợi đuôi có

thể xác định được, quan sát được dưới kính hiển vi, phần đuôi sẽ cuộn lại, uốn
cong và hiện tượng này gọi là cuộn đuôi. Cuộn đuôi là do sự phồng lên của
màng bào tương (thể tích nội bào tăng tối đa, màng căng tối thiểu). Chỉ những