KẾT QUẢ NGHIÊN cứu tác DỤNG KHÁNG KHUẨN KHÁNG nấm của VIÊN TRÌ THIÊN dược TRÊN IN VITRO

Trường Đại học Y Hà Nội
Bộ môn Dược lý

Cộng hoà xã hội chủ nghĩa Việt Nam
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG
KHÁNG KHUẨN- KHÁNG NẤM
CỦA VIÊN TRÌ THIÊN DƯỢC TRÊN IN VITRO

Nơi tiến hành: - Khoa Vi sinh, bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương
- Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội
Thời gian nghiên cứu: 7-8/2018
Cán bộ tham gia nghiên cứu:
1.

2.
3.
4.
5.
6.
7.

PGS. TS. Phạm Thị Vân Anh
PGS.TS. Nguyễn Vũ Trung
PGS.TS. Vũ Thị Ngọc Thanh
Ths.DS. Nguyễn Thị Thanh Loan
KTV. Nguyễn Kiều Vân
KTV. Đinh Quang Trường
KTV. Đàm Đình Tranh

I. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:
1


Thuốc nghiên cứu: Viên nang cứng Trĩ Thiên Dược được sản xuất bởi Công
ty TNHH Thiên Dược, đạt tiêu chuẩn cơ sở.
Bảng 3.1. Bảng công thức đóng viên nang Trĩ Thiên Dược
STT

Thành phần

Tỷ lệ %

1 viên (mg)

90,77%

590

Cao khô (hỗn hợp các phân đoạn
1

flavonoid của cây DỀN GAI THS và
RAU SAM THS)

2

Aerosil

0,62%

4

3

Tinh bột

6,15%

40

4

Sodium Starch Glycolate

1,54%

10

5

Talc

0,46%

3

6

Magnesi stearate

0,46%

3

Tổng cộng
100%
650
Mỗi viên nang chứa 590mg hỗn hợp phân đoạn rau dền gai và rau sam (gọi
là cao phân đoạn). Liều dùng dự kiến trên người: 8 viên/ngày.
1. Tác dụng kháng khuẩn:
Vật liệu nghiên cứu:
Chủng vi sinh vật: 05 chủng chuẩn quốc tế.
Chủng vi khuẩn: S. aureus, E. coli, E. faecalis, S. pneumonia,
P. aeruginosa.
2. Thử tác dụng kháng nấm: 1 chủng
Nấm 1 chủng: Candida albicans
 Vật liệu cho nuôi cấy chủng vi sinh vật, phân lập, định danh vi khuẩn từ
mẫu thử:
-Thạch máu
-Thạch Uri select
-Thạch thường
-Thạch sabouraud
Vật liệu cho xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và
các dụng cụ khác:
- Ống tube vô trùng
- Nước muối sinh lý vô trùng
2

- Thạch máu
- Pipet nhựa vô trùng
- Que cấy, đèn cồn, găng tay, lam kính...
Phương pháp nghiên cứu:
 Thiết kế nghiên cứu: thử nghiệm trong phòng thí nghiệm.
Kỹ thuật tiến hành:
 Nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn từ mẫu thử:
- Dùng que cấy lấy 1 lượng dung dịch cần thử cấy lên môi trường thạch
máu, uri select. Ủ ở 370 C/18-24h.
- Định danh vi khuẩn nếu mọc. Chỉ thực hiện các bước tiếp theo nếu không
mọc trong số những chủng thử nghiệm.


Xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm:
- Dùng pipet hút 1 ml dung dịch thử nghiệm vào ống tube vô trùng.
- Pha loãng bậc 2 các dung dịch thử nghiệm vào các ống tube (1, 2, 4, 8, 16…)

bằng nước muối sinh lý vô trùng, đánh dấu từng ống tube với mỗi độ pha loãng.
- 1 ống chứng là ống chỉ có nước muối sinh lý.
- Chuẩn bị huyền dịch:
• Chủng vi khuẩn cần thử được nuôi cấy thuần, qua đêm.
• Dùng que cấy lấy 3-5 khuẩn lạc hòa tan vào ống tube đựng nước muối
sinh lý vô trùng 0,9%, điều chỉnh để đạt huyền dịch có nồng độ 0,5 Mac Farland
(tương đương 108 CFU/1ml).
• Trong vòng 15 phút sau, tiếp tục pha loãng huyền dịch trên bằng canh
thang Muller-Hinton vô trùng (MHB) (đối với vi khuẩn dễ mọc) hoặc canh
thang Muller-Hinton có 2,5 - 5% máu cừu (đối với S. pneumoniae và S.
agalactiae), để đạt nồng độ 5 x 10 5 CFU/1ml (pha loãng 1:100 để đạt nồng độ
106 CFU/1ml, sau đó tiếp tục pha loãng 1:2 để đạt nồng độ 5 x 105 CFU/1ml).
• Huyền dịch được pha loãng tiếp 1:100 sau đó 1:2 bằng canh thang RPMI

1640 để đạt nồng độ 5 x 103 - 2,5 x 104 tế bào/ 1ml.
- Dùng pipet hút 1ml huyền dịch sau khi pha loãng ở bước cuối cùng cho
vào ống chứng, tiếp đến là từng ống tube chứa dung dịch thử nghiệm đã pha
loãng từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. Như vậy, mỗi ống sẽ chứa 2 ml, nồng độ
tác nhân cần thử và nồng độ vi khuẩn đều là 1:2.
- Ủ các ống tube ở 350 C/18-24 h đối với vi khuẩn, 48-96 giờ với nấm.
3


- Sau thời gian ủ ấm trên, dùng que cấy lấy một lượng dịch ở mỗi tube cấy
vào từng đĩa thạch máu, đánh dấu các đĩa thạch tương ứng với từng nồng độ pha
loãng. Ủ các đĩa thạch ở 370 C/18-24 h, có hoặc không có CO 2 tùy thuộc vào
chủng vi khuẩn, nấm cần thử.
- Kiểm tra các đĩa thạch máu xem sự mọc của vi khuẩn: đạt khi ở đĩa
chứng, vi khuẩn mọc tốt và ở tất cả các đĩa vi khuẩn mọc thuần nhất, khi đó mới
tìm nồng độ ức chế tối thiểu: là nồng độ mà tương ứng tại đó vi khuẩn không
mọc hoặc mọc < 10 % so với đĩa chứng (bị ức chế >90 %).
Trong nghiên cứu với mỗi chủng vi khuẩn đều pha loãng 5 nồng độ:
1/1,1/2,1/4, 1/8, 1/16 so với dung dịch gốc. Mỗi nồng độ ít nhất n=5 cho mỗi
chủng vi khuẩn, nấm.
Nhận định kết quả: tìm được nồng độ thấp nhất có tác dụng ức chế sự phát
triển của vi khuẩn và nấm.

4


II. Kết quả nghiên cứu:
2.1. Tác dụng kháng khuẩn
Bảng 1: Xác định tỷ lệ pha loãng của thuốc thử Trĩ Thiên dược lên sự phát triển
của chủng vi khuẩn S. aureus

Nồng độ pha

S. aureus
Lần 3
Lần 4

Lần 1
Lần 2
Lần 5
loãng
1/1
+
+
+
+
1/2
+
+
+
+
1/4
+
+
+
1/8
+
+
+
+
1/16

+
+
+
+
+
Với chủng vi khuẩn S. Aureus, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế sự
phát triển của vi khuẩn lần lượt ở tất cả các tỷ lệ pha loãng trong 5 lần. Do đó,
chưa xác định được nồng độ ức chế tối thiểu MIC của thuốc thử Trĩ Thiên Dược
với chủng vi khuẩn này.
Bảng 2: Xác định tỷ lệ pha loãng của thuốc thử Trĩ Thiên Dược lên sự phát triển
của chủng vi khuẩn E. coli
Nồng độ pha

E. coli
Lần 3

Lần 1
Lần 2
Lần 4
Lần 5
loãng
1/1
+
+
+
+
1/2
+
+
+

+
+
1/4
+
+
+
1/8
+
+
+
+
+
1/16
+
+
+
+
+
Với chủng vi khuẩn E. coli, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế sự phát
triển của vi khuẩn ở tất cả 5 nồng độ pha loãng. Vì vậy, chưa xác định được nồng
độ ức chế tối thiểu MIC của thuốc thử Trĩ Thiên Dược với chủng vi khuẩn này.

5


Bảng 3: Xác định tỷ lệ pha loãng của thuốc thử Trĩ Thiên Dược lên sự phát triển
của chủng vi khuẩn S. faecalis
Nồng độ pha

S. faecalis

loãng

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

1/1

-

-

-

+

-

1/2

+

+

-

-

+

+

+

+

-

1/4
1/8

+

+

+

+

+

1/16

+

+

+

+

+

Với chủng vi khuẩn S. faecalis, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế
sự phát triển của vi khuẩn ở các tỷ lệ pha loãng trong 5 lần. Do đó, chưa xác
định được nồng độ ức chế tối thiểu MIC của thuốc thử Trĩ Thiên Dược với
chủng vi khuẩn này.
Bảng 4: Xác định tỷ lệ pha loãng của thuốc thử Trĩ Thiên Dược lên sự phát
triển của chủng vi khuẩn S. pneumoniae
Nồng độ pha

S. pneumoniae

loãng

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

1/1

+

+

+

+

-

1/2

+

+

+

+

+

1/4

-

+

+

+

+

1/8

+

+

+

+

-

1/16

+

+

+

+

+

Với chủng vi khuẩn S. pneumoniae, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế
sự phát triển của vi khuẩn ở tất cả 5 nồng độ pha loãng 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 và 1/16.
Vì vậy, chưa xác định được nồng độ ức chế tối thiểu MIC của thuốc thử Trĩ
Thiên Dược với chủng vi khuẩn này.

6


Bảng 5: Xác định tỷ lệ pha loãng của thuốc thử Trĩ Thiên Dược lên sự phát triển
của chủng vi khuẩn P. aeruginosa
Nồng độ pha

P. aeruginosa
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Lần 4
Lần 5
loãng
1/1
+
+
+
1/2
+
+
+
+

1/4
+
+
+
+
1/8
+
+
+
+
+
1/16
+
+
+
+
+
Với chủng vi khuẩn P. aeruginosa, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế

sự phát triển của vi khuẩn ở tất cả các tỷ lệ pha loãng. Vì vậy, chưa xác định
được nồng độ ức chế tối thiểu MIC của thuốc thử Trĩ Thiên Dược với chủng vi
khuẩn này.
2.2. Tác dụng kháng nấm
Bảng 6: Xác định tỷ lệ pha loãng của thuốc thử Trĩ Thiên Dược lên sự phát triển
của chủng nấm Candida albican
Nồng độ pha

Candida albican
Lần 1
Lần 2

Lần 3
Lần 4
Lần 5
loãng
1/1
+
+
+
+
+
+
1/2
+
+
+
+
1/4
+
+
+
+
+
1/8
+
+
+
+
+
1/16
+

+
+
+
+
Với chủng nấm Candida albican, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế sự

phát triển của nấm ở tất cả các tỷ lệ pha loãng. Vì vậy, chưa xác định được nồng
độ ức chế tối thiểu MIC của thuốc thử Trĩ Thiên Dược với chủng vi nấm này.
III. Kết luận
3.1. Tác dụng kháng khuẩn:
Thuốc thử Trĩ Thiên Dược chưa thể hiện tác dụng kháng 5 chủng vi khuẩn
3.2. Tác dụng kháng nấm:
Thuốc thử Trĩ Thiên Dược chưa thể hiện tác dụng kháng nấm Candida
albican
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Andrews,

J.

M.

(2001),

"Determination

of

minimum

inhibitory

concentrations".Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48 (suppl 1): 5–16..
7


2.

Jump

up^ Turnidge

JD, Ferraro MJ, Jorgensen

JH (2003),

Susceptibility Test Methods: General Considerations. In PR Murray, EJ
Baron, JH Jorgensen, MA Pfaller, RH Yolken. Manual of Clinical
Microbiology. 8th Ed. Washington. American Society of Clinical
Microbiology. p 1103.
3.

Jump up^ Davison, HC; Low, JC; Woolhouse, ME (2000), "What is
antibiotic

resistance

and

how

can

we

measure

it?". Trends

in

Microbiology 8 (12): 554–9.
4.

Jump up^ O'Neill, AJ; Chopra, I (2004), "Preclinical evaluation of novel
antibacterial agents by microbiological and molecular techniques.". Expert
Opinion on Investigational Drugs 13 (8): 1045–63.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

Trưởng nhóm nghiên cứu
PGS.TS. Phạm Thị Vân Anh
Trường Đại học Y Hà Nội xác nhận
Chữ ký trên của PGS.TS. Phạm Thị Vân Anh là đúng
Trưởng phòng Tổ chức Cán bộ

8