CÁC kỹ THUẬT PHÁT HIỆN đột BIẾN GEN CYP1B1 TRONG BỆNH GLÔCÔM bẩm SINH NGUYÊN PHÁT

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1953, hai nhà bác học James D. Watson và Francis H.C. Crick đã
phát hiện cấu trúc chuỗi xoắn kép của DNA chính thức đánh dấu sự ra đời của
sinh học phân tử . Kỹ thuật sinh học phân tử là việc sử dụng các kỹ thuật gen
và kỹ thuật protein để xác định trình tự gen hay chuỗi acid amin của mỗi từng
gen khác nhau, cũng như lập bản đồ gen của từng khu vực nhất định trong bộ
gen của các loài sinh vật. Hiện nay, có nhiều phương pháp sinh học phân tử
ứng dụng cho từng loại bệnh lý khác nhau.giúp phát hiện các bệnh lý di
truyền. Trong lĩnh vực Y học và di truyền học kỹ thuật gen giúp con người
phát hiện được căn nguyên của một số bệnh nan y, chế tạo các loại thuốc mới
để điều trị bệnh. Đặc biệt, trong những năm gần đây, liệu pháp gen đã được
nghiên cứu và dần dần đưa vào ứng dụng để điều trị một số bệnh lý di truyền.
Di truyền Y học trong các năm qua đã phát triển rất nhanh cả về
chiều rộng lẫn chiều sâu, đặc biệt là các kỹ thuật sinh học phân tử đã thâm
nhập vào hầu hết các chuyên ngành của y học và phát huy hiệu quả to lớn
trong chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh.
Từ những năm 1970, Shaffer và Weiss đã xác định glôcôm bẩm sinh
nguyên phát là một thể bệnh glôcôm di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể
thường phổ biến ở trẻ em . Các nghiên cứu đã chỉ ra protein CYP1B1 đóng
vai trò quan trọng nhất trong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năng
vùng bè, góc tiền phòng của nhãn cầu và đột biến gen này dẫn đến bệnh
glôcôm bẩm sinh nguyên phát . Trong 5 năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh
glôcôm bẩm sinh nguyên phát ở châu Á đã và đang tập trung đi sâu vào cơ
chế bệnh sinh ở mức độ phân tử, làm cơ sở cho việc triển khai chẩn đoán
trước sinh cũng như liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc quản lý tốt
những người mang gen gây bệnh, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội.


2

Trong 5 năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên
phát ở châu Á đã và đang tập trung đi sâu vào cơ chế bệnh sinh ở mức độ
phân tử, làm cơ sở cho việc triển khai chẩn đoán trước sinh cũng như liệu
pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc quản lý tốt những người mang gen gây
bệnh.
Trong bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát, đột biến gen CYP1B1 chủ
yếu là đột biến điểm, xuất hiện trên toàn bộ chiều dài gen vì vậy phương pháp
PCR, giải trình tự gen và MLPA được sử dụng để phát hiện đột biến , , , , .
Cphạm vi chuyên húng tôi tiến hành chuyên đề này để trình bày xin đề cập
đến nội dung "Các kỹ thuật thông dụng để xác định đột biến gen CYP1B1
trong bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát và phát hiện người lành mang gen
bệnh ".
1. GEN CYP1B1 VÀ ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH GLÔCÔM BẨM SINH
NGUYÊN PHÁT

1.1. Cấu trúc và vị trí gen CYP1B1
Tên khoa học chính thức của gen CYP1B1 là "cytochrome P450,
family 1, subfamily B, polypeptide 1”. Ngoài ra gen CYP1B1 còn được gọi
với

các

tên

khác

như:

aryl

hydrocarbon

hydroxylase,

CP1B,

CP1B1_HUMAN, cytochrome P450 - subfamily I (dioxin-inducible) polypeptide

1,

flavoprotein-linked

monooxygenas,

microsomal

monooxygenase, xenobiotic monooxygenase.
Năm 1994, Sutter và cộng sự đã xác định được gen CYP1B1 gồm 543
axit amin và là một phân họ gen mới của cytochrome P450, P4501B1. Bằng
cách phân tích tế bào sinh dưỡng của người và động vật gặm nhấm, tác giả đã
lập bản đồ gen CYP1B1 và xác định gen nằm trên nhiễm sắc thể 2 .
Năm 1996, Tang và cộng sự đã phát hiện ra gen CYP1B1 nằm trên
nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2 tại vị trí 2p22.2 và bao gồm 3 exon, phần mã hóa
gen bắt đầu từ exon thứ 2, chiều dài gen là 1629 cặp base .


3

Từ việc xác định vị trí nối intron/exon của gen CYP1B1, Stoilov và

cộng sự (1997) đã chỉ ra gen CYP1B1 có 3 exon và 2 intron, dài 12 kb, mã
hóa phân tử mRNA gồm 1.631 base. Cụ thể hơn nữa, các gen CYP1B1 nằm
từ cặp base số 38.067.602 đến 38.076.180 . Trong một loạt nghiên cứu về
nhiễm sắc thể 2, vùng chứa gen CYP1B1 đã được xác định là GLC3A .

Hình 1. Vị trí của gen CYP1B1 trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2
Năm 1998, Ivaylo Stoilov và cộng sự đã xây dựng mô hình ba chiều về
vùng C' tận (C-terminal) của protein CYP1B1. Cấu trúc này gồm bốn vùng I,
L, J và K cùng với vùng gắn heme mô tả 3 đột biến dẫn đến thiếu một sản
phẩm giữa axit amin 189 và 254 axit amin từ terminus C là Glu387, Arg390
và Cys470.

Hình 2. Hình ảnh không gian 3 chiều vùng C' tận của protein CYP1B1.


4

1.2.2. Chức năng, cơ chế gây bệnh của gen CYP1B1

Gen CYP1B1 là một phân họ của cytochrome P450. Các cytochrome
của dòng P450 được biết đến chủ yếu với khả năng chuyển hóa các chất lạ
sinh học (xenobiotics) và có chức năng giống như bất kỳ phân tử men nào.
Các cytochrome tham gia vào các phản ứng oxy hóa như: sinh tổng hợp, sản
xuất hormon cần thiết hoặc đóng vai trò là các hợp chất trao đổi chất trung
gian trong hầu hết các sinh vật sống. Đột biến ảnh hưởng đến men thường tạo
ra các đột biến lặn. Đối với đột biến lặn dạng dị hợp tử, alen bình thường có
khả năng bù đắp chức năng cho alen bị đột biến. Từ quan điểm này, một kiểu
hình lặn như glôcôm bẩm sinh nguyên phát được gây ra bởi đột biến trong
một loại men như CYP1B1 là hợp lý.
Trong quá trình hình thành và phát triển nhãn cầu, chức năng của men

CYP1B1 chưa rõ ràng, nhưng nó được giả thiết rằng đóng một vai trò trong
việc hình thành các cấu trúc ở phía trước của mắt và cũng có thể tham gia vào
một quá trình điều chỉnh sự bài tiết thủy dịch.
Schwartzman và cộng sự năm 1987 đã xác định có mối liên quan giữa
arachidonate phụ thuộc cytochrome P450 với ức chế Na +, K +-ATPase trong
giác mạc trong việc điều chỉnh tính trong suốt của giác mạc và tiết thủy dịch.
Phát hiện này phù hợp với mờ đục của giác mạc và tăng nhãn áp, 2 tiêu chuẩn
chẩn đoán chính cho bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát .
Stoilov I. (2000) đã đưa ra giả thuyết rằng CYP1B1 chuyển hóa một
phân tử có nguồn gốc nội sinh (như steroid, axit béo hoặc hợp chất
prostanoid) cần thiết cho phát triển bình thường và chức năng của mắt. Hoạt
động của CYP1B1 có thể dưới hai dạng: tạo ra một hợp chất hoạt động trên
một số mục tiêu hoặc ngừng tác dụng của các hợp chất sinh học khác và
chiếm vị trí của nó. Tuy nhiên các phân tử này được chuyển hóa bởi quá trình
kích hoạt có tổ chức của các men. Vì vậy, CYP1B1 có thể thuộc về một con


5

đường tín hiệu sinh hóa nội sinh chưa được biết rõ, liên quan đến trưởng
thành cuối cùng của góc tiền phòng. Đột biến gen CYP1B1 sẽ gây ra rối loạn
sản xuất men , làm bất thường cấu trúc mạng lưới vùng bè, nơi có các ống
tuyến giúp lưu thoát thủy dịch khỏi mắt. Sự ứ trệ thủy dịch này làm tăng nhãn
áp gây bệnh glôcôm .
Thể đột biến CYP1B1
Mất chức
năng

Đích tác
động

Thể hoang dại CYP1B1

Cơ chất

Hoạt hóa
hay
Bất hoạt

gắn heme

Đột biến
cắt cụt

Đột biến
vùng bản lề

Đột biến
vùng lõi

Hình 3. Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1

Có sự khác biệt về tác động của thể hoang dại và thể đột biến của phân
tử CYP1B1. Phân tử CYP1B1 thể hoang dại được neo trên màng của lưới nội
nguyên sinh. Chức năng bình thường của nó đòi hỏi sự tham gia của một số
đối tác oxy hóa khử P450 reductase. P450 reductase có khả năng đưa một
nguyên tử của phân tử oxy vào cơ chất của nó. Khi đó có 2 khả năng xảy ra:
(B) trường hợp cơ chất được hoạt hóa và tác động trên mục tiêu xuôi dòng
chưa được biết. Tuy nhiên, oxy phân tử có thể làm tăng khả năng ưa nước của
cơ chất và làm dễ dàng cho sự bài tiết và thanh lọc cơ chất từ trong tế bào.

Bởi vậy, đột biến CYP1B1 có thể làm thay đổi 2 khả năng trên. (C) sự điều
hòa không gian và thời gian của các gen kiểm soát phát triển của góc tiền
phòng sẽ bị thay đổi bởi sự vắng mặt của phân tử điều hòa (ví dụ như steroid)
được sản sinh bởi CYP1B1. Bên cạnh đó, những dấu hiệu dừng phát triển của


6

góc tiền phòng được quan sát thấy trong góc tiền phòng của glôcôm bẩm sinh
nguyên phát có thể phản ánh ảnh hưởng của một quá trình chuyển hóa có thể
được giới hạn và loại bỏ bởi phân tử CYP1B1.
2. CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 VÀ PHÁT HIỆN
NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH
2.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Năm 1985, kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Kary Mullis phát minh, quá
trình nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm mà không cần nhờ đến
các tế bào chủ như vi khuẩn hay nấm men, đồng thời mở ra nhiều triển vọng
trong nghiên cứu và ứng dụng.
2.1.1. Nguyên tắc chung

Dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase xúc tác tổng hợp một mạch
DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotid. Phản
ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ
sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm ba bước: biến tính, bắt cặp, kéo dài chuỗi.
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản ứng
bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94 oC

- 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép
các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm
của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên
72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase,
Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ


7

thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây
đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi ADN mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
để làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản
phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài là
khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được
xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi.
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn
DNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ. Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng
gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNA đích đã
nhân bản được thành 2n bản sao. Nhờ vậy đủ số lượng DNA để có thể tách ra
khi điện di và có thể phát hiện được sau khi nhuộm và để có thể tạo dòng
hoặc giải trình tự. Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, ở những chu kỳ
sau lượng khuôn tăng nhưng lượng mồi và dNTP (deoxyribonucleoside
triphosphate) tự do giảm, enzym DNA polymerase hoạt động yếu dần. Do đó,
cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP và enzym để đảm bảo phản ứng PCR cho
kết quả tốt nhất .

8

Hình 4. Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR (Theo Andy Vierstraete, 1999)
2.1.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR

DNA khuôn
Đoạn khuôn DNA (DNA template, DNA target) tinh sạch là một yếu tố
quan trọng, giúp phản ứng PCR tạo được các sản phẩm chính xác. Kích thước
đoạn DNA khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả nhân gen tốt nhất. DNA khuôn
mẫu có thể được chiết tách từ bạch cầu máu ngoại vi, từ mô sinh thiết, từ tinh
dịch đã lâu ngày, từ tóc và xương của người đã chết, ... Lượng DNA khuôn
thường dùng là khoảng 100-1000 ng cho phản ứng PCR 25-50 μl .
Mồi
Mồi là những đoạn oligonucleotid có chiều dài khoảng 15-30 nucleotid.
Để thực hiện nhân một đoạn DNA bằng phản ứng PCR, cần có một cặp mồi
thích hợp, bắt cặp đặc hiệu với DNA khuôn. Mỗi cặp mồi gồm 1 mồi xuôi và
1 mồi ngược. Mồi xuôi có trình tự acid nucleic tương đồng với trình tự của
mạch đơn DNA không mang mã (mạch antisense), mồi xuôi bắt cặp ở đầu 3’
của mạch antisense. Mồi ngược có trình tự tương đồng với trình tự của mạch


9

DNA mang mã di truyền (mạch sense) và bắt cặp với mạch sense ở đầu 3’.
Nồng độ của mỗi mồi trong phản ứng là 0,1-0,5 μM .
Các nucleotid tự do
Gồm 4 loại deoxynucleotid triphosphat (dNTPs): dATP, dTTP, dGTP và
dCTP, được dùng làm cơ chất để tổng hợp DNA. Nồng độ dNTP mỗi loại
khoảng 50-200μM cho mỗi phản ứng PCR. Khi hàm lượng dNTP tự do quá ít,
tạo sản phẩm PCR ít không đủ để phát hiện. Ngược lại nồng độ dNTP cao thì

phản ứng PCR khó thực hiện.
Enzym DNA polymerase
Là yếu tố đóng vai trò quyết định hiệu quả của phản ứng PCR. Enzym
thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase, được phân lập từ vi khuẩn
Thermus aquaticus sống ở nhiệt độ cao. Hàm lượng enzym ảnh hưởng rất lớn
đến hiệu quả PCR. Khi hàm lượng enzym quá ít, không đủ tạo sản phẩm PCR
cần thiết. Ngược lại, quá nhiều enzym, sẽ tạo ra các sản phẩm PCR không đặc
hiệu. Thông thường lượng enzym Taq polymerase cần cho mỗi phản ứng có
thể tích 25 μl là 0,5 U , .
Dung dịch đệm của phản ứng
Dung dịch đệm của phản ứng PCR cần đảm bảo các thành phần cần
thiết cho hoạt động của enzym DNA polymerase như MgCl 2, KCl, Tris-HCl,...
Trong đó, Mg2+ là thành phần ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứng
PCR do ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch
khuôn. Nồng độ Mg2+ thường là 1-5mM .
2.1.3. Phương pháp PCR thường được sử dụng phát hiện đột biến gen CYP1B1
gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát - PCR đơn mồi (monoplex PCR)

Là PCR kinh điển nhất, trong mỗi phản ứng PCR, chỉ sử dụng duy nhất
một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA
của tế bào .


10

Các tác giả đã sử dụng từng cặp mồi để khuếch đại từng exon của gen
CYP1B1 bằng phản ứng PCR, sau đó điện di trên gel agarose, mẫu bệnh nhân
được tiến hành song song với mẫu đối chứng. Nếu mẫu đối chứng xuất hiện
vạch DNA tương ứng với kích thước của exon được khuếch đại, trong khi mẫu
bệnh nhân không xuất hiện vạch thì bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon đó.

Để khuếch đại gen CYP1B1 trong bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát,
các nghiên cứu trước đây đều sử dụng phương pháp PCR.

Hình 5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2,

gen CYP1B1 đột biến G61E trong nghiên cứu của I. Stoilov năm 1998 .

Hình 6. Hình ảnh PCR-RFLP của đột biến E229K
2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing)

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp
xếp của các nuceotid trong phân tử DNA. Hiện nay, người ta thường sử dụng
hai phương pháp giải trình tự đó là phương pháp dideoxynucleotid và giải
trình tự bằng máy tự động.
2.2.1. Giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid

Phương pháp này do F. Sanger, Smith và Coulson phát hiện ra năm
1977. Nguyên lý của phương pháp này như sau: dideoxynucleotid (ddNTP) là
một phân tử nhân tạo, cấu trúc của nó tương tự như phân tử deoxynucleotid


11

(dNTP), tuy nhiên ở carbon số 3 của đường deoxyribose không phải là nhóm
hydroxyl (– OH) mà là – H (hình 7).

Hình 7. Cấu trúc phân tử dNTP và ddNTP

Trong quá trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, một dNTP tự do gắn vào
chuỗi đang tổng hợp bằng liên kết phosphodieste giữa 5’ phosphat với nhóm

3’ hydroxyl của nucleotid cuối cùng của chuỗi (hình 8.A). Tuy nhiên, nếu một
ddNTP được gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng hợp thì sự tổng hợp DNA sẽ
dừng lại do không hình thành được liên kết phosphodieste với nucleotid tiếp theo
(hình 8.B).


12

Hình 8. Quá trình tổng hợp DNA bình thường (A) và tổng hợp DNA bị ức chế (B)

Quy trình giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid gồm các bước:

Hình 9. Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP

(a). Đoạn DNA cần giải trình tự được đưa vào vector tách dòng (thường
là plasmid), vector mang đoạn DNA này được biến nạp vào tế bào E.coli để


13

chọn lọc và nhân dòng. Sau đó tiến hành tách chiết DNA plasmid.
(b). Sử dụng một đoạn mồi bổ sung với trình tự của vector và gắn vào
đầu 3’ của vector gần vị trí chèn DNA.
(c). Phản ứng được tiến hành trong 4 ống nghiệm, mỗi ống được cung
cấp thêm DNA polymerase, 4 loại dNTP tự do ( một trong bốn loại dNTP này
được đánh dấu phóng xạ) và một trong bốn dideoxynucleic (ddATP, ddCTP,
ddGTP, ddTTP). Nồng độ của mỗi ddNTP được điều chỉnh thận trọng, thường
chỉ dùng một lượng nhỏ, khoảng 1%.
Trong quá trình tổng hợp chuỗi, enzym DNA polymerase sẽ gắn các
dNTP vào để kéo dài chuỗi. Do hàm lượng rất thấp nên thỉnh thoảng mới có 1

dideoxynucleotid được gắn vào chuỗi và lúc đó phản ứng tổng hợp chuỗi bị
dừng lại. Như vậy trong mỗi ống phản ứng chứa các mạch đơn DNA có chiều
dài khác nhau, và ở đầu 3’ của các đoạn DNA chứa một ddNTP tương ứng đã
cho vào ống đó.
(d). Tiến hành điện di 4 ống phản ứng trên 4 hàng của một gel
polyacrylamid để phân tách các đoạn DNA.
(e). Do một trong 4 dNTP có đánh dấu phóng xạ nên khi dùng kỹ thuật
phóng xạ tự ghi, các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo các vạch sáng trên phim X
quang.
(f). Tổng hợp kết quả ở cả 4 ống, thu được các mạch đơn có kích thước
hơn kém nhau 1 nucleotid. Đoạn DNA ngắn nhất sẽ di chuyển xa nhất. Trên ví
dụ ở hình 10, đoạn ngắn nhất xuất hiện ở ống chứa ddATP, như vậy nucleotid
đầu tiên được tổng hợp ở chuỗi bổ sung là Adenin. Đoạn DNA ngắn thứ 2
xuất hiện ở ống chứa ddCTP, như vậy nucleotid thứ 2 của mạch DNA bổ sung
là cytosin,... Phân tích tương tự, chúng ta sẽ biết được trình tự đoạn mạch đơn
mới được tổng hợp và xác định được trình tự của mạch DNA khuôn .
2.2.2. Giải trình tự bằng máy tự động


14

Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các
nucleotid trong phân tử DNA. Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như
trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi.
Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với
nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các
deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp. Sự gắn của
các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA được
tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau.
Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA có thể được xác định bằng cách chạy

đồng thời bốn phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loại
dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng
hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất phát
huỳnh quang đặc hiệu khác nhau. Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp
từ sợi khuôn được phân tách bằng điện di trên thạch acrylamid có độ phân
giải cao, cho phép phân biệt được các sợi đơn DNA hơn kém nhau 1
nucleotid. Trình tự các nucleotid được xác định tương ứng với trình tự của các
vạch trên gel ứng với mỗi loại dideoxynucleotid.
Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc
sử dụng ddNTP do F. Sanger và cộng sự phát minh. Máy giải trình tự gen
dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, hệ thống điện
di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử
ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang
tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích.
Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận biết được từng loại nucleotid và
trình tự của DNA đích .
Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên GeneBank
(National Center for Biotechnology Information – NCBI).


15

Kỹ thuật giải trình tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiều nghiên
cứu để xác định các đột biến mất nucleotid, thay thế nucleotid, thêm nucleotid
trên gen.

Người bình thường

Bệnh nhân

Hình 10. Hình ảnh giải trình tự gen CYP1B1 của bệnh nhân glôcôm bẩm sinh
nguyên phát (Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein)
2.2.3. Phương pháp giải trình tự gen thường được sử dụng phát hiện đột biến
gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát

Nghiên cứu của Reddy A. B. (2004) tại Ấn Độ đã dùng phương pháp
DNA sequencing phát hiện 16 đột biến gen CYP1B1, trong đó có 7 đột biến
mới gồm 2 đột biến xóa đoạn là g.3905del23bp, g.7900-7901delCG và 5 đột
biến thay thế acid amin là A115P, M132R, Q144P, S239R, G466D.


16

Hình 11. Hình ảnh đột biến xóa đoạn g.3905del23bp

Hình 12. Hình ảnh đột biến xóa đoạn g.7900-7901delCG

Nghiên cứu của Ezequiel Campos-Mollo (2009) tiến hành ở 38 bệnh
nhân phát hiện được 16 đột biến gen CYP1B1 trong đó có 6 đột biến mới là
A106D, E173X, F261L, E262X, W341X và P513_K514del .


17

Hình 13. Hình ảnh 6 đột biến mới gen CYP1B1 ở bệnh nhân Tây Ban Nha

Hình 14. Sơ đồ 6 vị trí đột biến mới trên gen CYP1B1

Nghiên cứu của tác giả Hee-Jung Kim ở Hàn Quốc năm 2011 sử dụng
phương pháp Bi-directional sequencing phân tích 85 bệnh nhân glôcôm bẩm

sinh nguyên phát đã phát hiện được 22 bệnh nhân (chiếm 25,9%) mang 11
đột biến gen khác nhau, trong đó có 3 trường hợp đồng hợp tử và 8 trường
hợp dị hợp tử. 7 đột biến thay thế acid amin (1 đột biến mới là p.G329S) và
4 đột biến xóa đoạn (1 đột biến mới làm lệch khung dịch mã là
p.V419Gfs11X) .


18

Người
bình thường

Bệnh nhân
Hình 15. Hình ảnh giải trình tự gen của đột biến xóa đoạn
làm lệch khung dịch mã p.V419Gfs11X .

Nghiên cứu của Gronskov K. và cộng sự năm 2016 tại Đan Mạch đã
dùng phương pháp Sanger sequencing để xác định được 12 đột biến của gen
CYP1B1 gây bệnh Glôcôm bẩm sinh nguyên phát, trong đó có 5 đột biến
mới. 12 đột biến gen bao gồm 6 đột biến thay thế acid amin, 4 đột biến tạo mã
kết thúc (2 đột biến vô nghĩa và 2 đột biến lệch khung dịch mã), 1 đột biến
xóa đoạn và 1 đột biến lặp đoạn .
Nghiên cứu của Đỗ Tấn và cộng sự năm 2016 ở Việt Nam đã dùng
phương pháp Bi-directional sequencing trên 30 bệnh nhân đã phát hiện được
5 đột biến (chiếm 16,7%), trong đó có 2 dạng đồng hợp tử và 3 dị hợp tử .

Bệnh nhân

Bệnh nhân

Người bình thường

Người bình thường

Hình 16. Hình ảnh giải trình tự gen của đột biến

c.364_363 insGACCGGCCGGCCTTCGCC, thêm 6 acid amin
(p.A121_S122insDRPAFA) và đột biến thay thế acid amin p.L107V.


19

2.3. Phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification)

Hiện nay, kỹ thuật MLPA được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh
lý di truyền, nó cho phép phát hiện các tổn thương gen một cách nhanh
chóng .
2.3.1. Chuẩn bị probe

Trong phản ứng MLPA, vấn đế thiết kế các probe gắn đặc hiệu với các
đoạn DNA đích đóng vai trò cực kỳ quan trọng. Thông thường, mỗi probe
chứa hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác nhau (hình 14):
- Phân tử oligonucleotid ngắn: Gồm 2 đoạn:
+ Đoạn 1: Có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và
sẽ lai với DNA đích khi tiến hành phản ứng lai, đoạn này có khoảng 21-30
nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe.
+ Đoạn 2: Nằm ở đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid. Trình tự
nucleotid của đoạn này giống nhau cho tất cả các probe, đây là vị trí gắn với
mồi Y để khuyếch đại probe khi tiến hành phản ứng PCR.
- Phân tử oligonucleotid dài: cấu tạo gồm 3 đoạn:

+ Đoạn 1’: Chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở
đầu tận 5’.
+ Đoạn 2’: Gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống
nhau cho tất cả các probe. Là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuyếch đại
probe.
+ Đoạn 3’: Còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai
đoạn 1’ và 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không
đặc hiệu với DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn
stuffer khác nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài


20

khác nhau. Do đó, sản phẩm khuyếch đại của các probe sẽ được phân tách
bằng điện di , .

Hình 17. Các giai đoạn của Kỹ thuật MLPA (theo Jan P. Schouten, 2002)
2.3.2. Các bước tiến hành phản ứng MLPA

- Mẫu DNA hòa với 5 μl TE được biến tính ở 98°C trong 5’.
- Cho hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của các probe vào.
- Hỗn hợp được ủ ở 60°C trong vòng 16 giờ (qua đêm). Hai đoạn lai
của 2 phân tử oligonucleotid sẽ gắn với DNA đích đặc hiệu ở vị trí sát nhau.
- Cho enzym ligase vào và ủ ở 54°C trong 15 phút, enzym lipase xúc
tác, nối hai đoạn oligonucleotid của probe lại với nhau. Phản ứng nối sẽ chấm


21

dứt bởi sự tăng nhiệt độ lên 98°C trong 5 phút của phản ứng PCR để khuyếch

đại các probe.
- Hai đầu 5’ và 3’ của các probe có trình tự nucleotid hoàn toàn giống
nhau, đây cũng là vị trí gắn mồi khi tiến hành phản ứng PCR. Do vậy, chúng
ta chỉ cần dùng duy nhất 1 cặp mồi nhưng khuyếch đại được toàn bộ các
probe khác nhau có trong hỗn hợp.
- Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuyếch đại thành nhiều bản
sao. Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm
(stuffer) của chúng khác nhau. Do vậy, chúng sẽ được phân tách bằng phương
pháp điện di (thường sử dụng phương pháp điện di mao quản). Số lượng sản
phẩm khuyếch đại của mỗi probe sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn
DNA đích đặc hiệu với probe đó , .
2.3.3. Phương pháp MLPA được sử dụng phát hiện đột biến gen CYP1B1 gây
bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát

Nghiên cứu của Kristy Damjanovich (2013) đã ứng dụng phương pháp
MLPA để phát hiện đột biến xóa đoạn dạng đồng hợp tử gen CYP1B1 trên


22

nhiễm sắc thể số 2 của bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát .

Hình 18. Hình ảnh đột biến xóa đoạn dạng đồng hợp tử

(vùng màu hồng) của gen CYP1B1.
KẾT LUẬN
Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học phân tử trong những
năm gần đây đã thay đổi một cách rõ rệt những hiểu biết ở mức độ phân tử
của rất nhiều bệnh lý khác nhau trong đó có bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên
phát. Nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, việc xác định đột biến gen

CYP1B1 đã đưa ra cái nhìn đầy đủ về nguyên nhân gây bệnh, phối hợp với
lâm sàng giúp chẩn đoán, điều trị sớm, cũng như tiên lượng và phòng bệnh
cho bệnh nhân. Với sự phát triển không ngừng của sinh học phân tử, các kỹ
thuật chẩn đoán ngày càng hoàn thiện và cho kết quả nhanh, chính xác. Song
song với việc chẩn đoán bệnh, ngành công nghệ sinh học còn giúp tạo ra
nhiều thuốc mới bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Bên cạnh đó, nhờ các kỹ thuật
sinh học phân tử, có nhiều phương pháp điều trị mới được ra đời và thu được
thành quả tốt như liệu pháp điều trị thay thế gen, ghép tế bào gốc... Hy vọng
trong tương lai, các bệnh lý di truyền nói chung và bệnh glôcôm bẩm sinh


23

nguyên phát nói riêng sẽ được chẩn đoán sớm và những biện pháp can thiệp
hợp lý nhằm giảm tỷ lệ mù lòa ở trẻ cũng như giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng
đồng.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

J. D. Watson và F. H. Crick (1974), "Molecular structure of nucleic
acids: a structure for deoxyribose nucleic acid. J.D. Watson and F.H.C.
Crick. Published in Nature, number 4356 April 25, 1953", Nature,
248(5451), tr. 765.

2.

Robert N. Weiss, Shaffer và Daniel I. (1970), "Congenital and pediatric
glaucomas", Mosby, St. Louis, tr. 37.

3.

M. Yang, X. Guo, X. Liu và các cộng sự. (2009), "Investigation of
CYP1B1 mutations in Chinese patients with primary congenital
glaucoma", Mol Vis, 15, tr. 432-7.

4.

Ji Hyun Lee, Chang-Seok Ki, Hee-Jung Kim và các cộng sự. (2011),
"Analysis of copy number variation using whole genome exon-focused
array CGH in Korean patients with primary congenital glaucoma", Mol
Vis. , 17, tr. 3583–3590.

5.

Mukesh Tanwar, Tanuj Dada, Ramanjit Sihota và các cộng sự. (2009),
"Mutation spectrum of CYP1B1 in North Indian congenital glaucoma
patients", Mol Vis., 15, tr. 1200–1209.

6.

Fuse N., Miyazawa A., Takahashi K. và các cộng sự. (2010), "Mutation
spectrum of the CYP1B1 gene for congenital glaucoma in the Japanese
population", Jpn J Ophthalmol., 54(1), tr. 1-6.

7.

K. Damjanovich, E. E. Baldwin, T. Lewis và các cộng sự. (2013),
"Novel homozygous CYP1B1 deletion in siblings with primary

congenital glaucoma", Ophthalmic Genet, 34(3), tr. 180-1.

8.

T. R. Sutter, Y. M. Tang, C. L. Hayes và các cộng sự. (1994),
"Complete cDNA sequence of a human dioxin-inducible mRNA
identifies a new gene subfamily of cytochrome P450 that maps to
chromosome 2", J Biol Chem, 269(18), tr. 13092-9.


9.

Y. M. Tang, Y. Y. Wo, J. Stewart và các cộng sự. (1996), "Isolation and
characterization of the human cytochrome P450 CYP1B1 gene", J Biol
Chem, 271(45), tr. 28324-30.

10.

Stoilov I., Akarsu A. N. và Sarfarazi M. (1997), "Identification of three
different truncating mutations in cytochrome P4501B1 (CYP1B1) as
the principal cause of primary congenital glaucoma (buphthalmos) in
families linked to the GLC3A locus on chromosome 2p21", Hum.
Molec. Genet, 6, tr. 641-647.

11.

M. Sarfarazi, A. N. Akarsu, A. Hossain và các cộng sự. (1995),
"Assignment of a locus (GLC3A) for primary congenital glaucoma
(Buphthalmos) to 2p21 and evidence for genetic heterogeneity",
Genomics, 30(2), tr. 171-7.

12.

/>
13.

Stoilov I., Akarsu A. N., Alozie I. và các cộng sự. (1998), "Sequence
analysis and homology modeling suggest that primary congenital
glaucoma on 2p21 results from mutations disrupting either the hinge
region or the conserved core structures of cytochrome P4501B1", Am.
J. Hum. Genet, 62, tr. 573-584.

14.

Schwartzman M. L., Balazy M., Masferrer J. và các cộng sự. (1987),
"12(R)-hydroxyicosatetraenoic acid: a cytochrome-P450-dependent
arachidonate metabolite that inhibits Na+,K+-ATPase in the cornea",
84(22), tr. 8125-9.

15.

M. Sarfarazi và I. Stoilov (2000), "Molecular genetics of primary
congenital glaucoma", Eye (Lond), 14 ( Pt 3B), tr. 422-8.

16.

Khất Hữu Thanh (2006), "Một số phương pháp cơ bản sử dụng trong
kỹ thuật gen", trong Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, chủ biên, Cơ
sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, tr. 137-64.