Phát hiện đột biến gen COL1A1 trên bệnh nhân tạo xương bất toàn bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1
GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHãA 2008 - 2012
HÀ NỘI – 2012
1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1
GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHãA 2008 - 2012
Giáo viên hướng dẫn: GS.TS. TẠ THÀNH VĂN


HÀ NỘI – 2012
2
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp là một bước ngoặt đánh dấu sự chuyển tiếp từ một
sinh viên trở thành cử nhân kỹ thuật y học; là quá trình học tập, tích lũy kiến
thức, kỹ năng để áp dụng vào thực tế. Trong suốt quá trình đó, tôi đã nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu.
Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn
chân thành tới:
GS.TS. Tạ Thành Văn - Giám đốc trung tâm nghiên cứu Gen -
Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã tạo điều kiện cho tôi thực
hiện khóa luận tại trung tâm.

TS.BS. Trần Vân Khánh - Trưởng bộ môn Bệnh học phân tử - Đại
học Y Hà Nội, Phó giám đốc trung tâm nghiên cứu Gen – Protein người đã
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, sửa chữa và góp ý cho tôi hoàn thành khóa luận.
Ban giám hiệu, phòng quản lý và đào tạo đại học, bộ môn Hóa sinh, Thư
viện và các phòng ban trong trường đại học Y Hà Nội
Tập thể Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu,
hoàn thành khóa luận.
Các Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sĩ trong hội đồng chấm khóa luận tốt
nghiệp, các thầy cô đã cho tôi nhiều chỉ dẫn và kinh nghiệm quý để đề tài đi
tới đích.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tất cả người thân trong gia đình,
bạn bè, các anh chị đi trước đã động viên, chia sẻ khó khăn với tôi trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn!
3
Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
***
LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội
Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các
số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất
cứ công trình nghiên cứu nào khác.
Hà nội, ngày 27 tháng 06 năm 2012
Người viết khóa luận
Nguyễn Thị Huyền Trang
4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

OI Osteogenesis imperfect (tạo xương bất toàn)
COL1A1 Collagen týp I alpha 1
COL1A2 Collagen týp I alpha 2
DNA Deoxyribonucleic Acid
cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid
RNA Ribonucleic Acid
mRNA Messenger Ribonucleic Acid (RNA thông tin)
NST Nhiễm sắc thể
Kb Kilo base
bp Base pair
dNTP deoxyribonucleoside triphosphate
ddNTP dideoxyribonucleoside triphosphate
PCR Polymerase Chain Reaction
RT-PCR Reverse Transcription PCR (PCR sao mã ngược)
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
BN Bệnh nhân
Ala: Alanine Gly: Glycine Pro: Proline
Arg: Arginine His: Histidine Ser: Serine
Asn: Asparagine Ile: Isoleucine Thr: Threonine
Asp:Aspartic Leu: Leucine Trp: Tryptophan
Cys: Cysteine Lys: Lysine Tyr: Tyrorine
Gln: Glutamine Met: Methionine Val: Valine
Glu: acid Glutamic Phe: Phenylalanine Stop codon: mã kết thúc
5
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh xương bất toàn có tên tiếng Anh là Osteogenesis Imperfecta, viết
tắt là OI, còn gọi là bệnh xương thủy tinh hay bệnh giòn xương. Đây là bệnh
phổ biến nhất trong các rối loạn di truyền về xương. Tần suất mắc bệnh
khoảng 1/15.000 – 1/25.000 trẻ sinh ra và chủ yếu là di truyền trội trên nhiễm
sắc thể thường [5]. Đặc điểm điển hình của bệnh là hệ xương không được

hình thành một cách hoàn chỉnh. Nguyên nhân chính là do đột biến gen tổng
hợp collagen týp I dẫn đến thiếu hụt hoặc bất thường cấu trúc phân tử
collagen týp I, làm xương giòn và dễ gãy khi có va chạm như ho, hắt hơi hoặc
ngay cả khi không có sang chấn. Bệnh không chỉ biểu hiện bất thường ở
xương mà còn bất thường ở các tổ chức khác như: da, dây chằng, củng mạc
mắt, răng…
Trên lâm sàng, bệnh được chia làm 4 týp khác nhau tùy thuộc vào mức
độ nặng nhẹ. Tuy nhiên, giòn xương, gãy nhiều xương, biến dạng xương là
triệu chứng phổ biến của tất cả các týp [5].
Các nhà khoa học đã phát hiện có khoảng trên 90% các trường hợp
bệnh tạo xương bất toàn gây nên do đột biến gen COL1A1 (Collagen týp I
alpha 1) và COL1A2 (Collagen týp I alpha 2). Đây là hai gen mã hóa cho sự
tổng hợp collagen týp I, một loại protein chiếm ưu thế trong chất cơ bản ngoại
bào của hầu hết các mô [33].
Cũng như nhiều bệnh lý di truyền khác, bệnh xương bất toàn là một
gánh nặng lâu dài với bản thân người bệnh, gia đình và xã hội. Việc điều trị
đòi hỏi thời gian dài và còn tùy thuộc vào mức độ nặng nhẹ của bệnh. Cho
đến nay bệnh vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu mà chỉ dừng lại ở
các biện pháp điều trị hỗ trợ và điều trị triệu chứng: giảm đau, giảm gãy
xương tái phát nhằm giảm tới mức tối đa tỷ lệ tàn tật và suy giảm chức năng
khác. Bởi vậy, chẩn đoán xác định bệnh bằng phương pháp phân tích gen tìm
6
đột biến trên bệnh nhân mắc bệnh xương bất toàn là cần thiết cho việc phát
hiện sớm, để có những can thiệp, hỗ trợ kịp thời, nâng cao chất lượng cuộc
sống cho bệnh nhân, động thời giảm bớt gánh nặng cho gia đình. Ngoài ra,
một mục tiêu quan trọng nữa của việc phát hiện đột biến đó là xác định người
lành mang gen bệnh, tạo tiền đề quan trọng giúp chẩn đoán trước sinh đối với
những đối tượng có nguy cơ cao sinh con bị bệnh, để đưa ra những lời khuyên
cần thiết.
Với những ý nghĩa trên, đề tài “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen

COL1A1 gây bệnh tạo xương bất toàn” được thực hiện nhằm mục tiêu:
Phát hiện đột biến gen COL1A1 trên bệnh nhân tạo xương bất toàn
bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen.
7
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh OI
1.1.1. Trên thế giới
Theo nghiên cứu của Lowenstein E.J. ở Ai Cập thì bệnh OI đã xuất
hiện từ 1000 năm trước công nguyên [21]. Tuy nhiên đến năm 1788 những
mô tả khoa học đầu tiên về bệnh OI mới được Olaus Jakob Ekman đưa ra.
Trong thế kỷ 20, những biến đổi lâm sàng đáng kể với mức độ nghiêm
trọng khác nhau của bệnh OI được xác định. Looser đã tiến hành phân loại
bệnh OI đầu tiên năm 1906, sau đó là Silence đề xuất phân loại OI thành 4 týp
năm 1979. Tuy đã được chỉnh sửa nhiều lần nhưng cách phân loại này vẫn
được áp dụng tới ngày nay [36].
Về mặt dịch tễ, tỷ lệ mắc bệnh OI vào khoảng 6-7/100,000. Tỷ lệ này
khác nhau ở các týp khác nhau: týp I và týp IV chiếm hơn một nửa trong số
tất cả các trường hợp. Với týp II, tỷ lệ mắc là 1-2/100,000 và đều tử vong
sớm. Týp III có tỷ lệ mắc tương đương týp II, còn týp IV là loại hiếm gặp
[36].
Năm 1974, những bất thường trong collagen của xương lần đầu tiên
được nhìn thấy trên kính hiển vi điện tử. Ba năm sau, báo cáo của Sykes đã
chỉ ra mối quan hệ tương tác giữa hai loại collagen trong sự tiêu biến của
pepsin trên da những bệnh nhân OI bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamide [36].
Đột biến gen mã hóa collagen týp I lần đầu tiên được mô tả bởi Chu và
cộng sự năm 1983 là đột biến xóa đoạn dài khoảng 0.5 kb trong 1 alen của
chuỗi procollagen - α1. Phát hiện này đánh dấu sự khởi đầu làm sáng tỏ quá
trình sinh tổng hợp collagen và cơ chế bệnh học phân tử của OI [5], [36].
8

1.1.2. Ở Việt Nam
Do tình hình bệnh tạo xương bất toàn ở Việt Nam vẫn còn rất ít và có
duy nhất một trung tâm nghiên cứu về bệnh học phân tử: trung tâm nghiên
cứu gen - protein tại Trường Đại học Y Hà Nội - Đống Đa - Hà Nội; còn lại
chủ yếu nghiên cứu về mặt lâm sàng (viện nhi Trung ương); nên số lượng
nghiên cứu về OI ở Việt Nam chưa nhiều, thông tin còn hạn chế. Một vài
nghiên cứu được công bố gần đây đều được thực hiện tại trung tâm duy nhất
này [1], [4].
1.2. Đặc điểm của bệnh OI
1.2.1. Đặc điểm lâm sàng
Năm 1979, Silence đã đề xuất phân loại OI thành 4 týp dựa trên đặc
điểm lâm sàng và đặc điểm di truyền trên những bệnh nhân đã xác định chắc
chắn là mắc bệnh OI tại Victoria, Autralia [36].
- Týp I: Là thể nhẹ nhất và hay gặp nhất, đặc trưng bởi mắt có màu
xanh ở tất cả các độ tuổi, trẻ bắt đầu gãy xương từ khi tuổi còn nhỏ nhưng tần
suất gãy xương thấp, không có biến dạng hoặc biến dạng xương ít, giảm thính
lực hoặc điếc. Hầu hết tiền sử gia đình bệnh nhân có người điếc, dây chằng
lỏng lẻo gây sai khớp. Đa số bệnh nhân không có tạo răng bất toàn.
- Týp II: Là thể nặng nhất. Bệnh nhân thường chết ngay trong tử cung
do gãy nhiều xương hoặc ngay sau khi sinh do rối loạn chức năng hô hấp
(thiểu sản phổi, gãy xương sườn). Hiện nay OI týp II được chia làm hai loại là
OI týp II-A và II-B.
- Týp III: Là thể tương đối nặng, chỉ đứng sau týp II, trẻ thường sinh ra
đã có gãy xương, biến dạng tiến triển xương dài, xương sọ, cột sống… Gãy
xương tái phát nhiều lần gây hậu quả là chi ngắn và biến dạng tăng dần, mặt hình
tam giác và có bướu trán. Củng mạc mắt thường quá trắng hoặc có màu xám, màu
xanh, giảm chức năng hô hấp, giảm thính lực và bất thường về răng.
9
- Týp IV: Là thể trung gian giữa týp I và III. Gãy xương xuất hiện ở
tuổi nhỏ, các biến dạng xương ở mức nhẹ đến trung bình, tần suất gãy xương

thay đổi. Củng mạc mắt có thể bình thường hoặc xám; có hoặc không có tạo
răng bất toàn; thường giảm thính lực ở tuổi trưởng thành và tiền sử gia đình
có người điếc [5].
Xếp theo thứ tự từ nhẹ đến nặng sẽ là týp I, týp IV, týp III, týp II. Một
số nghiên cứu mới đã phân loại thêm týp V, VI, VII, VIII.
Bảng 1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh OI [36]
Týp
Đặc điểm
I II-A II-B III IV
Di truyền
Trội trên
NST thường
Trội trên
NST thường
Trội/Lặn trên
NST thường
Trội/Lặn trên
NST thường
Trội/Lặn trên
NST thường
Mức độ nghiêm trọng Nhẹ
Tử vong
trước sinh
Nghiêm trọng Nhẹ vừa Vừa
Gãy xương bẩm sinh Không Có Có
Thường
xuyên
Hiếm gặp
Biến dạng xương Hiếm gặp Rất nặng Nặng Nặng vừa Nhẹ vừa
Tròng mắt Xanh Đen Đen

Xanh/ Xám/
Trắng
Bình thường
Tầm vóc Bình thường Đặc biệt nhỏ Đặc biệt nhỏ Rất nhỏ
Nhỏ có thay
đổi
Sự dịch chuyển khớp Có Có Có Có Có thể
Mất chức năng nghe
60% các
trường hợp
Chưa rõ Chưa rõ Phổ biến
42% các
trường hợp
Tạo răng bất toàn Có thể Chưa rõ Chưa rõ Có Có thể
Biến chứng hô hấp Không Có Có Có Không
Biến chứng thần kinh Không Chưa rõ Chưa rõ Có Không

10
1.2.2. Chẩn đoán
Hiện nay, siêu âm trước sinh là lựa chọn đầu tiên để phát hiện bệnh lý
của thai nhi trong đó có OI. Siêu âm trước sinh có thể chẩn đoán chính xác
bệnh OI tới 89%. Siêu âm hai chiều là kỹ thuật hình ảnh đáng tin cậy trong
OI týp II và III. Việc chẩn đoán có thể được thực hiện sớm nhất ở tuần 17 của
thai kỳ với OI týp I và tuần 13 với OI týp II. Đối với OI týp III, chiều dài chi
thường bắt đầu biến đổi sớm nhất ở khoảng tuần 17 đến 18 của thai kỳ. OI týp
III hoặc týp IV có thể có hoặc không có gãy xương, biến dạng xương hay
giảm khoáng hoá xương; nếu có thì sự biến đổi chỉ nhìn thấy được ở 3 tháng
cuối thai kì. Vì vậy cần siêu âm định kỳ khi có nghi ngờ OI týp III hoặc týp
IV [14].
Chẩn đoán bệnh OI ở người trưởng thành dựa vào: biểu hiện lâm sàng,

phim chụp X quang, tiền sử gãy xương và tiền sử gia đình.Với những trường
hợp không có tiền sử gia đình hoặc gãy xương không có kết hợp với những
bất thường ngoài xương thì chẩn đoán cần kết hợp thêm xét nghiệm số lượng
và cấu trúc phân tử collagen týp I qua nuôi cấy nguyên bào sợi từ da bệnh
nhân và kết hợp phân tích gen [5].
11
Hình 1.1. Sơ đồ chẩn đoán phân loại bệnh OI. [36]
1.2.3. Điều trị
Hiện nay, chưa có phương pháp thay thế cấu trúc collagen bị tổn
thương hay kích thích cho cơ thể tăng tổng hợp số lượng collagen, vì vậy
chứng bất toàn trong tạo sinh xương vẫn được xem là một rối loạn di truyền
không thể chữa khỏi được. Liệu pháp tác động lên gen và tế bào chỉ có tác
dụng hỗ trợ [17].
Các phương pháp chính điều trị OI gồm: Hóa dược trị liệu, vật lý trị
liệu (phục hồi chức năng), phẫu thuật chỉnh hình, điều trị răng, điều trị điếc
[2], [36].
12
a. Hóa dược trị liệu
Một trong những hoá dược điều trị OI được coi là hiệu quả nhất hiện
nay đó là thuốc ngăn cản quá trình huỷ xương nhóm bisphosphonate [2].
Bisphosphonate dùng để uống hoặc tiêm tĩnh mạch, được sử dụng rộng
rãi cho bệnh nhân OI thể nặng, nhưng tác dụng của nó trên nhóm bệnh nhân
OI thể nhẹ vẫn chưa được làm rõ [10], [36]. Ở một nhóm bệnh nhân OI dùng
thuốc sau vài tuần có biểu hiện: giảm đau, khỏe khoắn hơn, tăng trương lực
cơ [2]. Công bố mới đây của Bradbury về ảnh hưởng của Risedronate trên
người trưởng thành khẳng định ở bệnh nhân OI dùng thuốc có sự cải thiện
đáng kể mật độ chất khoáng ở cột sống thắt lưng, kèm theo giảm quá trình
hủy xương [8]. Clodronate và etidronate (bisphosphonates thế hệ đầu tiên)
gây ra sự tự chết của các hủy cốt bào do ức chế hoạt động của enzyme phụ
thuộc ATP (Adenosin triphosphat) [28]. Tuy nhiên, khi quá trình huỷ xương

bị ức chế mạnh thì nó sẽ gây hiệu ứng ngược làm ngăn cản quá trình sửa chữa
các thương tổn; nên việc sử dụng thuốc nhóm bisphosphonate điều trị OI có
thể dẫn đến các tai biến xa [2].
Ngoài ra, việc sử dụng hormone tăng trưởng hỗ trợ điều trị tầm vóc nhỏ
ở bệnh nhân OI týp III và IV cũng đang được tiến hành nghiên cứu [36].
b. Phẫu thuật chỉnh hình
Với các trường hợp giảm khoáng hóa xương, tần số gãy xương cao
hoặc dị dạng xương, phẫu thuật chỉnh hình được tiến hành nhằm duy trì tư thế
giải phẫu của chi [5].
c. Điều trị răng
Điều trị răng nhằm duy trì răng sữa và răng vĩnh viễn, duy trì chức
năng cắn và khớp cắn cho bệnh nhân [5]. Ở bệnh nhân OI, răng thường bị gãy
hoặc mòn. Điều này có thể được điều trị bằng đóng nắp răng với polyme cứng
để ngăn ngừa nhiễm trùng răng và biến dạng mặt [36].
13
d. Điều trị giảm chức năng nghe
Phẫu thuật điều trị điếc do gãy xương tai giữa hoặc do co cứng và sẹo ở
xương đe, một số trường hợp điếc xuất hiện muộn do ảnh hưởng thần kinh
cảm nhận thì không đáp ứng với phẫu thuật. Có thể dùng phương pháp cấy ốc
tai nhưng hiệu quả còn hạn chế [5].
e. Phục hồi chức năng
Vật lý trị liệu để ngăn ngừa sự co cứng và biến dạng cột sống trên bệnh
nhân OI týp III và IV. Một số biện pháp: tập thể dục, bơi lội, dinh dưỡng,
thực hiện một lối sống lành mạnh (không hút thuốc lá, tránh uống cà phê,
rượu, tránh dùng các loại thuốc chống viêm có corticosteroid) [2].
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều thử nghiệm điều trị và bước đầu đã
có kết quả khả quan như: liệu pháp điều trị gen, ghép tủy xương [5].
1.3. Cơ sở phân tử của bệnh OI
1.3.1. Cấu trúc, chức năng của protein Collagen typ I
1.3.1.1. Thành phần, cấu trúc

Phân tử collagen týp I là protein gồm 3 chuỗi polypeptide (2 chuỗi α1
và 1 chuỗi α2); trong đó gen COL1A1 mã hóa cho hai chuỗi procollagen - α1,
gen COL1A2 mã hóa cho một chuỗi procollagen - α2. Các chuỗi propeptide
liên kết với nhau (2 chuỗi procollagen - α1 và 1 chuỗi procollagen - α2) tạo
thành chuỗi bậc ba helix. Vùng trung tâm của chuỗi xoắn dài 1012 acid amin,
trong đó có 338 tripeptide G-X-Y lặp lại liên tục (với G là Glycin, X thường
là Proline, Y thường là Hydroxyproline) [16], [32], [36].
14
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử collagen bình thường và bất thường [32]
(A): Cấu trúc gen COL1A1 gồm 3 phần chính:
(1) Vùng promoter hay vùng hoạt hóa (màu vàng) chứa trình tự TATA (hộp TATA
màu đen) (4) là nơi bám dính của các protein liên kết với hộp TATA, để tạo phức hợp
RNA polymerase khởi động quá trình phiên mã (transcription). Hộp TATA cách mã mở
đầu của gen khoảng 50 nucleotide.
(2) Vùng chứa 51 exon và các intron của gen COL1A1 (màu xanh lá cây).
(3) Đuôi poly A (poly Adenin) màu hồng, nằm ở vùng 3’-UTR (untranslated
region): là chuỗi lặp lại nhiều ribonuceleotide dạng Adenine ở đầu 3’ của mRNA (sau khi
phiên mã). Sự polyadenyl hóa được thực hiện nhờ enzyme đặc biệt là poly(A) polymerase
sử dụng Adenine như một cơ chất để gắn và kéo dài chuỗi Adenine vào đầu 3’. Chuỗi poly
A là nơi bám dính đặc hiệu của protein đặc hiệu PABP (poly A binding protein). Protein
này hoạt hóa cùng với phức hợp eIF (Eukaryotic initiation factors), cụ thể là eIF-4, để hoàn
thiện quá trình phiên mã, kích hoạt sự bám của ribosom, khởi động quá trình dịch mã.
(B): Collagen týp I bao gồm 2 chuỗi procollagen - α1 và 1 chuỗi procollagen - α2.
Sự bền vững của cấu trúc này phục thuộc vào sự lặp lại của bộ ba axít amin Gly-X-Y. Khi
có sự bất thường xảy ra trên gen COL1A1 dẫn tới thêm hoặc mất glycin (vùng màu đỏ) sẽ
gây rối loạn cấu trúc phân tử collagen, là nguyên nhân gây bênh OI.
(C): Phân tử collagen týp I [32].
15
1.3.1.2. Chức năng:
Collagen thuộc họ protein ngoại bào đóng vai trò quan trọng trong sự

phát triển và là thành phần cần thiết tham gia cấu trúc mô và các cơ quan, bao
gồm cả phổi, da, xương, mạch máu. Collagen có vai trò làm kết dính, tạo độ
bền cho những cấu trúc có hình dạng của cơ thể như khung xương, nhãn cầu;
là bộ khung của các cấu trúc. Collagen tham gia cấu tạo hầu hết các mô và
cấu trúc bên ngoài của tế bào, đồng thời collagen cũng được tìm thấy bên
trong tế bào. Collagen là thành phần chính của gân, sụn, xương, dây chằng và
da; cùng với keratin mềm, collagen tạo nên độ dẻo dai của da, độ bền của
thành mạch máu và đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển mô tế bào. Sự
thoái hóa của collgen sẽ gây ra nếp nhăn dẫn đến tuổi già. Collagen cũng tồn
tại trong giác mạc, thủy tinh thể.
Collagen týp I là loại collagen cấu trúc chủ yếu của xương, da và dây
chằng; là thành phần chính của ngà răng, chiếm 30% trọng lượng cơ thể.
Ngoài ra nó còn được tìm thấy ở giác mạc, củng mạc mắt, màng não… Vì
vậy khi có sự khiếm khuyết về cấu trúc, chức năng phân tử collagen týp I
trong OI, bệnh biểu hiện ở nhiều mô và cơ quan [5].
1.3.2. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen COL1A1:
1.3.2.1. Vị trí
Gen COL1A1 nằm trên cánh dài NST 17 từ vị trí 21.3 đến 22 (17q21.3-q22).
COL1A1
Hình 1.3. Vị trí của gen COL1A1 trên cánh dài NST 17 ()
16
1.3.2.2. Cấu trúc và chức năng
Gen COL1A1 gồm 51 exon với chiều dài 18kb, mã hóa 5kb cho chuỗi
procollagen -α1 (procollagen týp I alpha 1) tham gia cấu trúc phân tử collagen
týp I. Các exon từ 6 tới 49 mã hóa chuỗi xoắn kép alpha. Hầu hết các exon
này có chiều dài khoảng 45 bp, 54 bp hoặc bội số của 45 hoặc 54 bp [31].
Hình 1.4. Cấu trúc của gen COL1A1 [31]
Gen COL1A1 mã hóa chuỗi procollagen - α1 gồm 1464 acid amin [31].
Cấu trúc gen chia thành 3 vùng chính: Vùng promoter, vùng chứa exon và
intron, đuôi poly A.

Để tổng hợp chuỗi procollagen, đầu tiên gen COL1A1 sẽ thực hiện
phiên mã tổng hợp phân tử mRNA tiền thân. Phân tử mRNA này trải qua quá
trình cắt các intron và nối chính xác các exon với nhau để tạo ra phân tử
mRNA hoàn chỉnh đảm bảo đúng trình tự. Phân tử mRNA hoàn chỉnh được
sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp chuỗi procollagen - α1.
1.3.3. Các dạng đột biến trên gen COL1A1
Hiện nay có đến 90% các trường hợp mắc bệnh OI là do đột biến gen
trội nằm trên gen COL1A1 hoặc COL1A2; còn lại 10% gây nên bởi các đột
biến gen lặn trên một trong các gen hiện nay đã biết (CRTAP, LEPRE1,
PPIB, SERPINH1, FKBP10, PLOD2, SP7, SERPINF1) hoặc trên các gen
chưa đươc phát hiện [36], [39].
17
Hình 1.5. Tỷ lệ các gen đột biến gây bệnh OI.
()
Các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI gồm: đột biến thay thế, đột
biến lặp, đột biến cắt nối, đột biến mất, đột biến thêm nucleotide. Trong đó
dạng đột biến thay thế là phổ biến nhất, chiếm khoảng 82% các đột biến trên
gen COL1A1 (Hình 1.6).
Hình 1.6. Tỉ lệ các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI.
()
18
Hầu hết các đột biến xảy ra trên exon, chiếm 83% tổng số đột biến trên
gen COL1A1. Trong đó đột biến thay thế là phổ biến nhất ở cả hai vị trí đột
biến trên exon và trên intron của gen COL1A1: chiếm 87% các đột biến trên
exon, 81% các đột biến trên intron (Hình 1.7).
Trong các đột biến thay thế thì phổ biến nhất là đột biến thay thế glycin
bằng một acid amin khác. Hiện nay có hơn 700 đột biến thay thế glycin được
phát hiện trên bệnh nhân OI và tổng hơp lại trên dữ liệu các đột biến gen
COL1A1 [5], [15], [36].
Hình 1.7. Tỷ lệ các đột biến gây bệnh OI trên gen COL1A1

()
19
Bảng 1.2. Một số đột biến gen COL1A1 ở bệnh tạo xương bất toàn [11].
Bệnh
nhân
cDNA Protein Exon
Thay thế 1 nucleotid
F1 c.1058G>A p.Gly353Asp 17
E6 c.1103G>T p.Gly368Val 17
E1 c.1273G>A p.Gly425Ser 19
H2 c.1364G>A p.Gly455Asp 21
F5 c.1409G>T p.Gly470Val 21
D8 c.1526G>T p.Gly509Val 23
G4 c.1643G>C p.Gly548Ala 24
A1 c.1804G>A p.Gly602Arg 26
G1 c.1804G>A p.Gly602Arg 26
D7 c.1814G>A p.Gly605Asp 26
G7 c.1840G>C p.Gly614Arg 27
A7 c.2218G>C p.Gly740Arg 32
c.1168G>A p.Ala390Thr 18
E4 c.2425G>A p.Gly809Ser 36
E8 c.2470G>C p.Gly824Arg 37
H4 c.2533G>C p.Gly845Arg 37
H5 c.2542G>C p.Gly848Arg 37
B1 c.2596G>A p.Gly866Ser 38
B7 c.2623G>A p.Gly875Ser 39
c.863A>T p.Glu288Ala 13
E5 c.2650G>A p.Gly884Ser 39
G2 c.2650G>A p.Gly884Ser 39
E3 c.2687G>A p.Gly896Asp 40

C5 c.2839G>T p.Gly947Cys 41
c.2563A>C p.Asn855His 38
G3 c.2930G>A p.Gly977Asp 41
B3 c.3001G>T p.Gly1001Cys 42
B2 c.3065G>T p.Gly1022Val 43
F3 c.3065G>T p.Gly1022Val 43
B5 c.3164G>A p.Gly1055Asp 44
20
G8 c.3280G>A p.Gly1094Ser 46
C6 c.3299G>A p.Gly1100Asp 46
c.436C>A p.Pro146Thr 5
D6 c.4237G>A p.Asp1413Asn 51
Thêm, lặp đoạn
H6 c.3148_3156dupGCTCCTGGT p.1050_1052dupAlaProGly 44
Cắt nối intron
C4 c.957+5G>A IVS14+5G>A Mất exon 14
A5 c.2509_2559+9del Mất exon 37
B6 c.3261+1G>A IVS45+1G>A Mất exon 45
H8 c.3423+2T>A IVS47+2T>A Mất exon 47
A2 c.3424-1G>C IVS47-1G>C Mất exon 48
1.3.4. Đặc điểm bệnh học phân tử của OI:
OI là bệnh di truyền trội trên NST thường.
Hình 1.8. Sự di truyền tính trạng bệnh trong bệnh OI
().
21
Sự di truyền bệnh OI qua các thế hệ có 3 đặc điểm chính: Nam nữ có tỉ
lệ mắc bệnh ngang nhau và bố mẹ cũng có vai trò ngang nhau trong việc
truyền tính trạng cho con cái; sự di truyền không ngắt quãng qua các thế hệ,
nếu bố mẹ không mang tính trạng bệnh thì sẽ không truyền bệnh cho con cái;
mặc dù sự truyền tính trạng từ bố cho con trai không dùng để đánh giá sự di

truyền trội trên NST thường nhưng sự có mặt của nó trong phả hệ loại trừ
chắc chắn các kiểu di truyền khác (đặc biệt là di truyền liên kết NST X). Thể
dị hợp tử mang gen bệnh truyền tính trạng này cho gần như một nửa con cái
của họ.
Đột biến gen trội gây bệnh OI týp I, II-A, II-B, III, IV: hiện nay đã có
hơn 1000 biến thể khác nhau trên gen COL1A1 và COL1A2 được phát hiện là
gây bệnh OI (). Các loại đột biến cũng như vị trí xuất
hiện ảnh hưởng tới kiểu hình người bệnh.
OI týp I là phổ biến nhất, đặc trưng bởi sự giảm 50% lượng collagen
týp I, thường là kết quả của những đột biến trên một alen của gen COL1A1,
đôi khi là do xóa hoàn toàn một alen hoặc thay thế glycine bởi một axit amin
nhỏ khác (Cystein, Alanin, Serin) gần mã kết thúc [36].
22
1.4. Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen COL1A1
Các đột biến trên gen COL1A1 chủ yếu là đột biến điểm do đó kỹ thuật
PCR và giải trình tự trực tiếp được sử dụng để phát hiện đột biến.
Trong trường hợp các đột biến nằm trong vùng mã hoá axít amin
(exon) như: đột biến sai nghĩa (missense), đột biến vô nghĩa (nonsense), đột
biến gây lệch khung dịch mã (frameshift) thì chỉ cần PCR mẫu DNA sau đó
giải trình tự trực tiếp tìm đột biến.
Nếu đột biến cùng intron (không mã hoá axit amin) nhưng ảnh hưởng
đến vị trí bám của các hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucloeprotein) thì
cần thêm bước khuếch đại sản phẩm cDNA bằng phương pháp RT-PCR đế
biết exon nào bị mất từ mRNA. Tuy nhiên mẫu bệnh phẩm phải được lấy ở
vùng có sự biểu hiện protein collagen týp I (da, xương).
Như vậy để phát hiện đột biến trên gen COL1A1 cần chú ý tới 3 kỹ
thuật chính là: PCR, RT-PCR và giải trình tự gen.
1.4.1. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR):
PCR là kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm. Nguyên tắc của
phản ứng PCR dựa trên đặc điểm của quá trình tự sao chép DNA trong tế bào:

cần có DNA ở dạng sợi đơn, cần các đoạn mồi và các loại enzym xúc tác.
Kỹ thuật PCR sử dụng Taq polymerase (enzym chịu nhiệt) tổng hợp
một mạch DNA mới từ mạch DNA đơn làm khuôn với nguyên liệu là 4 loại
nucleotide. Phản ứng đòi hỏi phải có mặt của cặp mồi đặc hiệu (mồi xuôi, mồi
ngược) có trình tự bổ sung với 2 đầu của trình tự DNA khuôn.
23
PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai
đoạn nhiệt độ khác nhau (Hình 1.9):
- Giai đoạn 1 (Biến tính): DNA khuôn sẽ được biến tính ở nhiệt độ
cao (cao hơn nhiệt độ Tm) mà tại đó phân tử từ dạng sợi kép thành
sợi đơn (94
0
C - 95
0
C trong vòng từ 30-60s).
- Giai đoạn 2 (Bắt cặp): Nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy
Tm (temperature melting) của các mồi (khoảng 40
0
C - 70
0
C tùy
thuộc mồi được sử dụng) cho phép các mồi bắt cặp với các sợi đơn
DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Thời gian cho giai đoạn này
khoảng 30-60s.
- Giai đoạn 3 (Kéo dài): Nhiệt độ tăng lên 72
0
C là nhiệt độ thích hợp
nhất cho enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA mới
bằng cách kéo dài sợi mồi từ 4 loại nucleotid (dATP, dCTP, dGTP,
dCTP).

24
Hình 1.9. Các giai đoạn trong phản ứng PCR ()
Sau mỗi chu kỳ, các đoạn DNA được tổng hợp sẽ được dùng làm
khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Một phản ứng
PCR thông thường từ 30-40 chu kỳ và cứ sau một chu kỳ thì số lượng DNA
lại tăng gấp đôi. Vậy sau n chu kỳ số lượng DNA thu được là 2
n
bản copy.
Sản phẩm cuối cùng của phản ứng PCR là các đoạn DNA dạng sợi kép với
chiều dài đặc hiệu đúng bằng khoảng cách giữa 2 đoạn mồi.
25