Xây dựng dấu vân tay hóa học và đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ vàng
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.04 MB, 78 trang )
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ LINH
XÂY DỰNG DẤU VÂN TAY HÓA HỌC
VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG
KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU
NGHỆ VÀNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2019
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ LINH
MÃ SINH VIÊN: 1401368
XÂY DỰNG DẤU VÂN TAY HÓA HỌC
VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG
KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU
NGHỆ VÀNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Quỳnh Chi
2. ThS. Phạm Tuấn Anh
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược liệu – Đại học
Dược Hà Nội
2. Đại học Université catholique de
Louvain – Vương quốc Bỉ
HÀ NỘI - 2019
LỜI CẢM ƠN
Trong q trình hồn thành khóa luận em đã nhận được sự hỗ trợ giúp đỡ từ nhiều
thầy cơ, bạn bè và gia đình. Với tình cảm chân thành cho phép em gửi lời cảm ơn sâu
sắc tới tất cả cá nhân, tập thể đã tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên
cứu và thực hiện đề tài.
Trước hết, với lịng kính trọng và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn
Quỳnh Chi, ThS. Phạm Tuấn Anh đã định hướng, chỉ bảo, giải đáp những thắc mắc
và dìu dắt em trong quá trình học tập, nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn ThS. Lê Thanh Bình, ThS. Nguyễn Khắc Tiệp đã giúp
đỡ, hỗ trợ em hồn thành khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tồn thể thầy cơ trường Đại học Dược Hà
Nội nói chung, các thầy cơ và anh chị kỹ thuật viên thuộc bộ môn Dược liệu – Trường
Đại học Dược Hà Nội nói riêng đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình
nghiên cứu.
Xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể sinh viên nghiên cứu tại bộ môn Dược liệu –
Trường Đại học Dược Hà Nội đã đồng hành, giúp đỡ, động viên tinh thần và đưa ra
nhiều góp ý trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã ln tin tưởng, là chỗ
dựa tinh thần và nguồn động viên to lớn đối với em trong suốt quá trình học tập, nghiên
cứu tại trường.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thị Linh
MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về Nghệ vàng Curcuma longa L. ....................................................... 2
1.1.1. Vị trí, phân loại .............................................................................................. 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Nghệ vàng Curcuma longa L. ...................... 2
1.1.3. Thành phần hóa học thân rễ Nghệ vàng Curcuma longa L. ......................... 3
1.1.4. Một số loài Curcuma L. khác ở Việt Nam dễ nhầm lẫn với Nghệ vàng
Curcuma longa L. .................................................................................................... 5
1.2. Tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng .................................................. 6
1.3. Vài nét về dấu vân tay hóa học. ............................................................................ 8
1.3.1. Khái niệm về dấu vân tay hóa học. ............................................................... 8
1.3.2. Ứng dụng của dấu vân tay hóa học. .............................................................. 8
1.3.3. Một số nghiên cứu thiết lập dấu vân tay hóa học. ......................................... 9
1.3.4. Tình hình tiêu chuẩn hóa Nghệ vàng và tinh dầu Nghệ vàng ..................... 10
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 12
2.1. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu. ........................................................... 12
2.1.1. Nguyên liệu. ................................................................................................ 12
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu. .............................................................................. 13
2.1.2.1. Dung mơi, hóa chất: ............................................................................. 13
2.1.2.2. Trang thiết bị, máy móc: ...................................................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu. ......................................................................................... 14
2.2.1. Thu mẫu Nghệ vàng và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu.
............................................................................................................................... 14
2.2.2. Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng. .................................... 14
2.2.3. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng. ................................. 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu. ................................................................................... 14
2.3.1. Thu mẫu nghiên cứu và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu.
............................................................................................................................... 14
2.3.2. Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng. .................................... 15
2.3.2.1. Xác định dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng. ............... 15
2.3.2.2. Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng .......................... 16
2.3.3. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng. .......................... 17
2.3.3.1. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)............................................. 17
2.3.3.2. Đánh giá tác dụng hiệp đồng của tinh dầu Nghệ vàng và kháng sinh.. 18
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 21
3.1. Thu mẫu Nghệ vàng và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu. ..... 21
3.2. Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng ............................................ 22
3.2.1. Dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng ...................................... 22
3.2.2. Dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng ................................................ 24
3.2.2.1. Phân tích các mẫu tinh dầu Nghệ vàng bằng GC/MS .......................... 24
3.2.2.2. Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng .......................... 27
3.3. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng. ................................. 32
3.3.1. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tinh dầu Nghệ vàng. ........... 32
3.3.2. Đánh giá tác dụng hiệp đồng của tinh dầu Nghệ vàng và kháng sinh......... 32
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 35
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH THÂN RỄ 20 MẪU NGHỆ VÀNG
PHỤ LỤC 2: THÀNH PHẦN 19 MẪU TINH DẦU NGHỆ VÀNG TRONG
NGHIÊN CỨU CỦA PHẠM THỊ KIỀU DUNG
PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ 20 MẪU TINH DẦU NGHỆ VÀNG
DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
GC/MS
Gas chromatography – mass spectrometry
TLC
Thin layer chromatography
RI
Retention index
Rf
Retention time
MSSA
Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus
MRSA
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
MIC
Minimum inhibitory concentration
MHB-Ca
Cation-adjusted Muller Hinton Broth 2
FIC
Fractional inhibitory concentration
HCA
Hierarchical cluster analysis
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
DĐVN V
Dược Điển Việt Nam V
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml) của tinh dầu Nghệ vàng đối với một
số chủng vi khuẩn ........................................................................................................... 7
Bảng 2.1: Thông tin 20 mẫu thân rễ Nghệ vàng ........................................................... 12
Bảng 3.1: Hàm lượng tinh dầu tính theo dược liệu tươi................................................ 21
Bảng 3.2: Kết quả phân tích thành phần tinh dầu các mẫu: .......................................... 25
Bảng 3.3: Kết quả phân tích thành phần tinh dầu các mẫu: .......................................... 26
Bảng 3.4: Giá trị MIC (nl/ml) của 7 mẫu tinh dầu Nghệ vàng : BN01, HN11, HN12,
NA03, VP01, NT01, CM01 ........................................................................................... 32
Bảng 3.5: Giá trị MIC tinh dầu Nghệ vàng và kháng sinh ............................................ 33
Bảng 3.6: Kết quả đánh giá tác dụng làm giảm MIC cefoxitin trên hai chủng vi khuẩn
MRSA ............................................................................................................................ 33
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Mơ tả bố trí checkerboard trên đĩa 96 giếng ................................................. 20
Hình 3.1: Sắc ký đồ của các mẫu tinh dầu Nghệ sau khi hiện màu bằng vanillin/ H2SO4
, quan sát dưới ánh sáng thường .................................................................................... 22
Hình 3.2: Sắc ký đồ của các mẫu BN01, NA03, HB01, HB02, HT01 ......................... 23
Hình 3.3: Sắc ký đồ tinh dầu Nghệ vàng mẫu BN01 .................................................... 27
Hình 3.4: Kết quả phân cụm 20 mẫu tinh dầu với biến đầu vào là các thành phần có
trong tinh dầu ................................................................................................................. 28
Hình 3.5: Kết quả phân cụm 20 mẫu tinh dầu với biến đầu vào là các thành phần
thường xuất hiện trong tinh dầu .................................................................................... 28
Hình 3.6: Kết quả phân cụm 39 mẫu tinh dầu với biến đầu vào các thành phần có trong
tinh dầu .......................................................................................................................... 29
Hình 3.7: Kết quả phân cụm 39 mẫu tinh dầu với biến đầu vào là các thành phần
thường xuất hiện trong tinh dầu .................................................................................... 30
Hình 3.8: Hình ảnh dấu vân tay sắc ký tinh dầu Nghệ vàng ......................................... 30
Hình 3.9: Sắc ký đồ 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng .......................................................... 31
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghệ vàng là cây trồng phổ biến quen thuộc ở nhiều tỉnh thành trên khắp cả nước
và được biết đến từ lâu như là một loại gia vị hay một vị thuốc sử dụng trong y học cổ
truyền. Ngày nay Nghệ vàng là một mặt hàng nông sản rất được chú trọng canh tác và
là nguồn nguyên liệu chủ yếu để khai thác curcuminoid – thành phần hoạt chất chính
trong thân rễ Nghệ vàng được sử dụng và lưu hành phổ biến trên thị trường.
Bên cạnh curcuminoid là thành phần đã được nghiên cứu nhiều, những năm gần
đây tinh dầu Nghệ vàng cũng đang được quan tâm. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh
tinh dầu từ thân rễ Nghệ vàng có nhiều hoạt tính sinh học nổi bật như tác dụng xua đuổi
muỗi, đặc biệt trên các chủng muỗi là vector gây bệnh nghiêm trọng trên người như sốt
xuất huyết, sốt rét [14]; tác dụng ức chế và diệt một số chủng vi nấm gây bệnh trên da
[1] cũng như một số chủng nấm gây bệnh cho cây trồng [22], [36]. Một số nghiên cứu
đã công bố tinh dầu Nghệ vàng Curcuma longa L. cịn có khả năng ức chế sự phát triển
của một số vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt với vi khuẩn Streptococcus mutans là vi khuẩn
tạo mảng bám trên răng và gây sâu răng [28]. Ngoài ra tinh dầu Nghệ còn cho kết quả
tốt trong nghiên cứu sử dụng để bảo quản hoa tươi [5].
Với nhiều hoat tính sinh học đáng chú ý, tinh dầu Nghệ vàng đang dần trở thành
đối tượng tiềm năng để khai thác và đưa ra sản phẩm trên thị trường. Tuy nhiên, thành
phần các loại tinh dầu nói chung và tinh dầu Nghệ nói riêng thay đổi phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như môi trường, thổ nhưỡng, điều kiện canh tác, giống, kiểu gen, điều kiện
thu hoạch và bảo quản đặt ra yêu cầu cần phải có các tiêu chuẩn về tinh dầu Nghệ. Hiện
nay, DĐVN V đã bổ sung thêm chuyên luận tinh dầu Nghệ vàng tuy nhiên các chỉ tiêu
kiểm nghiệm đặc biệt là chỉ tiêu định tính bằng sắc ký lớp mỏng cịn nhiều hạn chế. Để
góp phần bổ sung tiêu chuẩn chất lượng cũng như nâng cao giá trị tiềm năng của tinh
dầu Nghệ vàng Curcuma longa L. đề tài: “Xây dựng dấu vân tay hóa học và đánh giá
tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng” được thực hiện với 2 mục tiêu sau:
1. Xác định dấu vân tay sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng.
2. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng.
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Nghệ vàng Curcuma longa L.
1.1.1. Vị trí, phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987) [39], Nghệ vàng Curcuma longa
L. có vị trí phân loại như sau:
Giới thực vật - Plantae
Ngành Ngọc Lan - Magoliophyta
Lớp Hành - Liliopsida
Phân lớp Hành - Liliidae
Liên bộ Gừng - Zingiberanae
Bộ Gừng - Zingiberales
Họ Gừng - Zingiberaceae
Chi Nghệ - Curcuma
Loài - Curcuma longa L.
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Nghệ vàng Curcuma longa L.
Đặc điểm hình thái: Cây thảo sống nhiều năm, cao 0,6-1m. Thân rễ phát triển
thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi bẻ hoặc cắt ngang có màu vàng, vàng sẫm, vàng cam
đến vàng đỏ, mùi thơm. Lá mọc thẳng từ thân rễ, phiến lá màu lục nhạt có hình bầu dục
hoặc trái xoan, thn nhọn ở hai đầu, kích thước 40-45 x 15-18cm, hai mặt nhẵn, mép
nguyên, uốn lượn; cuống lá có bẹ, bẹ lá rộng và dài ơm vào nhau tạo thành thân. Cụm
hoa hình trụ, mọc từ giữa các lá lên; lá bắc rời, màu rất nhạt, lá bắc hữu thụ ở phía dưới
đầu trịn, màu lục hoặc trắng nhạt, lá bắc bất thụ ở trên hẹp hơn và pha màu hồng hoặc
tím nhạt ở đầu lá. Đài hoa dạng chuông, đầu xẻ 3 răng không đều; tràng màu trắng, các
thùy hình tam giác đều; cánh mơi gần trịn, màu vàng, phía trên chia thùy khơng rõ; nhị
có bao phấn có cựa do một phần lồi ra của trung đới ở dưới các ô, nhị lép bên dạng trái
xoan rộng, dài hơn bao phấn. Bầu có lơng [3], [4], [8].
Sinh thái: Cây ưa ẩm, ưa sáng, có thể hơi chịu bóng; cây có biên độ sinh thái
rộng, thích nghi được với nhiều vùng khí hậu khác nhau, từ khí hậu cận nhiệt đới đến
khí hậu nhiệt đới điển hình. Tồn bộ phần trên mặt đất tàn lụi vào mùa đơng ở các tỉnh
phía bắc và mùa khơ ở các tỉnh phía nam. Cây mọc lại vào giữa mùa xuân, có hoa sau
2
khi đã ra lá. Mùa hoa tháng 7-8. Thân rễ thường được thu hái vào tháng 8-9, cắt bỏ hết
rễ để riêng [3], [12].
Phân bố: Nghệ có nguồn gốc nguyên thủy có lẽ từ Ấn Độ. Từ xa xưa, cây đã
được trồng ở nhiều nơi về sau trở nên hoang dại, trước hết là ở Trung Quốc. Ngày nay
Nghệ là một cây trồng quen thuộc ở khắp các nước vùng nhiệt đới, từ Nam Á đến Đông
Nam Á và Đông Á. Tại Việt Nam, Nghệ được phân bố ở khắp các địa phương từ vùng
đồng bằng ven biển đến vùng núi cao trên 1500m [3], [12].
1.1.3. Thành phần hóa học thân rễ Nghệ vàng Curcuma longa L.
Cho đến nay có ít nhất 235 hợp chất đã được xác định là thành phần của thân rễ
Nghệ vàng Curcuma longa L. bao gồm các hợp chất diarylheptanoid (thường được gọi
là curcuminoid), diarylpentanoid, monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpenoid và
sterol [30]. Trong đó hai thành phần là curcuminoid (các chất màu phenolic) và
terpenoid có trong tinh dầu được nghiên cứu nhiều nhất và là các thành phần chính đã
được chứng minh có vai trị quyết định đến tác dụng dược lý của thân rễ Nghệ vàng.
Curcuminoid được biết đến là thành phần đem lại màu vàng và được sử dụng như một
chất phụ gia tạo màu cho thực phẩm còn tinh dầu mang lại mùi thơm và hương vị cho
thân rễ Nghệ vàng [30], [38].
Curcuminoid
Curcuminoid thuộc nhóm diarylheptanoid thơng thường có hàm lượng khoảng 315% với thành phần chính là curcumin (diferuloyl methan hoặc (1E,6E)-1,7-bis(4hydroxy-3-methoxyphenyl)1,6-heptadien-3,5-dion) [30]. Ngồi curcumin cịn có thêm
hai loại curcuminoid khác là demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin [38]
“Curcumin” trên thị trường là hỗn hợp của curcumin, demethoxycurcumin và
bisdemethoxycurcumin. Ba curcuminoid chính này cũng được tìm thấy ở một số lồi
Curcuma L. khác nhưng có hàm lượng thấp hơn như: C. amada Roxb., C. aeruginosa.
Roxb., C. aromatica, C. chuanyujin Roxb., C. xanthorrhiza Roxb., C. zedoaria (Berg.)
Rosc., C. heyneana Val.& Zijp., C. mangga Val.& Zijp., C. soloensis Val. [30].
Tinh dầu
Tinh dầu Nghệ vàng có thể thu được từ các bộ phận khác nhau như lá, hoa, thân
rễ trong đó tinh dầu thân rễ cho hàm lượng lớn hơn so với các bộ phận khác. Các nghiên
cứu cho thấy các terpenoid bao gồm monoterpen và sesquiterpen là các hợp chất thường
gặp trong tinh dầu Nghệ vàng trong đó monoterpen là thành phần chính của tinh dầu
3
chiết xuất từ hoa và lá trong khi thành phần chính của tinh dầu thân rễ là các sesquiterpen
[30], [38].
Các monoterpen chính trong các mẫu tinh dầu thân rễ Nghệ vàng đã được công
bố bao gồm: p-cymen, α-terpinen, β-terpinen, α-phellandren, β-phellandren, terpinolen,
α-pinen, β-pinen, 1,8-cineol, myrcen, linalool, isoborneol, α-terpineol [29], [30].
Nhóm sesquiterpen thường chiếm tỷ lệ cao trong tinh dầu. Các sesquiterpen chính
thường gặp trong thân rễ Nghệ vàng bao gồm: ar-turmeron, α-turmeron, β-turmeron, arcurcumen, ar-tumerol, bisabolon, α-zingiberen, (Z)-α-atlanton, β-bisabolen, αcurcumen, β-curcumen, β-sesquiphellandren, (Z)-γ-atlanton, (E)-γ-atlanton, germacron,
β-farnesen, curzerenon. Trong đó ar-turmeron, α-turmeron và β-turmeron là các thành
phần chính đặc trưng có thể chiếm ít nhất 40% tinh dầu thân rễ Nghệ vàng [30].
Tuy nhiên sự có mặt và hàm lượng của các thành phần có trong tinh dầu có sự
biến đổi giữa các vùng địa lý, điều kiện sinh trưởng, giống, nguồn, điều kiện canh tác,
mùa vụ, giai đoạn trưởng thành, phương pháp thu hoạch, chiết xuất và bảo quản [20],
[21], [30]. Theo báo cáo ar-turmeron là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất của tinh dầu
Nghệ vàng ở Paskistan (25,3%) [33], Ấn Độ (51,7% [37]; 31,7% [16]), Malaysia
(45,3%) [24], Iran (68,9%) [15], Bangladesh (27,78%) [18]. Trong khi đó một vài
nghiên cứu về thành phần tinh dầu Nghệ vàng khác ở vùng hạ Hymalaya phía Bắc Ấn
Độ [36] và Hàn Quốc [28] lại cho kết quả là thành phần α-turmeron (lần lượt là 44,1%
và 35,59%) chiếm tỷ lệ cao nhất. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu tại Nepan [20] lại
cho thấy β-turmeron chiếm tỷ lệ lớn nhất (17,74%). Một vài nghiên cứu khác lại cho kết
quả monoterpen là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất như bisabolen (13,9%) trong tinh
dầu Nghệ vàng thu tại Nigeria [40], hay α-phellandren (18,2%) trong tinh dầu Nghệ
vàng tại Sri Lanka [23].
Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu về thành phần tinh dầu thân rễ Nghệ vàng cũng
đã được thực hiện. Một nhóm nghiên cứu do Nguyễn Thị Kim Cúc và các cộng sự đánh
giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng thu tại Hưng Yên đã phân tích thành
phần tinh dầu và xác định được 13 cấu tử bao gồm các monoterpen và sesquiterpen trong
đó ar-turmeron là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất (30,3%) [19]. Ar-turmeron cũng là
thành phần chính chiếm tỷ lệ cao nhất trong tinh dầu thân rễ Nghệ vàng được thu tại
Kontum (chiếm 22,34%) [7]. Trong khi đó, α-turmeron lại là thành phần chiếm tỷ lệ cao
nhất trong các mẫu tinh dầu thu tại Bình Dương, Đồng Nai, Quảng Nam, Nghệ An (lần
4
lượt là 38,91%; 31,96%; 43,07%; 41,38%) [1]. Các thành phần cịn lại có sự thay đổi về
sự có mặt và hàm lượng giữa các mẫu.
1.1.4. Một số loài Curcuma L. khác ở Việt Nam dễ nhầm lẫn với Nghệ vàng Curcuma
longa L.
Curcuma xanthorrhiza Roxb – Nghệ rễ vàng
Đặc điểm thực vật có nhiều điểm tương đồng với Nghệ vàng Curcuma longa L.
như thân rễ cắt ngang có màu cam hoặc đỏ cam ở giữa; phiến lá hình bầu dục kích thước
lớn cỡ 40-80 x 15-20 cm, hai mặt nhẵn, cuống lá dài. Cụm hoa dạng chùy, các lá bắc
hữu thụ ở phía dưới, màu xanh tái; lá bắc bất thụ ở phía trên màu hồng. Ống đài chia
làm 3 răng, cánh môi màu vàng nhạt, chia thùy; bao phấn trắng có cựa hình dùi, cong;
nhị lép vàng, hình bầu dục. Hai vịi nhụy lép [3], [4], [8], [42].
Tuy nhiên có thể phân biệt với loài Curcuma longa L. ở điểm: mặt trên lá có dải
màu nâu đỏ dọc theo gân giữa nhưng không dài đến gốc phiến lá; cụm hoa mọc từ thân
rễ [3], [4], [8], [42].
Về thành phần tinh dầu: sự xuất hiện và hàm lượng các thành trong tinh dầu thân
rễ Curcuma xanthorrhiza Roxb. cũng thay đổi và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như địa lý,
giống, môi trường, khí hậu, điều kiện canh tác…. Các thành phần thường gặp trong tinh
dầu Curcuma xanthorrhiza Roxb. cũng bao gồm các monoterpen và sesquiterpen trong
đó các cấu tử bao gồm 1,8-cineol, camphor, ar-curcumen, xanthorrizol, curzenenon là
các thành phần thường xuyên xuất hiện. Theo báo cáo xanthorrizol là thành phần chiếm
tỷ lệ cao nhất trong tinh dầu thân rễ Nghệ rễ vàng ở Malaysia [25], [24] (31,9%; 44,5% ).
Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra ar-curcumen là thành phần chiếm hàm lượng cao nhất
trong tinh dầu Curcuma xanthorriza Roxb. thu tại Indonesia (64,8%; 41,4%) [45], [49].
Tại Thái Lan các nghiên cứu về thành phần tinh dầu Nghệ rễ vàng lại cho kết quả các
monoterpen tỷ lệ cao nhất như α-terpinolen (24,86%) [13], 1,8-cineol (37,58%) [26].
Như vậy khác với tinh dầu Nghệ vàng Curcuma longa L. tinh dầu Nghệ rễ vàng
Curcuma xanthorrhiza Roxb. khơng chứa các turmeron mà có chứa thành phần đặc
trưng là xanthorrhizol.
Curcuma elata Roxb – Mì tinh rừng
Giống như Curcuma longa L., Curcuma elata Roxb. có phần thân rễ cắt ngang
có màu vàng sậm ở giữa, vàng nhạt ở ngoài. Cụm hoa: các lá bắc hữu thụ ở phía dưới,
gần như trịn; lá bắc bất thụ ở phía trên, màu tím ở đầu lá. Ống đài màu trắng, phía trên
5
có 3 răng tù; cánh hoa trắng hơi hồng; cánh mơi hình bầu dục, phía đầu có màu vàng,
đầu rách mép; bao phấn có cựa ở gốc. Bầu có lơng [3], [8].
Điếm khác nhau cơ bản giữa Curcuma elata Roxb. và Curcuma longa L. là cụm
hoa ở bên, mọc riêng với thân có lá. Bên cạnh đó lá của lồi Curcuma elata Roxb. cũng
có hình bầu dục tuy nhiên kích thước lớn hơn 1m x 30 cm (Curcuma longa L. có kích
thước 40-45 x 15-18 cm) và hai mặt lá có lơng [3], [8].
Về thành phần tinh dầu: Cho tới nay chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa
học thân rễ lồi Curcuma elata Roxb. Trong đó 2 nghiên cứu tại Trung Quốc đã cơng
bố thành phần chính của tinh dầu Nghệ Curcuma elata Roxb. là 8,9-dehydro-9-formylcycloisolongifolen (14,76% – 52,19%) và germacron (4,12% – 14,02%) [43], [48] có sự
khác biệt rõ rệt so với loài Curcuma longa L.
1.2. Tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng
Năm 2007, Krittika Norajit cùng các cộng sự nghiên cứu đánh giá tác dụng kháng
khuẩn của tinh dầu 5 loài thuộc họ Gừng trong đó có Curcuma longa L. Kết quả cho
thấy tinh dầu Nghệ vàng với thành phần chính là α-turmeron khơng thể hiện tác dụng
ức chế đối với vi khuẩn E. coli (đường kính vịng vơ khuẩn = 0 và MIC > 50mg/ml) và
tốt nhất trên Listeria monocytogenes với đường kính vịng vơ khuẩn = 16mm, MIC =
25mg/ml. Trên 2 chủng còn lại: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, tác dụng ức
chế của tinh dầu Nghệ vàng không thể hiện rõ ràng (đường kính vịng vơ khuẩn 9 10mm, MIC > 50mg/ml) [35].
Một nghiên cứu khác do Shragufta Naz và các cộng sự đã đánh giá tác dụng của
tinh dầu Nghệ vàng thu tại Pakistan trên các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus
macerans, Bacillus licheniformis và vi khuẩn Azotobacter. Kết quả nghiên cứu cho thấy
ở nồng độ dao động từ 4 – 28 mg/ml các mẫu tinh dầu đều có khả năng ức chế các vi
khuẩn. Trong đó vi khuẩn B. subtilis cho đường kính vịng vơ khuẩn lớn hơn các vi
khuẩn khác vì vậy được cho là nhạy cảm nhất đối với các mẫu tinh dầu Nghệ vàng [34].
Năm 2015 Jelena S. Stanojević tiến hành nghiên cứu tinh dầu Nghệ vàng tại
Serbia đã xác định được 8 thành phần có trong tinh dầu trong đó các sesquiterpen (arturmeron, α-turmeron, β-turmeron) chiếm tỷ lệ lớn (65,4%). Nghiên cứu cũng đánh giá
tác dụng kháng khuẩn cho kết quả hoạt của tính tinh dầu Nghệ vàng tốt hơn so với
cefalexin trên chủng Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 và ampicilin trên chủng
Proteus vulgaris ATCC 8427 tuy nhiên khơng có tác dụng trên chủng Staphylococcus
6
aureus ATCC 25923 (MSSA), Escherichia coli ATCC 25922 và Listeria monocitogenes
ATCC 19166. Tinh dầu Nghệ cũng cho tác dụng kháng khuẩn yếu trên các chủng
Bacillus cereus ATCC, Bacillus subtilis ATCC 6633 (đường kính vịng vơ khuẩn lần
lượt là 17; 24 mm) [38].
Tại Colombia, năm 2016 Álvarez Nelson Méndez cùng các cộng sự thực hiện
nghiên cứu đánh giá tác dụng của tinh dầu Nghệ trên các chủng vi khuẩn bệnh viện. Kết
quả nghiên cứu cho thấy chỉ ở nồng độ 1000ppm tinh dầu Nghệ mới ức chế được trên
50% sự phát triển của vi khuẩn Bacillus sp.. Cũng ở nồng độ này tỷ lệ ức chế sinh trưởng
của Staphylococcus aureus ATCC 25923 (MSSA), Klebsiella pneumoniae, và
Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) tương ứng là 43%, 43%, 39% và 33%
[50].
Tại Việt Nam, năm 2010 Nguyễn Thị Kim Cúc cùng các cộng sự đã nghiên cứu
xác định được 13 cấu tử có trong tinh dầu thân rễ Nghệ vàng trong đó ar-turmeron và αturmeron chiếm tỷ lệ cao nhất (28,25% và 29,11%). Đồng thời nhóm nghiên cứu tiến
hành đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng, kết quả chỉ ra rằng các vi
khuẩn Gram (+) nhạy cảm với tinh dầu hơn so với vi khuẩn Gram (-). Bacillus cereus
bị ức chế ở nồng độ 1% trong khi Listonella damsela phát triển tốt ở nồng độ này và chỉ
bị ức chế ở nồng độ 3% [19].
Một nghiên cứu khác do Phan Thị Hoàng Anh cũng cho kết quả các sesquiterpen
bao gồm ar-turmeron, α-turmeron, β-turmeron là thành phần chiếm tỷ lệ lớn nhất trong
tinh dầu của 4 mẫu Nghệ vàng thu tại Bình Dương, Đồng Nai, Quảng Nam và Nghệ An.
MIC của các mẫu Nghệ vàng trên các chủng vi khuẩn được đánh giá bằng phương pháp
pha loãng trên thạch cho kết quả trong bảng 1.1.
Bảng 1.1: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml) của tinh dầu Nghệ vàng đối với
một số chủng vi khuẩn [1]
MIC (µg/ml)
Đồng Nai
Bình
Dương
Quảng
Nghệ An
Nam
Streptococcus hemolyticus β
250
125
125
62,5
Staphylococcus aureus
250
62,5
31,25
31,25
Salmonella
500
125
125
125
7
Như vậy từ các kết quả trên cho thấy tinh dầu Nghệ vàng Curcuma longa L. có
tác dụng ức chế yếu trên hầu hết các chủng vi khuẩn nghiên cứu trong đó vi khuẩn Gram
(+) (tốt nhất là Bacillus sp.) nhạy cảm hơn so với vi khuẩn Gram (-).
1.3. Vài nét về dấu vân tay hóa học.
1.3.1. Khái niệm về dấu vân tay hóa học.
Ngày nay, xu hướng sử dụng thuốc dược liệu tại các nước đang phát triển để điều
trị bệnh ngày một phổ biến. Trong tình hình sử dụng dược liệu ngày càng tăng, hướng
dẫn của WHO đưa ra về việc đánh giá hiệu lực và an toàn của thuốc có nguồn gốc từ
thảo dược đã quy định chỉ tiêu đánh giá chất lượng dược liệu về mặt hóa học như sau:
“Phải mơ tả các phép thử vật lý và hóa học được tiến hành để xác định các thành phần
hóa học của cây và mơ tả sắc ký đồ của phân đoạn hoạt chất hoặc chất đặc trưng. Nếu
không phải xác định một hỗn hợp các chất đặc trưng (dấu vân tay) của cây thuốc” [41].
Khái niệm dấu vân tay hóa học được đề cập trong phụ lục 12.23 Dược điển Việt
Nam V như sau: dấu vân tay hóa học là các thơng tin hóa học của dược liệu được biểu
thị dưới dạng sắc ký đồ, các phổ và các đồ thị… được ghi bằng các kỹ thuật phân tích
(kỹ thuật sắc ký) hay cịn được gọi là sắc ký đồ dấu vân tay. Trong sắc ký đồ dấu vân
tay được thiết lập, có pic của một hoặc nhiều chất đánh dấu hóa học hay các chất đặc
trưng [9].
Theo một số tài liệu, dấu vân tay hóa học hay dấu vân tay sắc ký còn được định
nghĩa: dấu vân tay sắc ký của một mẫu dược liệu là một bản sắc ký đồ của dịch chiết các
thành phần hóa học có hoạt tính dược lý và/ hoặc các thành phần hóa học đặc trưng của
dược liệu [27].
Tổ chức Y tế Thế giới WHO đưa ra định nghĩa về chất đặc trưng như sau: “ Một
thành phần chất tự nhiên có trong một bộ phận của cây có thể được dùng để đảm bảo
cho sự nhận biết hoặc đảm bảo chất lượng chế phẩm của cây thuốc đó, không nhất thiết
là hoạt chất” [41].
Như vậy dấu vân tay hóa học của một mẫu dược liệu có thể hiểu là các thơng tin
hóa học của dược liệu được ghi dưới dạng sắc ký đồ được dùng để đảm bảo cho sự nhận
biết hoặc đảm bảo chất lượng chế phẩm của cây thuốc đó.
1.3.2. Ứng dụng của dấu vân tay hóa học.
Dược liệu thường chứa rất nhiều thành phần và có khả năng biến đổi phức tạp
tùy thuộc nhiều vào địa lý, môi trường, điều kiện canh tác, mùa vụ, giống, điều kiện bảo
8
quản và phương pháp chế biến. Do đó việc xác định dấu vân tay hóa học của dược liệu
có vai trò quan trọng trong việc thiết lập tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu nhằm đánh
giá hiệu lực và đảm bảo tính an tồn của dược liệu.
Bên cạnh đó, xây dựng dấu vân tay hóa học cịn góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu
cho việc định tính thành phần các chất trong dược liệu, dịch chiết dược liệu và các chế
phẩm từ dược liệu. Trong các chuyên luận về dược liệu và chế phẩm thuốc ghi trong
Dược điển Việt Nam V, các kỹ thuật sắc ký (TLC, HPLC) được áp dụng trong các phép
thử định tính định lượng. Tuy nhiên đối với các tiêu chuẩn của tinh dầu, Dược điển Việt
Nam V vẫn chưa có các chỉ tiêu định tính, định lượng bằng sắc ký khí trong khi chỉ tiêu
này được quy định trong tất cả các chuyên luận tinh dầu trong Dược điển Châu Âu cũng
như phần lớn chuyên luận tinh dầu trong Dược điển Trung Quốc.
Ngoài ra việc xác định dấu vân tay hóa học đặc trưng cho dược liệu còn được sử
dụng để phân biệt, nhận biết dược liệu và phát hiện các tạp chất, các chất giả mạo pha
trộn trong dược liệu hay các thành phẩm từ dược liệu.
Như vậy, dấu vân tay hóa học có vai trị quan trọng trong việc định tính, xác định
các thành phần có trong dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu; phát hiện tạp chất, các
chất giả mạo pha trộn trong dược liệu và thiết lập tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu
nhằm đảm bảo hiệu lực và an toàn cho dược liệu và các chế phẩm thuốc có nguồn gốc
từ dược liệu.
1.3.3. Một số nghiên cứu thiết lập dấu vân tay hóa học.
Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới tập trung vào việc xây dựng dấu vân tay sắc
ký dược liệu, thuốc có nguồn gốc thảo dược và áp dụng kỹ thuật sắc ký dấu vân tay để
đánh giá, kiểm soát chất lượng dược liệu. Peishan Xie cùng các cộng sự đã ứng dụng kỹ
thuật sắc ký dấu vân tay (HPTLC và HPLC) để đánh giá chất lượng bao gồm việc xác
định, kiểm tra tính ổn định và nhất quán cũng như việc phát hiện các chất giả mạo của
một số thuốc cổ truyền Trung Quốc [44]. Năm 2008 Jian Hong Zeng cùng các cộng sự
đã sử dụng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ (GC/MS) để kiểm soát chất lượng tinh dầu
Curcuma kwangsiensis thu tại Quảng Tây, Trung Quốc [46]. Năm 2018 Hui Zhang cùng
các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng sắc ký dấu vân tay để đánh giá chất lượng
và kiểm sốt q trình bào chế chế phẩm thuốc cổ truyền [47]. Trong một nghiên cứu
khác, chất lượng các mẫu trà Phổ Nhĩ thu thập tại 12 cơ sở sản xuất tại Phổ Nhĩ, Vân
Nam và 6 mẫu trà thu thập tại 6 tỉnh khác Chiết Giang, Tứ Xuyên, Hà Nam, An Huy,
9
Hồ Bắc và Giang Tô cũng đã được đánh giá bằng kỹ thuật dấu vân tay sắc ký GC/MS
[32].
Tại Việt Nam, Nguyễn Kim Bích đã tiến hành “Phân tích và xác định các đặc
điểm hóa học đặc trưng của dược liệu phục vụ cơng tác chuẩn hóa” cho 20 lồi dược
liệu dựa trên cơ sở xác định các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất dược liệu nhờ kỹ
thuật sắc ký lớp mỏng. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật sắc ký khí khối
phổ cũng được sử dụng cho nhóm lignan của Đỗ trọng, alcaloid bay hơi của Xuyên
khung và thành phần bay hơi của Ô dược [2]. Trong năm 2016, Nguyễn Thị Bích Thu
đã tiến hành “Nghiên cứu chuẩn hóa dược liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
kết hợp kỹ thuật chỉ điểm vân tay” cho 10 loại dược liệu bao gồm: Cúc hoa, Hạ khơ
thảo, Hồng cầm, Sinh địa, Ngũ gia bì, Ngũ gia bì hương, Sài hồ, Ơ đầu, Tam thất và
Mật gấu [10]. Một nghiên cứu khác do Nguyễn Văn Tựu thực hiện “Nghiên cứu phát
triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công tác kiểm tra giám
sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược” trên 30 loại dược liệu. Đề tài đã xây dựng
được bộ dữ liệu chuẩn bao gồm 30 mẫu dược liệu đã được định danh đúng tên khoa học,
mô tả đặc điểm về hình thái, bột, vi phẫu và các đặc điểm hóa học đặc trưng thơng qua
các sắc ký dấu vân tay [11].
1.3.4. Tình hình tiêu chuẩn hóa Nghệ vàng và tinh dầu Nghệ vàng
Tiêu chuẩn về thân rễ Nghệ vàng được trình bày đầy đủ về đặc điểm hình thái,
mơ tả vi học, đặc điểm bột, dấu vân tay sắc ký lớp mỏng nhận dạng curcuminoid có
trong Nghệ vàng, xác định hàm lượng các thành phần chính (tinh dầu, curcuminoid) và
các chỉ tiêu khác về chất lượng trong Dược điển Châu Âu (EP 8.0), Dược điển Trung
Quốc (2015) và Dược điển Hồng Kông.
Trong Dược điển Việt Nam V, chuyên luận về Nghệ vàng cũng quy định các chỉ
tiêu chất lượng bao gồm mơ tả đặc điểm hình thái; mơ tả đặc điểm vi học; định tính bằng
sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu curcumin; chỉ tiêu định lượng hàm lượng tinh dầu,
curcuminoid và các chỉ tiêu khác về độ ẩm và tạp chất.
Về công tác tiêu chuẩn hóa tinh dầu Nghệ vàng: hiện nay Dược điển Châu Âu
(EP 8.0), Dược điển Trung Quốc (2015), Dược điển Hồng Kơng đều chưa có chun
luận về tinh dầu Nghệ vàng. Tại Việt Nam, Dược điển Việt Nam V đã có thêm chuyên
luận về tinh dầu Nghệ vàng quy định một số chỉ tiêu chất lượng của tinh dầu Nghệ vàng
như cảm quan màu sắc, mùi vị; các chỉ số vật lý (tỷ trọng, chỉ số khúc xạ và góc quay
10
cực riêng); định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, tuy nhiên các chỉ tiêu cịn hạn
chế, hình ảnh sắc ký lớp mỏng chưa được mô tả cũng như thành phần hóa học đặc trưng
chưa được nhắc đến, đồng thời chưa có chỉ tiêu định tính, định lượng bằng sắc ký khí.
11
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu.
2.1.1. Nguyên liệu.
Mẫu thân rễ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) được thu tại các địa phương thuộc
một số tỉnh miền bắc, miền trung và miền nam Việt Nam. Các mẫu Nghệ vàng được
kiểm tra về mặt hình thái đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V. Hình ảnh
các mẫu nghiên cứu được trình bày ở phần Phụ lục 1.
Thơng tin và ký hiệu của 20 mẫu thu được được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1: Thông tin 20 mẫu thân rễ Nghệ vàng
Thời gian thu
STT
Ký hiệu
Địa điểm thu mẫu
1
HN11
Hai Bà Trưng- Hà Nơi
26/09/2018
2
HN12
Ứng Hịa- Hà Nội
30/10/2018
3
HN13
Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế
4
HN14
biến cây thuốc Hà Nội Viện Dược Liệu.
5
TQ01
Sơn Dương-Tuyên Quang
01/11/2018
6
CM01
Cà Mau
12/12/2018
7
NB01
Ninh Bình
30/10/2018
8
VP01
Lập Thạch-Vĩnh Phúc
31/10/2018
9
VP02
Vĩnh n-Vĩnh Phúc
26/11/2018
10
NA03
Vinh-Nghệ An
31/10/2018
11
NT01
Nha Trang
10/11/2018
12
H01
Huế
25/02/2019
13
VT01
Vũng Tàu
01/02/2019
14
HCM01
Hồ Chí Minh
05/02/2019
15
BN01
Thuận Thành-Bắc Ninh
21/09/2018
16
HD01
Chí Linh-Hải Dương
04/11/2018
17
TN02
Châu Thành-Tây Ninh
01/02/2019
18
LC01
Lào Cai
25/02/2019
19
BG02
Bắc Giang
04/03/2019
20
TH02
Quảng Xương -Thanh Hóa
25/02/2019
12
mẫu
12/03/2019
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu.
2.1.2.1. Dung mơi, hóa chất:
❖ Dùng cho xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ:
₋
Các dung môi: n-hexan, ethyl acetat, toluen đạt tiêu chuẩn phân tích (Trung
Quốc); cloroform, n-hexan đạt tiêu chuẩn HPLC (Merck);
₋
Thuốc thử hiện màu trong SKLM: dung dịch vanillin-acid sulfuric được pha mới
bằng cách phối hợp đồng thể tích vanillin 1% trong ethanol và dung dịch H2SO4
10% trong ethanol;
₋
Natri sulfat khan (Trung Quốc);
₋
Dãy đồng đẳng ankan C8-C20 (Sigma Aldrich);
❖ Dùng cho đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ:
₋
Môi trường nuôi cấy: môi trường MHB (Sigma);
₋
Dung môi: DMSO, nước cất, đệm phosphat PSB;
₋
Resazurin;
₋
Kháng sinh cefoxitin.
2.1.2.2. Trang thiết bị, máy móc:
❖ Dùng cho định lượng tinh dầu:
₋
Cân kỹ thuật Sartorius TE412;
₋
Bếp điện;
₋
Bộ dụng cụ cất tinh dầu theo Dược điển Mỹ (USP38).
❖ Dùng cho xây dựng dấu vân tay hóa học tinh dầu:
₋
Cột sắc ký (chiều dài 50 cm, đường kính trong 2 cm), chất nhồi cột: silicagel
0,04-0,063 mm (Merck);
₋
Bản mỏng silicagel 60F254 (Merck);
₋
Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG (máy chấm sắc ký tự động
Linomat 5, buồng chụp bản mỏng TLC Visualiser có kết nối máy tính với phần
mềm VisionCATs, bình khai triển sắc ký);
₋
Hệ thống sắc ký khí Agilent 7890A, detector khối phổ 5975C, cột DB-5MS (30
m x 0,25 mm x 0,25 µm), khí mang heli;
₋
Micropipet Nichipet EX plus II;
₋
Máy ảnh kỹ thuật số;
13
₋
Các dụng cụ thí nghiệm khác trong phịng thí nghiệm: bình nón, pipet, ống
nghiệm.
❖ Dùng cho đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu:
₋
Đĩa petri;
₋
Đĩa 96 giếng vô trùng;
₋
Thiết bị đo độ đục Mc Farland (McF);
₋
Máy quang phổ SPECTRAmax;
₋
Micropipet.
❖ Chủng vi khuẩn thí nghiệm:
₋
Staphylococcus aureus ATCC 25923: tụ cầu vàng nhạy cảm với methicillin
(MSSA);
₋
Staphylococcus aureus ATCC 33591: tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA);
₋
Staphylococcus aureus 69486: tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) phân lập
từ bệnh viện Bạch Mai.
2.2. Nội dung nghiên cứu.
2.2.1. Thu mẫu Nghệ vàng và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu.
₋
Thu các mẫu thân rễ Nghệ vàng tại một số tỉnh thành;
₋
Xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước.
2.2.2. Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng.
₋
Xác định dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng;
₋
Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng.
2.2.3. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng.
-
Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của 7 mẫu tinh dầu Nghệ vàng trên 2 chủng vi
khuẩn S. aureus ATCC 25923 và S. aureus ATCC 33591.
-
Đánh giá tác dụng phối hợp của tinh dầu Nghệ vàng với kháng sinh trên 3 chủng
tụ cầu vàng ATCC 25923, ATCC 33591 và chủng 69486.
2.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Thu mẫu nghiên cứu và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu.
Mẫu thân rễ Nghệ vàng sau khi thu mua tại các tỉnh thành được kiểm tra theo tiêu
chuẩn Dược điển Việt Nam V [9] bằng phương pháp cảm quan (chụp ảnh các mẫu thu
được, lát cắt ngang, lát cắt dọc và màu sắc) đồng thời so sánh với mô tả trong luận án
14
“Nghiên cứu phân loại họ Gừng (Zingiberaceae Lindl) ở Việt Nam” của Nguyễn Quốc
Bình [3], thực vật chí Trung Quốc (Flora of China) [42].
Hàm lượng tinh dầu được xác định bằng phương pháp cất kéo hơi nước, sử dụng
bộ dụng cụ cất tinh dầu theo mô tả của Dược điển Mỹ (USP38). Mẫu được rửa sạch, cân
và chia nhỏ. Thêm lượng nước vừa đủ ngập lượng dược liệu, cất trong 7h, tắt bếp, để
nguội, đọc thể tích tinh dầu. Tinh dầu được loại nước bằng Na2SO4 khan, bảo quản trong
lọ kín, sẫm màu. Hàm lượng tinh dầu (thể tích/khối lượng) tính trên dược liệu tươi theo
cơng thức:
𝑋 =
𝑉 x 100
𝑚
Trong đó:
₋
X là hàm lượng tinh dầu tính theo dược liệu tươi (%);
₋
V là thể tích tinh dầu thu được (ml);
₋
m là khối lượng dược liệu đem cất (g).
2.3.2. Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng.
2.3.2.1. Xác định dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng.
20 mẫu tinh dầu được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng với các điều kiện như sau:
₋
Bản mỏng: silicagel 60F254 được hoạt hóa ở 110oC trong 1h, để nguội và bảo
quản trong bình hút ẩm.
₋
Chất đối chiếu: được phân lập từ tinh dầu Nghệ vàng bằng phương pháp sắc ký
cột và xác định thành phần bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ GC/MS [6]
₋
Dịch chấm sắc ký: tinh dầu được pha loãng trong cloroform theo tỉ lệ 1:30.
₋
Dung môi: toluen-ethylacetat (97:3).
₋
Cách tiến hành: Chấm lên bản mỏng 2µl mỗi dung dịch trên dải dài 5,0mm, các
vết cách mép dưới bản mỏng 10,0mm, cách mép ngoài bản mỏng 8,5mm; khoảng
cách giữa 2 vết liền nhau là 4,0mm. Thao tác được tiến hành trên hệ thống máy
chấm tự động Linomat 5. Sau khi triển khai sắc ký dung môi đi được 8cm, lấy
bản mỏng ra, để khô ở điều kiện thường và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước
sóng 254nm và 366nm sau đó hiện màu bằng dung dịch vanillin/acid sulfuric,
sấy ở 110oC trong 5 phút, quan sát dưới ánh sáng thường. Hình ảnh sắc ký được
chụp lại bằng hệ thống chụp ảnh CAMAG TLC Visualiser.
15
₋
Kết hợp hình ảnh sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các mẫu Nghệ vàng trong nghiên
cứu trước của Phạm Thị Kiều Dung [6] để đưa ra được hình ảnh dấu vân tay sắc
ký lớp mỏng của tinh dầu Nghệ vàng.
2.3.2.2. Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng
❖ Phân tích thành phần tinh dầu Nghệ vàng bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ
(GC/MS).
Mẫu phân tích: tinh dầu Nghệ vàng pha lỗng trong cloroform với nồng độ 1%
(tt/tt).
Tiến hành phân tích tinh dầu bằng hệ thống sắc ký khí, detector khối phổ; cột
DB-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm); khí mang heli, tốc độ dịng 1ml/phút; chương trình
nhiệt độ: 45oC giữ trong 5 phút, tăng 3oC đến 225oC, tăng 10oC đến 275oC; thể tích tiêm
mẫu 1µl, chia dòng 1:50.
Các thành phần trong tinh dầu được xác định dựa trên so sánh độ trùng lặp về
phổ khối các chất có sẵn trong thư viện và dựa trên giá trị RI được so sánh với các dữ
liệu có trong thư viện NIST và cơ sở dữ liệu đã được cơng bố [17]. Chỉ số RI được tính
tốn dựa trên thời gian lưu thực tế các pic trong mẫu phân tích và thời gian lưu các alkan
trong dãy đồng đẳng alkan C8-C20 được tiến hành ở cùng điều kiện sắc ký theo công
thức:
RI = 100 x(
Tx − Tn
+ n)
Tn+1 − Tx
Trong đó:
₋
Tx: Thời gian lưu của chất phân tích;
₋
Tn: Thời gian lưu của alkan liền trước pic phân tích;
₋
Tn+1: Thời gian lưu của alkan liền sau pic phân tich;
₋
n: Số nguyên tử carbon của alkan liền trước pic phân tích.
❖ Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng
Phân nhóm tinh dầu Nghệ vàng bằng kỹ thuật phân tích chùm theo cụm thứ bậc
HCA sử dụng phần mềm thống kê R 3.5.3 dựa trên dữ liệu là kết quả phân tích các thành
phần có mặt trong tinh dầu bằng GC/MS.
Phân nhóm 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng với 19 biến bao gồm tỷ lệ % của 18 cấu
tử có trong tinh dầu và tổng hàm lượng của 3 thành phần (ar-turmeron, α-turmeron, βturmeron).
16
Phân nhóm 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng dựa trên biến là tỷ lệ % của các thành
phần chính chiếm hàm lượng lớn trong tinh dầu.
Đối chiếu kết quả phân nhóm kết hợp với các kết quả nghiên cứu của Phạm Thị
Kiều Dung và cộng sự [6] đưa ra dấu vân tay sắc ký khí cho tinh dầu Nghệ vàng.
2.3.3. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng.
Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng được thực hiện tại
phịng thí nghiệm trường Đại học công giáo Louvain (Université catholique de
Louvain) – Vương quốc Bỉ.
2.3.3.1. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
Tác dụng kháng khuẩn của 7 mẫu tinh dầu Nghệ vàng được đánh giá trên hai
chủng vi khuẩn: tụ cầu vàng nhạy cảm với methicillin MSSA (Staphylococcus aureus
ATCC 25923) và tụ cầu vàng kháng methicillin MRSA (Staphylococcus aureus ATCC
33591). Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định bằng kỹ thuật vi pha loãng sử
dụng đĩa 96 giếng được tiến hành theo các bước sau:
₋
Chuẩn bị dung dịch tinh dầu: Hòa tan tinh dầu trong DMSO để được nồng độ
50µl/ml, bảo quản ở 4oC. Pha lỗng dung dịch này với mơi trường nuôi cấy để
được nồng độ 8192nl/ml, sử dụng trong ngày.
₋
Chuẩn bị vi sinh vật: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch
TSA ủ qua đêm ở 37oC. Lấy 2-3 khuẩn lạc thêm vào 3ml PSB trong ống Mc
Farland, lắc cho phân tán đều. Đo độ đục và điều chỉnh độ đục đạt 0,5 McF (tương
ứng 108vk/ml). Pha lỗng 100 lần trong mơi trường ni cấy để được lượng vi
khuẩn ban đầu là 106 vk/ml.
₋
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy được sử dụng là mơi trường
MHB-Ca.
₋
Tiến hành: thêm 100µl MHB-Ca vào giếng số 1-11, 200µl vào giếng 12 làm mẫu
đối chứng âm (khơng có vi khuẩn và tinh dầu giúp đánh giá độ vơ khuẩn của mơi
trường). Thêm vào 100µl tinh dầu (nồng độ 8192nl/ml) vào giếng 1, trộn đều.
Lấy 100 µl dung dịch từ giếng 1 thêm vào giếng 2, tiếp tục như vậy cho đến giếng
10 để được các nồng độ 4096, 2048, 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8nl/ml (ở
cột 10 loại bỏ 100µl). Bổ sung 100µl vi khuẩn vào cột 1-11 (cột 11 đóng vai trị
mẫu chứng dương để kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn). Ủ ở 37oC trong 20h
sau đó bổ sung Resazurin 100µg/ml để đánh giá sự phát triển của vi khuẩn.
17
