Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát triển của vi khuẩn sinh enzyme cellulase trong ruột mối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

Độc lập- Tự do- Hạnh phúc

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên :
Lớp
:
MSSV
:
Ngành
:

Nguyễn Thị Ân
51K2- Hóa Thực Phẩm
1052043910
Công nghệ thực phẩm

1. Tên đề tài : Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát triển
của vi khuẩn sinh enzyme cellulase trong ruột mối
2. Nội dung nghiên cứu đồ án tốt nghiệp:
- Nghiên cứu lựa chọn các chủng F có hoạt độ enzyme cellulase.
- Nghiên cứu lựa chủng F2.2 trong ruột mối có hoạt tính cao
- Nghiên cứu lựa chọn môi trường hoạt hóa và nuôi cấy phù hợp cho chủng F2.2
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp celluase của
chủng F2.2 trong ruột mối:
• Nghiên cứu thời gian tốt nhất cho quá trình phát triển và sinh tổng hợp

cellulase của chủng F2.2
• Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của
chủng F2.2
• Nghiên cứu ảnh hưởng của sự thay đổi nhiệt độ đến sự phát triển của chủng F 2.2
• Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến sự phát triển của chủng F 2.2
• Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng hữu cơ khác nhau đến sự
phát triển của chủng F2.2
Giáo viên hướng dẫn

:

ThS. Đào Thị Thanh Xuân

Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày

tháng năm 2014

Ngày hoàn thành đồ án

tháng năm 2014

: Ngày

Ngày
tháng năm 2015
Giáo viên hướng dẫn
( Ký, ghi rõ họ tên)

Chủ nhiệm bộ môn
(Ký, ghi rõ họ tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án vào ngày tháng năm 2015
Người duyệt
(Ký, ghi rõ họ tên)

i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

Độc lập- Tự do- Hạnh phúc

BẢN NHẬN XÉT TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên

:

Nguyễn Thị Ân

Khóa

:

51K- Hóa thực phẩm

MSSV

:

1052043910

Ngành

:

Công nghệ thực phẩm

Cán bộ hướng dẫn

:

ThS. Đào Thị Thanh Xuân

Cán bộ duyệt

:

1. Nội dung nghiên cứu thiết kế:
...............................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................

................................................................................................................................
2. Nhận xét của cán bộ hướng dẫn:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Ngày

ii

tháng 0 1 năm 2015


Cán bộ hướng dẫn
(Ký, ghi rõ họ tên)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

Độc lập- Tự do- Hạnh phúc

BẢN NHẬN XÉT TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên

:

Nguyễn Thị Ân

Khóa

:

51K- Hóa thực phẩm

MSSV

:

1052043910

Ngành

:

Công nghệ thực phẩm

Cán bộ hướng dẫn

:

ThS. Đào Thị Thanh Xuân

Cán bộ duyệt

:

1.Nội dung nghiên cứu thiết kế:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
2.Nhận xét của cán bộ duyệt:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
Ngày tháng 01 năm 2015

iii


Cán bộ duyệt
(Ký, ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Đào Thị Thanh Xuân,giảng viên
khoa Hóa học, trường Đại học Vinh đã tận tình, tâm huyết hướng dẫn em trong suốt
quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, toàn bộ cán bộ kỹ thuật viên phòng thí
nghiệm khoa Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu và
hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả các bạn cùng nhóm đồ án, các bạn
sinh viên khóa 51K Công nghệ thực phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho
tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và toàn thể bạn
bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đồ án tốt
nghiệp.
Vinh, ngày tháng 01 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Ân

iv


TÓM TẮT ĐỒ ÁN
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát triển và sinh tổng
hợp enzyme cellulase của vi khuẩn trong ruột mối.
Nội dung nghiên cứu:
- Tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn ruột mối có hoạt tính cao để tiến hành
những nghiên cứu tiếp theo.
- Nghiên cứu lựa chọn môi trường hoạt hóa thích hợp
- Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
- Nghiên cứu thời gian nuôi cấy chủng cho hoạt tính cao nhất.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát triển, sinh tổng hợp

cellulase của chủng F2.2.
Kết quả thu được:
• Những chủng vi khuẩn ruột mối cho hoạt tính cao nhất là: F 2.2, F4.3, F1.1.1
Tôi đã sử dụng chủng F2.2 để thực hiên các nghiên cứu tiếp theo.
•

Nghiên cứu thời gian nuôi cấy vi khuẩn ruột mối chủng F 2.2 cho hoạt tính

cao. Thời điểm sau 1 ngày nuôi cấy thì chủng F 2.2 cho hoạt tính cao nhất.
• Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chủng F 2.2 tách ra từ vi
khuẩn ruột mối :
- Môi trường hoạt hóa tối ưu: D8
- Môi trường nuôi cấy thích hợp : D8
- Thời gian nuôi cấy cho sự phát triển tối đa và hoạt tính cao: 24h
- Nhiệt độ tối ưu : 350 C
- pH tối ưu

: pH 7

- Nồng độ cơ chất tối ưu trong môi trường dinh dưỡng : CMC 1%

v


- Nguồn dinh dưỡng Carbon tốt nhất: Tinh bột
- Nguồn dinh dưỡng Nito tốt nhất : Cao thịt bò
MỤC LỤC
Trang

Họ và tên sinh viên : Nguyễn Thị Ân............................................................i

Lớp : 51K2- Hóa Thực Phẩm........................................................................i
MSSV : 1052043910.....................................................................................i
Ngành : Công nghệ thực phẩm......................................................................i
1. Nội dung nghiên cứu thiết kế:..................................................................ii
2. Nhận xét của cán bộ hướng dẫn:..............................................................ii
Tiến hành thí nghiệm..................................................................................53
Vi khuẩn sinh trưởng và phát triển qua 4 giai đoạn:...................................66
- Giai đoạn tiềm phát..................................................................................66
- Giai đoạn logarit (giai đoạn phát triển)....................................................66
- Giai đoạn cân bằng...................................................................................66
- Giai đoạn suy vong...................................................................................66
1. Tuyển chọn những chủng VSV phát triển mạnh và sinh enzyme cellulase
có hoạt tính cao để bảo quản và sử dụng cho những nghiên cứu và ứng
dụng tiếp theo..............................................................................................76
2. Nghiên cứu để thu nhận, tinh sạch và sử dụng enzyme cellulase vào mục
đích ứng dụng vĩ mô trong hầu hết các ngành công nghiệp: công nghệ thực
phẩm, công nghiệp dệt may, ngành công nghiệp đồ uống...........................76
6. Nguyễn Đức lượng và một số tác giả (2004), công nghệ enzyme, NXB
Đại học quốc gia TP.HCM...........................................................................77
7. Nguyễn Thanh Ngọc, Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn và khai thác
các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ liệu
metagenome hệ vi khuẩn ruột mối..............................................................77
8. Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự (2006), Nghiên cứu phân loại và xác
định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2......................77
9. Nguyễn Văn Tuấn (2009), Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Tuyển
chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của Endo- β-1,4-glucanase, NXB
Đại hõ Thái nguyên.....................................................................................78
10. Vũ Văn Tuyển (1991) Kết quả bước đầu nghiên cứu xử lí mối hại cây
cà phê- tạp chí khoa học và kĩ thuật số 16. 1-33tr.......................................78
22. Bhatta D R. 1994. Isolation and Characterization of the thermophilic

bacteria from the hot spring of Nepal (dissertation). Tribhuvan University,
Nepal............................................................................................................79

vi


23. Richmond P.A., [1991]. Occurrence and functions native cellulose. In:
Haigler, CH, Weimer, JP (Eds.) Biosynthesis and Biodegradation of
cellulose. Dekker, New York, 5-23..............................................................79
24. Bhat M.K. [2000]. Cellulases and related enzymes in biotechnology.
Biotechnol. Adv.,18: 355-383......................................................................79
25. Maki ML, Broere M,Leung KT and Qin W[2011] Characterization of
some efficient cellulase producing bacteria isolated from paper mill sludges
and organic fertilizers.Int J BiochemMol Biol. 2(2): 146–154...................79
26. Muhammad I, Safdar A, Quratulain S, Muhammad N, [2012]. Isolation
and screening of cellulolytic bacteria from soil and optimization of
cellulase production and activity. Turkish Journal of Biochemistry............79
27. Sadhu S, Maiti T. K., [2013] Cellulase production by Bacteria: A
Review. British Microbiology Research Journal 3(3): 235-258..................79

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Trang

Họ và tên sinh viên : Nguyễn Thị Ân............................................................i
Lớp : 51K2- Hóa Thực Phẩm........................................................................i
MSSV : 1052043910.....................................................................................i
Ngành : Công nghệ thực phẩm......................................................................i

1. Nội dung nghiên cứu thiết kế:..................................................................ii
2. Nhận xét của cán bộ hướng dẫn:..............................................................ii
Tiến hành thí nghiệm..................................................................................53
Vi khuẩn sinh trưởng và phát triển qua 4 giai đoạn:...................................66
- Giai đoạn tiềm phát..................................................................................66
- Giai đoạn logarit (giai đoạn phát triển)....................................................66
- Giai đoạn cân bằng...................................................................................66
- Giai đoạn suy vong...................................................................................66
1. Tuyển chọn những chủng VSV phát triển mạnh và sinh enzyme cellulase
có hoạt tính cao để bảo quản và sử dụng cho những nghiên cứu và ứng
dụng tiếp theo..............................................................................................76
2. Nghiên cứu để thu nhận, tinh sạch và sử dụng enzyme cellulase vào mục
đích ứng dụng vĩ mô trong hầu hết các ngành công nghiệp: công nghệ thực
phẩm, công nghiệp dệt may, ngành công nghiệp đồ uống...........................76
6. Nguyễn Đức lượng và một số tác giả (2004), công nghệ enzyme, NXB
Đại học quốc gia TP.HCM...........................................................................77
7. Nguyễn Thanh Ngọc, Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn và khai thác
các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ liệu
metagenome hệ vi khuẩn ruột mối..............................................................77
8. Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự (2006), Nghiên cứu phân loại và xác
định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2......................77
9. Nguyễn Văn Tuấn (2009), Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Tuyển
chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của Endo- β-1,4-glucanase, NXB
Đại hõ Thái nguyên.....................................................................................78
10. Vũ Văn Tuyển (1991) Kết quả bước đầu nghiên cứu xử lí mối hại cây
cà phê- tạp chí khoa học và kĩ thuật số 16. 1-33tr.......................................78
22. Bhatta D R. 1994. Isolation and Characterization of the thermophilic
bacteria from the hot spring of Nepal (dissertation). Tribhuvan University,
Nepal............................................................................................................79
23. Richmond P.A., [1991]. Occurrence and functions native cellulose. In:

Haigler, CH, Weimer, JP (Eds.) Biosynthesis and Biodegradation of
cellulose. Dekker, New York, 5-23..............................................................79
24. Bhat M.K. [2000]. Cellulases and related enzymes in biotechnology.
Biotechnol. Adv.,18: 355-383......................................................................79
viii


25. Maki ML, Broere M,Leung KT and Qin W[2011] Characterization of
some efficient cellulase producing bacteria isolated from paper mill sludges
and organic fertilizers.Int J BiochemMol Biol. 2(2): 146–154...................79
26. Muhammad I, Safdar A, Quratulain S, Muhammad N, [2012]. Isolation
and screening of cellulolytic bacteria from soil and optimization of
cellulase production and activity. Turkish Journal of Biochemistry............79
27. Sadhu S, Maiti T. K., [2013] Cellulase production by Bacteria: A
Review. British Microbiology Research Journal 3(3): 235-258..................79

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang

Họ và tên sinh viên : Nguyễn Thị Ân............................................................i
Lớp : 51K2- Hóa Thực Phẩm........................................................................i
MSSV : 1052043910.....................................................................................i
Ngành : Công nghệ thực phẩm......................................................................i
1. Nội dung nghiên cứu thiết kế:..................................................................ii
2. Nhận xét của cán bộ hướng dẫn:..............................................................ii
Tiến hành thí nghiệm..................................................................................53
Vi khuẩn sinh trưởng và phát triển qua 4 giai đoạn:...................................66

- Giai đoạn tiềm phát..................................................................................66
- Giai đoạn logarit (giai đoạn phát triển)....................................................66
- Giai đoạn cân bằng...................................................................................66
- Giai đoạn suy vong...................................................................................66
1. Tuyển chọn những chủng VSV phát triển mạnh và sinh enzyme cellulase
có hoạt tính cao để bảo quản và sử dụng cho những nghiên cứu và ứng
dụng tiếp theo..............................................................................................76
2. Nghiên cứu để thu nhận, tinh sạch và sử dụng enzyme cellulase vào mục
đích ứng dụng vĩ mô trong hầu hết các ngành công nghiệp: công nghệ thực
phẩm, công nghiệp dệt may, ngành công nghiệp đồ uống...........................76
6. Nguyễn Đức lượng và một số tác giả (2004), công nghệ enzyme, NXB
Đại học quốc gia TP.HCM...........................................................................77
7. Nguyễn Thanh Ngọc, Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn và khai thác
các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ liệu
metagenome hệ vi khuẩn ruột mối..............................................................77
8. Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự (2006), Nghiên cứu phân loại và xác
định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2......................77
9. Nguyễn Văn Tuấn (2009), Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Tuyển
chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của Endo- β-1,4-glucanase, NXB
Đại hõ Thái nguyên.....................................................................................78
10. Vũ Văn Tuyển (1991) Kết quả bước đầu nghiên cứu xử lí mối hại cây
cà phê- tạp chí khoa học và kĩ thuật số 16. 1-33tr.......................................78
22. Bhatta D R. 1994. Isolation and Characterization of the thermophilic
bacteria from the hot spring of Nepal (dissertation). Tribhuvan University,
Nepal............................................................................................................79
23. Richmond P.A., [1991]. Occurrence and functions native cellulose. In:
Haigler, CH, Weimer, JP (Eds.) Biosynthesis and Biodegradation of
cellulose. Dekker, New York, 5-23..............................................................79
24. Bhat M.K. [2000]. Cellulases and related enzymes in biotechnology.
Biotechnol. Adv.,18: 355-383......................................................................79

x


25. Maki ML, Broere M,Leung KT and Qin W[2011] Characterization of
some efficient cellulase producing bacteria isolated from paper mill sludges
and organic fertilizers.Int J BiochemMol Biol. 2(2): 146–154...................79
26. Muhammad I, Safdar A, Quratulain S, Muhammad N, [2012]. Isolation
and screening of cellulolytic bacteria from soil and optimization of
cellulase production and activity. Turkish Journal of Biochemistry............79
27. Sadhu S, Maiti T. K., [2013] Cellulase production by Bacteria: A
Review. British Microbiology Research Journal 3(3): 235-258..................79

xi


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Enzyme là loại protein xuc tác quá đỗi quen thuộc cho mọi phản ứng sinh học
trong mọi tế bào của sinh vật. Enzyme đóng vai trò quan trọng đối với cơ thể con
người, nếu không có enzyme thì mọi quá trình chuyển hóa, sinh tổng hợp trong cơ thể
bị đình trệ và con người không thể tồn tại được. Bên cạnh đó, chúng còn đóng vai trò
quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp: Chế biến thực phẩm, trong y học, dược
phẩm, kỹ thuật phân tích, và bảo vệ môi trường....
Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực
phẩm thải ra rất lớn : rơm rạ, bã trấu, bã mía, cám gạo, phế thải ngành công nghiệp
giấy, gỗ...Các phế thải này hầu hết cố thành phần chính là cellulose có thể bị thủy
phân trong môi trường kiềm hoặc hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cenllulose bằng
các phương pháp vật lý và hóa học phức tạp, tốn kém, có thể độc hại và kém an toàn.
Trong khi đó, việc xử lý chất thải bằng khả năng phân giải của các vi sinh vật vừa an
toàn lại rất có tính kinh tế và là nguồn lợi tiềm năng đáng quan tâm.Cellulase là một

trong số các enzyme được úng dụng phổ biến trong các ngành công nghiệp. Đặc biệt
hiện nay cellulase được toàn thế giới quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm ứng
dụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học. Đây là nguồn nhiên liệu thân thiện
với môi trường và có thể giải quyết được vấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiên
liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt.
Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase được sử dụng trong các ngành công
nghiệp ở Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Nước ta
là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme
cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh
vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc
tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất là cellulase từ tự nhiên
không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp
phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống sau
một thời gian sử dụng. Xuất phát từ lý do trên và tình hình nghiên cứu tại Việt nam
cùng những lợi tích to lớn, thiết thực nhất ,tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: " Nghiên

12


cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển và sinh tổng hợp enzyme
cellulase của VSV ttrong ruột mối".
2. Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong đồ án này tôi có các nhiệm vụ:
- Tuyển chọn các chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cellulase cao
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme cellulase
3. Vật liệu, phạm vi và nội dung nghiên cứu
3.1. Vật liệu
- Các vi khuẩn ruột mối được lấy từ mối sẵn cố trong tự nhiên ở các vùng gỗ
mục, nỗi thất và thân cây. Ở đây chúng tôi sử dụng mối sống ở thân cây và gỗ mục.
- Cellulase được sinh ra từ vi khuẩn sống trong ruột mối được nuôi cấy trong

các môi trường nuôi cấy khác nhau.
3.2 Phạm vị nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Hóa học, trường
Đại học Vinh trong thời gian từ tháng 7 tới tháng 12 năm 2014.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Đề tài được tiến hành với các nội dung chính sau:
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn ruột mối có khả năng sinh cellulase trong tập
hợp phạm vi chủng F phân lập được.
-

Tuyển chọn ra chủng có hoạt tính mạnh nhất để tiến hành làm sạch, bảo

quản và sử dụng nghiên cứu.
- Nghiên cứu thời gian nuôi chủng để chúng phát triển và sinh cellulase đạt
hoạt tính cao nhất.
-

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và hoạt tính của

cellulase chủng có hoạt tính cao nhất.

13


4.Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đề tài mang một ý nghĩa thực tiền quan trọng cho những nghiên cứ chuyên sâu
và có tính ứng dụng hơn và là cơ sỏ cho những nghiên cứu tiếp theo về thu nhận sử
dụng cellulase vào đời sống sản xuất, sinh năng lượng hoặc làm sạch môi trường.
Kết quả nghiên cứu có tính mới và là nguồn tham khảo tốt cho việc giải quyết
vấn đề về nguồn năng lượng sinh học an toàn vào sản xuất khi sử dụng nguồn enzyme

này.

14


PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng
có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi
sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi.

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose

Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch
thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với
nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4
glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180 o và có dạng
như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu
tạo như hình 1.1 và hình 1.2.

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose

Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả
năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm
hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ.
Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năng phân
hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase [3]

15

Giá trị của Cellulose giống như một nguồn tài sinh năng lượng được tạo ra từ
thủy phân là đối tượng của NC cường độ cao và mối quan tâm công nghiệp. Nó là một
sản phẩm ban đầu của quang hợp ở môi trường trên cạn, và là nguồn sản xuất vi sinh
vật tái sinh đa dạng nhất trong sinh quyển(100 tỉ tấn khô/1 năm). Khoảng gần 70%
sinh khối của cây được chứa trong đường 5 và 6C(D- xylose, D-arabinose, D-glucose,
D-galaclose, D- mannose).[23,24,25]
Thành phần chính được tìm thấy trong lignocellulosic sinh khô, bao gồm chủ
yếu là Cellulose, ít hơn nữa là hemicelluloses và ít nhất của tất cả ligrin . Chúng có thể
chuyển đổi các Pdime sinh học này thành Glucose phân tử bằng cả ý nghĩa hóa học và
sinh học. Cellulose là thành phần rộng lớn nhất của phần dư thực và hệ sinh thái trên
cạn và do đó đại diện cho một nguồn năng lượng rất lớn cho vi sinh vật, tác nhân chính
chịu trách nhiệm cho phức chất hữu cơ rắn. Các vi sinh vật bao gồm: vi khuẩn, nấm,
và xạ khuẩn có thể thực hiện chuyển đổi sinh học Cellulose. Cellulose, một dạng
polime tinh thể của dư lượng D-glucose đã kết nối với liên kết β − 1 , 4 Glucosidic,
thuộc về nguyên liệu cấu trúc ban đầu của tế bào cây, là nguồn cacbonhdrat phổ biến
nhất trong tự nhiên. Do đó, nó trở thành một quá trình phát triển nguồn lợi kinh tế
đáng kể cho sự xử lý có hiệu quả và sự sử dụng của phế thải từ gỗ giống như một
nguồn cacbon không đắt. Cellulose là một Enzyme sử dụng cho sự chuyển đổi sinh
học của Cellulosic và lignocellulosic dư. Hoạt động của Cellulolytic là một hệ thống
Enzym đa cấu tử và hoàn thành quá trình thủy phân Hdrolysic của hoạt động Enzym
hợp tử của 3 Enzymes hoạt động liên tục trong hệ thống Synergistc và sau đó chuyển
hóa Cellulose một nguồn năng lượng có thế dùng được và do đó Cellulases cung cấp
một vai trò chính trong sự sử dụng sinh khối. Ảnh hưởng hiệu quả chính nhất của hoạt
động Cellulase được quan sát trong nấm nhưng có một sự tăng đáng quan tâm trong sự
sản xuất Cellulase bằng vi khuẩn bởi vi khuẩn phát triển cao giồng như nấm và co tiềm
năng tốt để được sử dụng trong Cellulase. Nghiên cứu cho phát triển nòi giống vi sinh
vật năng suất Cellulase hoạt động cao hơn với nhiều hoạt động hơn và tính ổn định với
nhiệt độ cao, PH và dưới điều kiện không vô trùng có thể tạo nên quá trình có tính tiết

kiệm hơn vi khuẩn và nấm được tìm để sản xuất và tiết ra các Enzyme tự do trong
dung dịch; Tuy nhiên, một số sinh vật . . . Cũng được tìm thấy để sản xuất cá tế bào
giới hạn và Protein-đa cấu tử thể hiện.Các cellulosome lần đầu tiên được phát hiện lần

16


đầu tiên vào năm 1983 từ các thể kị khí, bào tử chịu nhiệt của Clostridium
thermocellum. Quá trình sản xuất của cellulase nhìn chung phụ thuộc vào tham số tăng
trưởng bao gồm quy mô cấy, độ pH, nhiệt độ, sự có mặt của chất gây xúc tác, chất bổ
sung vào môi trường, sự thoát khí, và thời gian và cũng như hoạt dộng của cellulase
xuất hiện sự phụ thuộc vào sự có mặt ion kim loại khác nhau giống như những chất
hoạt hóa hoặc ức chế [26,27]
Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đường
β-glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác
dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-glucananse
hay enzyme C1, Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase
hay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase
1.2. Giới thiệu về enzyme cellulase
1.2.1. Cấu trúc của cellulase
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các
axit amin được nối với nhau bởi lien kết peptid –CO-NH- . Ngoài ra, trong cấu trúc
còn có những phần phụ khác, Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm
endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của
nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát
từ trung tâm xác tác và được gắn them vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết
với cellulose (CBD: cellulose binding domain). Vùng này có vai trò tạo liên kết
với cellulose tinh thể. Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh
giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này
đối với cellulose. Hơn nửa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả

năng kết hợp của CBD với cellulose. Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính
cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme
cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết
với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi
chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme.[2,6]

17


Hình1.3. Enzymecellulase

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl
cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4glucosid trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc [2]
Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Cellulase hoạt động
ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5. Nhiệt độ tối ưu từ 40-50 độ C.
Hoạt tính cellulose bị phá hủy hoàn toàn ở 80 độ C trong 10 đến 15 phút
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose,
cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi các
ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ
Trọng lượng của enzyme cellulose thay đổi từ 30 -110 [12]
1.2.2. Nguồn gốc của enzyme cellulase
• Được thu nhận từ các nguồn khác nhau:
– Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…
– Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì
mạch đen…
– Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…
• Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật.
Các chủng vi sinh vật thường sử dụng:

18

– Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus…
– Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…
– Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…
1.2.3. Cơ chất của enzyme cellulase
Cellulose là cơ chất của enzyme cellulase.Cellulose là một polysaccharide
phong phú nhất trong tự nhiên. Việc phân hủy sinh học cellulose bởi vi sinh vật là một
trong những bước chính của chu trình carbon trên trái đất [7].
1.2.4. Phân loại enzyme cellulase
Về phương diện hóa học, cellulose là một polyme được cấu tạo từ các đơn
vị ß -glucose nối với nhau bằng liên kết ß -1,4-glucoside. Cellulose là thành
phần polysaccharide chủ yếu của vách tế bào thực vật.
Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được
chia thành ba loại:
-

1,4- ß -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

-

1,4- ß -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

-

ß -D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong dạ dày cỏ bò và
mối và trong một số nấm như Trichoderma, Aspergillus,...[9,11]
1.2.5. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Cơ chế 1,4- ß-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)
Enzyme này còn có tên gọi khác như: exoglucanase, exo- ß -1,4glucanase, cellobiohydrolase,

exo

–

cellobiohydrolase,

exo- ß

-1,4-glucan

cellobiohydrolase, 1,4-ß -D-glucan cellobiosidase, cellobiosidase, CBH 1, C1
cellulase, avicelase.
Enzyme này thủy phân liên kết 1,4- ß -D-glucoside từ đầu không khử của
chuỗi cellulose để tạo thành celllobiose.

19


Hì n h 1 . 4 Cơ chế 1,4- ß -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

Enzyme này còn có tên gọi khác như: Endoglucanase, Endo-1,4- ß -Dglucanase, Endo-1,4 glucanase,

ß -1,4-endoglucan hydrolase, Carboxymethyl

cellulase, Celludextrinase, Cellulase A, Cellulosin AP, Alkali Cellulase, Cellulase A3,
9,5 Cellulase, Avicelase, Pancellase SS.
Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4- ß -D-glucoside giữa mạch

của chuỗi cellulose, lichenin và các ß -D-glucan của ngũ cốc.

Hình 1.5 Cơ chế hoạt động của endoglucanase

20


Cơ chế-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)
Enzyme này thủy phân gốc ß -D-glucoside không khử ở đầu tận cùng để
phóng thích ra ß -D-glucose.

Bảng Cơ chế hoạt động ß -glucosidase

Hình 1.6 Quá trình phân giải cellulose của cellulase

21


1.2.6. Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose)
Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulose như
endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Thiếu một trong ba loại enzyme
trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng.[9]
Từ những nghiên cứu riêng lẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác
động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulose, nhiều nhà khoa học đều đưa ra
kết luận chung là các loại enzyme cellulose sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để
tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ
chế tác động của cellulose, trong đó cách giải thích do Erikson đưa ra được nhiều
người công nhận hơn cả.
Theo Erikson và cộng tác viên (1980), cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loại
cellulose như sau: đầu tiên endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề

mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch tự do. Tiếp
đó exoglucanase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành.
Kết quả tác động của endoglucanase và exoglucanase tạo ra các celloligosaccharit
mạch ngắn, cellobiose, glucose. β-glucosidase thủy phân tiếp và tạo thành glucose.
Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulose trong điều kiện tự
nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có
loài phát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy
cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy
cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độm pH, nồng độ cơ chất,
lượng enzyme…, một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệ
enzyme cellulose từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Quá trình thủy phân cellulose
chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ ba loại
enzyme cellulose.
Mỗi loại vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tồng hợp ưu việt một loại enzyme.
Chính vì thế cần phải khai thác enzyme cellulose từ nhiều nguồn vi sinh vật [5,7]

22


1.2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của enzyme cellulase
1.2.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi
sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tồng hợp. Sinh trưởng và sinh tổng hợp
enzyme thường bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một
giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme. Hoạt tính enzyme
đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào
0
khoảng 40 – 50 C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc

0
mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 0 C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng
lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp.
0
Cellulase từ A. niger NRRL – 363 hoạt động mạnh nhất ở 50 C, trong khi đó
0
cellulase từ A. niger Z10 là 40 C, còn hoạt tính xúc tác của endoglucanase III từ
0
Trichoderma reesei đạt tối đa ở 55 C. Theo kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs
(1996), các endoglucanase từ chủng A. oryzae KBN616 hoạt động tốt nhất torng dải
0
nhiệt độ 45 – 55 C.
1.2.7.2. Ảnh hưởng của pH
Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng.
Tủy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có
thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối thích cho
hoạt động của cellulase từ A. niger NRRL – 363 là 5,5; của cellulase từ A. niger Z10
là 4,5 và 7,5; của endoglucanase III từ Trichoderma reesei là 4,0 – 5,0; của
endoglucanase từ A. oryzae KBN616 là 4,0 – 5,0. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của
pH lên hoạt tínhendoglucanase từ chủng nấm ưa acid A. terreus M11, Gao và cộng
sự (2008) cho rằng enzyme này có khả năng hoạt động trong dải pH 2 – 5, trong đó
pH 2 là tốt nhất.[2,4].

23


1.2.7.3. Ảnh hưởng của ion kim loại
Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme.
Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm
không thuận nghịch enzyme. Sharma và cs (1995) nhận thấy, ion Ca

2+

làm tăng hoạt

tính của enzyme cellulase của Baccillus sp. D04 lên 40% so với đối chứng, còn Mg

2+

làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92%) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính của enzyme
này (hoạt tính còn lại bằng 37% so với đối chứng). Theo nghiên cứu của Gao và
cộng sự (2008), endoglucanase từ A. terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với
2+

Hg

(2mM), 59% khi ủ với Cu

2+

(2mM).

Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rữa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến
hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của
enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau.
Nghiên cứu trên chủng Penicillium sp. DTQ – HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ
methnol, ethanol, isopropanol và aceton đều ức chế hoạt động của cellulase đặc biệt là
n – butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn
33 – 63%. Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X – 100 đều làm
giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính

cellulase chỉ còn 18 – 34%.[3]
1.2.7.4.Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng phụ
thuộc vào [E], v= K[E] có dạng y=ax. Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốc
phản ứng do enzyme đó xúc tác.
Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa thì
vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó.[1]
1.2.7..5. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S]
Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chỉ một cơ chất

24


k1

k2

E +S

ES

E + P (1)

k-1
Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.
Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và S
Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).
v1 = k1[E][S]
v-1 = k-1[ES]
v2 = k2[ES]

khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:
k-1[ES]+k2[E][S]
(k-1+k2)[ES] = k+1[E][S]

(2)

Gọi E0 là nồng độ ban đầu:
[E0]=[E]+[ES] ⇒ [E]=[E0]-[ES]

(3)

Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có:
⇒ [ES]=

(k-1+k2)[ES]=k1([E0]-[ES])[S]

k1[Eo][S]
k1 + k 2 + k1[ S ]

Nếu đặt Km= k − 1 + k 2
k

(Km gọi là hằng số Michalis Menten)
Ta có: [ES]=

[ Eo][ S ]
Km + [ S ]

Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là:

25

V= k2[ES]