Nghiên cứu thành phần hóa học phần dưới mặt đất của một loài Mạch môn (Ophiopogon sp.) thu hái ở Duy Tiên, Hà Nam

T
Ờ

PH M NG C KHANH
Mã số Sinh viên: 1606008

Ầ

NGHIÊN C
Ầ

ỚI MẶ

ẤT CỦA

M T LOÀI M CH MÔN
(Ophiopogon sp.),
THU HÁI Ở DUY TIÊN, HÀ NAM

-2019


T
Ờ

PH M NG C KHANH
Mã sinh viên: 1606008

Ầ

NGHIÊN C

Ầ

ỚI MẶ

ẤT CỦA

M T LOÀI M CH MÔN
(Ophiopogon sp.),
THU HÁI Ở DUY TIÊN, HÀ NAM

ấ
:
1.
2. Vi n Hóa học các h p chất thiên
nhiên, Vi n Hàn lâm Khoa học và
Công ngh Vi t Nam

-2019


LỜI CẢM Ơ
Để hoàn thành được khoa luận tốt nghiệp dược sĩ này tôi đã nhận được rất nhiều
sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia, các đồng nghiệp và gia đình.
Trước hết tôi xin hết lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Hoàng Tuấn, là
người đã hướng dẫn chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận
tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà
Nội và PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường cùng các đồng nghiệp Phòng Hoạt chất sinh
học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã
dành cho tôi những điều kiện hóa chất thiết bị cũng như về hướng dẫn, góp ý chuyên

môn, tạo điều kiện thời gian, động viên tinh thần để tôi thực hiện công việc nghiên cứu
khóa luận này.
Xin biết ơn sâu sắc tới gia đình cùng bạn bè đã động viên và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi thời gian học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.

Sinh viên

Phạm Ngọc Khanh


MỤC LỤC
Trang
MỤ
MỤ

Ả

MỤ
Ặ

Ấ

1

Ơ

2
ọM

1.1.

1.1.1

2

ị tr phân loại

2

1.1.2 Đ c điểm thực vật họ M ng tây
1.2.

2
2

Ophiopogon
1.2.1. Mô tả các loài thuộc chi Ophiopogon

3

1.2.2 Các nghiên cứu về thành phần h a học chi Ophiopogon

6

Ơ

Ơ

11
Ơ

(NGUYÊN LI U, THI T B , N
NGHIÊN C U)
2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu

11

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

11

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

11

2.1.2.1

a chất, dung môi

11

2.1.2.2 D ng c , thiết ị, máy m c

12

2.2 Nội dung nghiên cứu

12

2.3. Phương pháp nghiên cứu

13

2.4. Cách thực hiện

13

Ơ
3.1. Định t nh

M

Ả VÀ

ng phản ứng h a học

21
21

3.2. ác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu

22

3.3. Phân t ch tinh dầu

22

ng phương pháp sắc k kh kết hợp khối ph

3.4. Định tính các thành phần trong tinh dầu b ng phương pháp SKLM

28


3.5. Nghiên cứu thành phần hóa học của các dịch chiết thực vật

29

3.5.1.

Kết quả phân lập các chất từ c n dịch chiết dichlormethan

29

3.5.2.

Kết quả xác định cấu trúc hợp chất Os.02 từ c n dịch chiết

32

dichlormethan
3.6. àn luận

33

Ơ

N NGH
M

Ụ Ụ

Ả

35


MỤ

CC

Column chromatography – Sắc ký cột thường

DCM

Dichlormethane
V

Dược điển iệt Nam V

DD

Dung dịch

d

doublet – vạch đôi hay vạch bội

EtOAc

Ethyl acetate

GC-MS

as chromatography – mass spectrometry sắc k kh kết hợp khối
ph

glc
HS(%)

Đường glucose
Hiệu suất so với mẫu khô

J (Hz)

H ng số tương tác t nh

KT

K ch thước

m

multiplet – vạch đa

NMR

Nuclear magnetic resonance - Ph cộng hưởng từ hạt nhân

q

quartet – vạch bốn hay vạch lưỡng bội

rha

đường rhamnose

RUS

ruscogenin

s

singulet – vạch đơn

SKLM

Sắc k lớp m ng

TLC

Thin layer chromatography

TT

Thuốc th

UV

Ultra violet

xyl

Đường xylose

ng Hz


MỤ

ẢNG

Trang
ảng 1.1.

Phân ố và ứng d ng các loài thuộc chi Ophiopogon

4

ảng 1.2.

Cấu trúc một số spirostanol saponin phân tách từ O. japonicus

7

Bảng 1.3

Cấu trúc một số furostanol saponin

8

Bảng 1.4

Cấu trúc hóa học của một số homoisoflavonoid có liên kết

9

C2-C3 no
Bảng 1.5

Cấu trúc hóa học của một số homoisoflavonoid có liên kết

9

C2-C3 chưa no
Bảng 3.1

Kết quả định tính các nhóm chất trong phần dưới m t đất cây

21

Mạch môn Ophiopogon sp. b ng phản ứng hóa học
ảng 3.2.

Kết quả định lượng tinh dầu trong phần dưới m t đất loài

22

Mạch môn – Ophiopogon sp.
ảng 3.3.

Thành phần cấu t trong tinh dầu phần dưới m t đất loài

22

Mạch môn -Ophiopogon sp. (trình bày theo thời gian lưu –
RT (phút))
ảng 3.4.

Thành phần cấu t trong tinh dầu tinh dầu phần dưới m t đất

24

loài Mạch môn - Ophiopogon sp. (trình bày theo công thức
cấu tạo)
ảng 3.5.

Các thông số ph NMR hợp chất Os.02

31

ảng 3.6.

So sánh với thành phần tinh dầu phần dưới m t đất loài

33

Ophiopogon sp. thu hái tại Việt Nam với loài Ophiopogon
japonicus của Trung quốc

DA

MỤ

Ả

Trang
Hình 2.1: Loài Mạch môn - Ophiopogon sp.

11

Hình 3.1. Cấu trúc của các hợp chất thành phần tinh dầu Mạch môn

27

Ophiopogon sp.
Hình 3.2: Ảnh sắc k đồ tinh dầu phần dưới m t đất loài Mạch môn –

28

Ophiopogon sp.
Sơ đồ 1: Sơ đồ phân đoạn dịch chiết ethanol t ng và phân lập hợp

29

chất Os.02 từ phân đoạn dichloromethan.
Hình 3.3. Ph

1

H-NMR của hợp chất Os.02

Hình 3.4. Cấu trúc của hợp chất Os.02

30
32


Ặ

Ấ

Ophiopogon Ker-Gawl. – chi Mạch môn đông hay Địa long là một chi thuộc họ
M ng tây Aspragaceae), bộ M ng tây. Chi có khoảng 30 loài cây thân thảo, phân bố
từ khu vực ôn đới ấm tới nhiệt đới thuộc miền đông, đông nam và nam châu Á, ở các
nước như Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản [1]. Nền y học c truyền nhiều nước trong đ
có Việt Nam đã s d ng nhiều loại Ophiopogon để làm thuốc chữa bệnh như trị ho,
bệnh đường hô hấp, đường tiêu hóa, háo khát, dùng ngoài trị nấm [2, 3]. Thành phần
hóa học của loài Ophiopogon có chứa các đường, saponin steroid, homoisoflavonoid,
polysaccharid, acid phenolic và các sesquiterpen [4]. Trong nghiên cứu y học hiện đại,
các hợp chất này đã được phát hiện có nhiều tác d ng dược l qu như tác d ng bảo vệ
tim mạch, chống viêm, chống ung thư, chống oxy hóa, t ng cường miễn dịch và chữa
ho [4]. Trong quá trình đi khảo sát vùng Duy Tiên,

à Nam, chúng tôi đã phát hiện

một loài thực vật mọc hoang và được trồng trong vườn nhà mà phần dưới m t đất của
cây được nhân dân trong vùng s d ng để chữa ho, làm thuốc thanh nhiệt, giải khát,
thông tiểu, trị khó tiêu và dùng ngoài trị ngứa, trị lở loét ở người lớn, trị rôm sảy ở trẻ
em. Qua khảo sát an đầu, loài cây được xác định thuộc chi Ophiopogon.

ì chưa thu

hái được hoa nên chưa xác định được chính xác tên khoa học của loài. Hiện nay, các
nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Ophiopogon ở Việt Nam còn
khá hạn chế. Việc nghiên cứu phát hiện các hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính tương
ứng với ứng d ng chữa bệnh trong dân gian của loài thực vật nói chung, loài
Ophiopogon nói riêng là rất thú vị và vô cùng cần thiết, do vậy kh a luận tốt nghiệp
này lựa chọn đề tài: “

ầ

ọ

phầ d ới mặ đất c a

m t loài thu c chi Mạch Môn (Ophiopogon sp.), thu hái ở Duy Tiên, Hà Nam”
với các m c tiêu nghiên cứu như sau:
1. Định t nh sơ ộ các nh m chất hữu cơ c trong phần dưới m t đất của mẫu nghiên
cứu.
2.

ác định hàm lượng tinh dầu và thành phần cấu t tinh dầu trong phần dưới m t

đất.
3. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 1 hợp chất từ phần dưới m t
đất của mẫu nghiên cứu.

1

Ơ
ọM

1.1

)

ọ M ng tây (Asparagaceae), là một họ thảo mộc sống lâu n m với thân rễ
ngang hay tạo thành củ, ao gồm khoảng 53 chi và hơn 13
vùng nhiệt đới châu Phi, châu M , chủ yếu là ở Nam

loài, phân ố khắp các

và Đông Nam

[1].

Theo thực vật ch Việt Nam và hệ thống phân loại của Takhtajan [1], vị tr của họ
M ng tây Asparagaceae trong giới thực vật như sau:
ớ (Kingdom)

(Planta)
ọ

(Division)

(Magnoliophyta)

ớ (Class)

(Liliopsida)

ớ (Subclass)

(Liliadae)
M

(Order)
ọ (Family)
Mă

(Asparagales)
M

(Asparagaceae)

y

Họ M ng tây hay họ Thiên môn đông (danh pháp khoa học: Asparagaceae) là
một họ trong thực vật có hoa. Một số nhà phân loại học hay xếp các loài trong họ này
vào trong họ Loa kèn (Liliaceae).
Hệ thống APG II n m 2

3 cũng công nhận họ này và đ t nó trong bộ M ng

tây (Asparagales), thuộc nhánh một lá mầm (monocots . AP II cũng c 2 tùy chọn để
định nghĩa họ này:
-

Asparagaceae sensu lato nghĩa rộng), bao gồm tất cả các loài thực vật
trong khoảng 153 chi và 2.480 loài.

-

Asparagaceae sensu stricto nghĩa hẹp), bao gồm chỉ 2 chi (là Asparagus và
chi Hemiphylacus), với t ng số khoảng 165-295 loài.

Hệ thống APG III, có sự phân tách ra của nhiều họ khác như Agavaceae,
Aphyllanthaceae, Hesperocallidaceae, … [5].

1.2.

2


Chi Mạch môn đông hay chi Duyên giai thảo, Địa Long danh pháp khoa học
Ophiopogon, là một chi chứa khoảng 65-72 loài cây thân thảo sống lâu n m, thuộc họ
M ng tây Asparagaceae , trước đây được phân loại trong họ Loa kèn (Liliaceae) [2].
Các loài trong chi này có nguồn gốc từ khu vực ôn đới ấm tới nhiệt đới thuộc miền
đông, đông nam và nam châu Á. Tên gọi khoa học của chi này có nguồn gốc từ tiếng
Hy Lạp ophis, "rắn" và pogon, "râu", hay Địa Long là để chỉ tới lá của chúng giống
hình rắn [2].
1.2.1. Mô tả các loài thuộc chi Ophiopogon
Thực vật chí Việt Nam mô tả các loài thuộc chi Mạch môn đông - Ophiopogon
Ker-Gawl. là loại c nhiều n m; c thân rễ hơi dài, hóa gỗ, mọc bò, phân nhánh nhiều,
chóp rễ phình lên thành củ nạc ho c thô. Thân trên m t đất ngắn ho c kéo dài, bò ho c
đứng thẳng. Lá tập trung ở đỉnh thân ho c thành từng bó cách nhau; phiến lá hình dải
rộng ho c hẹp, hình mũi giáo ho c mác thuôn, có cuống ho c không cuống, ph a dưới
dạng bẹ, m ng, ôm lấy thân. C m hoa chùm, mọc ở nách lá ho c trong túm lá ở đỉnh

thân, hoa ít ho c nhiều xếp trên tr c hoa, 1-4 hoa trong mỗi lá bắc; lá mảnh, dính nhau
ở gốc, phía trên rời nhau, xếp 2 vòng, không b ng nhau, khi nở trái ra. Nhị 6, đ nh ở
gốc mảnh bao hoa; chỉ nhị nhắn hơn ao phấn, rời, dẹp, dày; bao phấn hình thuôn,
đ nh gốc 2 ô, hướng trong, mở b ng khe dọc. Bầu trung, 3 ô, mỗi ô 2 noãn, đảo; vòi
nh y hình tr ho c hình n n; đầu nh y 3 thùy, ngắn. Quả mọng, nứt trước khi quả chín
để lộ hạt ra ngoài. Hạt 1-2, hình cầu ho c thuôn, v hạt màu tím lam, nạc; nội nhũ
sừng, phôi hình tr tròn Mùa hoa quả thường từ tháng 7 – 10 [1].
Ở Việt Nam, các loài Ophiopogon sp. là cây ưa ẩm và ưa

ng, thường mọc

dưới tán rừng k n thường xanh trên núi đá vôi hay granit; độ cao đến 1300 m. Cây
thường mọc riêng lẻ ho c tạo thành khóm trên đất ẩm, nhiều mùn, hốc đá, ven suối,
trong rừng thường xanh. Cây ra hoa hàng n m. Cây phát tán và phát triển nhờ hạt [1].
Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ, chi Ophiopogon được xếp vào họ Địa long Hemodoraceae gồm 4 chi gồm Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes và Neolourya [3].
Theo tác giả Đỗ Huy Bích & cs., chi Ophiopogon Ker.- Gawl. có khoảng 30 loài trên
thế giới, 13 – 15 loài ở Việt Nam, được gọi là chi Mạch môn ho c Địa long, hầu hết là
cây mọc tự nhiên ở vùng rừng ẩm [2]. Thực vật ch
định loại các loài thuộc chi Ophiopogon ở

3

iệt Nam cũng đã trình ày kh a

iệt Nam dựa theo các đ c điểm thực vật


của mỗi loài [1]. Trong
truyền c t nh dưỡng âm,
số loài Ophiopogon ph

ả
TT
1

2

3

4
5

6

học c truyền, Mạch môn được phân vào nh m thuốc c
phế, giải nhiệt, sinh tân [2]. Phân ố và ứng d ng của một
iến và quan trọng nhất được liệt kê trong ảng 1.1.

.1
ọ

Tên tiếng
ố
Ophiopogon
Mạch môn cảnh Lai Châu
ình Lư , Đà
intermedius
D. (kiểng),
Ngô Nẵng
à Nà , Lâm Đồng
Don.

công tam thất
Đà Lạt . Cây mọc tự nhiên
Xà thảo vừa [1] trong rừng cây lá rộng
thường xanh. Ph iến trồng
làm cảnh [2].
Mùa hoa tháng 5-8, mùa
quả tháng 8-10 [1]
Ophiopogon
Cao cẳng lá nh Lào Cai, hà Giang, Lai
chingii F.T.
[1]
Châu. Cây mọc tự nhiên ở
Wang et T. Tang
vùng núi, trong rừng cây lá
rộng thường xanh ở độ cao
1000 – 1600m.
Mùa hoa: tháng 1-8, mùa
quả: 6-12 [1]
Ophiopogon
Mạch môn núi, Hòa Bình, Tuyên Quang,
bockianus Diels
Mạch
môn các tỉnh miền núi phía Bắc;
(O.
backianus rừng, Su cua Lào cai. Cây mọc tự nhiên ở
Diels)
đông, Pác pất vùng núi dưới rừng cây lá
(Tày), Địa long rộng thường xanh; trên đất
Bắc cạn [1]
mùn vùng đá vôi.

Ophiopogon
Mạch môn núi Cây mọc tự nhiên ở vùng
mairei Levl.
lá dài [1]
núi phía Bắc nước ta.
Ophiopogon
Mạch
môn Cây thường được trồng ở
japonicus (L.f.) đông, Lan tiên, vùng nông thôn các tỉnh
Ker-Gawl.
Tóc tiên, Xà đồng ng.
(Convallaria
thảo
nhật, Mùa hoa 6-7, mùa quả: 10japonica L.f.)
Duyên
giới 12 [1]
thảo, Địa long
lá dài, Phiéc
kép phạ Tày ,
Mạch môn [1]
Ophiopogon
ẹ rừng, Cao
ải Ph ng, oà ình, Thừa
stenophyllus
cẳng lá to [1]
Thiên uế. Cây mọc tự
(Merr.) Rodr.
nhiên dưới rừng tre nứa,
(Peliosanthes
trảng cây i, khe đá, trong

stenophyllus
rừng cây lá rộng thường

4

d
ph i, chữa ho,
viêm phế quản, ho
khan, miệng khô,
nhuận tràng rễ củ
[2].

Chữa hen, m n
nhọt (cả cây) [2].
Làm thuốc, dùng
cây tươi đắp ngoài
chữa nhọt độc
mưng mủ [1]
Trúng gió, tay chân
tê bại (rễ) [2].

Dùng như Mạch
môn
iêm phế quản, sốt
n ng, thiếu sữa, ho,
tiêu đờm, táo
n
Rễ sắc uống .
Thuốc
, trị mất

sức, tắc sữa, táo
n, trị ho, chống
ung thư [1]
Chữa ho Rễ sắc
uống . ôi miệng
(Lá).


7

Merr.)
Ophiopogon
tonkinensis Rodr

xanh.
Xà bì bắc bộ Lào Cai, à iang, Lạng
[1], [3]
Sơn, Quảng Ninh, Thái
Nguyên. Cây mọc tự nhiên
nơi đất ẩm, râm mát, trong
rừng cây lá rộng thường
xanh.
Mùa hoa quả: VII-III
Tóc tiên dại,
Lạng Sơn, ải Ph ng Cát
Cao cẳng lá Bà), Ninh Bình, Kon Tum,
mác [1]
ia Lai, Lâm Đồng. Cây
mọc tự nhiên trong rừng cây
lá rậm thường xanh, rừng

tre nứa, trảng cây i, hốc
đá.
Mùa hoa: tháng 5-6, mùa
quả: 7-12.
Sú cua đồng,
Cây mọc tự nhiên trong
Cao cẳng to [1] rừng thưa ở Sơn La.
Mùa hoa quả: 6-8

8

Ophiopogon
dracaenoides
Hook.f

9

Ophiopogon
platyphyllus
Merr.
(Liriope
platyphylla Wang
et Tang)
Ophiopogon
Phắc kép đông
wallichianus
Hook. f.
Ophiopogon
Cao cẳng lá
latifolius Rodr.

rộng, Địa long
lá rộng, Xà thảo
lá rộng [1]
Ophiopogon
Địa long bò,
reptans Hook. f.
Cao cẳng bò [1]

10

11

12

13

Ophiopogon
longifolius Dcne.

Quảng ình, Quảng Trị,
Thừa Thiên uế. Cây mọc
tự nhiên
Tuyên Quang (Na Hang),
Lạng Sơn, à Tây Ba Vì),
ĩnh Phúc, Nghệ An
(Vinh), Đà lạt
Vùng núi: Ba vì, Bà Nà,
Chứa chan
ùng núi a ình, Sơn
La, Ninh Bình, Thanh Hóa,

đ c biệt là các tỉnh giáp
vùng biên giới phía Bắc.
Mùa hoa: tháng 5-8, mùa
quả: 9-12 [1]

Địa long lá dài, Cao B ng Trà Lĩnh ,
Xà thảo lá dài Quảng Ninh (Bãi Cháy),
[1]
Hải Phòng (Cát Bà), Hải
Dương, Ninh Bình, Huế,
miền Trung và Nam Việt

5

ph i, chữa ho
cả cây .

Sốt, phong thấp,
đau
ng kinh,
gãy xương cả cây .

Co giật, trúng gió
cả cây [1].

Chữa ngộ độc thức
n, khản tiếng
Thân rễ .
chưa rõ

Giảm đau, tán ứ,
tiêu sưng, chữa
chân tay nhức m i,
tê thấp, bán thân bất
toại, mệt m i, vết
thương ầm tím,
thân rễ làm thuốc
chữa ho thay mạch
môn [1]
chưa rõ


Nam [1]
Ophiopogon
Bì Xà Regnier Lào Cai, Yên bái, Cao
regnieri Bois.
[1], [3]
B ng, Nam bộ, các tỉnh
miền Nam. Mùa hoa tháng
5-7, mùa quả 8-12 [1]
Ophiopgogon
à ì đứng [1], Sa pa, miền núi phía Bắc.
caulescens (Bl.) [3]
Mùa hoa tháng 3-6, mùa
Back.
quả tháng 7-12 [1]

14

15

chưa rõ

chưa rõ

Ngoài ra, một số loài Địa Long Ophiopogon mới tìm thấy tại án đảo Đông
Dương ao gồm các nước Việt Nam, Lào và Campuchia đã xác nhận phát hiện và b
sung thêm như O. alatus Aver. & N.Tanaka, O. erectus Aver. & N.Tanaka, O.
fruticulosus Aver., N.Tanaka & K.S.Nguyen, O. griffithii (Baker) Hook.f, O. ogisui
M.N.Tamura & J.M.Xu, O. patulus Aver. & N.Tanaka, O. petraeus Aver. &
N.Tanaka, O. rupestris Aver. & N.Tanaka, O. tristylatus Aver., N.Tanaka & Luu [6].

1.2.2. Các nghiên cứu v t

Ophiopogon

Trong chi mạch môn có 30 loài cây thân thảo, thì Ophiopogon japonicus (L.f.)
Ker-Gawl. (Mạch môn đông) là loài thực vật được nghiên cứu nhiều nhất. Thành phần
hóa học của loài Ophiopogon sp. gồm có saponin steroid, homoisoflavonoid,
polysaccharid, acid phenolic và sesquiterpen (tinh dầu) [4].
a. Saponin steroid
Saponin steroid có cấu tạo từ đường và sapogenin. Có khoảng 75 saponin
steroid đã được phân lập từ loài O. japonicus Ker-Gawl. với rất nhiều tác d ng sinh
học như tác d ng bảo vệ tim mạch [7], chống ung thư [8], kháng viêm, chống oxy hóa,
t ng cường miễn dịch, chữa ho [4], chữa tiểu đường [9], kháng virus và kháng nấm
[10].
Dựa trên cấu trúc của aglycon mà saponin steroid được phân thành spirostanol
saponin và furostanol saponin. Spirostanol saponin chứa hệ vòng 6 ABCDEF lại được
phân thành saponin kiểu ruscogenin (RUS) ho c spirostanol saponin kiểu thường theo
cấu trúc của vòng F ví d như 25 S – ho c 25(R) – ruscogenin, ophiopogonin A-E, P,

Q, O, R, diosgenin, ophiopogonin

’-D’ (Bảng 1.2) [4]. Furostanol saponin chứa hệ

vòng 5 carbon ABCDE như ophiofurospiside A – B (Bảng 1.3) [4].

6


Bảng 1.2. Cấu trúc một số spirostanol saponin phân tách từ O. japonicus
TT

Tên chất

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7

25-C

khung spirostanol saponin (kiểu ruscogenin)
1
2
3

25(S)-ruscogenin
25(R)-ruscogenin
Ophiopogonin A

4

Ophiopogonin B

5

Ophiopogonin C

6

Ophiopogonin D

7
8

Ophiopogonin E
Ophiopogonin P

OH
OH
O-[Acrha(12)]fuc

O-rha(12)fuc
O-[rha(12)]xyl(13)fuc
O-rha(12)xyl(13) fuc
H
H

9

Ophiopogonin Q

H

10

Ophiopogonin O

H

11
12
13

Ophiopogonin R
Diosgenin
Ophiopogonin ’

H
H
H

14

Ophiopogonin C’

H

15

Ophiopogonin D’

H

TT Tên chất

H
H
H

H
H
H

H
H
H

H
H
H

H
H
H

H
H
H

S
R
R

H

H

H

H

H

H

R

Ac

H

H

H

H

H

R

H

H

H

H

H

H

R

xyl(1-4)glc
[Ac-rha(12)]xyl (14)glc
rha(1-2)[Acxyl (1-4)]glc
rha(1-2)
xyl(1-4) glc
rha(1-2) glc

H
[Ac-rha(12)] xyl(13)glc
rha(1-2) glc

H
H

H
H

OH
H

H
H

H
H

R
-

H

H

H

H

H

-

H

OH

OH

H

glc

R

OH
H
H

OH
H
H

OH
H
H

H
H

H

H
H
H

R
-

H

H

H

H

H

-

H

H

H

H

H

-

rha(12)xyl(1-3)

R1

R2

khung spirostanol saponin (kiểu thường)
16

Ophiofurospiside A

rha(1-2)xyl(1-4)glc glc

7

H


17 Ophiofurospiside B

man(1-2)ara(1-4)

glc

H

Bảng 1.3: Cấu trúc một số furostanol saponin

TT

Tên chất

R1

R2

R3

R4

R5

R6

khung furostanol saponin
18

Ophiopojaponin B

H

19

Ophiopogonin J

H

20

Ophiopogonin L

H

21

Ophiopogonin N

H

22

Ophiopogonin K

H

23

Ophiopogonin M

H

24

Ophiopogonin F

H

25

Ophiopogonin G

H

26

Ophiopogonin H

H

rha(1-2)glc
rha(1-2)xyl(14)glc
rha(1-2)xyl(14) glc
rha(1-2)xyl(14)glc
rha(1-2)glc
xyl(1-4)rha(12)glc
xyl(1-4)rha(12)glc
xyl(1-4)rha(12)glc
rha(1-2)glc

H

OH

H

glc

H

OH

H

glc (1-2)glc

OH

OH

H

glc

H

OH

H

glc (1-6)glc

H

OH

OH

glc (1-2)glc

OH

OH

OH

glc

H

H

H

glc (1-2)glc

H

H

H

glc (1-6)glc

H

H

H

glc (1-2)glc

b. Homoisoflavonoid
Homoisoflavonoid (3-benzylidenechroman-4-on) là một dạng flavonoid đ c
biệt có thêm một nguyên t

C giữa vòng C, hay tìm thấy trong các họ Hành t i

(Liliaceae) và họ Đậu (Fabaceae). Các homoisoflavonoid thường được chia thành 2
nhóm dựa trên độ bão hòa của liên kết giữa C2 – C3: nhóm no (liên kết đơn C2-C3) và
nh m chưa no liên kết đôi C2=C3 . Homoflavonoid có chứa liên kết C2-C3 no điển
hình

là

ophiopogonanon

A,

E,

C,

H,

8-formyl

ophiopogonanon

B,

methylophiopogonanon A,… (Bảng 1.4) [4]. Còn các homoisoflavonoid thuộc nhóm
có liên kết C2-C3 chưa no c thể kể đến như ophiopogon A-D, methylophiopogon A,
isoophiopogon A,… (bảng 1.5) [4].

c. Polysaccharid

8


Mạch môn đông - Ophiopogon japonicus Ker-Gawl. rất giàu các polysaccharid.
Đến n m 2 18, c khoảng 11 polysaccharid từ phân đoạn nước của Mạch môn đã
được phân lập, định danh xác định cấu trúc và đánh giá nhiều tác d ng sinh học như
chống thiếu máu cơ tim [11], hạ đường huyết [12], chống oxy hóa [13], giảm hấp thu
lipid [14], t ng cường miễn dịch [15].

Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của một số homoisoflavonoid có liên kết C2-C3 no
TT

Tên chất

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7

R8

R9

R10

khung homoisoflavonoid có liên kết C2-C3 no
27
28
29
30
31

Ophiopogonanon A
Ophiopogonanon E
Ophiopogonanon C
Ophiopogonanon H
8-formyl
ophiopogonanon B
Methylophiopogona
non A

OH
OH

OH
OH
OH

Me
Me
Me
Me
Me

OH
OH
OH
OH
OH

H
OMe
CHO
Me
CHO

H
OH
H
H
H

-O-CH2-OH
OMe

-O-CH2-O-O-CH2-OH
OMe

H
H
H
H
H

H
H
H
H
H

H
H
H
OH
H

OH

Me

OH

Me

H

-O-CH2-O-

H

H

H

Bảng 1.5. Cấu trúc của một số homoisoflavonoid có liên kết C2-C3 chưa no
TT Tên chất

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7

khung homoisoflavonoid có liên kết C2-C3 chưa no
32
33
34

35
36
37
38

Methylophiopogonone B
Ophiopogone A
Ophiopogone B
Ophiopogone C
Ophiopogone D
Methylophiopogone A
Isoophiopogone A

OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH

Me
Me
Me
OH
Me
Me
H

OH

OH
OH
OH
OH
OH
OH

9

Me
H
H
Me
H
Me
Me

H
H
H
CHO
OH
H
H

H
OMe
-OCH2-O
H
OMe

-OCH2-O
H
OH
-O-CH2-O-O-CH2-O-


d. Tinh d u:
Không có nhiều công bố về thành phần tinh dầu của các loài Ophiopogon. T nh đến
thời điểm viết bài, mới chỉ 2 công bố của các nhà khoa học Trung Quốc cho thấy, có
khoảng 50 chất và 48 chất là thành phần tinh dầu của rễ củ và thân rễ của loài
Ophiopogon japonicus. Các hợp chất dễ ay hơi như -elemene (9,61 %/ 11,48%),
longifolene (7,84% / 8,65%) và viridiflorol (1,88% / 0,02%) chiếm hàm lượng cao
nhất trong các tinh dầu nghiên cứu rễ củ và thân rễ của loài Ophiopogon japonicus. Có
khoảng 25 chất như sa inene, camphor và guaiol là c m t cả trong 2 loại tinh dầu
[16], [17], [18].

e. Các chất khác
Các chất khác được tìm thấy từ loài Mạch môn đông - Ophiopogon japonicus KerGawl. gồm có 13 acid hữu cơ: acid salicylic, p – hydroxybenzoic, acid vanillic, phydroxybenzaldehyd, acid trans-p-coumaric, acid oleanolic, acid azelaic, acid ntricosanoic, acid tianshic, acid L-pyroglutamic, acid 9,12-octadecadienoic, acid
hexadecanoic và acid 6-octadecenoic; 4 glycosid gồm ophiopogonosid A, L-borneol-βD-glucopyranosid,

3,4-dihydroxy-allylbenzene-4-O-α-L-rhamnopyranosy(1-6)-β-D-

glucopyranosid và ophiopojaponin D; 2 cyclodipetid là cyclo-(Phe-Tyr) và cyclo(Leu-Ile); và N-(2-(4- hydroxyphenyl)ethyl)-4-hydroxy-cinnamid, α-humulen, βsitosterol, stigmasterol, β-sitosterol-β- D-glucosid, chrysophenol và emodin [4].

10


Ơ

Ơ

2.1. ố

ng

2.1.1.

ợ

thiết bị
ứ

Đối tượng nghiên cứu là phần dưới m t đất thân rễ của mẫu thực vật được thu
hái tại Duy Tiên, Hà Nam, ngày 19/1/2019. Qua mô tả, và so sánh với thực vật chí
Việt Nam [1], đã giám định loại thực vật nghiên cứu thuộc chi Ophiopogon. Tuy
nhiên, cho tới tháng 7 – 8 cây mới ra hoa do vậy hiện nay, chúng tôi chưa xác định
được tên khoa học chính xác của loài thực vật này. Tiêu ản thực vật gồm thân, cuống
lá, và phiến lá, được lưu giữ tại

iện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (C-643), sau

khi thu được hoa mới được nộp vào phòng tiêu bản và được cung cấp phiếu tiếp nhận
tiêu ản chính thức.

Hình 2.1: Loài Mạch môn - Ophiopogon sp.
2.1.2 Thiết b

ứ

2

- Định t nh
- Sắc k

ng phản ứng h a học: Nước cất, ethanol 90%, các thuốc th định tính

lớp m ng: methanol, aceton, toluen, acid acetic, n-hexan, bản m ng

silicagel...

11


- Sắc ký cột Silica gel F254 cỡ hạt 60-200 μm (Merck), Sephadex LH-20, sắc ký cột
pha đảo (RP-18). Tất cả các h a chất, dung môi đạt tiêu chuẩn DĐ N V.
ế

y

c

- D ng c :
D ng c

ng thủy tinh: cốc c m , phễu, ình gạn 25 ml, pipet các loại, ống

nghiệm to nh , đũa thủy tinh, ình n n ...
ộ d ng c định lượng tinh dầu theo Dược điển iệt Nam V
- Máy m c thiết ị:
Tủ sấy, ếp hồng ngoại, ếp ảo ôn, đ n cồn
+ Cân k thuật Precisa, cân phân t ch Satorius độ chính xác 0,001 g

+ Máy sắc k kh kết hợp khối ph GC-MS (Agilent Technologies)
+ ệ thống sắc k

ản m ng án tự động (HPTLC CAMAG LIMONAT 5)

K nh hiển vi điện t Leica DMLS và Olympus
Máy xác định hàm ẩm theo phương pháp sấy (OHAUS MB25)
d
Các nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:
2.2.1.

ộ

ấ

: Dùng các phản ứng

định tính với các thuốc th đ c hiệu để nhận biết sự có m t của các nhóm chất trong
dịch chiết mẫu thực vật như alcaloid, flavonoid, saponin, coumarin, polysaccharid…
2.2.2.

ợ

dùng phương pháp cất kéo hơi nước để thu được

tinh dầu. Thực hiện 3 lần để thu được giá trị trung bình.
2.2.3.

ấ

u

phương pháp sắc k kh kết hợp khối ph

ợc li u: Dùng

C-MS để xác định thành phần các cấu

trong tinh dầu mẫu thân rễ dược liệu. S d ng các thư viện ph như NIST 17 và Wiley
Database để định danh thành phần tinh dầu.
dùng sắc k lớp m ng để định tính các

2.2.4.

thành phần c trong tinh dầu thân rễ; hiện màu dưới ánh sáng t ngoại ho c thuốc th
đ c hiệu.
2.2.5. Chiết xuất, phân l p và nh n d ng các hợp chất thiên nhiên dùng sắc k lớp
m ng để định tính các thành phần c trong tinh dầu thân rễ; hiện màu dưới ánh sáng t
ngoại ho c thuốc th đ c hiệu. Dùng sắc ký cột để phân lập các hợp chất thiên nhiên.
Các phương pháp ph được dùng để xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên.

12


2.3.1.
ươ

-

đ

ơ trong dược liệu

ng phản ứng h a

học đ c trưng cho mỗi nhóm chất [19].
ươ

-

đ

ượ

ước

ượ

Theo phương pháp sấy

theo dược điển iệt Nam V [20].
ươ

-

đ

ượ

ằ

ươ

ké

ơ

ước. S d ng

ộ d ng c cất lôi cuốn hơi nước theo dược điển iệt Nam V [20].
ươ

-

k k

k

ợ k

Sắc k kh kết hợp khối ph

C-MS

gồm c thiết ị sắc k kh kết nối với detector khối ph . Mẫu sau khi được tách trên
cột phân t ch của thiết ị sắc k kh s được detector khối ph nhận iết.
phương pháp này được áp d ng ph

iện nay

iến để định t nh dựa vào thời gian lưu hay định

lượng dựa vào chiều cao hay diện t ch peak tinh dầu.
ươ

-

t xu t, phân lập hợp ch t hóa học: chiết b ng dung môi, ắc ký

bản m ng - TLC, sắc ký bản m ng hiệu n ng cao - HPTLC, sắc ký cột với chất hấp
ph là silica gel pha thường (Merck loại 40-63 m) ho c pha đảo (ODS, YMC (30-50
μm)). Phương pháp kết tinh để thu chất sạch.
ươ

-

k

ớ

: Dịch chiết mẫu / dịch phân đoạn và tinh dầu

được khai triển trên ản m ng silicagen tráng sẵn 6 -F254 Merck) với hệ dung môi
khai triển th ch hợp. Quan sát sắc k đồ ở ước s ng 254 nm 366 nm và thuốc th
hiện màu [19].
-

ươ

đ nh c u trúc hóa học: Cấu trúc hóa học của các hợp chất

phân lập ra được xác định b ng cách kết hợp các phương pháp vật lý và hóa học,
và s d ng các phương pháp ph . Cấu trúc của hợp chất được xác định b ng sự kết
hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp ph hiện đại như ph khối lượng,
ph NMR.

2.4. Cách th c hi n
Quy ước thực hiện trên ống nghiệm nh là loại ống có dung t ch 5 ml, còn ống
nghiệm lớn là loại ống có dung tích 20 ml.
2.4.1.

13


: Lấy 2 gam dược liệu cho vào ình n n 25 ml, thêm 4 ml ethanol 9

.

Đun cách thủy. Lọc n ng, dịch lọc thu được đem thực hiện các phản ứng định t nh sau:
ả

ả

- Cho vào ống nghiệm nh 1 ml dịch chiết. Thêm khoảng 1 mg Magnesi kim loại.
Nh 3-5 giọt

Cl đậm đ c. Để yên vài phút, phản ứng dương t nh nếu dung dịch

trong ống nghiệm chuyển từ màu vàng sang đ .
ả

ớ k

- Phản ứng với amoniac: Nh vài giọt dịch chiết lên 2 vị trí trên giấy lọc, sấy khô,
hơ một vết trên miệng lọ đựng amoniac đ c đã mở nút, đối chiếu vết được hơ hơi
amoniac với vết không được hơ. Nếu vết hơ hơi amoniac c màu vàng đậm hơn thì
phản ứng dương t nh.
- Phản ứng với NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nh 1 ml dịch chiết, thêm 2 giọt
dung dịch NaOH 10%, lắc đều, phản ứng dương tính nếu dung dịch trong ống
nghiệm vàng đậm hơn so với dịch chiết an đầu.
c. Phản ng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nh 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Phản ứng dương t nh nếu xuất hiện tủa xanh đen.
d. Phản ng diazo hóa
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa b ng dung dịch kiềm (dung dịch
NaOH 10%, KOH 10%, Na2CO3 10%), thêm vài giọt thuốc th diazo mới pha, lắc đều
(có thể đun n ng trên nồi cách thủy trong vài phút) phản ứng dương tinh nếu xuất hiện
màu đ .
2.4.2.
Cân khoảng 1 g bột dược liệu, cho vào một ống nghiệm lớn ho c một bình nón
dung tích 50ml. Thêm 5ml ethanol 90%, quấy đều. Đun trong nồi cách thủy sôi
khoảng 3-5 phút. Lọc nóng qua giấy lọc, dịch chiết thu được để làm các phản ứng định
tính
a. Phản ng mở đ
TT

1

ò
Thực hiện

Tiến hành / Kết quả

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch

14

Ống 1

Ống 2

thêm 0,5ml dung

để nguyên


chiết

dịch NaOH 10%

Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội

2

3

Vàng ho c tủa đ c

Trong suốt

rồi quan sát

màu vàng

Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml

trong suốt

có tủa đ c

tủa đ c như ống 2

-

nước cất. Lắc đều rồi quan sát
Acid hóa ống 1 b ng vài giọt Cl đ c

4

b. Phản ng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm nh 1ml dịch chiết. Thêm vào đ 2ml dung dịch NaOH
1

. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nh vài giọt thuốc th diazo s c màu đ

gạch.
c. Quan sát huỳnh quang của các v

ưới ánh sáng tử ngoại khi tác

d ng với dung d ch ki m (Phản ng chuyển từ đồ

đồng phân trans

ưới tác d ng của tia tử ngoại)
Nh vài giọt dịch chiết coumarin lên giấy thấm. Nh tiếp vài giọt dung dịch
NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc b ng một miếng
kim loại chìa kh a, đồng xu… rồi chiếu tia t ngoại trong một vài phút. B miếng
kim loại ra, quan sát tiếp dưới đ n t ngoại s thấy: Phần không bị che có huỳnh quang
sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp t c chiếu tia t ngoại, phần bị che s sáng dần lên, sau
vài phút cả hai phần đều phát quang như nhau.
2.4.3
: Cân 5 gam ột dược liệu c vào ình n n dung t ch 1

ml. Thêm 4

ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên ếp hồng ngoại đến sôi 2 phút. Lọc
dịch lọc vào ình gạn dung t ch 125 ml. Kiềm h a dịch lọc
6N khoảng 8ml đến p = 9-1
chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml .
với acid sulfuric 1N

th

ng dung dịch amoniac

ng giấy chỉ thị . Chiết alcaloid

ng cloroform

ộp dịch chiết cloroform. Chiết l ng l ng dịch cloroform

ng ình gạn 2 lần, mỗi lần 5ml . Tách lấy lớp acid, gộp lớp

acid dùng làm các phản ứng định t nh sau: Cho vào 3 ống nghiệm nh , mỗi ống 1 ml
dịch chiết acid.
- Ống 1: Cho thêm 2 giọt thuốc th Mayer, phản ứng dương t nh nếu c tủa trắng
- Ống 2: Cho thêm 2 giọt thuốc th

ouchardat, phản ứng dương t nh nếu c tủa nâu.

15


- Ống 3: Cho thêm 2 giọt thuốc th Dragendorff, phản ứng dương t nh nếu c tủa vàng
cam đến đ
2.4.4.
ượ

-

ạ

ọ:

: Cho 1 gam bột dược liệu vào ình n n, thêm

1 ml nước cất. Đun sôi 2 phút trên nguồn nhiệt trực tiếp, lọc lấy dịch lọc. Cho 5 ml
dịch chiết vào ống nghiệm to, dùng ng n tay cái ịt ch t và lắc theo chiều thẳng đứng
ống nghiệm 1 phút, để yên ống nghiệm trên giá. Phản ứng dương t nh nếu sau 15 phút

c

ọt ền vững n i lên trên ề m t ống nghiệm.

- Phản ng Liebermann-Bouchardat: Ti n hành: Cân 1 g bột dược liệu cho vào ống
nghiệm to, thêm 1 ml ethanol 7

, đun sôi cách thủy 2 phút, lọc lấy dịch lọc. Cho

vào ống nghiệm bé 2 ml dịch chiết trên, cô cách thủy đến cắn. Cho vào cắn 1 ml
anhydrid acetic, lắc cho tan hết cắn. Cho từ từ theo thành ống nghiệm nghiêng 450 1ml
acid sulfuric đ c. Phản ứng dương t nh nếu m t phân cách c màu t m đ , lớp trên màu
xanh lá
2.4.5.

nh tính tanin
Lấy khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30 ml

nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính sau:
a. Ống 1: lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5

TT , phản ứng

dương t nh nếu xuất hiện màu ho c tủa màu xanh đen.
b. Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 1

TT , phản ứng dương t nh nếu

xuất hiện tủa bông trắng.
c. Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1 , phản ứng dương

t nh nếu xuất hiện tủa bông trắng.
2.
Ti n hành: Cân 15 gam ột dược liệu cho vào ình n n dung t ch 1

ml. Thêm

3 ml nước cất. Đun sôi trực tiếp trên ếp hồng ngoại sôi 2 phút, lọc lấy dịch lọc, để
nguội cho vào ình gạn dung t ch 125 ml. Chiết dịch lọc trên bình gạn với 5ml
cloroform.

ạn lấy lớp cloroform làm phản ứng định t nh. Cho vào hai ống nghiệm

nh , mỗi ống 1ml dịch chiết cloroform và tiến hành các phản ứng:
a. Phản ng Bortrager:

16


- Ống 1: Thêm 1ml dung dịch amoniac 1

. ịt miệng ống lắc theo chiều đứng ống

nghiệm khoảng 1 nhịp, để yên ống nghiệm trên giá cho phân lớp n định. Phản ứng
dương t nh nếu lớp kiềm ở trên c màu đ sim
- Ống 2: Thêm 1ml dung dịch NaO

1

.

ịt miệng ống lắc theo chiều đứng ống

nghiệm khoảng 1 nhịp, để yên ống nghiệm trên giá cho phân lớp n định. Phản ứng
dương t nh nếu lớp kiềm ở trên c màu đ sim.
V

ă

:

Cho trải đều ,5 gam ột dược liệu vào nắp nhôm đường k nh 2,5 cm, cao 0,5
cm. Nắp nhôm được đốt trực tiếp trên nguồn nhiệt đến khi ắt đầu c kh i ay lên từ
nắp thì đậy một phiến k nh lên miệng nắp, trên phiến k nh đ t một lớp ông tẩm nước
cất lạnh. Tiếp t c đốt khoảng 5 phút thì dừng đốt, để nguội. Lật ngược phiến k nh và
soi dưới k nh hiển vi ở vật k nh x1 . Phản ứng dương t nh nếu quan sát c tinh thể
hình kim và nh dung dịch NaO 1

lên phiến k nh cho màu đ .

y

2.

: Cho vào ình n n 25 ml khoảng 2 g ột dược liệu, đun cách thủy với
8 ml ethanol 5
chì acetat 3
lọc

trong 3 phút, lọc lấy dịch lọc. Dịch lọc thu được đem loại tạp
, lọc loại tủa với chì. Dịch lọc trong loại chì dư

ng

ng natri sulfat 15 ,

tủa, lấy dịch lọc cho vào ình gạn dung t ch 125 ml. Chiết trên bình gạn 3 lần

với cloroform mỗi lần 5 ml .

ộp dịch chiết cloroform, chia đều vào 4 ống nghiệm.

Đ t các ống nghiệm vào một cố c m dung t ch 1

ml, trong cốc c sẵn khoảng 4

ml nước. Đ t cốc vào nồi cách thủy, cô đến khi các ống nghiệm chỉ c n cắn. Dùng các
ống nghiệm chứa cắn làm các phản ứng định t nh sau:
ả

a.

ủa khung steroid:

- Phản ứng Lie ermann – Burchardat: Cho 1 ml anhydrid acetic vào ống nghiệm 1, lắc
nhẹ cho tan hết cắn. Nghiêng ống nghiệm 450. Cho vào từ từ 1 ml acid sulfuric đ c
theo thành ống nghiệm. Để đứng ống nghiệm và quan sát m t phân cách của hai lớp
dung dịch trong ống nghiệm. Phản ứng dương t nh nếu m t phân cách giữa hai lớp
chất l ng xuất hiện v ng t m đ , lớp ph a dưới c màu hồng, lớp trên c màu xanh lá
ả
- Phản ứng

ủ vòng

aljet: Cho thêm 0,5ml ethanol 90%, vào ống nghiệm 2, lắc cho tan hết

cắn. Nh từng giọt thuốc th
1

ạnh:
aljet 1 phần acid picric 1

9 phần dung dịch NaO

mới pha. Phản ứng dương t nh nếu thấy xuất hiện tủa cam.

17